一、单克隆抗体亲和层析法纯化Namalva细胞干扰素（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究指明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
王丛丛[2]（2021）在《禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用》文中认为禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对禽类危害极大,可引起禽流行性感冒（Avian influenza,AI）。大多数AIV只会导致轻度到无症状的感染,但高致病性AIV,主要是H5和H7亚型,在家禽中会导致高达100%的死亡率。最近几年,H7亚型的流感病毒引发了严重的人和家禽的感染,据统计,2013年至2019年3月,H7N9病毒在中国的出现已导致1,568人感染,615人死亡。最初几年,该病毒是低致病性毒株,经过不断发生基因重组与突变,到2017年,进化为高致病性毒株,造成感染禽类快速发病、发生大量死亡,导致养禽业出现巨大损失。为控制H7N9 AIV对养禽业以及人类健康的威胁,降低鸡群中循环的病毒载量,我国开展了H7亚型禽流感疫苗的全面免疫工作。疫苗免疫后需要有可靠方便的实验方法评估抗体水平,因此,H7亚型AI抗体检测工作就显得尤为重要。经典的H7亚型AI抗体检测方法是血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验,该方法稳定性好,操作简便。但是,依然还是有一些不足之处,例如,自动化程度低、难以获得SPF红细胞且不能长期保存、四单位抗原的配制受到操作人员水平的影响较大等。为了避免HI方法的缺陷和进一步增加市场产品的多样化,本研究开展了H7亚型AI抗体的竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,C-ELISA）的研究工作。本研究通过蔗糖梯度密度离心法纯化A/chicken/Guangdong/SD008/2017（H7N9）蛋白作为抗原;在实验室研究基础上,复苏H7亚型杂交瘤细胞1H9制备小鼠腹水,并通过Protein G过柱纯化,得到大量单克隆抗体;利用过碘酸钠法偶联辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）与单克隆抗体1H9制备酶标抗体（HRP-1H9）;根据棋盘滴定法确定最适包被浓度与血清稀释度来建立一种检测H7亚型AI抗体的C-ELISA方法。根据Med Calc软件绘制背景清晰的546份血清的ROC曲线及交互式点状图,确定判定血清样品阴、阳性的临界值。此外,本研究制备了抗AIV H1～H15、H7Nx（N1～N4,N7～N9）亚型鸡血清和其他禽类常见病的血清,如抗新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）鸡血清、抗传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）鸡血清,以及抗传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）鸡血清。并将这些血清作为特异性试验、敏感性试验和重复性试验的血清标准品,结合对1,392份现地样品的检测结果,评估了建立的检测H7亚型AI抗体的C-ELISA方法的诊断性能。根据试验结果,确定C-ELISA方法以5μg/m L浓度包被抗原,1/10稀释血清,1/3,000稀释酶标抗体。通过ROC曲线及交互式点状图分析178份AIV阴性和368份AIV阳性血清（n=546）,当抑制率（Percentage inhibition,PI）为40%时,C-ELISA的特异性和敏感性均达到较高水平,分别为99.44%和98.91%,因此确定C-ELISA的临界值为40%,即血清PI<40%时判定为H7亚型AI抗体阴性。在验证性试验中,通过检测AIV H7Nx（N1～N4,N7～N9）、H1～H6与H8～H15亚型血清以及NDV血清、IBV血清和IBDV血清,验证了建立的C-ELISA方法,除AIV H7各亚型血清外,其余亚型AIV及禽类常见病毒的血清均判定为阴性,具有良好的特异性;通过梯度稀释阳性血清,在320倍稀释时,仍可检测出血清的PI值大于40%,敏感性良好;批内和批间重复性试验的计算结果显示,两组试验的变异系数均小于12%,试验方法较为稳定;对现地样品进行检测,本方法与HI试验的符合率为98.56%。综上所述,本研究利用H7亚型特异性酶标单克隆抗体作为竞争抗体,建立了C-ELISA抗体检测方法。其特点在于同时加入了酶标抗体与待检血清进行竞争反应,与先加入待检血清,再加竞争抗体反应的常规方法比较,简化了操作步骤,缩短反应时间,为开展H7-AI抗体的大量检测提供了一种简单、便捷的技术手段。
王妍[3]（2020）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原是PRRS病毒（PRRSV）,是一种危害严重的病毒性疫病,给全球养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV非结构蛋白9（Non-structural protein 9,Nsp9）有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）功能,对病毒复制至关重要。另外,Nsp9序列相对保守,是理想的抗PRRSV靶标。实验室前期研究发现在MARC-145细胞中稳定表达Nsp9特异性纳米抗体Nb6能抑制PRRSV复制。同时,还证明了Nb6与细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,CPP）融合表达的重组蛋白能进入宿主细胞并发挥抗病毒功能。然而,Nb6通过靶向Nsp9抑制PRRSV复制的抗病毒机制尚不清楚,此外,Nsp9的三维结构未知。本研究使用X-射线小角散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）技术,获得了Nsp9以及Nsp9-Nb6复合物的分子包膜信息,同时鉴定了参与Nsp9-Nb6相互作用的重要氨基酸位点。在此基础上,本研究进一步通过反向遗传技术构建了突变这些氨基酸位点的重组病毒,体外评估了突变病毒的复制效率,确定了影响PRRSV复制的关键氨基酸。另外,获得并解析了Nsp9特异性纳米抗体Nb7的高分辨率晶体结构（1.8?）。本研究为抗PRRSV感染以及开发基于结构的抗病毒药物提供了试验依据。本论文的研究内容及结果如下:1.使用阴离子交换柱、Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化Nsp9重组蛋白,获得了纯度较高的重组蛋白并对其进行了结晶;通过I-TASSER在线服务器预测了全长Nsp9的结构,总体结构分为两个部分呈上窄下宽的桶形;根据此预测结构以及前期文献报道将Nsp9截短表达;使用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）方法检测了Nsp9重组蛋白在溶液中的粒径大小,结果表明此Nsp9重组蛋白溶液是均一的,单分散的;将不同浓度的Nsp9重组蛋白进行SAXS分析,最终获得了Nsp9重组蛋白的大分子包膜,其大分子包膜不对称且呈桶形。2.扩增Nb6/Nb7基因并将其克隆到p MECS载体中,构建p MECS-Nb6/Nb7重组表达载体;将载体转化BL21感受态细胞,诱导后,经验证Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌周质中成功表达;重组蛋白使用Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化获得了高纯度蛋白;接下来,将Nb6/Nb7基因克隆到p PICZαA载体,构建p PICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体;重组表达载体经线性化后电转化毕氏酵母菌株X-33感受态细胞;甲醇诱导后,经SDS-PAGE分析表明Nb6/Nb7重组蛋白在细胞上清中大量的分泌表达;Nb6/Nb7经Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化,获得了高纯度的重组蛋白;结晶酵母表达的Nb6/Nb7的晶体并收集数据,Nb7重组蛋白的晶体具有较好的衍射,最终获得了1.8?高分辨率衍射数据,每个不对称单元中有两个Nb7,重组蛋白的形状总体呈现紧致的圆柱形,并且没有长的CDR3,这与其他的纳米抗体不一样。3.将纯化的Nsp9重组蛋白和过量Nb6重组蛋白孵育,通过凝胶过滤层析柱纯化,获得Nsp9-Nb6复合物;使用生物膜干涉技术（Bio-layer interferometry,BLI）分析了Nsp9与Nb6之间的亲和力大小,结果表明Nsp9与Nb6具有高亲和力;DLS分析显示Nsp9-Nb6复合物溶液是均一的;将不同浓度的Nsp9-Nb6复合物进行SAXS分析,获得了Nsp9-Nb6复合物在溶液中的结构信息数据,最终获得了Nsp9-Nb6复合物的大分子包膜信息;通过将复合物的大分子包膜和Nsp9单体的大分子包膜分析比较后确定了Nsp9-Nb6相互作用模型。在此模型中,复合物的相互作用是通过Nsp9的Ile588、Asp590、Leu643和Asp646与Nb6的Trp105、Pro107、Tyr62和Asp64介导的;使用BLI和ELISA方法验证Nsp9和Nb6之间相互作用的氨基酸,结果表明,Nsp9的588、590和643位氨基酸和Nb6的62、105和107位氨基酸参与了二者的相互作用;以高致病PRRSV（Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV）SD16株感染性克隆为骨架,构建了Nsp9的第588位、590位和643位氨基酸替换的重组病毒;在MARC-145细胞上的复制动力学表明,第588位和643位氨基酸替换的突变病毒较其亲本毒复制效率明显降低并且其负链基因组RNA水平与其亲本病毒之间也存在明显差异。综上所述,本研究首次使用SAXS方法获得了Nsp9和Nsp9-Nb6复合物的分子包膜,并鉴定出对PRRSV复制至关重要的Nsp9的两个新的氨基酸。这些发现丰富了有关PRRSV Nsp9以及病毒复制和致病性的知识,有助于开发抗PRRSV感染的药物和新型疫苗。
邢青波[4]（2020）在《腺相关病毒EGFP-AAV9纯化及生物学特性研究》文中进行了进一步梳理近年来,病毒介导的基因治疗受到广泛关注。与其他病毒相比,腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）因具备安全性好、宿主范围广、免疫原性低和表达稳定等优点,被广泛应用于基因治疗研究。为了满足临床研究及基因治疗对高纯度、高质量AAV的需求,需要建立一种简单、高效的AAV纯化方法。目前,AAV从裂解的包装细胞中获得,需额外进行细胞裂解、去除细胞碎片及宿主细胞DNA和蛋白质等过程,常常需要结合多种方法进行纯化,操作繁琐,耗时耗力。为了获得更大量的增强型绿色荧光蛋白-腺相关病毒血清型9（Enhanced green fluorescent protein adeno-associated virus 9EGFP-AAV9）,本文首先通过优化“包装质粒与聚乙烯亚胺（PEI）质量比”和“三包装质粒摩尔比”来找到产生大量EGFP-AAV9的最佳三质粒和转染试剂用量;然后利用AAV9血清型在转染后可以大量释放入培养基中的特性,采用“七天内隔天收集EGFP-AAV9”的方法,以期获得最大EGFP-AAV9产量。随后选择切向流过滤（TFF）和聚乙二醇（PEG）8000沉淀法,对EGFP-AAV9进行浓缩纯化,并通过SDS-PAGE、q PCR,以及体外感染人肾上皮细胞系（293T细胞）比较两种方法对EGFP-AAV9纯度、滴度及细胞转导效率等生物学特性的影响。为了获得更高的纯度,将EGFP-AAV9分别进行碘克沙醇超速离心及超滤离心管（100k Da）进行脱盐、浓缩,比较了两种方法纯化EGFP-AAV9的操作过程、消耗时长,并以上述同样的方法检测了二者对EGFP-AAV9生物学特性的影响。最后,通过感染293T细胞,提取基因组DNA、总RNA和总蛋白样品分别进行PCR、RT-PCR和免疫印迹（WB）检测,评估EGFP体外表达情况。此外,应用EGFP-AAV9感染鸡成纤维细胞系（DF-1）和鸡淋巴瘤细胞（DT40）,检测其转导效率。结果显示:（1）当“质粒与PEI质量比”以及“三包装质粒（p AAV-CAG-GFP、p Helper、p AAV-RC9）摩尔比”分别为1:3和2:1:1时,AAV-293细胞转染效率最高,以此比例可产生最大产量EGFP-AAV9;（2）TFF-Iodixanol和PEG8000-Iodixanol两种纯化方法耗时大致相等,但前者获得的EGFP-AAV9具有更高的滴度及293T细胞体外感染效率;（3）提高EGFP-AAV9纯度能明显改善对293T细胞转导效率;（4）PCR、RT-PCR和WB均证实,EGFP在293T细胞中成功表达;（5）EGFP-AAV9对鸡DF-1和DT40细胞感染效率极低,表明其可能不适合于禽类细胞的体外感染。结论:本研究获得了产生大量EGFP-AAV9的最佳三质粒及PEI用量;TFF-Iodixanol法纯化EGFP-AAV9效果最佳,其纯化的EGFP-AAV9可获得更高的293T细胞感染效率;EGFP-AAV9对鸡DF-1和DT40细胞的感染效率极低。
姜涛[5]（2020）在《鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备》文中提出细胞因子是一类小分子可溶性蛋白,对动物的固有免疫和适应性免疫起着十分重要的作用。IFN-γ和IL-10作为较为重要的细胞因子,吸引了众多研究者的关注。IFN-γ能直接调动体内的多种免疫原细胞的增殖与分化,参与所有的I型辅助T细胞（Th1细胞）的免疫反应;IL-10能抑制炎症反应并提高体内免疫系统对外来细菌和病毒的应答反应。本实验首先利用基因工程技术,表达纯化得到了鼠源的IFN-γ和IL-10蛋白。利用单克隆抗体技术,筛选出15株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（分泌IFN-γ抗体的杂交瘤细胞株2株,分泌IL-10抗体的杂交瘤细胞株13株）。对分泌IFN-γ抗体的杂交瘤细胞株2D8进行亚型鉴定结果为Ig G2a型。将杂交瘤细胞2D8按照每只106个的剂量注入提前用弗氏不完全佐剂处理的小鼠腹腔,通过腹水采集和纯化获得了IFN-γ抗体。本工作中表达纯化得到的IFN-γ和IL-10蛋白,可以为其他研究者进一步研究这两种鼠源细胞因子结构与功能及其相关疾病提供重要的物质基础,通过单克隆抗体技术得到能稳定分泌IFN-γ和IL-10抗体的杂交瘤细胞,可以为后续建立双抗夹心ELISA方法检测这两种细胞因子提供关键的抗体支持。
房慧[6]（2020）在《CAV感染诱导chMAB21L1转录水平变化及稳定表达chMAB21L1基因DF-1细胞系建立》文中提出鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia,CIA）是一种由鸡贫血病毒（Chicken anemia virus,CAV）引起的以再生障碍性贫血和广泛性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制疾病。研究CAV致病机理和机体抗该病毒感染免疫机制对防控CIA具有重要意义。MAB21L1蛋白（Male abnormal gene family-21-like 1 protein,雄性异常基因家族21样1蛋白）与环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（Cyclic GMP-AMP synthase,c GAS）同属于MAB21家族蛋白,具有相同的MAB21结构域。本实验室前期研究发现,CAV感染MDCC-MSB1细胞（Marek’s disease virus-transformed lymphoblastoid cell line,马立克病肿瘤淋巴母细胞系）后,可激活c GAS-STING天然免疫信号通路。MAB21L1作为c GAS的同源蛋白,是否也能通过天然免疫信号通路而发挥抗CAV感染作用尚不清楚。为了体外研究鸡MAB21L1基因（chMAB21L1）的功能,首先需要建立能够持续表达该基因的稳转细胞系作为研究模型。对此,本课题以chMAB21L1基因为研究对象,检测CAV感染后chMAB21L1基因的转录表达情况,制备chMAB21L1蛋白的特异性抗体,建立能够持续表达chMAB21L1基因的稳转细胞系。主要研究内容与结果总结如下:1)CAV体外诱导chMAB21L1基因转录表达水平的检测。论文中以1×101.33TCID50的CAV感染MDCC-MSB1细胞,分别于感染后0 h、6 h、12 h和24 h收集感染细胞,采用RT-q PCR检测chMAB21L1基因在MDCC-MSB1细胞中的转录表达水平。结果显示,与感染后0 h相比,感染后6 h该基因转录水平显着上调,12 h和24 h后达到极显着上调水平,表明chMAB21L1蛋白是一种CAV感染相关蛋白。2)chMAB21L1基因重组表达质粒构建及其多克隆抗体制备。论文中首先采用酶切酶连法构建原核表达重组质粒p ET-32a-chMAB21L1,并对其进行诱导表达。然后,采用切胶方法纯化rchMAB21L1蛋白,并经PEG20000浓缩后获得浓度为1 mg/m L的rchMAB21L1蛋白。最后,以150μg rchMAB21L1抗原/只的免疫剂量对6周龄雌性Balb/c小鼠进行免疫接种,共免疫四次,每次间隔两周。第4次免疫后7 d对小鼠进行摘眼球采血分离免疫血清,采用间接ELISA和免疫琼脂扩散试验检测免疫血清中特异性抗体的效价,最终获得ELISA效价为1:65536(1:216),琼扩效价为1:16的鼠抗chMAB21L1多克隆抗体,可用于稳转细胞系的鉴定。3)稳定表达chMAB21L1基因的DF-1细胞系建立。论文中首先采用基因同源重组技术构建chMAB21L1基因重组慢病毒表达载体。然后,采用磷酸钙转染法将该重组慢病毒表达质粒与病毒包装辅助质粒（ps PAX2、p MD2.G）共同转染到HEK293T细胞中进行重组慢病毒包装,并通过超高速离心浓缩重组慢病毒。最后,以重组慢病毒感染DF-1细胞,用浓度为1μg/m L的嘌呤霉素进行稳转细胞系筛选,并在转录水平和蛋白水平对其进行鉴定。结果显示:（1）chMAB21L1基因的重组慢病毒表达载体经PCR与双酶切鉴定,均得到与目的基因预期大小相符的DNA条带,且测序序列无任何突变与缺失,表明该重组慢病毒表达载体构建成功;（2）重组慢病毒表达载体转染后的293T细胞可表达绿色荧光蛋白,细胞内chMAB21L1基因在转录与蛋白水平均有表达,并从重组慢病毒基因组中也检测到chMAB21L1基因,表明重组慢病毒包装成功。（3）经嘌呤霉素筛选后的DF-1细胞,连续传至15代后仍能持续表达绿色荧光蛋白,且细胞内chMAB21L1基因的转录表达水平与蛋白表达水平均显着高于对照组细胞,表明chMAB21L1基因已整合到DF-1细胞基因组,稳定表达chMAB21L1基因的DF-1细胞系构建成功。综上所述,CAV感染能够诱导chMAB21L1基因转录表达水平显着上调。在构建原核表达重组质粒p ET-32a-chMAB21L1基础上,成功制备出鼠抗chMAB21L1抗体。采用重组慢病毒感染法成功建立稳定表达chMAB21L1蛋白的DF-1细胞系。
张淑婷[7]（2020）在《人巨细胞病毒PP65抗原单克隆抗体及纳米抗体的制备》文中认为目的:1.制备人巨细胞病毒（human cytomegalic virus,HCMV）PP65抗原的单克隆抗体,建立HCMV PP65抗原的免疫组化检测方法2.制备HCMV PP65抗原的纳米抗体,并初步鉴定其与PP65抗原的反应性方法:1.诱导PQE30-PP65重组质粒表达PP65抗原,免疫BALB/c小鼠。通过血清抗体阳性小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）的细胞融合,HTS筛选,扩大培养,亲和纯化获得单克隆抗体。对制备的单克隆抗体亚型、效价及特异性进行测定,并将其用于临床样本的玻片免疫组化检测。2.为获得HCMV PP65特异性纳米抗体,本研究以重组PP65蛋白为靶抗原对已构建的非免疫性噬菌体文库进行四轮淘筛后,采用间接ELISA法筛选出8株PP65特异性纳米抗体序列,并将序列构建入pClod低温诱导原核表达载体,进行纳米抗体的重组表达和纯化。进行大量制备,采用间接ELISA法验证制备的纳米抗体与PP65抗原的反应性。结果:1.将PQE30-PP65重组质粒转化至E.coli M15感受态细胞中。加入IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定,实验组在26-33kDa附近可见明显条带,与预期大小一致,说明重组质粒转化成功并可以表达目的蛋白。2.通过western-blot鉴定,在26-33kDa附近可见一条与HRP标记的抗His单克隆抗体结合的清晰条带,说明该蛋白为目的蛋白且带有his标签,可用镍柱进行纯化。3.对PQE30-PP65重组质粒进行大量诱导表达,超声破碎菌体,利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化,纯化后样品经12%SDS-PAGE结果显示,在26-33kDa附近可见明显的单一条带,与预期大小一致,表明成功制备纯度较高的PP65蛋白。4.以PP65蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,选择血清效价最高的小鼠再次加强免疫。取免疫后的小鼠脾细胞,制备杂交瘤细胞,经过阳性杂交瘤细胞筛选及3次亚克隆化后,共筛选出8株高滴度的抗HCMV PP65特异性的单克隆抗体细胞株。5.对8株单克隆抗体纯化后进行纯度鉴定,经12%的SDS-PAGE检测,发现均可在50kDa左右看到单抗的重链,在25kDa附近看到单抗的轻链,表明纯化的单抗纯度较高。6.使用单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒通过间接ELISA的方法鉴定抗体亚类,经鉴定,8株抗体的重链亚类均为IgG1型抗体,轻链均为κ链。7.通过间接ELISA法检测纯化后的8株单克隆抗体效价,确定8株单抗效价均达到1:1024000以上。8.将8株单克隆抗体分别与PP65蛋白及其他4种不同的无关蛋白进行酶联免疫吸附实验,检测其特异性,发现8株单抗与PP65蛋白反应的OD450-630值均明显高于其他无关蛋白。说明8株单抗均能很好的特异性识别PP65目的蛋白,而与其他蛋白的反应性较低,表现出良好的特异性。9.利用纯化后的8株单克隆抗体对临床已知的阳性及阴性标本进行免疫组化检测,证明其中6株单抗能够准确界定阳性及阴性感染。10.以PP65为筛选抗原,对非免疫文库进行四轮淘筛后筛选出8株抗原特异性的纳米抗体。11.将8株纳米抗体对应的基因序列插入pCold I原核表达载体,对8株纳米抗体进行表达鉴定。经SDS-PAGE和Werstern-blot鉴定,8株纳米抗体均与预期分子量大小一致,且能与HRP标记的小鼠抗His抗体结合,说明成功表达8株纳米抗体。12.将8株纳米抗体进行大量诱导表达,用镍柱亲和层析法进行纯化,用超滤离心管对目的蛋白进行缓冲体系置换和浓缩,对纯化后的样品进行SDS-PAGE鉴定,结果显示成功获得纯度较高的8株纳米抗体。13.通过间接ELISA的方法检测8株纳米抗体与PP65抗原的反应性。可见其中2株抗体与PP65抗原反应性较好。结论:1.制备了8株针对HCMV PP65抗原的单克隆抗体,其中6株能够通过玻片免疫组化准确鉴定HCMV激活性感染。研究结果为HCMV感染检测试剂盒的研发提供了材料。2.筛选并制备了2株针对HCMV PP65抗原的纳米抗体,为HCMV感染检测试剂的研发以及抗HCMV靶向药的载体研发提供了材料。
史冰君[8]（2020）在《细胞外猪ISG15夹心ELISA检测方法的建立及外源性猪ISG15对PRRSV复制的调控初探》文中认为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）作为一种猪病毒性传染病,在1987年于美国部分区域首次出现并报道,两年后欧洲地区也迅速爆发此病,随后在全世界的猪场形成广泛流行传播趋势,造成了巨大的经济损失。引发PRRS的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。除弱毒疫苗免疫外,对于PRRS的防控与净化目前还没有较好的方法,因此需要进一步研究PRRSV免疫机制从而对其进行有效防治。在病原体入侵过程中,宿主会通过天然免疫应答和适应性免疫应答来保护宿主。宿主天然免疫应答中的I型干扰素（type I Interferons,IFNs）结合细胞表面的受体后通过刺激细胞上调数百种干扰素刺激基因（Interferon-stimulated Genes,ISGs）来激活细胞进入抗病毒状态。在这些ISGs中,泛素样蛋白ISG15是产生最早和表达量最高的ISGs之一。与泛素相似,ISG15可通过酶级联反应与靶蛋白共价结合,但同时ISG15可以单体形式被释放至细胞外。有报道称,重组或细胞外游离ISG15具有细胞因子的作用,可以刺激NK细胞的增殖、刺激IFN-γ的产生、诱导DC分化成熟、也可作为中性粒细胞的趋化因子发挥功能。然而,作为一种细胞内的抗病毒蛋白,ISG15在不同的物种间并不保守,因此ISG15作为一种细胞因子对免疫系统的作用,以及在病毒感染中所发挥的机制依然不明。本研究以此为出发点,通过自行表达重组猪ISG15蛋白,制备猪ISG15特异性单克隆抗体和多克隆抗体建立猪ISG15夹心ELISA检测方法,探究PRRSV与猪ISG15的相互作用,进一步探究猪ISG15作为细胞因子对PRRSV可能的调控作用。本研究的主要工作和结果如下:1.制备识别猪ISG15的单克隆抗体并进行了功能鉴定:首先构建原核表达载体p ET28a-ISG15并在大肠杆菌中诱导表达并纯化了His标记的猪ISG15蛋白,通过使用重组蛋白免疫Balb/c小鼠后采集脾脏进行细胞融合,并通过ELISA筛选,Western blot筛选及亚克隆,获得1株稳定分泌ISG15抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D5E6。经过Balb/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞获得腹水,纯化后通过抗体亚型鉴定试剂盒鉴定3D5E6抗体亚型为Ig G1。Western blot和IFA检测3D5E6可识别猪IFN-α刺激CRL2843细胞所表达产生的内源性ISG15。2.猪ISG15双抗夹心ELISA检测方法的建立:委托南京金斯瑞公司使用纯化后猪ISG15蛋白免疫新西兰白兔,通过抗原亲和层析获得识别猪ISG15的兔多克隆抗体。以鼠源3D5E6作为捕获抗体,兔多抗作为检测抗体,以猪ISG15蛋白为标准品,通过棋盘滴定法确定了猪ISG15双抗夹心ELISA方法的最适反应条件及夹心抗原的最低检测限度,并绘制出标准曲线。优化后的双抗夹心ELISA检测条件为:捕获抗体包被量8μg/孔,检测抗体稀释比例为1:4000,最低检测下限为250 pg/m L。3.不同毒力PRRSV毒株感染PAMs后ISG15表达水平的差异:用PRRSV不同毒株（强毒,弱毒）感染PAMs 24 h后,收取细胞检测猪ISG15 m RNA和蛋白水平的变化。同时收取细胞上清液,利用猪ISG15双抗夹心ELISA法测定不同PRRSV毒株感染PAMs后上清中猪ISG15的表达水平。同时使用PRRSV不同毒株感染PAMs的上清液预处理VERO细胞（IFNs产生缺陷）12 h,再用对干扰素敏感的NDV-GFP感染细胞检测PAMs上清液中的IFNs活性,24 h后观察发现GFP阳性细胞数量在不同PRRSV毒株感染PAMs上清处理组中无差异,初步证明PRRSV不同毒株感染PAMs后引起ISG15在转录水平和翻译水平的表达差异不依赖于IFNs,且PRRSV弱毒株感染PAMs后可诱导高水平的猪ISG15分泌。4.重组猪ISG15对PRRSV在PAMs上复制的调控作用:对纯化后的猪ISG15蛋白和对照蛋白SUMO进行去内毒素处理,经SDS-PAGE分析去内毒素后蛋白未发生降解。分别用两种蛋白预处理PAMs 24 h,再用PRRSV-JXA1毒株感染PAMs 24 h后Western blot检测PRRSV N蛋白表达。经与对照组相比,猪ISG15蛋白刺激PAMs后能有效抑制PRRSV复制。综上所述,PRRSV弱毒株及疫苗株感染PAMs后能诱导ISG15的大量表达,而PRRSV强毒株无法诱导PAMs上ISG15的表达。PRRSV疫苗株诱导产生的内源性ISG15可被分泌释放至细胞外,通过使用重组猪ISG15刺激PAMs可抑制PRRSV增殖,说明PRRSV感染天然靶细胞PAMs后诱导ISG15表达和分泌的能力,可能是导致不同PRRSV毒株毒力差异的因素之一,本研究可对PRRSV的毒力差异和免疫调节机制以及未来的防治提供重要线索。
柏极[9]（2020）在《抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备》文中研究说明目的制备抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（Lipoarabinomanan,LAM）荧光抗体,为应用于痰涂片镜检打下基础。方法LAM经兔皮下免疫后,采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测抗体效价,兔心脏采血获得足量高效价的兔血清。兔血清依次经过盐析法粗提,G蛋白亲和层析纯化抗体,通过SDS-PAGE鉴定纯化效果,透析除盐后浓缩,BCA法检测抗体浓度。经荧光素异硫氰酸酯（FITC）偶联,测定F/P值,获得荧光抗体。结果成功进行6次LAM兔皮下免疫,成功构建ELISA法检测抗体效价,测得抗体效价达到1:51200,顺利行心脏采血,获得约100 mL含抗LAM抗体兔血清。顺利完成盐析法,G蛋白亲和层析纯化抗体,经SDS-PAGE鉴定,获得了高纯度多克隆IgG。抗体经除盐浓缩,BCA法测定抗体浓度为7.26 mg/mL。经FITC偶联,制备荧光抗体,测F/P值2.7。结论成功制备荧光抗体,为建立直接免疫荧光法检测痰中结核分枝杆菌打下基础。
许姝雅[10]（2020）在《冠状病毒S蛋白三聚体的表达纯化及与单克隆抗体结合试验的研究》文中认为冠状病毒（CoVs）是一种含有最大基因组的单股正链RNA病毒,可导致人和动物的轻度或致死性呼吸道和胃肠道疾病。冠状病毒基因组N端包含两个大的开放阅读框（Openreading frame,ORF）,ORF1a和ORF1b;C端主要包含编码结构蛋白的基因,编码S蛋白（纤突糖蛋白）、M蛋白（膜蛋白）、E蛋白（包膜蛋白）和N蛋白（核蛋白）四种结构蛋白。冠状病毒S蛋白是一种同源三聚体Ⅰ类融合蛋白,包括三个S1头和三个S2茎,其主要功能是首先通过S1亚基与宿主细胞表面受体结合,激发构象变化,再通过S2亚基促进病毒和宿主的膜融合,从而将病毒基因组释放到细胞质中,介导病毒进入宿主细胞。冠状病毒S蛋白既是宿主细胞向性的主要决定因素,又是病毒进入宿主细胞的媒介。已有研究报道SARS-CoV、MERS-CoV与抗体复合物的冷冻电镜结构,病毒-抗体免疫复合物的结构研究可以帮助更好地理解抗体介导中和的分子机制,也为基于结构的疫苗设计提供有价值的信息。本研究首先以PEDV S蛋白三聚体的表达纯化及与单克隆抗体结合试验为例,依次表达纯化SeACoV、SARS-CoV-2的S蛋白三聚体,为后续蛋白-抗体复合物冷冻电镜结构解析奠定基础。具体研究如下:1.对冠状病毒S基因序列进行改造和优化,构建重组质粒,利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中表达了PEDVS蛋白三聚体,利用亲和层析法和凝胶过滤色谱法纯化蛋白,收集纯化后的S蛋白,交联和密度梯度离心法优化蛋白品质并负染观察。2.通过Western Blot和ELISA等试验,利用PEDV S蛋白三聚体鉴定实验室现存的2C2G11、2G4C5、3B10G8和7D7G1四株PEDV S单体蛋白的单克隆抗体。3.用与PEDV S蛋白三聚体相同的表达条件,表达纯化SeACoV、SARS-CoV-2的S蛋白三聚体并检测。
二、单克隆抗体亲和层析法纯化Namalva细胞干扰素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单克隆抗体亲和层析法纯化Namalva细胞干扰素（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 AIV蛋白结构和功能 |
| 1.2.1 RNA聚合酶复合体蛋白(PB1、PB2、PA) |
| 1.2.2 血凝素(HA) |
| 1.2.3 核蛋白(NP) |
| 1.2.4 神经氨酸酶(NA) |
| 1.2.5 基质蛋白(M1、M2) |
| 1.2.6 非结构蛋白(NS1、NEP/NS2) |
| 1.3 H7亚型AIV流行动态 |
| 1.4 禽流感抗原和抗体诊断方法的研究进展 |
| 1.4.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR(r PCR) |
| 1.4.3 数字PCR(d PCR) |
| 1.4.4 HA试验和血凝抑制(HI)试验 |
| 1.4.5 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 1.4.6 胶体金免疫层析法(GICA) |
| 1.4.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 H7-AIV蛋白、HRP-1H9 及血清标准品的制备 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、血清和试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂和材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液和样品准备 |
| 2.2 抗原的扩增与纯化 |
| 2.2.1 抗原的扩增 |
| 2.2.2 抗原的纯化 |
| 2.3 单克隆抗体的扩增、纯化与标记 |
| 2.3.1 杂交瘤细胞的复苏 |
| 2.3.2 腹水的制备 |
| 2.3.3 单克隆抗体的纯化 |
| 2.3.4 过碘酸钠法标记抗体 |
| 2.4 血清的制备与检验 |
| 2.4.1 病毒效价测定 |
| 2.4.2 接种免疫原 |
| 2.4.3 鸡血的采集 |
| 2.4.4 血清的制备 |
| 2.4.5 血清的检验 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 制备与纯化出H7亚型AIV抗原 |
| 2.5.2 成功纯化1H9 单克隆抗体 |
| 2.5.3 获得高效的酶标抗体 |
| 2.5.4 获得特异性与敏感性标准品 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 抗原、抗体和血清 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2 H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.2.1 抗原浓度、血清和酶标抗体稀释倍数的选择 |
| 3.2.2 反应条件的优化 |
| 3.2.3 H7亚型C-ELISA临界值的判定 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 敏感性试验 |
| 3.2.6 重复性试验 |
| 3.2.7 现地样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 确定出抗原包被浓度、血清及酶标抗体稀释倍数 |
| 3.3.2 确定最佳H7亚型C-ELISA抗体检测方法的反应条件 |
| 3.3.3 确定出H7亚型C-ELISA抗体检测方法的临界值 |
| 3.3.4 H7亚型C-ELISA抗体检测方法特异性良好 |
| 3.3.5 H7亚型C-ELISA抗体检测方法敏感性良好 |
| 3.3.6 H7亚型C-ELISA抗体检测方法重复性较好 |
| 3.3.7 H7亚型C-ELISA与 HI试验检测的符合率较高 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展 |
| 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概况 |
| 1.1.2 PRRSV基因组构成 |
| 1.1.3 PRRSV感染有关的细胞的受体及因子 |
| 1.1.4 PRRSV致病的分子机制 |
| 1.2 PRRSV Nsp9概述 |
| 1.3 PRRSV防控策略 |
| 1.3.1 PRRSV入侵阻断剂 |
| 1.3.2 PRRSV感染过程中宿主miRNAs的抗病毒作用 |
| 1.3.3 基于反义RNA的策略作为PRRSV特异性疗法 |
| 1.3.4 草药提取物和化合物抑制PRRSV |
| 1.3.5 抗PRRSV的纳米抗体 |
| 1.3.6 免疫刺激剂及其作为PRRSV疫苗佐剂的潜力 |
| 1.3.7 当前的挑战和未来的研究方向 |
| 1.4 X-射线小角散射概述 |
| 1.4.1 SAXS在结构分析中的应用 |
| 1.4.2 展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRRSV Nsp9的生物学结构研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Nsp9重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.2 Nsp9重组蛋白的晶体生长 |
| 2.2.3 Nsp9重组蛋白结构预测 |
| 2.2.4 Nsp9截短片段的扩增以及原核表达载体的构建 |
| 2.2.5 分析Nsp9截短蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.6 测量Nsp9重组蛋白的粒径大小 |
| 2.2.7 Nsp9 重组蛋白SAXS分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Nsp9重组蛋白的纯化 |
| 2.3.2 Nsp9重组蛋白预测的结构 |
| 2.3.3 Nsp9截短片段原核表达载体的构建以及表达 |
| 2.3.4 Nsp9重组蛋白DLS分析 |
| 2.3.5 Nsp9SAXS分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Nsp9 特异的纳米抗体Nb6和Nb7的生物学结构研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因扩增及表达载体的构建 |
| 3.2.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 3.2.3 Nb6/Nb7重组蛋白在巴斯德毕氏酵母X-33中的克隆、表达和纯化 |
| 3.2.4 在酵母中表达的Nb6/Nb7重组蛋白的晶体生长 |
| 3.2.5 Nb7重组蛋白晶体数据收集与处理 |
| 3.2.6 解析Nb7重组蛋白的晶体结构 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pMECS-Nb6/Nb7原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中周质中的表达及纯化 |
| 3.3.3 pPICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体的构建 |
| 3.3.4 Nb6/Nb7重组蛋白在酵母中的表达分析 |
| 3.3.5 Nb6/Nb7重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 Nb6/Nb7重组蛋白结晶及条件优化 |
| 3.3.7 Nb7重组蛋白的晶体数据收集、处理及结构解析 |
| 3.3.8 Nb7重组蛋白晶体结构 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Nsp9 上影响PRRSV复制关键氨基酸位点分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂耗材 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 BLI分析Nsp9重组蛋白与Nb6之间的亲和力大小 |
| 4.2.2 Nsp9-Nb6复合物的纯化 |
| 4.2.3 测量Nsp9-Nb6复合物的粒径大小 |
| 4.2.4 Nsp9-Nb6复合物蛋白晶体生长条件筛选 |
| 4.2.5 Nsp9-Nb6 复合物SAXS分析 |
| 4.2.6 Nb6突变体蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.7 Nsp9突变体蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.8 Nb6突变体蛋白与Nsp9之间的亲和力测定 |
| 4.2.9 Nsp9突变体蛋白与Nb6之间的亲和力测定 |
| 4.2.10 突变病毒的构建及鉴定 |
| 4.2.11 突变病毒的拯救 |
| 4.2.12 拯救病毒的鉴定 |
| 4.2.13 重组病毒的病毒滴度测定 |
| 4.2.14 重组病毒的增殖特性分析 |
| 4.2.15 Nsp9上的氨基酸替换对病毒RNA相对水平的影响 |
| 4.2.16 Nsp9上的氨基酸替换对病毒负链基因组RNA水平的影响 |
| 4.2.17 Nsp9上的氨基酸替换对病毒感染水平的影响 |
| 4.2.18 对PRRSV Nsp9中氨基酸残基561-689进行序列比对 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Nb6和Nsp9之间亲和力的测定 |
| 4.3.2 Nb6与Nsp9复合物的纯化 |
| 4.3.3 DLS检测分析 |
| 4.3.4 Nsp9-Nb6复合物SAXS分析 |
| 4.3.5 Nsp9-Nb6复合物相互作用位点分析 |
| 4.3.6 突变质粒的构建 |
| 4.3.7 突变病毒的拯救 |
| 4.3.8 拯救病毒的核酸检测 |
| 4.3.9 Nsp9上参与病毒复制的关键氨基酸位点鉴定 |
| 4.3.10 病毒感染能力检测 |
| 4.3.11 I588、L643在Nsp9的保守性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）腺相关病毒EGFP-AAV9纯化及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 论文综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 AAV简介 |
| 1.2.1 AAV血清型来源 |
| 1.2.2 AAV的结构 |
| 1.2.3 AAV的产生方法 |
| 1.3 AAV纯化方法研究进展 |
| 1.3.1 超速离心法 |
| 1.3.2 色谱法 |
| 1.3.2.1 离子交换色谱法 |
| 1.3.2.2 亲和层析法 |
| 1.3.2.3 尺寸排阻色谱法 |
| 1.3.3 其他方法 |
| 1.3.3.1 超滤法 |
| 1.3.3.2 沉淀法 |
| 1.4 AAV在基因治疗研究方面的应用 |
| 1.5 AAV介导的基因传递在动物生物反应器研究中的应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 试验技术路线 |
| 第二章 EGFP-AAV9包装条件优化及其纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要试验器材 |
| 2.2.3 常用试剂配制 |
| 2.3 阳性质粒的扩增和提取 |
| 2.3.1 感受态Stbl3的制备 |
| 2.3.2 阳性质粒转化 |
| 2.3.3 阳性质粒扩增 |
| 2.3.4 中提阳性质粒 |
| 2.4 EGFP-AAV9包装 |
| 2.4.1 AAV-293细胞复苏 |
| 2.4.2 AAV-293细胞传代 |
| 2.4.3 三质粒共转染AAV-293细胞 |
| 2.4.3.1 PEI用量优化 |
| 2.4.3.2 三质粒用量优化 |
| 2.4.4 EGFP-AAV9大量包装及收集 |
| 2.5 EGFP-AAV9纯化 |
| 2.5.1 TFF超滤浓缩培养基中EGFP-AAV9 |
| 2.5.2 PEG8000沉淀EGFP-AAV9 |
| 2.5.3 碘克沙醇超速离心纯化EGFP-AAV9 |
| 2.5.4 缓冲液交换及浓缩 |
| 2.6 结果 |
| 2.6.1 PEI用量优化 |
| 2.6.2 三质粒用量优化 |
| 2.6.3 两种EGFP-AAV9纯化方法比较 |
| 2.7 讨论 |
| 2.8 小结 |
| 第三章 EGFP-AAV9质量鉴定及其体外感染 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 主要试验器材 |
| 3.2.3 常用试剂配制 |
| 3.3 EGFP-AAV9质量鉴定 |
| 3.3.1 SDS-PAGE检测EGFP-AAV9纯度 |
| 3.3.2 qPCR对EGFP-AAV9基因组进行定量 |
| 3.3.3 体外细胞感染 |
| 3.3.3.1 感染293T细胞 |
| 3.3.3.2 感染DF-1和DT40细胞 |
| 3.4 PCR检测293T细胞中EGFP表达 |
| 3.4.1 提取细胞基因组DNA |
| 3.4.2 提取细胞RNA |
| 3.4.3 RNA反转录 |
| 3.4.4 PCR检测EGFP表达 |
| 3.5 WB检测293T细胞中EGFP表达 |
| 3.5.1 提取细胞总蛋白 |
| 3.5.2 SDS-PAGE |
| 3.5.3 WB检测EGFP表达 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 超速离心前EGFP-AAV9质量鉴定结果 |
| 3.6.2 超速离心后EGFP-AAV9质量鉴定结果 |
| 3.6.3 293T细胞EGFP表达结果检测 |
| 3.6.4 TFF-Iodixanol获得的EGFP-AAV9感染DF-1和DT40细胞结果 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录:缩略词中英文全称 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 细胞因子的概述 |
| 1.1.1 细胞因子的功能 |
| 1.1.2 细胞因子的分类 |
| 1.2 IFN-γ的概述 |
| 1.2.1 IFN-γ的发现 |
| 1.2.2 IFN-γ的结构与功能 |
| 1.2.3 IFN-γ与相关疾病的研究 |
| 1.2.4 IFN-γ检测方法的研究进展 |
| 1.3 IL-10的概述 |
| 1.3.1 IL-10的发现 |
| 1.3.2 IL-10的结构与功能 |
| 1.3.3 IL-10与相关疾病的研究 |
| 1.3.4 IL-10检测方法的研究进展 |
| 1.4 细胞因子的制备 |
| 1.4.1 原核表达系统 |
| 1.4.2 真核表达系统 |
| 1.5 细胞因子单克隆抗体的制备 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 IFN-γ和IL-10重组载体的构建与蛋白的表达纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要生物化学试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.1.1 E.coli BL21(DE3)和DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.2.1.2 p ET-32a-IFN-γ重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.1.3 p ET-32a-IFN-γ和p ET-28a质粒的提取 |
| 2.2.1.4 PCR扩增IFN-γ基因 |
| 2.2.1.5 IFN-γ基因和p ET-28a载体的双酶切和胶回收 |
| 2.2.1.6 IFN-γ基因和p ET-28a载体的连接 |
| 2.2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.2.1.8 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.2.1.9 pET-28a-IFN-γ重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.1.10 pET-28a-IL-10 重组质粒鉴定和转化 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.2.1 pET32a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.2.2.2 pET28a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.2.2.3 IFN-γ重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.2.4 IFN-γ重组蛋白的大量表达与纯化 |
| 2.2.2.5 IFN-γ重组蛋白的浓度测定 |
| 2.2.2.6 IFN-γ重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.2.2.7 IL-10重组蛋白的少量表达与可溶性检测 |
| 2.2.2.8 IL-10重组蛋白的大量表达与纯化 |
| 2.2.3 鼠IFN-γ和IL-10单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3.1 小鼠免疫 |
| 2.2.3.2 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.2.3.3 饲养细胞的制备 |
| 2.2.3.4 免疫脾细胞的制备 |
| 2.2.3.5 细胞融合 |
| 2.2.3.6 杂交瘤细胞的阳性筛选 |
| 2.2.3.7 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.2.3.8 杂交瘤细胞株的冻存 |
| 2.2.3.9 杂交瘤细胞株的复苏 |
| 2.2.3.10 单克隆抗体的亚型的鉴定 |
| 2.2.3.11 阳性腹水的制备 |
| 2.2.3.12 单克隆抗体的纯化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组质粒的构建(p ET-28a-IFN-γ) |
| 2.3.1.1 PCR扩增IFN-γ基因 |
| 2.3.1.2 IFN-γ基因和p ET-28a载体的双酶切 |
| 2.3.1.3 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2.1 p ET-32a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.3.2.2 p ET-28a-IFN-γ重组蛋白的少量表达 |
| 2.3.2.3 IFN-γ重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.3.2.4 IFN-γ重组蛋白的大量表达及纯化 |
| 2.3.2.5 IFN-γ重组蛋白的浓度测定 |
| 2.3.2.6 IFN-γ重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3.2.7 IL-10重组蛋白的少量表达与可溶性检测 |
| 2.3.2.8 IL-10重组蛋白大量表达与纯化 |
| 2.3.3 鼠IFN-γ和IL-10单克隆抗体的制备 |
| 2.3.3.1 小鼠免疫 |
| 2.3.3.2 骨髓瘤细胞SP2/0的制备 |
| 2.3.3.3 细胞融合 |
| 2.3.3.4 杂交瘤细胞的阳性筛选 |
| 2.3.3.5 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3.3.6 杂交瘤细胞株的冻存 |
| 2.3.3.7 杂交瘤细胞株的复苏 |
| 2.3.3.8 单克隆抗体的亚型的鉴定 |
| 2.3.3.9 阳性腹水的制备 |
| 2.3.3.10 单克隆抗体的纯化 |
| 2.4 小结 |
| 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）CAV感染诱导chMAB21L1转录水平变化及稳定表达chMAB21L1基因DF-1细胞系建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文常用中英文缩写词 |
| 文献综述 |
| 1 鸡贫血病毒(CAV)的研究进展 |
| 2 MAB21L1基因(蛋白)的研究进展 |
| 3 稳转细胞系的建立方法 |
| 4 小结与展望 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.3 质粒与细胞 |
| 2.4 主要溶液与培养基的配制 |
| 2.4.1 MDCC-MSB1细胞完全培养液 |
| 2.4.2 DF-1及HEK293T细胞完全培养液 |
| 2.4.3 无钙镁离子的PBS缓冲液 |
| 2.4.4 2×HBS缓冲液(20×) |
| 2.4.5 50×TAE电泳缓冲液 |
| 2.4.6 含Amp抗性的LB固体培养基 |
| 2.4.7 转膜缓冲液 |
| 2.4.8 ELISA包被液 |
| 2.4.9 ELISA封闭液/洗涤液 |
| 2.5 主要仪器 |
| 2.6 CAV感染前后MAB21L1基因的转录表达分析 |
| 2.6.1 MDCC-MSB1细胞培养与CAV感染 |
| 2.6.2 细胞总RNA提取与cDNA合成 |
| 2.6.3 感染前后MAB21L1基因时序转录表达水平的检测 |
| 2.7 鸡MAB21L1蛋白的原核表达及其抗体制备 |
| 2.7.1 chMAB21L1基因原核表达重组质粒的构建 |
| 2.7.2 chMAB21L1蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.7.3 鼠抗chMAB21L1多克隆抗体的制备 |
| 2.8 chMAB21L1基因重组慢病毒表达载体的构建 |
| 2.9 chMAB21L1重组慢病毒的包装与鉴定 |
| 2.9.1 细胞培养 |
| 2.9.2 细胞转染与病毒包装 |
| 2.9.3 重组慢病毒的浓缩 |
| 2.9.4 转染细胞与重组慢病毒的鉴定 |
| 2.10 重组慢病毒感染DF-1细胞及其稳转细胞系筛选 |
| 2.11 过表达鸡MAB21L1基因的DF-1稳转细胞系鉴定 |
| 2.11.1 转录水平鉴定 |
| 2.11.2 蛋白水平鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CAV感染前后chMAB21L1基因的时序转录表达水平 |
| 3.2 原核表达重组质粒chMAB21L1的构建与鉴定 |
| 3.3 重组chMAB21L1蛋白的诱导表达与产物纯化 |
| 3.4 鼠抗chMAB21L1多克隆抗体的效价 |
| 3.5 chMAB21L1基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定 |
| 3.6 转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 |
| 3.7 转染细胞中chMAB21L1基因的转录水平 |
| 3.8 转染细胞中融合蛋白EGFP-3Flag-chMAB21L1的表达 |
| 3.9 重组慢病毒液的RT-PCR鉴定 |
| 3.10 重组慢病毒感染DF-1细胞后稳转细胞系的筛选 |
| 3.11 过表达chMAB1L1基因的DF-1稳转细胞系的转录水平鉴定 |
| 3.12 过表达chMAB21L1基因的DF-1稳转细胞系的蛋白水平鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）人巨细胞病毒PP65抗原单克隆抗体及纳米抗体的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 人巨细胞病毒PP65抗原单克隆抗体的制备及免疫组化检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗原制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 小鼠血清抗体效价检测 |
| 2.4 杂交瘤细胞的建立 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.6 单克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.8 PP65 抗原免疫组化检测法的建立 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组PP65 抗原的鉴定 |
| 3.2 重组PP65 抗原的纯化 |
| 3.3 单克隆抗体的制备 |
| 3.4 单克隆抗体特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 抗人巨细胞病毒PP65 抗原新型纳米抗体的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 非免库的淘筛 |
| 2.2 抗PP65 蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 2.3 抗PP65 蛋白特异性纳米抗体的制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗HCMV PP65 蛋白纳米抗体的筛选 |
| 3.2 抗HCMV PP65 蛋白纳米抗体的诱导鉴定 |
| 3.3 抗HCMV PP65 蛋白纳米抗体的表达与纯化 |
| 3.4 纳米抗体与PP65 抗原反应性的初步鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）细胞外猪ISG15夹心ELISA检测方法的建立及外源性猪ISG15对PRRSV复制的调控初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 PRRSV概述 |
| 1.1.1 PRRSV的生物学特性 |
| 1.1.2 PRRSV逃避宿主天然免疫应答机制 |
| 1.2 ISG15蛋白概述 |
| 1.2.1 ISG15的发现 |
| 1.2.2 ISG15在细胞内的作用 |
| 1.2.3 胞外分泌型ISG15作为细胞因子的作用 |
| 1.2.4 ISG15在病毒感染中的作用 |
| 第二章 抗猪ISG15单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验相关菌株 |
| 2.1.2 试验相关试剂、耗材 |
| 2.1.3 试验相关仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪ISG15蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.2 p Cold-SUMO-UBI重组质粒的构建与蛋白的表达纯化 |
| 2.2.3 Balb/c小鼠的免疫及血清抗体效价检测 |
| 2.2.4 细胞融合 |
| 2.2.5 间接ELISA法筛选阳性母克隆 |
| 2.2.6 细胞亚克隆 |
| 2.2.7 腹水的制备与纯化 |
| 2.2.8 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 2.2.9 Western blot检测单抗与免疫原的反应性 |
| 2.2.10 Western blot检测单抗与细胞内源性ISG15 的反应性 |
| 2.2.11 间接免疫荧光法检测单抗与CRL2843细胞的反应性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪ISG15蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2 p Cold-SUMO-UBI的载体构建 |
| 2.3.3 p Cold-SUMO-UBI重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.4 四免后小鼠效价检测 |
| 2.3.5 腹水纯化单克隆抗体 |
| 2.3.6 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 2.3.7 单克隆抗体的免疫印迹分析 |
| 2.3.8 IFA检测猪ISG15 单抗与细胞内源性的反应 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪ISG15 双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 相关抗体 |
| 3.1.2 试验相关试剂、耗材 |
| 3.1.3 试验相关仪器、设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗猪ISG15兔多抗与免疫原的反应性 |
| 3.2.2 抗猪ISG15 兔多抗与CRL2843 细胞的反应性 |
| 3.2.3 抗猪ISG15 双抗夹心ELISA方法的建立 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 兔多抗的免疫印迹分析 |
| 3.3.2 最佳封闭液的确定 |
| 3.3.3 单抗与多抗最佳工作浓度的确定 |
| 3.3.4 一抗最佳孵育时间的确定 |
| 3.3.5 猪ISG15 双抗夹心ELISA检测方法的操作步骤 |
| 3.3.6 标准曲线的绘制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV不同毒株感染PAMs后 ISG15 表达及分泌水平的检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验相关病毒、细胞与抗体 |
| 4.1.2 试验相关试剂、耗材 |
| 4.1.3 试验相关仪器、设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PRRSV增殖与病毒滴度测定 |
| 4.2.2 不同毒株PRRSV感染PAM后 ISG15 m RNA水平的检测 |
| 4.2.3 不同毒株PRRSV感染PAMs上清ISG15水平的检测 |
| 4.2.4 PRRSV感染PAMs上清中干扰素活性检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同毒株PRRSV感染PAMs后 ISG15 m RNA水平的检测 |
| 4.3.2 不同毒株PRRSV感染PAMs后 ISG15蛋白水平的检测 |
| 4.3.3 PRRSV感染PAMs上清中干扰素活性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 重组猪ISG15 蛋白对PRRSV复制的调控作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验相关菌株 |
| 5.1.2 试验相关试剂 |
| 5.1.3 试验相关仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 p Cold-SUMO蛋白的表达与纯化 |
| 5.2.2 重组猪ISG15 蛋白和p Cold-SUMO蛋白的内毒素处理 |
| 5.2.3 重组猪ISG15 蛋白作用于PAMs后 PRRSV感染的抑制作用检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SDS-PAGE分析重组猪ISG15 蛋白和SUMO蛋白去内毒素前后变化 |
| 5.3.2 Western blot检测重组猪ISG15 蛋白作用于PAMs后 PRRSV感染的抑制作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、结核分枝杆菌LAM多克隆抗体的制备 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌LAM动物免疫 |
| 1.1.4 抗体效价测定 |
| 1.1.5 动物心脏采血 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 二、间接ELISA法检测抗体效价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.2 酶联免疫吸附法检测血清抗LAM抗体 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 三、多克隆荧光抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物血清 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 多克隆抗体的纯化 |
| 3.1.4 抗体纯化后的SDS-PAGE验证 |
| 3.1.5 抗体的浓缩与BCA法浓度测定 |
| 3.1.6 抗体的FITC荧光标记 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 抗体的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.2 抗体的浓缩与BCA法浓度测定 |
| 3.2.3 荧光抗体含量及F/P测定 |
| 3.3 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）冠状病毒S蛋白三聚体的表达纯化及与单克隆抗体结合试验的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 冠状病毒概述 |
| 2 猪流行性腹泻病毒研究进展 |
| 2.1 猪流行性腹泻病毒流行情况 |
| 2.2 猪流行性腹泻病毒的基因结构及功能 |
| 2.2.1 S蛋白 |
| 2.2.2 M蛋白 |
| 2.2.3 E蛋白 |
| 2.2.4 N蛋白 |
| 3 猪肠道α冠状病毒研究进展 |
| 3.1 猪肠道α冠状病毒的基因结构与功能 |
| 3.2 猪肠道α冠状病毒的流行情况 |
| 4 新型冠状病毒研究概述 |
| 5 冠状病毒S蛋白三聚体冷冻电镜结构研究进展 |
| 6 研究目的和意义 |
| 7 技术路线 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 PEDV S蛋白三聚体的表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、毒株和质粒 |
| 1.1.2 试剂与溶液配方 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 杆状病毒质粒(Bacmid)的构建 |
| 1.2.2 PEDVS蛋白三聚体的蛋白表达和纯化 |
| 1.2.3 负染电镜 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 杆状病毒重组质粒(Bacmid)的构建和鉴定 |
| 2.2 PEDV S蛋白三聚体的表达、纯化和检测 |
| 2.2.1 P1代重组杆状病毒检测 |
| 2.2.2 PEDV S蛋白三聚体小量蛋白表达纯化及检测 |
| 2.2.3 大量蛋白表达纯化及检测 |
| 2.3 PEDV S蛋白三聚体的负染电镜结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 PEDV S蛋白三聚体交联及负染电镜观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与溶液配方 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 PEDV S蛋白三聚体交联与密度梯度离心 |
| 1.2.2 PEDV S蛋白三聚体负染电镜观察 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PEDV S蛋白三聚体交联与密度梯度离心 |
| 2.2 PEDV S蛋白三聚体负染电镜观察 |
| 3 讨论 |
| 第四章 PEDV S蛋白三聚体与其单克隆抗体的相互作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗体 |
| 1.1.2 试剂与溶液配方 |
| 1.1.3 主要仪器与器材 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 4株PEDV S蛋白鼠单克隆抗体的ELISA鉴定 |
| 1.2.2 4株PEDV S蛋白鼠单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 四株PEDVS蛋白鼠单克隆抗体的ELISA鉴定 |
| 2.2 PEDV S蛋白鼠单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 SeACoV S蛋白三聚体表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞与病毒 |
| 1.1.2 试剂与溶液配方 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 杆状病毒质粒(Bacmid)的构建 |
| 1.2.2 SeACoV S蛋白三聚体的蛋白表达和纯化 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 杆状病毒质粒(Bacmid)的构建和鉴定 |
| 2.2 SeACoV S蛋白三聚体的表达、纯化和检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 SARS-CoV-2 S蛋白三聚体的表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞与毒株 |
| 1.1.2 试剂与溶液配方 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 SARS-CoV-2 S杆状病毒质粒（Bacmid)的构建 |
| 1.2.2 SARS-CoV-2 S蛋白三聚体杆状病毒质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.3 SARS-CoV-2 S蛋白三聚体杆状病毒质粒的表达与纯化 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 杆状病毒质粒(Bacmid)的鉴定 |
| 2.2 SARS-CoV-2 S蛋白三聚体的表达、纯化和检测 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
| 致谢 |
四、单克隆抗体亲和层析法纯化Namalva细胞干扰素（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]禽流感病毒H7亚型C-ELISA抗体检测方法的建立及其初步应用[D]. 王丛丛. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析[D]. 王妍. 西北农林科技大学, 2020
- [4]腺相关病毒EGFP-AAV9纯化及生物学特性研究[D]. 邢青波. 广西大学, 2020(07)
- [5]鼠IFN-γ和IL-10细胞因子的表达及单克隆抗体的制备[D]. 姜涛. 华中农业大学, 2020(02)
- [6]CAV感染诱导chMAB21L1转录水平变化及稳定表达chMAB21L1基因DF-1细胞系建立[D]. 房慧. 安徽农业大学, 2020(03)
- [7]人巨细胞病毒PP65抗原单克隆抗体及纳米抗体的制备[D]. 张淑婷. 山西医科大学, 2020(12)
- [8]细胞外猪ISG15夹心ELISA检测方法的建立及外源性猪ISG15对PRRSV复制的调控初探[D]. 史冰君. 西北农林科技大学, 2020
- [9]抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖荧光抗体的制备[D]. 柏极. 海南医学院, 2020(01)
- [10]冠状病毒S蛋白三聚体的表达纯化及与单克隆抗体结合试验的研究[D]. 许姝雅. 浙江大学, 2020