一、湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究(论文文献综述)
杜阳阳[1](2020)在《宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建》文中研究说明目的1、了解宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染状况,探究高危型人乳头瘤病毒(high risk-HPV,HR-HPV)感染与宫颈细胞病理学特征之间的关系。2、利用人乳头瘤病毒58突变型E6E7(Mutant type E6E7,m E6E7)融合基因为靶点,以对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58m E6E7融合基因的重组病毒,鉴定HPV58m E6E7转化活性,为HPV58型治疗性疫苗研究奠定基础。方法1、收集体检普查女性宫颈脱落细胞,以所提DNA为模板,用HPV L1区通用引物MY09/11,进行PCR扩增,检测宫颈脱落细胞总感染率;利用HPV E6型特异性引物检测宫颈脱落细胞中具体感染型别;统计分析HPV感染与临床病理特征的关系。2、PCR扩增带有50bp Towne开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的Galk、HPV58 E6E7融合基因,采用凝胶回收试剂盒对目的基因片段切胶、回收并纯化。将Galk片段电转至SW102-T-BAC感受态细胞内,使其发生同源重组,通过含有Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得带有Galk的SW102-T-ORF75-GalkBAC克隆,制备其感受态细胞;然后分别将纯化的m E6E7和w E6E7融合基因,电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,通过脱Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得SW102-T-ORF75-HPV58-m E6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-w E6E7-BAC克隆。提取所得克隆质粒DNA,转染到ARPE-19细胞,逆转录PCR及测序分析验证转染细胞HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7表达状况;观察重组病毒T-ORF75-HPV58-m E6E7及T-ORF75-HPV58-w E6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7转化活性。结果1、经PCR扩增,检测到573例标本有HPV感染,HPV总感染率为56.85%。HPV16型的感染率为7.33%;HPV18型的感染率为2.62%;HPV58型的感染率为13.61%。依据年龄进行分组,各年龄段中41~50岁组HPV感染率较高为63.66%。对各年龄组HPV感染状况进行统计学分析显示,其差异具有统计学意义(P<0.05)。根据细胞病理学分期结果,HPV在HSIL组、LSIL组、ASC组、NILM组的阳性率分别是100%、80.15%、51.69%、51.55%,随着病变程度的降低HPV感染率呈现下降的趋势,统计分析其差异具有统计学意义(P<0.05)。且HPV58型在HSIL组的感染率较高为12.50%。2、获得了SW102-Towne-ORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-ORF75-w E6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中m E6E7及w E6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-w E6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,因此出现重叠生长现象,其形态特征出现显着变化,由原来的梭形逐渐转变为圆形,肿胀,伴随着胞浆颗粒增多,并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-TowneORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-BAC及未转染细胞没有出现上述细胞的特点。结论1、所收集标本中HPV总感染率为56.85%,其中所检测型别中HPV58型感染率较高为13.61%。在体检普查41-50岁年龄组感染率较高为63.66%,并且随着宫颈病变严重程度的加重HPV总感染率呈现增高的趋势。因此有必要进行HPV治疗性疫苗的研究。2、获得了T-ORF75-HPV58-m E6E7和T-ORF75-HPV58-w E6E7重组病毒,并且T-ORF75-HPV58-m E6E7转化活性已经消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。图[14]幅;表[5]个;参[86]篇。
胡仁建[2](2020)在《HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用》文中指出背景与目的:宫颈癌是全球妇女癌症中仅次于乳腺癌居第四位的癌症,2018年全球宫颈癌发病人数57万例,死亡人数31.1万。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌的直接病因,其中HPV16型的发病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的关键分子,HPV16 E7蛋白只选择性表达在肿瘤细胞中,随着宫颈上皮内瘤变从CIN1到CIN3进展,HPV16 E7蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高,最终HPV16 E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。细胞学检查(如TCT)联合HR-HPV DNA检测,可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3、宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。目前,人乳头瘤病毒(HPV)的临床检测方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于检测HPV DNA和HPV分型,但不能检测HPV E6、E7致癌蛋白,所以预测HPV阳性癌症如宫颈癌的准确率不高。本研究的目的是针对那些细胞学检测为阴性而HR-HPV的DNA检测阳性的妇女,补充检测HPV16 E7蛋白等,即制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体并建立在蛋白质水平检测HPV16 E7致癌蛋白的化学发光免疫分析方法等,HPV16 E7蛋白的存在提示宫颈有癌细胞的存在,这很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在,具有早期预警宫颈癌的作用。方法:本研究采用基因克隆技术制备HPV16 E7蛋白;用杂交瘤技术制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体;测定和分析抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征,如单抗的配对、单抗的氨基酸序列和亲和力测定、单抗的优势线性B细胞表位的鉴定和保守性分析等;探索抗HPV16 E7蛋白单抗在免疫化学、免疫荧光、Western Blot等方法中定性检测天然的HPV16 E7蛋白的有效性、特异性及初步诊断价值;探索两个新的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体79A11和69E2(79A11作为捕获抗体,69E2作为检测抗体)被用于基于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记检测抗体69E2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的常规双抗夹心ELISA法的检测系统,以及基于标记的链霉亲和素生物素(Labelled Streptavidin-Biotin,LSAB)加鲁米诺的化学发光免疫分析法的检测系统,在ng级水平定量检测宫颈内瘤病变CIN和宫颈癌等患者宫颈脱落细胞或组织中HPV16 E7致癌蛋白的诊断价值。主要结果如下:1.HPV16 E7基因的克隆、鉴定和HPV16 E7蛋白的纯化以CaSki细胞中的总DNA为模板,PCR扩增HPV16 E7基因约322bp,重组质粒pET-28a(+)-HPV16 E7中的HPV16 E7蛋白氨基酸序列与CaSki细胞株中的HPV16 E7蛋白氨基酸在第28位氨基酸上不同(28F和28L),与SiHa细胞株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列完全一致。工程菌pET-28a(+)-HPV16 E7-Rosetta(DE3)pLysS表达的HPV16 E7蛋白的分子量大约为18 kDa,其表达量高、呈可溶性表达以及二级结构为ɑ螺旋,镍柱亲和层析联合DEAE柱纯化,获得纯度大于95%的HPV16 E7蛋白。2.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备HPV16 E7蛋白免疫BALB/c小鼠的后腿足垫和腹腔5次,细胞融合前的免疫BALB/c小鼠血清的效价在1:1280001:256000。小鼠腹股沟淋巴结细胞和脾脏细胞分别与SP2/0-Ag14融合后的融合率均为100%。淋巴结细胞来源的效价高的单克隆抗体的亚型主要为IgG2a,包括69E2、69B10、54D5、54F4、54G5,其中的69A6为IgM;脾脏细胞来源的3株效价高的单克隆抗体亚型以IgM为主,以单抗79A11为代表。用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2的纯度高达95%以上,69E2的抗体效价最高(0.19ng);用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗79A11的纯度高达95%以上,单抗79A11的效价较高,大约6.25ng。3.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征8株单抗79A11,69E2,69A6,54D5,54F4,54G5,74F3和72E6通过Western blot方法与一个含有组氨酸标签的人c-Myc(HIS-c-Myc)反应,都没有出现曝光条带,排除这8株单抗与组氨酸标签反应的假阳性。这8株单抗配对56对,出现比较强的阳性信号的单抗对有4对:79A11与69E2、79A11与69A6、79A11与74F3、79A11与54D5。单抗79A11适合作为捕获抗体,单抗69E2、69A6、54D5、74F3适合做检测抗体。测定配对信号强的两对单抗共3个单抗79A11、69E2、69A6是3个新的互相不同的抗HPV16 E7蛋白的单抗,两个单抗79A11与69E2的重链和轻链氨基酸序列的差别都很大。单抗69E2与HPV16 E7蛋白之间的亲和力较高(5.60E-9M),因为单抗79A11与HPV16 E7蛋白之间结合后被高盐洗脱下来,所以单抗79A11被认为与HPV16 E7蛋白之间没有特异性结合。3个单抗79A11、69E2和69A6的特异性表位均是外露、不连续和位置邻近的3个肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97,都是构象性表位。3株单抗79A11、69E2和69A6的3个外露的特异性表位肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97的氨基酸序列与从NCBI中下载的30株HPV16毒株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列的同源性很高。关于3株单抗79A11、69E2和69A6的优势线性B细胞表位不同点有2个:第一是重叠肽的间接ELISA法结果显示单抗69E2与HPV16 E785-98的反应有较强的信号(p<0.01),而2株单抗79A11和69A6与HPV16 E785-98的反应没有阳性的信号;第二是重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA的结果不同,3株单抗79A11、69E2和69A6抑制重叠肽HPV16 E749-66的抑制率依次为40.66%、94.28%和16.28%。这两个不同点提示这3株单抗的优势线性B细胞表位存在差异。4.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用8株单抗79A11、69E2、69A6、54D5、54F4、54G5、74F3和72E6在低至7.8125 ng时与CaSki细胞进行免疫细胞化学反应,均出现棕黄色颗粒,而与HeLa细胞反应,不出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6分别在0.895μg/片、5μg/片和1.84μg/片与HPV16阳性的宫颈癌组织进行免疫组织化学反应,都出现典型的棕黄色颗粒,与HPV18阳性的宫颈癌组织反应,都没有出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6都在1μg/ml与CaSki细胞进行免疫荧光反应,均出现绿色荧光,而与HeLa细胞反应,不出现绿色荧光。3株单抗79A11、69E2和69A6与CaSki细胞的总蛋白进行Western Blot反应,在18kDa处出现典型的曝光条带,而与HeLa细胞的总蛋白反应,没有出现典型的曝光条带。5.单抗79A11和69E2在基于HRP-69E2和TMB的常规双抗夹心ELISA检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用常规双抗夹心ELISA的优化条件为:捕获抗体79A11的最佳包被浓度是2μg/mL,检测抗体HRP-69E2的最佳工作浓度是1μg/mL,5%脱脂乳封闭2 h的本底低和信号强。双抗夹心ELISA结果显示当抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法(0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔)稀释时,制备的直线拟合的参考曲线的决定系数R2=0.9723。以抗原HPV16 E7蛋白在0和变异系数CV低于10%的低浓度25ng含量为横坐标,对应的OD值为纵坐标,获得计算检测限的方程为Y=0.01122*X+0.6896和决定系数R2值=0.9889,以信噪比S/N=3的高标准确定检测下限的OD450nm=3*0.6896=2.0688,检测限=(2.0688-0.6896)/0.01122=122.9234ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限122.9234ng,所以需要探索灵敏度更高的检测系统。6.单抗79A11和69E2在基于LSAB加鲁米诺的化学发光免疫分析法检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用化学发光免疫分析方法的优化条件如下:捕获抗体79A11的包被浓度是2 ug/mL,0.25%BSA封闭液封闭2 h,抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法(0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔)稀释与捕获抗体在37℃反应2 h,检测抗体Biotin-69E2和HRP-Streptavidin的工作浓度都为1 ug/mL,鲁米诺反应10 min等。以优化条件制备参考曲线,其直线拟合的回归方程为Y=53.35*X+10294,直线拟合和双对数拟合的决定系数R2依次为0.9666和0.956;以抗原HPV16 E7蛋白在0和低浓度25 ng的含量为横坐标,对应的相对光度(relative light units,RLU)值为纵坐标,获得计算检测限的回归方程Y=363.1*X+3441,R2=0.9823,信噪比S/N=3的RLU=3*3441=10324,检测限=(10324-3441)/363.1=18.9562ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限18.9562ng,与常规双抗夹心ELISA法定量检测HPV16 E7癌蛋白的定量限122.9234 ng相比,灵敏度提高6.48倍。将标本的RLU值带入方程Y=53.35*X+10294,结果显示4个正常宫颈组织和4例HPV52阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量都小于定量下限18.9562 ng;12例HPV16阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量波动在102.1743438.2473 ng,与正常组织和HPV52阳性宫颈癌组织中的HPV16 E7蛋白含量相比有显着差异(p<0.01)。结论:本研究制备了分子量大约18 kDa、呈可溶性表达、二级结构为ɑ螺旋的HPV16 E7蛋白,获得两株新的不同的抗HPV16 E7蛋白的代表单抗79A11(IgM)和69E29(IgG2a),单抗79A11和69E2的特异性表位都是构象性表位,分别位于HPV16 E7蛋白二聚体的两个单体上。单抗79A11和69E2在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中定性检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在诊断价值。单抗79A11和69E2被应用于基于LSAB-鲁米诺-双抗夹心ELISA的化学发光免疫分析法中,定量检测HPV16 E7蛋白的定量限为18.9562 ng,该化学发光免疫分析法检测12例HPV16阳性的宫颈癌组织中HPV16 E7蛋白的检出率在100%,表明单抗79A11和69E2在化学发光免疫分析法定量检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在的诊断价值。
王致萍[3](2019)在《人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选》文中研究说明人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达31.1万例。目前宫颈癌的治疗手段有限,手术切除对人体伤害较大且有复发的风险,因此,开展HPV治疗性疫苗的研究刻不容缓。癌蛋白HPV E6和E7在肿瘤发生发展进程中起关键作用,被认为是干预和治疗的关键靶分子,因此对癌蛋白E6和E7的结构和功能展开深入的研究具有十分重要的意义。本研究分别利用原核表达系统和真核表达系统等多途径对HPV E6和E7蛋白的上清可溶性表达进行了探索,最终在pTO-T7载体上取得突破,经过密码子优化、表达菌株、洗脱条件和储存缓冲液等条件的探索和优化,克服了癌蛋白E7在原核表达系统中易聚集沉淀的难题,建立了一套稳定的表达纯化体系,获得了纯度90%以上、均一性和稳定性均良好的HPV18 E7蛋白,并对其展开了单克隆抗体的筛选,共获得55株与HPV18 E7蛋白具有良好反应性的单抗细胞株。本研究进一步对其中26株反应性优良的单抗细胞株展开抗体纯化和性质鉴定工作,包括抗体亚型、抗原抗体反应性、线性及构象和型特异性等。建立了HPV18 E7单抗盘,并且获得了1株反应性良好的型特异性构象抗体9A5、6株反应性良好的型特异性线性抗体(2E8、14E5、17F2、17F3、8A7、5C5、18E7和3B5)、1株反应性较弱的型特异性构象抗体(18E6)、6株两型交叉抗体(1A12、4A10、8E6、17A3、14A6和11E8)和1F6这株六型交叉线性抗体。综上,本研究建立了HPV18致癌蛋白E7可溶性表达和纯化体系,获得了高纯度且性质稳定的HPV18 E7蛋白并建立了单抗盘,为后续开展HPV18 E7蛋白结构解析、功能研究和治疗性疫苗或药物开发奠定了坚实的基础。
马春华[4](2015)在《高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究》文中进行了进一步梳理目的:评价高危型HPV基因型检测在宫颈癌筛查中的可行性及应用价值。P16/Ki-67细胞学双染在HPV阳性、宫颈不同病变脱落细胞中的表达和意义。探讨新疆地区感染HPV16变异体谱系分布及E6、E7、LCR基因突变研究,分析HPV16变异体在宫颈癌及癌前病变发生发展中的作用。方法:应用高危型HPV基因检测系统,对2014年09月2015年8月在新疆自治区人民医院住院及门诊就诊行HC2、TCT检测、并有病理结果的564位女性的宫颈细胞标本进行HPV基因型检测,对其中59例HC2阳性患者的液基细胞学涂片用免疫细胞化学法检测P16/Ki-67蛋白在宫颈脱落细胞中的表达。对HPV16阳性的宫颈癌及癌前病变患者,提取基因组DNA,利用PCR扩增HPV16 DNA E6、E7基因及LCR区核苷酸片段,正反向测序。与HPV16基因序列分析比对,确定HPV16谱系分布,分析核苷酸突变位点。结果:(1)高危型HPV基因型检测在诊断CIN2+病变时优于HC2、TCT、Hybr Miax分型检测,差异具有统计学意义(P<0.05),不同液基细胞学分级及组织病理分级中HR-HPV感染率不同,差异具有统计学意义(P<0.05),随细胞学及病理学诊断级别升高,HR-HPV感染率上升(P<0.05),HPV16型感染率上升(P<0.05)。各级别宫颈病变以HPV16型及合并HPV16型感染为主,HP16型分布在维吾尔族和汉族妇女之间无统计学差异(P>0.05)。各年龄段高危型HPV的构成比无统计学差异(P>0.05)。高危型HPV基因型检测对ASCUS分流优于HC2。(2)P16/Ki-67细胞学双染检测诊断CIN2+病变时具有高灵敏度(92%)和总符合率(78%),P16/Ki-67细胞学双染检测与组织病理学结果符合率较一致(Kappa=0.569,P<0.05),在对ASCUS/ASC-H进行P16/Ki-67细胞学双染检测更能发现宫颈高级别病变(P<0.05),不同宫颈病变P16/Ki-67细胞学双染检测阳性率:炎症39.13%(9/23)CIN1 20%(2/10),CIN2-3 91.30%(21/23),宫颈癌100%(2/2)差异具有统计学意义(P<0.05),随病变程度的加重,P16/Ki-67细胞学双染阳性率呈上升的趋势。(3)E6基因突变率为80.00%(92/115)主要突变位点T350G(58.78%),T178G(18.47%),E7突变率为54.78%(63/115)主要突变位点A647G(33.33%),T846C(26.98%),LCR突变率为23.48%(27/115),主要突变位点为C24T(74.07%),C13T(25.92%)。维吾尔族妇女与汉族妇女之间比较,维吾尔族T350G突变率显着高于汉族,汉族A647G、T846C、C24T突变率显着高于维吾尔族,差异具有统计学意义(P<0.05)。维吾尔族宫颈癌组T350G突变率显着高于炎症组(P<0.05),且随病变严重程度增加突变率上升,汉族T350G、A647G、T846C、C24T突变率炎症组、宫颈病变组显着高于宫颈癌组(P<0.05),维吾尔族C24T突变率炎症组显着高于宫颈癌组(P<0.05),差异均具有统计学意义(P<0.05)。新疆汉族人中感染的HPV16主要为亚洲型,新疆维吾尔族感染的HPV16主要为欧洲型。结论:高危型HPV感染是宫颈癌前病变和宫颈癌的主要致病因素;宫颈各级别病变中以HPV16型及合并HPV16型感染为主;随细胞学及病理学诊断级别升高HR-HPV感染率上升;高危型HPV基因型检测对ASCUS诊断分流优于HC2。P16/Ki-67细胞学双染阳性率随着宫颈病变程度加重呈上升趋势;P16/Ki-67细胞学双染检测可以有效对ASCUS及HPV阳性者进行诊断分流,具有临床应用价值。HPV16E6、E7突变可能与宫颈病变进展有关,T350G突变可能是维吾尔族宫颈癌高发的原因之一;新疆汉族人中感染的HPV16型主要为亚洲型,新疆维吾尔族感染的HPV16型主要为欧洲型。
贾超颖[5](2015)在《稳定表达人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6E7融合基因的人C33A宫颈癌细胞株的构建及验证》文中指出目的:将含靶向人HPV58E6E7融合基因(E6E7 fusion gene)的慢病毒转染人宫颈癌细胞C33A,构建稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞系,并通过体外及体内实验验证其稳定表达。方法:将已构建成功的HPV58E6E7融合基因通过慢病毒介导法转染入人宫颈癌C33A细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆。利用荧光定量PCR、Western-blot等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的C33A细胞株中的表达。将稳定转染HPV58E6E7融合基因的C33A细胞接种于裸鼠左腋下成瘤,用荧光定量PCR、Western blot对瘤组织中HPV58E6E7融合基因的表达进行验证。并予行MTT及流式细胞仪检测细胞周期以了解转染后细胞的生长情况。结果:将构建好的LV-HPV58E6E7融合基因转染C33A细胞并筛选出强荧光的细胞株后,荧光定量PCR显示:HPV58E6E7融合基因在转染HPV58E6E7融合基因组中病毒负载量为0.95,在转染空载组及对照组中均为0,Western-blot检测可见转染HPV58E6E7融合基因组有带His-tag的融合蛋白表达,其他两组则未见。细胞MTT试验提示:转染HPV58E6E7融合基因组的C33A细胞生长速度明显快于转染空载组及对照组(P<0.05);细胞周期试验提示:转染HPV58E6E7融合基因组C33A细胞的G1期细胞数为42.16±1.63,明显低于转染空载组(54.09±2.75 P<0.05)及其C33A组(54.09±2.83,P<0.05);G2期细胞数为23.33± 1.63,明显高于转染空载组(16.59±3.18,P<0.05)及其 C33A 组(17.71±1.48,P<0.05);S 期细胞数为34.51 ±2.01,明显高于转染空载组(25.89±3.07,P<0.05)及其C33A组(27.18±2.22,P<0.05)。将构建完成并经过验证的带HPV58E6E7融合基因的C33A细胞及对照组细胞分别皮下注射于12只裸鼠左腋下皮肤,21天后发现均长出最大径约1cm左右瘤组织,活体成像仪照相可见转染有慢病毒载体细胞成瘤的两组均可见绿色荧光蛋白,C33A组则未见;取每组3个瘤组织进行荧光定量PCR显示:HPV58E6E7融合基因在转染HPV58E6E7融合基因组裸鼠瘤组织中病毒负载量分别为为0.90,0.90,0.92,其余两组病毒负载量均为0,Western-blot检测可见转染HPV58E6E7融合基因组裸鼠瘤组织中有带His-tag的融合蛋白表达,其他两组则未见。结论:成功构建了能够稳定转染HPV58E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞株,并可在体外、体内稳定表达。
徐建华[6](2013)在《SOCS1沉默的DCs疫苗及DCs-CIKs对宫颈癌的治疗研究》文中研究表明背景:宫颈癌是世界上女性发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤,高危型人乳头瘤病毒(High risk HPV,HR-HPV)持续性感染是宫颈癌主要原因,其中HPV16感染占所有宫颈癌病例50%以上。在我国,宫颈癌发病率呈上升趋势和发病年龄呈年轻化趋势。目前对宫颈癌治疗还局限于手术、放化疗,这些方法能够清除受损组织,同时也残留已被HPV感染的细胞,因而常常导致复发,甚至转移。已上市的宫颈癌预防性疫苗被证明对宫颈癌和已被HPV感染的患者没有治疗作用。因此,研究治疗宫颈癌药物和治疗性疫苗非常迫切和必要。在HPV致病基因中,HPVE6和E7分别与细胞内抑癌因子p53和pRb相互作用,在细胞周期调控及凋亡调节中起重要干扰作用,导致细胞永生化和转化,并且E6和E7表达是维持宫颈癌必需,常被视为HPV感染相关的肿瘤相关性抗原。此外,E7还影响宿主对感染的耐受和免疫功能,与宿主蛋白同源性小,因而常被研究者作为宫颈癌重要的治疗药物作用和疫苗设计的靶点。包括宫颈癌在内的肿瘤免疫治疗被视为继手术、放疗和化疗之后的治疗肿瘤的一种重要方法。树突状细胞(DCs)作为体内最有效的专职抗原递呈细胞,在先天性免疫和获得性免疫中起中心作用。成熟DCs高表达的MHC分子与肿瘤抗原结合后,递呈给CD4+T细胞,使之活化并发挥抗瘤效应,或递呈给CD8+T细胞以产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞,发挥抗瘤效应。目前已经有多种DCs相关生物治疗方案用于疾病治疗,并取得了一定效果,如2010年被FDA批准治疗难治性前列腺癌的DCs疫苗---sipuleucel-T(也称为APC8015)。但DCs疫苗真正引起临床反应的不多见,主要原因是机体处于对肿瘤的免疫耐受。细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)是一类由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负调节因子。SOCS1参与了经典的JAK/STAT,TLR等信号通路的调节,并在DCs和T细胞的成熟和分化起重要作用。同时,SOCS1还能够调节IFN-Y、IL-4、IL-12、和IL-15等细胞因子的分泌。研究表明,SOCS1沉默可以消除DCs自身耐受和自身免疫性病理反应,对以DCs为基础的抗肿瘤疫苗研究具有重大意义。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIKs)对肿瘤的治疗是近年来用于临床肿瘤治疗的辅助治疗,由于其在体外细胞因子IFN-γ、IL-2和抗CD3抗体的作用下易扩增、具有非限制的T细胞和NK细胞的特征,对肿瘤具有杀伤作用且无毒性,适合同种和自身的免疫细胞治疗。此外,DCs激活后与CIKs共培养能加强CIKs对肿瘤细胞的杀伤和肿瘤的治疗,但其机制尚未完全明了。目的:本课题旨在研究以去HPV16E7转化活性的重组mE7为特异性宫颈癌肿瘤相关抗原,作为天然免疫抑制因子的抑制子---沉默SOCS1的DCs疫苗和DCs-CIKs强化对宫颈癌模型的免疫治疗。方法:本课题采用定点突变的方法突变HPV16E7转化活性相关位点,然后克隆被突变的 HPV16E7,即 HPV16mE7,构建重组质粒 pET-28a-HPV16mE7,转化 B121(DE3)后在0.5μmol/L IPTG诱导下高表达,采用Ni2+树脂层析柱对表达的mE7进行纯化,用Western Blot分析突变的HPV16E7,对mE7进行鉴定,以及分析对其抗原性的影响。用淋巴细胞分层液从人的外周血或小鼠骨髓分离单核细胞,在细胞因子GM-CSF和IL-4的诱导下,体外培养DCs细胞,用光学显微镜观察细胞的形态和流式细胞仪分析DCs特异表达的表面分子,以及在脂多糖(LPS)刺激下,用流式细胞仪分析对DCs成熟的影响。CIKs的培养采用人外周血或小鼠脾细胞分离单个核细胞,在细胞因子IFN-γ、IL-1α、IL-2和抗CD3抗体的诱导下培养,用流式细胞仪分析其表型,如CD3、CD4、CD8和CD56。为了研究DCs细胞疫苗和DCs-CIKs对宫颈癌的治疗效果,我们采用组成表达HPV16E6E7的TC-1接种C57BL/6小鼠制备宫颈癌的动物模型。本研究还利用复制缺陷型腺病毒载体构建重组腺病毒Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCSl(SOCS1的突变体),对重组的腺病毒载体用PCR和测序鉴定,鉴定正确的重组病毒载体用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染293T细胞,收获的重组腺病毒用腺病毒纯化试剂盒纯化,计算病毒滴度后,感染小鼠B16和DCs细胞,用Western Blot和定量RT-PCR分析重组腺病毒对SOCS1基因的沉默。我们先用HPV16mE7脉冲培养DCs细胞后,与CIKs细胞共培养,用乳酸脱氢酶释放实验检测其对宫颈癌细胞TC-1的杀伤作用、CTL反应,用ELISA检测细胞因子IFN-γ,用HPV16mE7脉冲的DCs-CIKs(106)治疗接种TC-1荷瘤小鼠,检测其肿瘤的体积大小和小鼠存活情况。接下来,我们用感染复数为50的重组腺病毒感染培养的DCs,使SOCS1沉默,并用流式细胞仪检测对DCs表面分子,如CD40、CD80、CD83和CD86表达的改变,再用HPV16mE7脉冲沉默的DCs,在LPS刺激下成熟,用DCs疫苗免疫小鼠,用释放实验检测CTL反应,用ELISA检测IFN-γ水平。再用动物模型研究DCs疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用和肿瘤细胞对已免疫小鼠的攻击作用。为了研究DCs加强CIKs特异杀伤的机制,用SOCS1沉默和HPV16E7.49-57表位肽脉冲的DCs后,用流式细胞分析仪检测表面分子CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-I表达水平,用ELISA分析上述处理的共培养上清液的细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-1 β,在DCs-CIKs共培养液中加入抗IL-12抗体,用释放实验检测对TC-1的杀伤活性。采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,不同感染分组与刺激分组,或不同感染分组与比率分组采用两因素析因统计方法进行分析,如存在交互作用,利用单因素方差分析(one-way ANOVA)进一步分析其单独效应,当P<0.05,差异具有统计学意义。结果:DNA测序分析表明与HPV16E7转化活性相关的位点突变成功,重组质粒pET-28a-HPV16mE7双酶切和DNA测序证明成功构建了重组质粒,用SDS-PAGE、Western Blot和ELISA分析证明了我们构建的质粒在B121(DE3)能表达,突变的HPV16E7的免疫原性没有受到影响。流式细胞仪对培养的DCs和CIKs分析证明了用细胞因子能够在体外扩增获得DCs和CIKs细胞。DNA测序和PCR检测所构建的Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCS1正确,重组腺病毒感染小鼠和DCs细胞,能抑制SOCS1的表达,且与感染的剂量有关。ELISA试剂盒检测在LPS的刺激下HPV16mE7脉冲的DCs感染Ad-shRNA-SOCS1后各种细胞因子如IL-6、IL-12、TNF-α的水平情况,同时刺激分组以未用LPS为对照,感染分组以PBS、Ad-shRNA-mSOCS1为对照。在不同刺激和不同感染条件下,两因素析因分析结果显示:(1)不同感染条件下(PBS、Ad-shRNA-mSOCS1、Ad-shRNA-SOCS1),IL-6、IL-12和TNF-α水平差异具有显着统计学意义(IL-6:F感染分组=176.367,P<0.01;IL-12:F感染分组=2979.755,P<0.01;TNF-α:F感染分组=7382.292,P<0.01)。(2)不同刺激条件下(NoLPS和LPS),IL-6、IL-12和TNF-α水平差异具有显着统计学意义(IL-6:F刺激分组=483.471,P<0.01;IL-12:F刺激分组=14162.505,P<0.01;TNF-α:F刺激分组=13260.004,P<0.01)。(3)不同感染和刺激条件下具有交互作用,在LPS刺激和Ad-shRNA-SOCS1感染条件下,IL-6、IL-12和TNF-α水平最高(IL-6:F感染*刺激=203.101,P<0.01;IL-12:F感染*刺激=3176.630,P<0.01;TNF-α:F感染*刺激=6861.513,P<0.01)。进一步分析各因素的单独效应,结果如下:(1)IL-12:PBS,Ad-shRNA-mSOCS1 与 Ad-shRNA-SOCS1 三者之间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05);(2)IL-6:PBS 与 Ad-shRNA-mSOCS1 比较P= 1.83,P>0.05,差异无统计学意义,PBS与Ad-shRNA-SOCS1比较P=260.29,P<0.05差异有统计学意义,Ad-shRNA-SOCS1 与 Ad-shRNA-mSOCS1 比较 F =277.83,P<0.05差异有统计学意义。(3)TNF-α:PBS与Ad-shRNA-mSOCS1比较F =0.83,P>0.05,差异无统计学意义,PBS 与 Ad-shRNA-SOCS1 比较F=260.29,P<0.05,差异有统计学意义,Ad-shRNA-SOCS1与Ad-shRNA-mSOCS1比较P=277.83,P<0.05,差异有统计学意义。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,CTL反应结果:(1)不同感染条件下[DCs、DCs-Ad-shRNA-mSOCS1(E7.49-57)、DCs-Ad-shRNA-SOCS1(E7.49-57)、DCs-Ad-shRNA-SOCS1(HPV16mE7)],CTL 反应效果不同,差异具有显着统计学意义(F感染分组=182.906,P<0.01);(2)不同比率条件下(10:1、50:1、100:1),CTL反应效果不同,差异具有显着统计学意义(F比率分组=787.213,P<0.01);(3)不同感染和比率条件具有交互作用(F感染*比率=203.101,P<0.01),在 DCs-Ad-shRNA-SOCS1(HPV16mE7)感染和 100:1 比率条件下,CTL反应效果最好。进一步分析各因素的单独效应:(1)10:1比例:DCs-Ad-shRNA-SOCS1(HPV16mE7)与其他各组比较,P<0.05,差异有统计学意义;其他各组比较,P>0.05,差异无统计学意义;(2)50:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义;(3)100:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,上清液中IFN-γ水平:(1)不同感染条件下(PBS、DCs、DCs-Ad-shRNA-mSOCS1、DCs-Ad-shRNA-SOCS1),IFN-γ水平差异具有显着统计学意义(F感染分组=475.139,P<0.01);(2)不同比率条件下(10:1、40:1、100:1),IFN-γ水平差异具有显着统计学意义(F感染分组=333.168,P<0.01);(3)不同感染和比率条件具有交互作用(F感染*比率=32.236,P<0.01),在 DCs-Ad-shRNA-SOCS1 感染和 100:1 比率条件下,IFN-γ水平最高。进一步分析各因素的单独效应:(1)10:1比例:DCs与DCs-Ad-shRNA-mSOCS1比较,P>0.05,差异无统计学意义,其他组比较P<0.05,差异有统计学意义;(2)40:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义;(3)100:1比例:各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。不同DCs疫苗治疗肿瘤的效果显示,PBS对照组小鼠肿瘤生长较快,而DCs-Ad-shRNA-mSOCS1组和DCs-Ad-shRNA-SOCS1实验组可有效抑制肿瘤生长,且DCs-Ad-shRNA-SOCS1的作用更明显,显示良好的肿瘤治疗效果,同时没有观察到明显毒副作用。siSOCS1沉默后的DCs细胞在LPS刺激(siSOCS1 DCs + LPS)作用下,CD40,CD83,CD80,CD86和MHC-I分子的表达水平与对照组(DCs、siSOCS1 + DCs、simSOCS1DCs+LPS)比较,具有一定程度的升高。SOCS1沉默后的DCs对CIKs的影响研究中,两因素析因分析在不同感染和刺激条件下,共培养上清液中IL-6,IL-12p40,IL-12p70和IL-1 β水平:(1)不同感染条件下(空白DCs、Ad-shRNA-mSOCS1、Ad-shRNA-SOCS1),IL-6、IL-12p40、IL-12(?)和IL-1β水平差异具有显着统计学意义(IL-6:F感染分组=1223.158,P<0.01;IL-12p40:F感染分组=1894.263,P<0.01;IL-12p70:F感染分组=3881.274,P<0.01;IL-1β:F感染分组=3528.552,P<0.01);(2)不同刺激条件下(PBS、LPS、CpG、PolyI:C),IL-6 IL-12p40,IL-12p70和IL-1 β水平差异具有显着统计学意义(IL-6:F刺激分组=313.500,P<0.01;IL-12p40:F刺激分组=348.197,P<0.01;IL-12p70:F刺激分组=796.722,P<0.01;IL-1β:F刺激分组=804.453,P<0.01)。不同刺激和感染条件具有交互作用,在LPS刺激和Ad-shRNA-SOCS1感染条件下,IL-6、IL-12p40、IL-12p70 和 IL-1β水平最高(IL-6:F刺激*感染=176.003,P<0.01;IL-12p40:F刺激*感染=188.454,P<0.01;IL-12p70:F刺激*感染=612.579,P<0.01;IL-1 β:F刺激*感染=502.899,P<0.01)。进一步分析各因素的单独效应:(1)空白PBS刺激组:空白 DCs、Ad-sh-SOCS1 及 Ad-sh-mSOCS1 感染后各上清液中 IL-6,IL-12p40、IL-12p70和IL-1β水平变化不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)Ad-sh-SOCS1 感染后,经 LPS、CpG 和 PolyI:C 刺激,与空白 DCs、Ad-sh-mSOCS1感染后比较,上清液中的IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-1β水平明显升高,差异具有显着统计学意义(P<0.01)。(3)空白DCs和Ad-sh-mSOCS1感染后经 LPS、CpG和 PolyI:C 刺激,上清中的 IL-6、IL-12p40、IL-12p70 和 IL-1β维持低浓度水平,与PBS组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。两因素析因分析在不同感染和比率条件下,DCs-CIKs对TC-1的裂解效应:(1)不同感染条件下[DCs+CIKs、siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs+anti-IL-12、msiSOCSI DCs+E7.49-57 +CIKs、siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs],CTL 反应效果不同,差异具有显着统计学意义(F感染分组=39.369,P<).01);(2)不同比率条件下(11:1、33:1、50:1),CTL反应效果不同,差异具有显着统计学意义(F比率分组=36.567,P<0.01);(3)不同感染和比率条件具有交互作用(F感染*比率=3.235,P<0.05),在siSOCS1 DCs+E7.49-57+CIKs感染和50:1比率条件下,CTL反应效果最好。进一步分析各因素的单独效应:(1)10:1比例:DCs+CIKs与其他三组比较P<0.05,差异有统计学意义;其他各组间比较,P>0.05,差异无统计学意义;(2)33:1 比例:msiSOCS1 DCs +E7.49-57 +CIKs 与 siSOCS1 DCs +E7.49-57+CIKs+anti-IL-12比较,P>0.05,差异无统计学意义;其他各组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。(3)50:1比例:siSOCS1 DCs+7.49-54+CIKs与其他三组比较,P<0.01,差异有统计学意义;其他各组比较,P>0.05,差异无统计学意义。DCs-CIKs共培养时抗IL-12抗体能减弱CIKs对TC-1的杀伤活性。结论:1.在本研究中,我们采用健康人静脉血和小鼠骨髓,在细胞因子GM-CSF和IL-4诱导下成功培养了 DCs,在刺激剂LPS作用下,DCs从不成熟转变成成熟的表型。PBMCs和小鼠脾细胞在IFN-γ、IL-1 α、IL-2和抗CD3抗体诱导下形成CIKs的异质的细胞群体,包括CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+等。2.我们用组成式表达HPV16E6E7的小鼠TC-1(2×106)接种C57BL/C小鼠的皮下,成功制备宫颈癌的动物模型。3.我们成功构建了能在原核生物E:coli表达的HPV16mE7重组质粒,表达的mE7仍保留了 HPV16E7的免疫原性,可以作为疫苗抗原。4.成功构建重组腺病毒Ad-sh-SOCS1和Ad-sh-mSOCS1,证明了它们能够感染B16和DCs,并能沉默SOCS1。Ad-sh-SOCS1沉默和mE7脉冲的DCs疫苗对接种的TC-1细胞具有显着抑制作用,表明SOCS1沉默能强化DCs疫苗的抗肿瘤免疫效果。Ad-sh-SOCS1重组腺病毒也可以用于抗肿瘤治疗和抗病毒作用。5.炎症细胞因子IL-12在SOCS1沉默的DCs和CIKs的相互作用中起重要作用,是SOCS1沉默DCs加强CIKs的杀伤活性重要机制。
刘红[7](2008)在《广东分离株HPV16L1基因克隆及其蛋白的分泌表达》文中提出【目的】①克隆广东地区人乳头瘤病毒(HPV)16型L1基因并分析其结构特点;构建广东分离株HPV16 L1毕赤酵母分泌型表达载体。②按照毕赤酵母密码子使用偏好,优化广东分离株HPV16 L1基因并对其在毕赤酵母细胞中的表达进行研究。【方法】①采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV16L1基因,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαC,测序并进行序列分析。②根据毕赤酵母密码子使用偏好对广东分离株HPV16L1基因进行密码子优化并测序鉴定。③分别将毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16L1及经过密码子优化的毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1m电转化入毕赤酵母GS115并进行表型筛选和Zeocin抗性筛选;对整合了目的基因的重组酵母表达菌株进行PCR鉴定。④以0.5%(v/v)甲醇诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白的表达。【结果】①成功扩增了广东地区HPV16L1基因,广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株相比有16处不同,同源性为98.99%,其编码的氨基酸序列有8处发生改变;与中国标准株比较有9处不同,同源性为99.18%,其编码的氨基酸序列有4处发生变化。②广东分离株HPV16 L1基因蛋白疏水性及抗原决定簇预测结果与德国标准株相比较存在差异。③对广东分离株HPV16 L1基因进行了密码子优化,经过测序鉴定,确认12个碱基位点全部优化成功。④成功构建了经密码子优化HPV16L1基因的毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1m。⑤广东分离株HPV16 L1蛋白的酵母表达:a.在30℃条件下,以0.5%(v/v)甲醇分别诱导工程菌GS115/pPICZαC-HPV16L1,GS115/pPICZαC-HPV16 L1m。发酵上清经SDS-PAGE电泳检测显示,上清中均有特异蛋白表达;HPV16 L1基因经过密码子优化的工程菌GS115/pPICZαC-HPV16 L1m目的蛋白表达量要高于HPV16L1基因未经过优化的工程菌GS115/pPICZαC-HPV16 L1。b.诱导条件的优化:在30℃条件下,甲醇0.5%(v/v)诱导工程菌GS115/pPICZαC-HPV16 L1m72小时,目的蛋白HPV16L1的表达量可达到最大值,为107mg/L。【结论】①广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株、中国标准株相比较均存在差异。②成功构建了经密码子优化HPV16L1基因的毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1m。③目的蛋白HPV16L1在毕赤酵母菌中成功表达。经过密码子优化的工程菌GS115/pPICZαC-HPV16 L1m目的蛋白表达量要高于工程菌GS115/pPICZαC-HPV16L1。
曾莉[8](2007)在《广东地区人乳头瘤病毒的分子流行病学研究》文中指出宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,居女性生殖系统恶性肿瘤的第一位。流行病学资料显示,人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤和宫颈癌发生的主要原因。HPV依据其基因组核酸序列的变异分为不同的型。不同型是指病毒的DNA与其他任何已知的HPV的L1、E6和E7开放阅读框的DNA序列同源性小于90%;同源性达到90%-98%者为亚型;同源性大于98%者为型内变异株。已证实不同的HPV型别具有不同的致病能力。根据HPV亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为低危型和高危型两大类。不同地区HPV的人群感染率不同,所携带的型别不同,与宫颈癌相关的型别也不尽相同。因此了解广东地区HPV的流行状况和型别分布将有助于本地区HPV感染的防控和疫苗的研制。目前,国内、外HPV研究主要集中在:疫苗及其防治技术的研究,HPV流行病学调查及分子诊断方法的研究,HPV变异株的分离鉴定、分子特征与致病关系的研究,HPV致病机理,HLA多态性与宫颈HPV感染及宫颈癌相关性研究等。为研究和制备适合广东地区人群的宫颈癌预防和治疗性疫苗,在进行疫苗研制和使用之前须了解广东地区HPV型和宫颈癌的流行病学以及致肿瘤性HPV型别的分布,故本研究从宫颈癌和HPV病毒株出发,着重从以下几个方面对广东地区宫颈病变人群中主要HPV型别及其基因多态性进行了研究。1.广东地区宫颈病变患者感染的HPV主要型别采用PCR直接测序法,对广东地区因宫颈病变就诊患者的宫颈脱落细胞标本1400份(其中HC-Ⅱ检测HPV DNA高危型阳性的标本1200份,阴性的标本200份)进行了HPV基因测序分型,以了解广东地区宫颈病变患者HPV主要型别。研究结果提示,在1200份HC-Ⅱ阳性的标本中共检测出HPV基因型(亚型)30型,检出率84.5%(1014/1200);单一感染93%(943/1014),双重以上混合感染7.0%(71/1014)。单一感染中各基因型及其检出率依次为HPV16型24.9%(235/943)、58型17.4%(164/943)、33型13.5%(127/943)、11型10.3%(97/943)、52型6.9%(65/943)、6型4.5%(42/943)、18型3.3%(31/943)、53型2.8%(26/943)、81型2.8%(26/943)、66型2.4%(23/943)、31型2.4%(23/943)、39型2.0%(19/943)、84型2.0%(19/943)、56型1.6%(15/943)、54型0.8%(8/943)、59型0.7%(7/943);其它HPV CP8304:3例,HPV1、7、8、45、46、51、63、64、68、69、70、75、76各1例,共占1.7%(16/943)。在200份HC-Ⅱ阴性的标本中共检测出HPV基因型(亚型)3型,检出率4.5%(9/200),各基因型及其检出率依次为HPV 58型2.0%(4/200)、16型1.5%(3/200)、33型1.0%(2/200),无混合感染。本研究发现广东地区宫颈脱落细胞中有30种HPV亚型;其中有16种高危型HPV型别(16、58、33、52、18、53、66、31、39、56、54、59、45、51、68、69),尤以HPV16、58、33、52、18型多见;14种低危型HPV型别(11、6、81、84、CP8304、1、7、8、46、63、64、70、75、76)。首次发现广东地区存在HPV46、52、81、84、CP8304型。HC-Ⅱ阴性并不能排除HPV感染,还须结合临床病理等去明确诊断。针对广东地区HPV感染的疫苗的研制和使用时,以及设计包括广东地区常见感染亚型的检测试剂盒时,须考虑广东地区的16种高危型HPV型别,尤其HPV16、58、33、52、18型别。2.广东地区宫颈癌及上皮内瘤患者人群中HPV感染特征及其主要型别研究采用PCR直接测序法,对宫颈癌等宫颈病变组织标本或宫颈脱落细胞标本、石蜡包埋宫颈癌组织标本进行了HPV基因测序分型,以调查广东地区致肿瘤性HPV的主要型别及其感染研究,为将来广东地区人群HPV疫苗的研制和应用提供流行病学依据。研究结果提示,广东地区宫颈病变患者HPV感染率为54.6%(239/438);宫颈癌患者HPV16、33、18、58型分别占31.78%(34/107)、23.36%(25/107)、16.82%(18/107)和3.74%(8/107)。广东地区人群HPV33型感染较多,与国内其它学者结果有所不同,有明显的地区特点。本研究发现各类宫颈病变的HPV感染高峰年龄在21-40岁年龄段,其中宫颈癌患者高峰年龄在31-50岁年龄段。各年龄组宫颈癌高危型HPV感染率之间没有显着性差异,但是其中以31-40岁、41-50岁年龄组的高危型HPV感染率较高分别为85.2%(23/27)和82.5%(47/57)。不同年代宫颈癌发病年龄不同,1975-1984与1985-1994之间宫颈癌发病年龄没有差异(P=0.970),而二者都与1995-2004有差异(P=0.05),说明宫颈癌年龄提前10余年。本研究发现宫颈感染高危型HPV后约10年才能发展至宫颈癌,并且宫颈癌的发病年龄提前了近10年。疫苗接种年龄宜在21-40岁年龄段。3.广东地区宫颈病变组织HPV L1基因多态性分析HPV L1基因多态性分析在临床上有助于诊断分析和流行病学研究,在预防性疫苗的研究制备中具有重要意义。本研究对来自广东地区宫颈病变,尤宫颈癌组织中高危型HPV L1基因进行序列分析,以调查广东地区宫颈病变患者感染的HPV L1基因多态性,为适合广东地区人群HPV预防性疫苗的研制提供流行病学依据。研究结果提示,广东地区HPV33、52、58型L1的进化处于相对较低的进化地位,是其他HPV33、52、58型L1病毒株的祖先株。国内、外其他地区的HPV预防性疫苗不一定适用于广东地区;须研制适合广东地区人群宫颈病变的预防性疫苗;研制适合广东地区人群的宫颈病变预防性疫苗时,必须考虑HPV6 L1H315N、E431Q分离株;HPV16 L1优势病毒株(M368K/S375F/D412E)和HPV58 L1C350W、R364S、T366N分离株;以及兼顾HPV18、33、39、45、52、53、54、58型的基因多态性。4.广东地区宫颈病变组织部分高危型HPV(16、33、58)E6、E7基因多态性分析早期转录区的E6和E7主要与病毒细胞转化功能及致癌性有关,而且还具有对病毒基因和细胞基因转录的反式激活活性。本研究对来自广东地区宫颈病变,尤宫颈癌组织中高危型HPV E6、E7基因进行序列分析,以调查广东地区宫颈病变患者感染的常见高危型HPVE6、E7基因多态性,为适合广东地区妇女HPV治疗性疫苗的研制提供流行病学依据。研究结果提示,广东地区①HPV16 E6/E7变异株是:E6 D32E,E7 N29S;推测广东地区HPV16除了亚洲型(E7 N29S)和广东地区变异株(E6 D32E)以外,还有人口流动传入广东的变异株。②HPV33 E6/E7变异株是:E6 K35N、E6 K93N,与国内和日本报道一致;E7 A45E、A50P为本地变异株;广东地区HPV33 E6、E7基因处于标准株、广东地区分离株共存的状态。③HPV58 E6/E7变异株是:E6 K93N、E7 T20I/G63S,生物学功能也有相应改变。④在研制适合广东地区人群的HPV治疗性疫苗时,必须考虑HPV16、HPV33、HPV58E6/E7变异株。通过对广东地区宫颈病变患者感染的HPV型别分布和HPV L1、E6、E7基因多态性研究,为适合广东地区人群HPV预防性和治疗性疫苗的研制提供流行病学基础:①首次在广东地区人群HC-Ⅱ检测HPV DNA阳性的宫颈脱落细胞中发现有30种HPV亚型,HC-Ⅱ阴性并不能排除HPV感染。②首次发现广东地区人群宫颈存在HPV46、52、81、84、CP8304型感染;针对广东地区HPV感染的疫苗的研制和使用时,以及设计包括广东地区常见感染亚型的检测试剂盒时,须考虑广东地区的16种高危型HPV型别,尤其HPV16、58、33、52、18型别。③本研究发现各类宫颈病变的HPV感染高峰年龄在21-40岁年龄段,其中宫颈癌高峰年龄在31-50岁年龄段。宫颈合并高危型HPV感染后约10年才能发展至宫颈癌,而近年来宫颈癌的发病年龄提前了近10年。④疫苗接种年龄宜在21-40岁年龄段。⑤HPV16、33、18型是宫颈癌的主要致病型,有一定的人群或地域特点。⑥广东地区HPV33、52、58型L1的进化处于相对较低的进化地位,是其他HPV33、52、58型L1病毒株的祖先株;国内、外其他地区的HPV预防性疫苗不一定适用于广东地区;须研制适合广东地区人群的预防性疫苗,同时也须考虑HPV6 L1 H315N、E431Q分离株,HPV16 L1优势病毒株(M368K/S375F/D412E)和HPV58 L1 C350W、R364S、T366N分离株,以及HPV18、33、39、45、52、53、54、58型的基因多态性。⑦广东地区人群HPV16 E6/E7变异株是:E6 D32E,E7 N29S;HPV33 E6/E7变异株是:E6 K35N、E6 K93N;HPV58 E6/E7变异株是:E6 K93N、E7 T20I/G63S;国内、外其他地区的HPV治疗性疫苗不一定适用于广东地区,须研制适合广东地区人群的宫颈病变的治疗性疫苗,同时必须考虑HPV16、HPV33、HPV58 E6/E7变异株的影响。
尹锐[9](2006)在《人乳头瘤病毒16E7 HLA-A2限制性CTL表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究》文中研究指明随着社会的发展,性传播疾病(sexually transmitted diseases,STDs)发病率逐年增加,经生殖道传播和感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)正呈逐年上升趋势。HPV感染,尤其是高危型(包括16、18型等)感染是引起阴道、宫颈尖锐湿疣并最终导致阴道癌、宫颈癌的最常见型别,几乎100%宫颈癌和癌前病变、鳞状上皮病变中含有HPV-DNA。HPV的感染已成为全球关注的重大健康问题之一。然而,HPV感染后机体对其产生的免疫应答特别是细胞免疫,不能有效被激活以清除病毒,从而导致感染持续存在。可见清除HPV感染,尤其是高危型HPV,不仅可以减少性传播疾病的发生,还可明显降低相关肿瘤的发病率。目前临床广泛采用的治疗方法多是去除疣体和/或非特异性的免疫治疗方法,在短期内有一定的效果,但不能彻底有效清除细胞内的病毒,也不能有效控制复发。伴随对HPV病毒抗原的研究,治疗性疫苗成为抗HPV及相关肿瘤生物治疗研究的热点之一。以往研究表明:细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)介导的特异性细胞免疫在机体抗感染和抗肿瘤中起重要作用。因此有效激发特异性CTL应答是治疗性疫苗的重要目标。CTL通过其T细胞受体特异性识别抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)(如肿瘤细胞)表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-I类分子-肽复合物,然后自身得以活化,并最终通过多种机制杀死靶细胞。能与MHC-I类分子结合的短肽即为CTL表位。随着HPV的CTL表位相继被鉴定,使得基于CTL表位的肽疫苗成为HPV治疗性疫苗研制的重要方向之一。由于肽疫苗以天然氨基酸为原料,可通过全自动化学合成大规模生产,纯化和质控相当方便,而且对于机体相对安全,因此受到广泛重视并有极大发展空间。但由于存在免疫原性弱、半衰期短及不易被APC摄取等缺陷,肽疫苗很难在体内诱导出有效的CTL反应,故临床应用受到很大限制。为弥补不足,人们尝试采用多种方式对肽疫苗进行改造和修饰,如对与MHC-I类分子结合的锚点氨基酸进行置换、在多肽
高慧[10](2005)在《人乳头瘤病毒16E6/7转基因小鼠模型的建立及HPV16DNA疫苗的研究》文中认为人乳头瘤病毒(HPV)是一组具有组织特异的双链DNA肿瘤病毒,能引起上皮和粘膜组织增生,主要通过直接或间接接触污染人的皮肤、粘膜组织,其中尖锐湿疣是HPV感染引起的常见性传播性疾病,感染率高、传染性强。目前研究认为,高危型HPV感染是宫颈癌发生发展的必要因素,特别HPV16在富颈癌组织中检出率最高,可达50%。HPV感染性疾病、宫颈癌在现今条件下仍无特效的预防和治疗方法,加之体外很难获得大量HPV病毒粒子,也无HPV自然感染的动物模型可以利用,限制了对HPV的深入研究及其防治性疫苗的研制开发。 为了建立HPV致病性和疫苗评价研究的动物模型,建立适合国内推广的防治HPV感染的疫苗株,我们从国人宫颈癌组织中提取DNA,分离HPV16E6E7、L1基因,建立E6E7转基因小鼠模型和L1抗原表达移植瘤模型,构建真核表达重组质粒pcDNA-L1、pcDNA-E7,免疫小鼠测定其免疫效力。观从以下四个方面概述: 一、HPV16型E6/7、L1基因的克隆和序列分析 从感染HPV16型的宫颈癌组织中提取组织DNA,根据已发表的HPV16标准株DNA全序列设计跨HPV16 E6/7、L1整个阅读框,包含起始密码子和终止密码子的两对特异性引物,以提取的DNA为模板,PCR法扩增HPV16E6/7、L1基因,并以pGgM-Teasy为克隆载体,按常规方法构建重组质粒pGEM-T-E6/7、pGEM-T-L1,经蓝白斑筛选和限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果显示我们分离、克隆的HPV16分离株E6/7、L1基因与已报道的标准株(德国)序列存在高度同源性。其中E6基因在核苷酸、氨基酸序列上都与标准株完全一致:E7基因与标准株仅在核苷酸序列上有一处突变,即199位的T→C,密码子由TTG变为CTG,而氨基酸序列未发生改变;L1基因与标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,即标准株序列6,240处的C→G,核苷酸三联密码TCA变为TGA,编码氨基酸由组氨酸(H)变为天门冬氨酸(D):6,432
二、湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究(论文提纲范文)
(1)宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略表 |
引言 |
第1章 宫颈脱落细胞HPV58型感染状况分析 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 主要仪器 |
1.1.2 实验用试剂 |
1.1.3 溶液配制 |
1.1.4 标本及临床资料的收集 |
1.1.5 研究方法 |
1.2 结果 |
1.2.1 所提标本DNA的质量检测 |
1.2.2 HPV总感染率的检测 |
1.2.3 HPV16 型,HPV18 型和HPV58 型感染率的检测 |
1.2.4 不同年龄段女性及不同病理分型女性HPV感染状况 |
1.2.5 不同组织学类型的病理图片 |
1.3 讨论 |
1.3.1 本地区HPV感染型别特点 |
1.3.2 本地区HPV感染年龄分布特点 |
1.3.3 本地区HPV感染与病理组织学分型的关系 |
1.4 小结 |
参考文献 |
第2章 人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2 实验用试剂 |
2.1.3 溶液配制 |
2.1.4 材料 |
2.1.5 实验方法 |
2.2 结果 |
2.2.1 HPV58E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 |
2.2.2 Gal K插入SW102-T-ORF75-BAC |
2.2.3 HPV58E6E7 融合基因代替Gal K基因 |
2.2.4 转染与未转染细胞生长状况 |
2.2.5 转染与未转染细胞中T-ORF75-HPV58-m E6E7 与T-ORF75-HPV58-w E6E7 表达状况 |
2.2.6 软琼脂克隆实验 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
参考文献 |
结论 |
第3章 综述 |
3.1 人乳头瘤病毒的结构 |
3.2 HPV各基因区的功能 |
3.2.1 早期基因区(E区)的功能 |
3.2.2 晚期基因区(L区)的功能 |
3.2.3 长调控区(LCR)的功能 |
3.3 HPV分类及相关疾病 |
3.4 年龄与HPV感染的关系 |
3.5 HPV持续感染与宫颈病变的关系 |
3.6 HPV致病机制 |
3.6.1 HPV DNA的整合 |
3.6.2 HPV与细胞周期 |
3.7 HPV58型感染 |
3.7.1 1HPV58型病毒的分子结构与生物学意义 |
3.7.2 HPV感染的过程 |
3.7.3 HPV58的整合状态 |
3.8 HPV检测方法 |
3.8.1 形态学检测的方法 |
3.8.2 杂交捕获法(HC2) |
3.8.3 HPVL1区通用引物检测方法 |
3.8.4 HPVE区分型的检测方法 |
3.8.5 APOT检测系统 |
3.9 HPV疫苗研究进展 |
3.9.1 HPV预防性疫苗 |
3.9.2 HPV治疗性疫苗 |
3.10 HPV疫苗在我国的应用现状 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间研究成果 |
(2)HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第1章 文献综述 基于人乳头瘤病毒的免疫诊断和免疫疗法用于HPV诱发癌症的研究进展 |
1.1 引言 |
1.2 基于HPV的免疫诊断 |
1.2.1 检测肿瘤组织和细胞中的HPV蛋白抗原 |
1.2.2 检测患者唾液或阴道冲洗液中的抗HPV蛋白抗体 |
1.2.3 检测患者血清中抗HPV抗体 |
1.3 基于HPV的免疫治疗 |
1.3.1 用于治疗的天然抗HPV蛋白单克隆抗体 |
1.3.2 用于治疗的基于HPV蛋白mAb的放射免疫疗法 |
1.3.3 用于治疗的亲和毒素 |
1.3.4 用于治疗的HPV细胞内单链抗体(scFvs) |
1.3.5 用于治疗的HPV纳米抗体 |
1.3.6 治疗性疫苗接种 |
1.4 结论和展望 |
第2章 引言 |
2.1 研究背景及目的意义 |
2.2 主要研究内容 |
2.2.1 HPV16E7蛋白的制备 |
2.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
2.2.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
2.2.4 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
2.2.5 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在常规双抗夹心ELISA中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
2.2.6 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
2.3 技术总路线 |
第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表达及HPV16 E7 蛋白的纯化 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 材料 |
3.1.2 方法 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 重组质粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的构建 |
3.2.2 HPV16E7蛋白的诱导表达 |
3.2.3 HPV16E7蛋白的表达形式和镍柱纯化 |
3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱纯化及其二级结构的测定 |
3.3 讨论 |
3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鉴定 |
3.3.2 HPV16E7蛋白的表达和纯化 |
3.4 小结 |
第4章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备和纯化 |
4.1 材料和方法 |
4.1.1 材料 |
4.1.2 方法 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
4.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备、收集和保存 |
4.2.3 二步法纯化Ig G2a亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体单抗69E2 |
4.2.4 二步法-辛酸-硫酸铵沉淀加Protein A的方案纯化Ig M亚型单抗69A6 |
4.2.5 四步法-硫酸铵沉淀+凝胶过滤层析+IgM柱+凝胶过滤层析的方案纯化Ig M亚型单抗79A11 |
4.2.6 间接ELISA测定纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
4.3 讨论 |
4.3.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
4.3.2 阳性克隆杂交瘤细胞株的筛选方法的建立 |
4.3.3 饲养层细胞的制备 |
4.3.4 细胞融合 |
4.3.5 杂交瘤细胞株的HAT选择性培养 |
4.3.6 阳性克隆的筛选 |
4.3.7 克隆化 |
4.3.8 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备 |
4.3.9 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的保存 |
4.3.10 Ig G2a和 Ig M亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的纯化 |
4.3.11 ELISA检测纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
4.4 小结 |
第5章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
5.1 材料和方法 |
5.1.1 材料 |
5.1.2 方法 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
5.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的亚型和氨基酸序列测定 |
5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位鉴定 |
5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的特异性表位的保守性分析 |
5.3 讨论 |
5.3.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的测定和氨基酸序列的预测 |
5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位比较 |
5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2、69A6 的特异性表位的保守性分析 |
5.4 小结 |
第6章 HPV16 E7 蛋白单抗在免疫组化、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 材料 |
6.1.2 方法 |
6.2 结果与分析 |
6.2.1 8株HPV16 E7 单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反应 |
6.2.2 8株HPV16E7单克隆抗体在免疫细胞化学中的诊断应用 |
6.2.3 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
6.2.4 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6与Ca Ski和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应 |
6.3 讨论 |
6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反应 |
6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫细胞化学中的诊断应用 |
6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6在Western Blot中的诊断应用 |
6.4 小结 |
第7章 定量检测HPV16 E7 蛋白的常规双抗夹心ELISA法的建立 |
7.1 材料与方法 |
7.1.1 材料 |
7.1.2 方法 |
7.2 结果与分析 |
7.2.1 间接ELISA检测捕获抗体79A11 和检测抗体69E2 的效价 |
7.2.2 直接ELISA检测偶联物HRP-69E2 的抗体效价 |
7.2.3 封闭条件的优化 |
7.2.4 双抗夹心ELISA的棋盘实验 |
7.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体79A11反应时间的优化 |
7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ng~μg级以3 倍稀释法稀释时的线性关系 |
7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释时的线性关系和定量限 |
7.3 讨论 |
7.4 小结 |
第8章 单抗在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16E7蛋白的诊断应用 |
8.1 材料与方法 |
8.1.1 材料 |
8.1.2 方法 |
8.2 结果与分析 |
8.2.1 间接ELISA测定单抗79A11和69E2 的抗体效价 |
8.2.2 直接ELISA测定检测抗体偶联物Biotin-69E2 的抗体效价 |
8.2.3 化学发光免疫分析方法的原理 |
8.2.4 捕获抗体79A11 和检测抗体Biotin-69E2 的最适工作浓度优化 |
8.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应的时间优化 |
8.2.6 封闭条件的优化 |
8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释 |
8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg级以等比等差法稀释 |
8.2.9 抗原在ng~μg级以3倍法稀释 |
8.2.10 制备参考曲线和检测临床标本 |
8.3 讨论 |
8.4 小结 |
第9章 全文总结 |
9.1 HPV16E7蛋白的制备 |
9.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
9.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
9.4 3株单抗79A11、69E2和69A6 定性检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
9.5 2株单抗79A11和69E2 定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
论文创新点 |
不足和展望 |
参考文献 |
博士期间发表文章及课题参研情况 |
致谢 |
(3)人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 前言 |
1 人乳头瘤病毒概况 |
1.1 HPV基因组 |
1.2 HPV早期蛋白的概述 |
1.2.1 E1蛋白 |
1.2.2 E2蛋白 |
1.2.3 E4蛋白 |
1.2.4 E5蛋白 |
1.2.5 E6蛋白 |
1.2.6 E7蛋白 |
1.3 HPV晚期蛋白的概述 |
1.3.1 L1蛋白 |
1.3.2 L2蛋白 |
1.4 HPV分型 |
1.5 HPV的感染历程 |
1.6 HPV的流行性病学研究 |
2 E6的结构与功能研究 |
2.1 E6的结构生物学研究 |
2.2 E6的生物学功能研究 |
3 E7的结构与功能研究 |
3.1 E7的结构生物学研究 |
3.2 E7的生物学功能研究 |
4 HPV疫苗研究进展 |
4.1 HPV预防性疫苗研究进展 |
4.2 当前HPV预防性疫苗的局限 |
4.3 HPV治疗性疫苗研究进展 |
5 本论文研究目的、思路与意义 |
第二章 材料与方法 |
1 材料 |
1.1 主要仪器设备 |
1.2 实验材料 |
1.2.1 E.coli菌株 |
1.2.2 质粒 |
1.2.3 细胞株 |
1.2.4 实验动物 |
1.2.5 酶 |
1.2.6 抗体 |
1.2.7 常用试剂 |
1.2.8 其他耗材 |
1.3 工作站和软件 |
1.4 常用溶液及试剂配制 |
2 方法 |
2.1 大肠杆菌表达系统的构建 |
2.1.1 目的序列的选取 |
2.1.2 引物设计 |
2.2 真核表达系统重组质粒的构建 |
2.3 蛋白表达和纯化方法(以pTO-T7-HPV-18 E7为例) |
2.3.1 HPV-18 E7表达菌株的建立 |
2.3.2 工程菌的小量诱导表达 |
2.3.3 工程菌的大量诱导表达 |
2.3.4 AKTA色谱纯化分子筛层析 |
2.4 蛋白性质鉴定方法 |
2.4.1 SDS-PAGE和Western Blot分析蛋白大小和纯度 |
2.4.2 LC-MS/MS检测 |
2.4.3 高效液相色谱检测 |
2.4.4 AUC-SV检测方法 |
2.4.5 酶联免疫吸附反应检测抗原抗体的反应性 |
2.4.6 DSC(Differential Scanning Calorimetry)分析法 |
2.5 HPV-18 E7蛋白免疫动物实验 |
2.6 抗HPV-18 E7单克隆抗体的制备和筛选 |
2.6.1 杂交瘤细胞的获取 |
2.6.2 杂交瘤细胞的筛选 |
2.6.3 杂交瘤细胞的培养 |
2.7 抗HPV-18 E7单克隆抗体的初步性质鉴定 |
2.7.1 单抗腹水诱导 |
2.7.2 单抗纯化 |
2.7.3 蛋白免疫印迹分析单抗的构象性/线性 |
第三章 结果与分析 |
第一部分: HPV E6和E7蛋白表达与纯化研究 |
1.1 HPV E6和E7蛋白原核表达与纯化研究 |
1.1.1 MBP融合蛋白质粒构建及表达纯化 |
1.1.2 非保守半胱氨酸突变蛋白质粒构建及表达纯化 |
1.1.3 GST融合蛋白质粒构建及表达纯化 |
1.1.4 pTO-T7载体质粒构建及表达纯化 |
1.2 HPV E6和E7蛋白真核表达和纯化研究 |
1.2.1 三个真核表达系统的重组质粒构建及表达纯化 |
1.2.2 CHO表达系统质粒优化及表达鉴定 |
第一部分小结 |
第二部分: HPV18 E7-pTO-T7载体原核表达纯化条件的优化 |
2.1 HPV E6和E7基因序列密码子优化 |
2.2 HPV E6和E7蛋白镍亲和层析方案的优化 |
2.3 HPV18 E7蛋白存储缓冲液的优化 |
2.4 HPV18 E7蛋白凝胶过滤层析纯化 |
第二部分小结 |
第三部分: 原核表达HPV18 E7蛋白的理化性质研究 |
3.1 蛋白电泳、蛋白免疫印迹及肽指纹图谱分析HPV18 E7 |
3.2 高效液相色谱分析(HPLC)及分析型超速离心(AUC)检测样品均一性 |
3.3 差式扫描热量法(DSC)分析HPV18 E7蛋白热稳定性 |
第三部分小结 |
第四部分: 抗HPV18 E7单克隆抗体的制备及性质鉴定 |
4.1 HPV 18 E7单克隆抗体细胞株的筛选 |
4.2 HPV 18 E7单克隆抗体的制备与性质鉴定 |
4.2.1 单抗腹水制备与纯化 |
4.2.2 单抗与抗原反应性分析 |
4.2.3 单抗的亚型、线性及构象性质分析 |
4.2.4 单抗与各型别E6和E7的交叉反应性分析 |
第四部分小结 |
第四章 讨论 |
1 HPV E6和E7蛋白的可溶性表达 |
2 HPV18 E7抗体研究 |
3 HPV18 E7蛋白结构的研究 |
4 HPV18 E7致癌机制的研究 |
小结与展望 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
在校期间发表成果 |
在校期间参与的科研项目 |
(4)高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 高危型HPV基因型检测在宫颈癌筛查中应用 |
1 研究内容与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 主要试剂及仪器设备 |
1.3 研究方法 |
1.4 宫颈液基薄层细胞学检查 |
1.5 细胞学分类方法 |
1.6 COBAS HPV检测实验(高危型HPV基因型检测实验) |
1.7 HybrMiax HPV分型检测实验 |
1.8 阴道镜检查及宫颈活检 |
1.9 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二部分P16/Ki-67细胞学双染42在HPV阳性、宫颈不同病变脱落细胞中的表达和意义 |
1 研究内容与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 主要仪器设备和试剂 |
1.3 细胞学检查 |
1.4 细胞学分类及诊断方法 |
1.5 HC-2 HPV病毒检测 |
1.6 阴道镜检查及宫颈活检 |
1.7 P16/Ki-67免疫细胞化学双染检测(CINTEC PLUS) |
1.8 COBAS高危型HPV检测 |
1.9 统计分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 HPV16变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究 |
1 研究内容与方法 |
1.1 研究对象的纳入和排除标准 |
1.2 研究对象基本情况 |
1.3 实验所需试剂及仪器设备 |
1.4 实验方法 |
1.5 质量控制 |
1.6 PCR产物序列测定及DNA数据分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
综述 宫颈癌筛查研究进展 |
参考文献 |
攻读博士期间获得的学术成果 |
个人简历 |
导师评阅表 |
(5)稳定表达人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6E7融合基因的人C33A宫颈癌细胞株的构建及验证(论文提纲范文)
个人简历 |
摘要 |
ABSTRACT |
第一章: 前言 |
第二章: 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因对宫颈癌细胞部分生物学特性的体外研究 |
第一节 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因对人宫颈癌C33A细胞部分生物学特性的体外研究 |
1. 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 质粒、菌株、细胞 |
1.1.2 主要试剂 |
1.1.3 实验主要仪器设备 |
1.1.4 部分试剂的配制 |
1.1.5 用具处理 |
1.2 方法 |
1.2.1 GV303慢病毒表达系统的构建 |
1.2.1.1 HPV58E6E7融合基因PCR扩增所需引物设计及合成 |
1.2.1.2 HPV58E6E7融合基因片段PCR扩增 |
1.2.1.3 HPV58E6E7融合基因PCR扩增产物的纯化及回收 |
1.2.1.4 AgeI/ NheI双酶切GV303载体 |
1.2.1.5 PCR纯化产物交换入GV303线性化表达载体 |
1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH-5 α感受态细胞 |
1.2.1.7 挑取阳性克隆 |
1.2.1.8 重组慢病毒表达质粒的初步鉴定 |
1.2.1.9 质粒DNA快速提取 |
1.2.1.10 重组慢病毒表达质粒的PCR鉴定 |
1.2.1.11 重组慢病毒表达质粒测序 |
1.2.2 慢病毒颗粒包装及其滴度测定 |
1.2.3 病毒颗粒感染人宫颈癌细胞 |
1.2.3.1 细胞培养、传代、冻存及计数 |
1.2.3.2 病毒颗粒感染C33A细胞 |
1.2.3.3 转染效率的检测 |
1.2.4 三组细胞培养 |
1.2.5 Trizol法提取三组细胞总RNA |
1.2.6 浓度及纯度检测 |
1.2.7 cDNA合成 |
1.2.8 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的构建 |
1.2.8.1 引物设计、合成及稀释 |
1.2.8.2 GAPDH基因扩增(RT-PCR) |
1.2.8.3 GAPDH产物的纯化与回收 |
1.2.8.4 回收纯化的GAPDH基因片段与pMD18-T载体连接 |
1.2.8.5 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒转化DH-5 α感受态细胞 |
1.2.8.6 阳性克隆的挑选 |
1.2.8.7 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的初步鉴定 |
1.2.8.8 大量提取pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒 |
1.2.8.9 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒的PCR鉴定 |
1.2.9 制备pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒标准品 |
1.2.10 慢病毒介导C33A细胞中HPV58E6E7融合基因的表达情况 |
1.2.10.1 实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测三组细胞中HPV58E6E7融合基因的含量 |
1.2.10.2 结果计算方法 |
1.2.10.3 统计学分析 |
1.2.11 慢病毒介导C33A细胞中His-tag标签蛋白的表达情况 |
1.2.11.1 单层贴壁细胞总蛋白的提取 |
1.2.11.2 BCA法各组蛋白浓度测定 |
1.2.11.3 Western Blot检测三组细胞中His-tag标签蛋白的含量 |
2. 实验结果 |
2.1 HPV58E6E7融合基因的特异性扩增 |
2.2 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303 RT-PCR电泳结果 |
2.3 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303测序结果 |
2.4 重组质粒HPV58E6E7融合基因-GV303转染293T细胞结果(此部分委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成) |
2.5 病毒滴度测定结果(此部分委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成) |
2.6 病毒颗粒感染人宫颈癌C33A细胞 |
2.7 转染效率检测 |
2.8 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7重组质粒单克隆结果 |
2.9 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒RT-PCR鉴定 |
2.10 pMD18-T/GAPDH、pMD18-T/HPV58 E6E7融合基因质粒扩增标准曲线结果 |
2.11 荧光定量PCR检测三组细胞中HPV58E6E7融合基因的病毒负载量 |
2.12 Western Blot验证三组细胞中HIS-tag标签蛋白的表达 |
小结 |
第二节 过表达重组慢病毒LV-HPV58E6E7融合基因转染对C33A细胞生长及其周期的影响 |
1. 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 细胞株 |
1.1.2 试剂及配置 |
1.1.3 主要实验仪器 |
1.2 方法 |
1.2.1 MTT法检测三组细胞生长曲线的测定 |
1.2.2 流式细胞仪检测三组细胞生长周期变化 |
2. 结果 |
2.1 MTT法测定三组细胞生长曲线 |
2.2 流式细胞仪检测各组细胞周期的变化 |
小结 |
本章讨论 |
第三章: 稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞株在裸鼠体内真核表达的鉴定 |
1、材料和方法 |
1.1 实验动物、细胞及仪器 |
1.2 裸鼠皮下成瘤模型的建立 |
1.2.1 细胞培养及裸鼠左腋下皮肤接种 |
1.2.2 观察裸鼠皮下成瘤情况 |
1.2.3 小动物活体成像仪了解裸鼠皮下种植瘤体中荧光表达情况 |
1.2.4 种植瘤取出并保存 |
1.3 裸鼠皮下瘤组织中HPV58E6E7融合基因的表达情况 |
1.3.1 荧光定量PCR检测三组瘤组织中HPV58-E6E7融合基因的含量 |
1.3.2 Western Blot检测三组裸鼠皮下瘤组织中HIS标签蛋白的表达 |
2、结果 |
2.1 成功建立裸鼠皮下成瘤模型 |
2.2 荧光定量PCR检测三组瘤组织中HPV58E6E7的表达 |
2.3 Western Blot验证三组瘤组织中His-tag标签蛋白的表达 |
3、本章讨论 |
全文小结 |
正文参考文献 |
附录 |
第四章: 宫颈癌HPV感染及其疫苗研究现状(文献综述) |
1、目前宫颈癌现状 |
2、宫颈癌发病的高危因素 |
2.1 生物学因素 |
2.1.1 病毒感染 |
2.1.2 宫颈慢性疾病 |
2.2 性行为与生殖相关因素 |
2.2.1 初次性生活过早 |
2.2.2 性生活紊乱 |
2.2.3 多孕多产 |
2.3 雌激素水平 |
2.4 遗传因素 |
2.5 其他 |
3、HPV分子结构及其生物学特性 |
4、HPV的分型及其流行病学分布情况 |
4.1 HPV分型 |
4.2 HPV流行病学情况 |
5、HPV的致病机制 |
5.1 HPV DNA的整合 |
5.2 HPV与细胞周期的关系 |
5.3 HPV与细胞凋亡的关系 |
5.4 HPV与机体免疫的关系 |
5.4.1 细胞免疫 |
5.4.2 体液免疫 |
6、HPV58型感染与宫颈癌的关系 |
6.1 HPV58的结构 |
6.2 HPV58的致癌机理 |
7、HPV疫苗的研究进展 |
7.1 HPV疫苗的研究背景 |
7.2 HPV疫苗的分型及其临床试验成果 |
7.2.1 HPV预防性疫苗 |
7.2.2 HPV治疗性疫苗 |
综述参考文献 |
致谢 |
(6)SOCS1沉默的DCs疫苗及DCs-CIKs对宫颈癌的治疗研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一部分 前言 |
一、宫颈癌概述 |
二、HPV与宫颈癌关系 |
三、免疫治疗策略 |
四、技术路线图 |
参考文献 |
第二部分 DCs和CIKs分离培养及宫颈癌动物模型的建立 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
参考文献 |
第三部分 HPV16mE7基因扩增及其原核表达 |
1.材料与方法 |
2. 结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
参考文献 |
第四部分 SOCS1沉默对DCs疫苗治疗宫颈癌的影响 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
参考文献 |
第五部分 SOCS1沉默和HPV16 E7表位肽脉冲的DCs-CIKs作用机制 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.小结 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
总结 |
结束语 |
英文缩写词 |
成果 |
致谢 |
统计学证明 |
(7)广东分离株HPV16L1基因克隆及其蛋白的分泌表达(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
目录 |
前言 |
1.1 HPV的分子生物学特征 |
1.2 HPV感染与宫颈癌发生的关系 |
1.3 HPV疫苗的研究现状 |
1.4 目的蛋白的表达体系和优化策略 |
1.5 研究意义 |
第一部分:广东地区HPV16型L1基因的序列分析及其毕赤酵母表达载体的构建 |
1.1 实验材料 |
1.2 试剂配制 |
1.3 主要仪器 |
1.4 实验方法 |
1.5 结果分析 |
第二部分:广东分离株HPV16 L1基因密码子的优化及其蛋白的分泌达表达 |
2.1 实验材料 |
2.2 试剂配制 |
2.3 主要仪器 |
2.4 实验方法 |
2.5 结果与分析 |
讨论 |
1.HPV16L1基因序列的变异分析 |
2.广东分离株HPV61L1基因在毕赤酵母中的表达 |
结论 |
英文缩略词 |
参考文献 |
附录Ⅰ:pPICZαC-HPV16L1测序图 |
附录Ⅱ:pPICZαC-HPV16L1m测序图 |
在读期间发表论文清单 |
致谢 |
(8)广东地区人乳头瘤病毒的分子流行病学研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 广东地区宫颈病变患者感染的HPV主要型别 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
四、小结 |
五、参考文献 |
第二部分 广东地区宫颈癌及上皮内瘤患者人群中HPV感染特征及其主要型别研究 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
四、小结 |
五、参考文献 |
第三部分 广东地区宫颈病变组织HPV L1基因多态性分析 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
四、小结 |
五、参考文献 |
第四部分 广东地区宫颈病变组织部分高危型HPV(16、33、58)E6、E7基因多态性分析 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
四、小结 |
五、参考文献 |
总结 |
附录 |
发表文章 |
致谢 |
(9)人乳头瘤病毒16E7 HLA-A2限制性CTL表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究(论文提纲范文)
英文缩写词汇表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
论文正文 人乳头瘤病毒16 E7 HLA-A_2限制性CTL 表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究 |
前言 |
第一部分 人乳头瘤病毒16 型 E7 HLAA_2 限制性 CTL 表位穿膜肽疫苗的设计及鉴定 |
前言 |
第一节 CPP-CTL 表位融合肽疫苗的设计、合成、纯化和鉴定 |
第二节 CPP-CTL 表位融合肽诱导产生特异性 CTL 效应的研究 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 CPP-CTL 表位融合肽疫苗 MHC-I 类抗原呈递动力学及呈递机制的初步研究 |
前言 |
第一节 CPP-CTL 表位融合肽疫苗的入胞效应研究 |
第二节 抗 E7_(49-57)/K~b 单克隆抗体的制备 |
第三节 CPP-CTL 表位融合肽疫苗的 MHC-I 类抗原呈递动力学研究 |
第四节 CPP-CTL 表位融合肽疫苗的 MHC-I 类抗原呈递机制的初步研究 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 CPP-CTL 表位融合肽疫苗抗肿瘤免疫效应的实验研究 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
全文结论 |
致谢 |
文献综述 |
文献综述一 穿膜肽 HIV Tat 蛋白的研究进展 |
参考文献 |
文献综述二 人乳头瘤病毒及其疫苗的研究进展 |
参考文献 |
博士期间发表文章和获得基金资助情况 |
(10)人乳头瘤病毒16E6/7转基因小鼠模型的建立及HPV16DNA疫苗的研究(论文提纲范文)
符号说明 |
综述一:HPV分子生物学研究进展 |
综述二:HPV感染动物模型的研究进展 |
第一章 分离株HPV16型E6/7、L1基因克隆和序列分析 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.参考文献 |
第二章 HPV16E6/7转基因小鼠的模型建立 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.参考文献 |
第三章 分离株HPV16L1DNA疫苗免疫保护作用研究 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.参考文献 |
第四章 分离株HPV16E7DNA疫苗的免疫研究 |
1.材料和方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.参考文献 |
结论 |
致谢 |
攻读期间发表的学术论文目录 |
四、湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究(论文参考文献)
- [1]宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建[D]. 杜阳阳. 华北理工大学, 2020(02)
- [2]HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用[D]. 胡仁建. 西南大学, 2020(01)
- [3]人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选[D]. 王致萍. 厦门大学, 2019(09)
- [4]高危型HPV基因型检测、分流及HPV16型变异体在宫颈癌及癌前病变中的分布研究[D]. 马春华. 新疆医科大学, 2015(03)
- [5]稳定表达人乳头瘤病毒58型(HPV58)E6E7融合基因的人C33A宫颈癌细胞株的构建及验证[D]. 贾超颖. 广西医科大学, 2015(12)
- [6]SOCS1沉默的DCs疫苗及DCs-CIKs对宫颈癌的治疗研究[D]. 徐建华. 南方医科大学, 2013(01)
- [7]广东分离株HPV16L1基因克隆及其蛋白的分泌表达[D]. 刘红. 暨南大学, 2008(03)
- [8]广东地区人乳头瘤病毒的分子流行病学研究[D]. 曾莉. 南方医科大学, 2007(09)
- [9]人乳头瘤病毒16E7 HLA-A2限制性CTL表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究[D]. 尹锐. 第三军医大学, 2006(11)
- [10]人乳头瘤病毒16E6/7转基因小鼠模型的建立及HPV16DNA疫苗的研究[D]. 高慧. 扬州大学, 2005(05)