一、血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达（论文文献综述）
孙燕勇[1]（2021）在《整合eGWAS和eQTL分析绵羊全血转录组与繁殖激素的关联》文中研究说明血液中繁殖激素的动态变化对于评估家畜繁殖性能具有重要意义,血液转录组不仅用来鉴定多个物种的免疫相关调控因子,近年来在家畜生产管理中的应用也逐渐开展。为解析绵羊全血转录组的动态时序表达与繁殖激素调控的关联,本研究以巴美肉羊为研究对象,对血液转录组及其表达基因型进行深入挖掘,将有助于提升血液应用于家畜繁殖性能辅助管理的新认识。本研究获得的主要研究结果如下:1、对绵羊血液转录组的时序动态表达进行研究,检测3、4和5月的不同经产羔类型绵羊的血液转录组,对基因表达与可变剪接进行组间差异分析初探。结果不同经产羔类型之间共检测到1417个差异表达基因,3332个差异可变剪接基因,相比无羔组,单羔组与双羔组基因表达模式更接近。差异表达基因与差异可变剪接共同功能富集结果说明血液表征产羔类型与卵母细胞减数分裂、激素调节和免疫应答等相关。不同月份之间共鉴定到660个差异表达基因,3135个差异可变剪接基因,动态时序表达的基因在功能层面直接或者间接影响激素水平,由此推断绵羊血液时序表达基因可能与激素紧密相关。2、在研究一差异基因分析的基础上,扩大到237个样本,构建加权基因共表达网络（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）,并结合表达全基因组关联分析（expression genome-wide association study,e GWAS）重点研究促卵泡素（follicle-stimulaing hormone,FSH）、促黄体素（luteinizing hormone,LH）、生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）和骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）血清浓度与基因动态表达、变异的关联。结果产羔类型差异表达基因分布在红色和紫色基因模块中较多,且全局网络中红色和紫色基因模块与产羔数关联度较高。通过e GWAS发现模块的显着关联基因主要位于X染色体,包括COIL、NELFE和GCLM等,参与调控卵母细胞成熟、颗粒细胞毛细血管再生、季节性繁殖和免疫应答等。时序差异表达基因主要分布在黄色和蓝色基因模块中,且在全局网络中黄色、蓝色基因模块与激素关联度较高。e GWAS显着关联基因包括CASP9和SRP68基因等,功能富集到催产素信号通路,均影响激素调控过程。最后使用机器学习和先验的绵羊GWAS数据库的方法对样品分组与全局网络模块的功能进行验证补充,证明了小样本差异表达基因在大样本分析中的支持度与可行性。总之,通过表达基因组层面解析了绵羊繁殖激素的关联网络,为繁殖激素时序生理状态的基因表达与变异体之间提供互补信息。3、为进一步挖掘高繁绵羊血清LH/FSH比值调控的深层机制。发现不同LH/FSH比值的差异表达基因在50～150之间。这些基因影响核糖体、催乳激素信号通路、促性腺激素信号通路、卵巢类固醇生成、催产素信号通路和花生四烯酸代谢等与激素调控相关的通路。共鉴定了涉及黄色与蓝色基因模块的1 823个显着关联与1 433个e QTL-SNP,且不均一的分布在各染色体,e QTL-SNP共影响到690个基因。鉴定到26 445个ASE-SNP,影响了4 970个基因,均一分布在各染色体,可见LH/FSH比值与绵羊血液基因表达关联过程中受到广泛的顺式调控作用。结果共筛选出8个候选标记物:PCNX4、FAS、RPL36AL、JCHAIN、LOC101113346、IQSEC1、RPL21和RPL8,大多数的表达基因型特征显现出等位基因不平衡现象,且受到至少一个e QTL-SNP与两个ASE-SNP的影响。4、为了挖掘高繁绵羊GDF9和BMP15影响的深层机制。我们分别对不同GDF9和BMP15血清浓度下的转录组进行比较与关联研究。结果血清中BMP15和GDF9的浓度可能依赖于调节它们共享的差异表达基因RPL23A、LOC101110403、PAQR5、LOC114116858,LOC114114874和NAIP建立内分泌信号交换。其中RPL23A、PAQR5与NAIP直接或者间接地参与到卵母细胞发育和卵巢功能,证明了血液在识别激素影响下的主要基因及关联生物学过程方面的潜力。同时发现血液中广泛存在对GDF9、BMP15的ASE-SNP与e QTL-SNP的调控,共鉴定到502个ASE-SNP,包含58个同时与e QTL-SNP关联。共同调控GDF9与BMP15的e QTL-SNP与ASE-SNP表达的候选血液生物标志物JAK1,IL6R,ITGA4,GAA,PRKD3,CAMK2D,TAB2和IQGAP1的基因型存在明显的等位基因表达失衡现象。综上,本研究描绘了绵羊血液转录组与繁殖激素的网络全景,并对繁殖激素关联的调控元件进行深层探讨,证明了血液在识别激素影响下的主要基因及关联生物学过程方面的潜力,也为任何以血液为适合代理组织的复杂性状提供重要借鉴。
呼啸[2]（2021）在《VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究》文中进行了进一步梳理羊绒制成的纺织品轻薄柔软,保温效果极佳,加之羊绒产量较少,所以具有极高的经济价值。内蒙古绒山羊阿尔巴斯型主要分布于内蒙古西北部地区,该品种繁殖率高,体型较大,所产羊绒纤维纤细,能够满足高端纺织品对原材料的各项要求。但因羊绒具有细而短的特点,纤维间的抱合力和摩擦力均小,易产生起球现象,增加羊绒纤维的长度能够有效解决这一问题。血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）能够通过诱导血管形成而促进绒毛生长,成纤维细胞生长因子5（Fibroblast Growth Factor 5,FGF5）可以通过调节毛囊生长周期而影响羊绒纤维长度,二者对毛发生长分别具有正向和负向调控的作用,本研究以VEGF在FGF5位点定点整合绒山羊为动物模型,研究基因编辑对绒山羊表型的影响,并通过多种高通量测序技术结合分子生物学手段来探究VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的作用机制,发掘下游功能基因和核心作用分子,同时为高产优质绒山羊新品种的培育提供理论依据。一、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测1、基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定首先通过PCR和Southern Blot在DNA水平对VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的基因整合情况进行鉴定,结果出现序列和长度正确的特异性条带,证明VEGF在FGF5位点实现整合;通过real-time PCR检测基因表达量,该基因编辑绒山羊皮肤组织中VEGF和FGF5分别是对照组的1.63倍和0.41倍,结果与Western Blot一致,表明VEGF在高表达的同时降低了FGF5的表达量;此外,从脱靶分析和健康状况方面对基因编辑绒山羊的安全性进行检测,结果表明该基因编辑绒山羊没有发生脱靶且健康状况良好。2、基因编辑绒山羊产绒性能检测从宏观和微观两方面对基因编辑绒山羊的产绒性能进行检测。宏观方面,该绒山羊表现出了多部位羊绒成簇聚集生长的表型,与对照相比产绒量提高31.5%,绒纤维长度增加35%,且并没有影响绒纤维的细度和强度;微观方面,我们通过石蜡切片及HE染色发现该绒山羊皮肤组织中次级毛囊的数量与对照相比增加19%,次级毛囊平均直径增加48.3%。表明该绒山羊具有良好的产绒性能,可以作为动物模型用于研究VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的作用机制,并可作为高产优质绒山羊培育的育种材料。二、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析1、转录组学研究以基因编辑绒山羊为实验组,以未经基因编辑的体细胞核移植绒山羊和经自然交配产生的野生型绒山羊共同作为对照组,通过转录组测序研究皮肤组织在m RNA水平的差异。按照|log2FC|≥0.848、p-adjust<0.05为标准,共筛选到差异基因1,246个,其中上调基因843个,下调基因403个。对差异基因参与的生物学功能进行分析,发现其主要富集到生长因子结合、PI3K-AKT信号通路和细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）受体互作中,且PI3K-AKT信号通路与VEGF信号通路有交汇,共同作用于花生四烯酸代谢。2、TMT（Tandem Mass Tags）蛋白质组学研究通过TMT标记,对绒山羊皮肤组织中的蛋白质进行研究,以上调差异倍数1.2、下调差异倍数0.83、p-adjust<0.05为标准,共筛选得到差异蛋白178个,其中上调蛋白108个,下调蛋白70个。在GO富集中,差异蛋白主要富集到花生四烯酸代谢过程、内质网腔和铁离子结合;在KEGG富集中,差异蛋白主要富集在其他多糖降解、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢。且差异蛋白在花生四烯酸代谢中的富集呈现出高表达蛋白多而分散、低表达蛋白少而集中的特点。3、LC-MS非靶向代谢组学研究通过非靶向代谢组学分析绒山羊皮肤组织中代谢物的种类和含量,共筛选到122个已被命名的差异代谢物,其中阳离子73个,阴离子49个。在KEGG富集中,差异代谢物主要富集到亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和甲状腺素合成中,且代谢物在花生四烯酸代谢中富集的位置与蛋白质组一致。此前研究表明,VEGF表达量的升高和FGF5的降低均能提高p-AKT的表达,证明PI3K-AKT信号通路被激活。结合本研究中高通量测序结果,表明VEGF的高表达与FGF5的敲除共同激活PI3K-AKT信号通路,进而影响花生四烯酸的代谢进程,最终对绒山羊的绒毛生长产生影响。三、VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的研究以GFFs为实验材料,通过添加PI3K-AKT信号通路激活剂740 Y-P和抑制剂NU7441,分析二者对GFFs细胞增殖、凋亡和周期方面的影响,并通过real-time PCR和Western Blot对PI3K-AKT信号通路中的核心蛋白AKT及其磷酸化形式p-AKT和花生四烯酸代谢通路中的PLA2G4D、PTGS2、CYP2B和EPHX2的表达量进行检测,探究VEGF和FGF5对花生四烯酸代谢通路的影响。结果显示在PI3K-AKT信号通路激活剂740 Y-P处理后的GFFs中,上述基因的表达趋势与VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊皮肤组织中的趋势一致。表明VEGF和FGF5通过影响PI3K-AKT信号通路的活化状态,进而作用于花生四烯酸代谢,阻碍了花生四烯酸向EETs（Epoxyeicosa trienoic acid）和DHETs（Dihydroxyeicosa trienoic acid）的转化,进而促进绒山羊的绒毛生长。本研究初步阐明了VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的机制,为培育高产优质绒山羊提供了育种材料,更为下游功能基因和核心作用分子的发掘提供了理论基础。
宫文静[3]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究说明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
李特[4]（2021）在《Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展》文中研究表明背景:目前部分研究提示磷酸酶肌动蛋白调控因子1（Phactr1）的遗传变异与动脉粥样硬化性心血管疾病相关,然而Phactr1是如何影响动脉粥样硬化的进展以及其相关机制尚未明确,需要进行深入研究及探讨。因此,明确Phactr1的作用机制及其影响将促进我们对动脉粥样硬化的进一步理解,根据相关研究结果,可能会发现治疗动脉粥样硬化疾病的新靶点。基于上述原因,深入研究其作用机制是一项具有重要临床意义的课题。目的:深入了解Phactr1在斑块稳定性中的作用,探讨Phactr1在动脉粥样硬化中潜在的作用机制,在Phactr1缺陷小鼠中对ox-LDL诱导的巨噬细胞极化,炎症反应和泡沫细胞形成进行研究。方法:应用Apoe基因敲除小鼠(Apoe-/-)、Phactr1全基因敲除小鼠(Phactr1-/-)、Apoe和Phactr1双基因敲除小鼠(Phactr1-/-Apoe-/-,DKO)及KLF4δMC过表达、Apoe、Phactr1基因敲除小鼠(KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-)建立动脉硬化模型,给予八周大雄性DKO和Apoe-/-小鼠高脂饮食（16%的脂肪和1.3%的胆固醇）,持续16周,对总甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）进行测定。对小鼠血管组织进行染色后评估细胞内脂质含量、斑块的形态、斑块的负荷、坏死面积以及纤维帽厚度。通过定量RT-PCR检测小鼠巨噬细胞中Phactr1 m RNA的表达。通过定量RT-PCR及ELISA分析对小鼠炎症反应程度（TNF-α和IL-6）进行评估。通过BM移植策略评估造血Phactr1缺乏对动脉硬化的影响。通过定量RT-PCR对TNF-α、IL-6、Arg1、CD206及KLF4的表达进行检测。同时,我们应用免疫印迹和定量分析检测LOX-1,SR-A,CD36,ABCA1、ABCG1及KLF4的蛋白质表达情况。用免疫印迹分析p38MAPK和CREB的磷酸化情况。通过双重荧光素酶报告基因测定系统对CREB反应元件的荧光素酶活性进行检测。结果:（1）Phactr1荧光强度在晚期动脉粥样硬化斑块中较强,并且主要在Mac2阳性细胞中表达,晚期病变的Apoe-/-小鼠Phactr1表达增加,而正常饮食的Apoe-/-小鼠Phactr1的表达实际上较低。（P<0.05）（2）高脂饮食16周后,Phactr1+/+和Phactr1-/-小鼠的体重和食物摄入量没有差异。高脂饮食的Apoe-/-小鼠血浆中TC,TG和LDL-C含量较高,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的血脂水平与Apoe-/-小鼠相当。（P<0.05）（3）主动脉窦横截面上的油红O染色显示,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块比Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块更显着。Phactr1-/-Apoe-/-小鼠坏死核区域更大,纤维帽更薄,巨噬细胞堆积更多。Phactr1缺乏导致Apoe-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块中胶原蛋白的积累明显减少。（P<0.05）（4）Phactr1-/-Apoe-/-小鼠主动脉中TNF-α和IL-6含量更高,血浆中TNF-α和IL-6水平也升高。（P<0.05）（5）与移植了Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠相比,移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠的斑块更显着。富含脂质的坏死核的面积显着增加,纤维帽厚度相应减少,巨噬细胞负荷增加。（P<0.05）（6）移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠,主动脉中TNF-α和IL-6的表达显着增加,血浆TNF-α和IL-6的水平升高。（P<0.05）（7）在存在ox-LDL的情况下,Phactr1的表达上调并在12小时达到峰值。ox-LDL至少部分通过Lox-1/NF-κB途径诱导巨噬细胞中Phactr1表达。（8）Phactr1的缺失显着促进BMDMs中M1巨噬细胞标志物如TNF-α和IL-6的表达,而M2表型标记物如Arg1和CD206的表达则显着降低。Phactr1-/-BMDMs中,M1巨噬细胞比例增加,而M2巨噬细胞比例则受到抑制。（P<0.05）（9）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1-/-BMDMs中的致动脉粥样硬化细胞因子水平更高,包括TNF-α,IL-6,RANTES,CCL2,IL-1β,IFN-γ以及M-CSF。Phactr1的沉默增强了ox-LDL诱导的这些细胞因子的表达。（P<0.05）（10）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1的缺失导致细胞内脂质含量显着增加。Phactr1-/-BMDMs中细胞内胆固醇含量明显高于Phactr1+/+BMDMs中的胆固醇水平。（P<0.05）（11）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1基因敲除导致BMDMs中LOX-1,SR-A和CD36的水平升高,而Phactr1基因敲除对ABCA1和ABCG1的表达没有明显影响。（P<0.05）（12）Phactr1和CREB在BMDM中直接相互作用。Phactr1和CREB之间的直接相互作用通过Flag-Phactr1和HA-CREB共转染的HEK293T细胞免疫共沉淀进一步证实。Phactr1过表达可增强CREB反应元件的活性。（P<0.05）（13）Phactr1-/-BMDMs中KLF4的表达降低。使用CREB抗体在KLF4启动子上进行的Ch IP-q PCR表明Phactr1敲除降低了CREB对BMDMs中KLF4启动子（片段1内的CREB结合基序）的结合。Phactr1过表达后HEK293T细胞中KLF4的转录活性显着增强。（P<0.05）（14）通过转导KLF4腺病毒（Ad-KLF4）来过表达KLF4可减少因Phactr1缺失诱导的M1表型标志物的表达,恢复M2表型标志物的表达。（P<0.05）（15）在Phactr1缺陷的BMDM中,KLF4过表达减轻了清道夫受体Lox-1,CD36和SR-A的增加趋势。（P<0.05）（16）KLF4上调显着降低了Phactr1-/-BMDM中细胞内胆固醇的含量。Ad-KLF4上调可减少因Phactr1缺乏所致的泡沫细胞的形成。油红色O染色区域的测量结果显示,与接受Phactr1-/-Apoe-/-BM的DKO(Phactr1-/-Apoe-/-)小鼠相比,接受KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的DKO小鼠斑块面积明显减少。（P<0.05）结论:（1）在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加。（2）Phactr1可抑制M1促炎表型,其减少可促进向易损斑块表型发展的速度,Phactr1可延缓动脉粥样硬化的进展。（3）Phactr1是巨噬细胞介导炎症、巨噬细胞极化以及泡沫细胞形成的关键因素。（4）KLF4过表达能够部分抵消因Phactr1缺乏对动脉粥样硬化斑块的加剧作用。
成姣岐[5]（2021）在《WAP4二硫核心域蛋白2（Wfdc2）在造血干细胞从胎肝迁移至骨髓中的作用研究》文中研究指明目的:在小鼠造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）发育过程中,HSCs在胎肝内扩增后,移位到骨髓,以维持造血系统的终生稳定。但是哪些因子调节胎肝HSCs移位至骨髓,目前知之甚少。本研究旨在探讨乳清酸性蛋白四硫化物核心域蛋白2（WAP 4-disulfide bond core domain 2,Wfdc2）在HSCs发育过程中从胎肝迁移至骨髓过程中的作用。实验方法:通过q RT-PCR检测胎肝和成年鼠骨髓内造血细胞Wfdc2的表达。利用CRISPR/Cas9技术产生杂合型Wfdc2+/-小鼠（C57BL/6遗传背景）。采用流式细胞术分析E14.5 Wfdc2-/-胎肝细胞及E18.5 Wfdc2-/-骨髓细胞中的HSCs比例和数量。取E14.5 Wfdc2+/+和Wfdc2-/-胎肝细胞（CD45.2）通过单纯性和竞争性骨髓移植植入经致死剂量照射受体小鼠（CD45.1或CD45.1/2）,分别于移植后1、2和3个月分析受体鼠外周血中CD11b、Gr-1、CD3及B220阳性细胞数比例,移植后3个月分析受体鼠骨髓内HSCs的数目。以竞争性骨髓移植受体小鼠为研究对象,在移植后第3个月给受体鼠注射5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）,在5-FU作用后第9天检测受体鼠外周血各群细胞的比例,在第10天检测受体鼠骨髓内HSCs的数目;将Wfdc2蛋白或PBS孵育的CD45.1骨髓细胞与数目相同的CD45.2骨髓细胞移植入CD45.1/2受体鼠体内,移植后1、2和3个月分别检测受体鼠外周血CD11b、Gr-1、CD3及B220阳性细胞比例,观察Wfdc2蛋白对HSCs体内重构能力的影响。结果:1.Wfdc2特异性高表达于小鼠HSCs中,且E14.5胎肝内CD45+Lin-c-Kit+细胞内Wfdc2的表达显着高于成年鼠骨髓CD45+Lin-c-Kit+细胞（p（27）0.01）。2.Wfdc2基因敲除不影响E14.5胎鼠存活,但Wfdc2基因敲除小鼠在出生后不能存活。3.与E14.5 Wfdc2+/+胚胎肝脏细胞中非成熟细胞（Lin-）、LSK（Lin-c-Kit+Scal-1+）细胞及HSCs（Lin-c-kit+Scal-1+CD48-CD150+）细胞数相比,Wfdc2-/-胚胎肝脏非成熟细胞数量具有增高趋势,但无统计学意义,LSK细胞和HSCs数量无明显区别。4.与E18.5 Wfdc2+/+胚胎骨髓细胞中非成熟细胞、LSK细胞及HSCs数量相比,Wfdc2-/-胚胎骨髓内LSK细胞与HSCs百分比明显降低（p（27）0.01）。5.单纯性骨髓移植和竞争性骨髓移植实验结果表明,Wfdc2敲除不会影响小鼠HSCs的重建能力和多向分化能力。6.竞争性骨髓移植受体小鼠经5-FU处理后,与Wfdc2+/+来源的HSCs相比,Wfdc2-/-HSCs重建造血系统能力显着降低,骨髓内Wfdc2-/-LSK细胞和HSCs数量显着降低（P（27）0.01）,外周血中的Wfdc2-/-CD11b、Gr-1及B220阳性细胞比例显着降低（P（27）0.01）。7.Wfdc2蛋白增强HSCs体内重建能力:与PBS组相比,外周血中经Wfdc2蛋白孵育组HSCs来源的造血细胞比例显着升高（p（27）0.01）,外周血中的CD11b、Gr-1、CD3以及B220阳性细胞比例显着增加（p（27）0.05）。结论:1.Wfdc2高表达于胎肝HSCs;Wfdc2基因敲除不影响E14.5胎肝HSCs数量,但E18.5骨髓HSCs明显减少,Wfdc2调节胎肝HSCs向骨髓迁移。2.基因敲除Wfdc2不会影响HSCs的体内重建能力。3.基因敲除Wfdc2降低应激条件下HSCs的造血系统重建能力。4.Wfdc2蛋白增强HSCs的体内重建和多向分化能力。
孙佳[6]（2021）在《在三阴性乳腺癌中LNK调控Jak2-Stat3通路的机制研究》文中认为乳腺癌（breastcancer,BC）是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤,其最为致命的亚型是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子2（HER-2）均为阴性的三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）。目前,TNBC仍以手术根治及化疗为主,因其缺乏有效的临床治疗靶点而对现有的内分泌治疗不敏感,具有较高的复发率并易向远处转移,预后很差,是临床治疗的难题。因此,探索TNBC的发生发展机制,挖掘其在生物治疗上的新靶点具有重要意义。淋巴细胞调节蛋白 LNK（lymphocyte adaptor protein,LNK）,又称为 SH2B3,是SH2B家族的成员,不具有酶活性,是造血系统的负向调节因子,主要在造血细胞和内皮细胞中表达,在血液肿瘤中低表达。然而LNK在实体瘤中功能的研究很少,课题组在前期研究中发现LNK在TNBC中高表达,本研究主要探讨LNK在TNBC发生发展中的生物学功能及其作用机制,为TNBC的临床治疗及靶点的选择提供理论依据。方法:1.利用免疫组化（IHC）分析人LNK（hLNK）在TNBC以及非TNBC患者的肿瘤样本中的表达水平。2.采用western blot以及qRT-RCR方法检测乳腺癌细胞株中hLNK的表达。3.将pLKO-shLNK83、pLKO-shLNK84质粒经293T细胞包装、制备敲减hLNK的病毒液,感染人TNBC细胞株:MDA-MB-231（MB-231）以及人非TNBC细胞株:MCF-7,经嘌呤霉素筛选,建立敲减hLNK的稳转细胞株231-shLNK83、231-shLNK84以及 MCF-7-shLNK83、MCF-7-shLNK84。4.运用PCR扩增hLNK cDNA,并亚克隆入慢病毒载体pCDH,构建重组质粒pCDH-hLNK,包装过表达hLNK的重组慢病毒并感染人TNBC细胞株:MB-231、MDA-MB-453（MB-453）以及非TNBC细胞株:MCF-7,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定过表达 hLNK 的细胞系:MB-231-hLNK（231-hLNK）、MB-453-hLNK（453-hLNK）以及MCF-7-hLNK。5.通过荧光显微镜法观察、western blot法分析hLNK在上述乳腺癌细胞株中的表达水平;通过CCK-8、平板克隆实验分析hLNK敲减/过表达后对乳腺癌细胞增殖的影响;利用划痕实验、transwell小室侵袭实验探究hLNK敲减/过表达后对乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。6.运用western blot方法分析hLNK过表达/敲减后乳腺癌细胞中信号分子Jak2、Stat3、Stat5、AKT、PI3K、p38的磷酸化水平以及14-3-3家族蛋白的表达水平,初步分析hLNK过表达/敲减后影响TNBC发生发展的机制。结果:1.IHC结果表明,hLNK在TNBC患者肿瘤样本中较非TNBC样本,呈高表达。2.Western blot及qRT-PCR结果表明,hLNK在人TNBC细胞株MB-231中高表达。3.hLNK 敲减的 TNBC 细胞株:231-shLNK83、231-shLNK84 以及非 TNBC 细胞株:MCF-7-shLNK83、MCF-7-shLNK84成功构建。平板克隆、CCK-8增殖实验结果表明,hLNK敲减后MB-231无法正常增殖,而MCF-7细胞的增殖,细胞侵袭能力显着增强,且MCF-7-shLNK84的效果更为显着,提示,hLNK为MB-231细胞正常增殖所必须,缺乏则导致该细胞的增殖停滞并死亡。4.hLNK过表达的TNBC细胞株:231-hLNK,453-hLNK以及非TNBC细胞株:MCF-7-hLNK均成功构建。平板克隆、CCK-8、划痕实验以及transwell实验结果均表明:hLNK过表达的TNBC细胞株231-hLNK和453-hLNK的增殖、迁移以及侵袭能力均受到抑制,但仍具有较高的增殖、迁移和侵袭能力,而MCF-7-hLNK则完全丧失该能力。提示,在TNBC细胞株中,LNK上调仍以促进肿瘤进展的作用为主,但其促癌作用可能受到LNK表达水平的调控,一定水平的LNK是TNBC增殖、迁移和侵袭所必须,强制过度表达的LNK反而对TNBC细胞具有一定的抑制作用。5.信号通路分子活化水平的分析结果表明,在TNBC细胞株:MB-231-hLNK、MB-453-hLNK中,p-Jak2、p-Stat3的表达水平得到下调,提示hLNK过表达影响TNBC发展的作用可能主要通过Jak2-Stat3通路进行。在MCF-7中敲减hLNK,细胞中p-Stat3的表达水平得到显着上调,提示hLNK敲减对非TNBC细胞株而言,依然主要通过Jak2-Stat3通路促进其发展。结论:TNBC中,一定表达水平的LNK为TNBC增殖所必须,但强制过表达LNK具有抑制TNBC的发生发展的作用,该作用主要通过Jak2-Stat3信号通路所引起的。
张珊珊[7]（2021）在《视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究》文中研究说明血管生成是通过已有的血管发芽而形成新血管的过程,胚胎发育完成后生理性与病理性血管均通过此过程产生。生理性的血管生成对损伤修复、组织的生长和再生都十分关键,而生理性血管的异常生成和病理性血管的形成往往与许多疾病的发生有关。视网膜血管作为视网膜中氧气和营养供应的通道,其异常发育会诱发许多眼病,如家族性渗出性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等。目前对于这些疾病仍缺少有效的诊疗方法,寻找影响血管生成的基因,明确生理性血管发育与病理性血管生成的机制,对于这些疾病的诊疗具有重要意义。本论文研究了三个基因在视网膜血管生成中的作用,并对其调控机制进行了研究,为血管性眼病的治疗提供了参考。论文的主要内容如下:1.首次就TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其机制进行了研究。研究发现,人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常。另外,在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Tmem30a导致视网膜表层血管发育迟缓、密度降低,血管末端膨大,顶端内皮细胞的数量减少,丝状伪足数目降低;在小鼠全身敲除Tmem30a还会导致血管壁的完整性遭到破坏。而在小鼠视网膜血管发育完成后敲除Tmem30a不会影响血管网络的维持。在转录水平进行分析发现在敲减TMEM30A的人视网膜血管内皮细胞与全身敲除Tmem30a小鼠的肺组织中与细胞周期有关的基因表达量减少;同时蛋白质免疫印迹分析发现其中涉及VEGF信号传导的相关蛋白质的磷酸化水平也明显降低。以上结果表明,Tmem30a在血管生成和维持血管屏障的完整性中发挥了作用,其通过调节VEGF的信号传导来控制血管生成。2.研究了TWIST1基因在视网膜病理性血管生成中的作用。研究发现在血管内皮细胞条件性过表达Twist1的小鼠中出现了视网膜表层血管发育迟缓、前端异常增生和局部渗漏的表型。免疫荧光染色发现该小鼠血管内皮细胞增殖速度显着加快,小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达增多,血管内皮生长因子分泌异常。而血管内皮细胞核染色显示血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠血管内皮细胞核多为椭圆形,且不指向无血管区。该结果说明Twist1过表达导致星形胶质细胞的异常激活,其分泌的血管内皮生长因子随之升高,进一步导致了血管的异常增生,同时Twist1过表达后引起的血管内皮细胞极性的丧失会导致血管发育迟缓。而在小鼠视网膜血管发育完成后过表达Twist1不会影响血管网络的维持。另外,全身过表达Twist1后,小鼠眼球变小,视网膜表层血管发育迟缓、密度下降、局部渗漏,与在血管内皮细胞过表达Twist1的表型不同,说明Twist1在其他细胞中同样发挥作用。体外荧光素酶实验发现过表达TWIST1导致Norrin/β-catenin信号通路活性增强。以上结果表明TWIST1可能通过异常激活Norrin/β-catenin信号通路导致视网膜病理性新生血管的生成。3.鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1,并对其致病机制进行了研究,首次将DLG1与FEVR相关联,进一步明确了DLG1影响血管生成的作用机制。研究表明DLG1的错义突变S598G使DLG1无法正常激活β-catenin信号的传导,血管形成实验表明敲减DLG1影响了人视网膜血管内皮细胞的管腔形成,蛋白免疫印迹实验证明了DLG1缺失后VEGFR2蛋白磷酸化水平降低。综上,本研究阐明了TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其分子机制,证实了TWIST1在病理性血管生成中的作用,鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1。为血管性眼病及其他病理性血管生成疾病的治疗提供了新的药物治疗靶点。
贺健[8]（2021）在《单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育》文中研究指明哺乳动物血液系统为中胚层起源,在发育早期具有多位点起始、多谱系层级等特征。解析血液发生过程的细胞命运和分子机制对再生医学意义重大。造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）是个体血液系统形成的基础,并且通过自我更新（Self-renewal）和多系分化（Multilineage differentiation）维持个体整个生命周期的血液系统功能。一般认为,胚胎时期的造血干细胞起源于主动脉-性腺-中肾区域（Aorta-gonad-mesonephros,AGM）的背主动脉（Dorsal aorta）腹侧,由一群具有生血潜能的内皮细胞（Hemogenic endothelial cell,HEC）经内皮生血转化（Endothelial to hematopoietic transition,EHT）发育而来。目前关于造血干细胞起源的认识大部分都是基于小鼠,斑马鱼等模式动物的研究。由于早期人胚样本较难获得,以及细胞数量相对较少,人们对于人胚造血干细胞的发生过程仍然知之甚少,尤其是关于HSC前体细胞HEC的特征及其富集策略,亟待通过高效的方法和手段加以解析。本研究中,我们首先对胚胎背主动脉的细胞进行基于10x Genomics平台的单细胞转录组测序（sc RNA-seq）,分析鉴定出一群特异性高表达RUNX1的内皮细胞,功能富集分析该群体具有明显的RNA合成和代谢活跃等特征;通过对差异基因中表面标志分子的筛选,我们推测CD44具有在内皮细胞中富集生血内皮细胞的潜能。随后,我们对背主动脉区域的内皮细胞中CD44+和CD44-的群体进行富集测序（Single cell tagged reverse transcription sequencing,STRT-Seq）,发现CD44+主要富集了动脉内皮细胞,而CD44-主要富集了静脉内皮细胞,并且在动脉内皮细胞中分离出一群表达RUNX1,MYB和ANGPT1的生血内皮细胞,功能富集分析显示这群生血内皮细胞同样表现出显着的核糖体代谢等特征。随后,我们使用STRT-Seq对背主动脉中的CD34+CD45+的造血干祖细胞（HSPC）进行了测序,分析鉴定出一个淋系祖细胞和一个髓系祖细胞亚群,以及三个分别表现为明显动脉特征、细胞周期活跃以及相对成熟的造血干祖细胞亚群。联合所有的内皮细胞和造血干祖细胞群体,我们构建了胚胎背主动脉区内皮生血转化过程中细胞特化的路径,并发现一些基因,如EMCN,PROCR和RUNX1T1会在内皮向造血命运决定的时刻呈现瞬时上调表达的趋势。通过对极早期胚胎体进行测序分析,我们发现了一群同样兼具内皮和生血特征的早期生血内皮细胞。相比于背主动脉生血内皮细胞,早期生血内皮细胞缺乏动脉特征和Notch信号的富集。联合所有的内皮造血细胞进行分析,我们推测早期生血内皮细胞不需要经历类似于背主动脉生血内皮细胞的动脉化过程,而直接分化产生造血细胞。最后,利用配-受体对分析,我们解析了背主动脉区域不同间质,上皮和内皮细胞群体与生血内皮细胞的潜在互作关系,并提示了Notch,BMP4,TGF-beta等信号通路在生血微环境形成过程中潜在的调控作用。同样,我们利用sc RNA-seq解析了人胚发育过程中卵黄囊和胎肝中细胞异质性,明确了其中巨核细胞的转录组特征。通过比较分析,我们发现卵黄囊中的巨核细胞主要呈现糖酵解等特征,而胎肝中的巨核细胞主要呈现周期活跃等特征。进一步地,我们整合并分析了巨核细胞自身的异质性,发现其除了产生血小板的常规巨核细胞亚群,还包含了一群胞外基质特征明显的微环境形成巨核细胞,和一群CD14+免疫调节特性的巨核细胞。通过假时序分析,我们发现这些不同的巨核细胞亚群呈现两种分化模式并且具有不同的转录调控机制。总的来说,我们围绕造血干细胞发生过程和巨核细胞异质性,利用单细胞转录组测序解析了人胚早期造血系统发育的分子细胞图谱。我们首先在背主动脉区域捕获到一群兼具动脉内皮特征和生血特征的造血干细胞;进一步的筛选发现CD44是能够高效富集生血内皮的表面标志分子;随后我们又解析了背主动脉区域造血干祖细胞的异质性,并联合动脉内皮细胞和生血内皮细胞,绘制了内皮生血转化的细胞发育路径和探究了该过程中的分子变化规律;此外,我们在极早期的胚内发现了一群缺乏动脉内皮特征的早期生血内皮细胞;并且通过分析背主动脉区不同细胞群体与生血内皮细胞的互作,在分子水平上阐释了生血微环境异质性;最后,我们解析了巨核细胞的发育位点差异和群体的异质性,及其分化过程的调控模式。这些发现不仅填补了人胚早期血液系统发生过程的知识空缺,同时也为血液相关疾病的治疗尤其是体外血液再生策略提供重要理论基础。
段红霞,熊朝亮,景林,徐庆吉,刘晶玉,马欣然,王大吉,向建全,何志恒,冯静,阎锡蕴[9]（2020）在《CD146三十年研究的回顾与展望》文中研究说明CD146分子发现于1987年,最初被认为是黑色素瘤标志分子,随后30余年的研究,逐渐揭示了该分子在早期发育、免疫应答、代谢等生理过程,以及在肿瘤、炎症、自身免疫病中的重要作用及机制.目前认为, CD146不仅是一个黏附分子,还是新生血管、T细胞活化和多种肿瘤的标志分子,更是一种细胞膜受体,接受细胞外信号并调控细胞内多种重要信号途径.最近,越来越多的临床研究报道,无论是细胞膜表面的CD146,还是血清和其他体液中的可溶性CD146（soluble CD146, sCD146）,都已成为多种疾病诊断和预后评价的重要参考,将成为疾病治疗的新靶点.迄今,全球已有40余株CD146抗体,有些治疗性抗体已进入临床试验阶段.本文全面回顾了CD146的研究历史,分析了当前亟待解决的关键科学问题,展望了其未来临床应用的潜能,以期为全面认识CD146,充分发挥其在疾病诊疗中的价值提供更多借鉴.
储冰冰[10]（2020）在《创伤性脑损伤后VEGF/FLK-1信号、MMP-7基因的表达及法医学意义》文中认为目的:研究创伤性脑损伤后VEGF/FLK-1信号和MMP-7基因在海马区及海马区以外的大脑组织中的表达及分布,探讨它们在创伤性脑损伤后的分子作用机制及其表达变化与损伤时间之间的关系,为法医学和创伤性脑损伤的分子病理学研究提相关的实验依据。方法:SD大鼠40只（雌、雄均有,体重250±10 g）随机分为正常对照组（Normal组,5只）和创伤性脑损伤组（TBI组,35只）,其中TBI组又分为7个亚组:TBI 30 min组、TBI 6 h组、TBI 1 d组、TBI 3 d组、TBI 5 d组、TBI 7 d组、TBI9 d组。根据Marmarou自由落体打击模型的原理,自行设计自由落体打击器,构建TBI模型。通过模型组大鼠行为学变化及大脑组织H-E染色观察,判断是否造模成功,并分别取大鼠海马及海马以外的大脑组织,采用免疫组织化学染色技术、免疫荧光染色技术及Western Blot技术检测VEGF、FLK-1、MMP-7基因表达的蛋白变化。结果:（1）在正常对照组中,大鼠大脑海马区组织及大脑皮质、髓质中VEGF、FLK-1、MMP-7基因均有少量表达,与正常对照组相比,模型组海马组织中:VEGF/FLK-1信号中VEGF及FLK-1蛋白在损伤后的6 h内表达持续降低,6 h后表达急剧升高,3 d时表达达到高峰后开始降低,并维持在高于正常组的水平;MMP-7的表达在损伤后即开始上调,3 d时表达达到高峰后急剧降低,5 d后表达下降变缓,并维持在高于正常组的水平。（2）在大脑皮质及髓质中,VEGF、FLK-1、MMP-7的表达在髓质的分布较皮质广泛,与正常对照组相比,模型组大脑皮质及髓质中:VEGF的表达在损伤后30 min内稍微升高,30 min后开始降低,6 h时表达低于正常组,6 h后表达上调直到3 d时又开始降低,5 d后表达又持续升高并维持在较高水平;FLK-1的表达在损伤后6 h内持续降低,6 h后表达升高,3 d时表达达到高峰后缓慢降低,但始终维持在高于正常组的水平;MMP-7的表达在损伤后即开始持续升高,7 d时表达达到高峰后急剧降低,但仍高于正常组水平。结论:VEGF/FLK-1信号的基因及MMP-7基因在创伤性脑损伤后表达上调,其可能通过血管新生、神经元及神经胶质再生对脑损伤起修复作用。在创伤性脑损伤中,VEGF/FLK-1信号基因及MMP-7基因的表达呈动态变化,可能与创伤性脑损伤的发生、发展过程有关。VEGF/FLK-1及MMP-7三个基因在海马及海马以外的大脑皮质、髓质中的表达并不完全一致,存在着差异性,它们在创伤性脑损伤中的表达变化趋势,在法医学中,对推断创伤性脑损伤的损伤时间具有一定的参考价值。
二、血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）整合eGWAS和eQTL分析绵羊全血转录组与繁殖激素的关联（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 血液转录组的应用研究 |
| 1.1.1 预测疾病生物标记物 |
| 1.1.2 鉴定免疫调控因子 |
| 1.1.3 家畜生产管理中的应用 |
| 1.2 绵羊繁殖转录组研究进展 |
| 1.2.1 巴美肉羊概况 |
| 1.2.2 基于性腺轴的研究进展 |
| 1.2.3 可变剪接与单核苷酸多态性的调控研究 |
| 1.3 绵羊产羔与排卵的调节机制 |
| 1.3.1 BMP15、GDF9 对排卵和产羔数的调节 |
| 1.3.2 FSH、LH对排卵和产羔数的调节 |
| 1.4 研究的主要内容 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 研究一不同产羔类型绵羊血液转录组时序动态表达初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 RNA提取 |
| 2.1.4 转录组文库构建与测序 |
| 2.1.5 测序数据质量评估和过滤去噪 |
| 2.1.6 参考序列比对与转录本检测定量分析 |
| 2.1.7 差异表达基因分析 |
| 2.1.8 差异可变剪接分析 |
| 2.1.9 差异表达基因与差异可变剪接的聚类分析 |
| 2.1.10 短时序表达分析 |
| 2.1.11 功能富集分析 |
| 2.1.12 统计显着性分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 绵羊产羔类型的差异表达基因分析 |
| 2.2.2 绵羊产羔类型差异可变剪接分析 |
| 2.2.3 绵羊产羔类型差异表达基因与差异可变剪接的聚类分析 |
| 2.2.4 绵羊转录组时序表达变化 |
| 2.2.5 绵羊转录组时序动态表达模块分析 |
| 2.2.6 绵羊转录组时序可变剪接变化 |
| 2.2.7 绵羊产羔类型与时序性表达的整合分析 |
| 2.2.8 试验重复性验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 3 研究二大样本动态血液基因整合e GWAS解析绵羊繁殖激素共表达网络 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 RNA 提取与建库测序 |
| 3.1.4 测度数据质量评估与过滤去噪 |
| 3.1.5 参考序列比对与转录本检测定量分析 |
| 3.1.6 血清LH、FSH、GDF9与BMP15 的浓度测定 |
| 3.1.7 加权基因共表达网络分析 |
| 3.1.8 eGWAS分析 |
| 3.1.9 基因功能注释与候选位点的确定 |
| 3.1.10 构建主题文献摘要与全文的绵羊GWAS数据库 |
| 3.1.11 机器学习验证分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 全局样本构建繁殖激素调控的共表达网络 |
| 3.2.2 基于表达的全基因组关联研究 |
| 3.2.3 产羔类型相关的模块 |
| 3.2.4 激素调控相关模块 |
| 3.2.5 产羔类型与月份之间的关联模块 |
| 3.2.6 绵羊GWAS数据库验证全局网络的功能属性 |
| 3.2.7 机器学习验证小样本产羔类型差异表达基因对于大样本的支持度 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 4 研究三 LH/FSH 血清浓度比值的绵羊等位基因特异性表达与遗传关联研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 试验主要仪器与设备 |
| 4.1.3 RNA提取 |
| 4.1.4 转录组文库构建与测序 |
| 4.1.5 测序数据质量评估与过滤去噪 |
| 4.1.6 参考序列比对与转录本检测定量分析 |
| 4.1.7 LH、FSH激素浓度的测定 |
| 4.1.8 差异表达基因分析 |
| 4.1.9 差异ASE分析 |
| 4.1.10 eQTL分析 |
| 4.1.11 功能富集分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 LH与FSH血清浓度相关性分析 |
| 4.2.2 LH/FSH比值在不同月份的方差分析 |
| 4.2.3 LH/FSH比值在不同月份的转录组差异分析 |
| 4.2.4 LH/FHS比值差异表达基因通路富集分析 |
| 4.2.5 ASE证实血液存在广泛的顺式调控影响 |
| 4.2.6 eQTL-SNP和 ASE-SNP联合分析 |
| 4.2.7 eQTL-SNP与 ASE-SNP富集分析 |
| 4.2.8 LH/FSH比值生物标志物的表达基因型 |
| 4.2.9 LH/FSH比值生物标志物的遗传调控网络 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 5 研究四 GDF9、BMP15 血清浓度的绵羊等位基因特异性表达与遗传关联研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 试验主要仪器与设备 |
| 5.1.3 RNA提取 |
| 5.1.4 转录组文库构建与测序 |
| 5.1.5 测序数据质量评估与过滤去噪 |
| 5.1.6 参考序列比对与转录本检测定量分析 |
| 5.1.7 血清GDF9、BMP15 激素浓度的测定 |
| 5.1.8 差异表达基因分析 |
| 5.1.9 差异ASE分析 |
| 5.1.10 eQTL分析 |
| 5.1.11 功能富集分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同GDF9 血清浓度的差异表达基因分析 |
| 5.2.2 不同GDF9 血清浓度的ASE分析 |
| 5.2.3 不同BMP15 血清浓度的差异表达基因分析 |
| 5.2.4 不同BMP15 血清浓度的ASE分析 |
| 5.2.5 GDF9与BMP15 的联合分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 6 全文主要结论、创新点及展望 |
| 6.1 论文主要结论 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 论文未来研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（2）VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 VEGF和 FGF5 调节毛发生长的研究进展 |
| 1.1 VEGF的分子特征与功能 |
| 1.1.1 VEGF的分子特征 |
| 1.1.2 VEGF的分子功能 |
| 1.1.3 VEGF促进毛发生长的研究进展 |
| 1.2 FGF5 的分子特征与功能 |
| 1.2.1 FGFs的分子特征 |
| 1.2.2 FGF5 的生物学功能 |
| 1.2.3 FGF5 促进毛发生长的调控机制 |
| 1.3 结语 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 VEGF在 FGF5 位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 试剂耗材 |
| 1.2.2 仪器设备 |
| 1.2.3 溶液配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定 |
| 1.3.2 基因编辑绒山羊产绒性能检测 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定 |
| 1.4.2 基因编辑绒山羊产绒性能检测 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 VEGF在 FGF5 位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂耗材 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转录组学研究 |
| 2.3.2 TMT蛋白质组学研究 |
| 2.3.3 LC-MS非靶向代谢组学研究 |
| 2.3.4 VEGF和 FGF5与PI3K-AKT信号通路 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 转录组学研究 |
| 2.4.2 TMT蛋白质组学研究 |
| 2.4.3 LC-MS非靶向代谢组学研究 |
| 2.4.4 VEGF和 FGF5与PI3K-AKT信号通路 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 VEGF和 FGF5 调节绒山羊绒毛生长的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞增殖检测 |
| 3.3.3 细胞凋亡检测 |
| 3.3.4 细胞周期检测 |
| 3.3.5 Real-Time PCR检测 |
| 3.3.6 Western Blot检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 细胞增殖检测 |
| 3.4.2 细胞凋亡检测 |
| 3.4.3 细胞周期检测 |
| 3.4.4 Real-Time PCR检测 |
| 3.4.5 Western Blot检测 |
| 3.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及专利 |
（3）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 动脉粥样硬化的影响因素 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 动脉粥样硬化与泡沫细胞形成及巨噬细胞的脂质代谢的相关性 |
| 1.2.1 巨噬细胞胆固醇摄取 |
| 1.2.2 胆固醇酯化及水解 |
| 1.2.3 胆固醇排出 |
| 1.2.4 与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成有关的GWAS发现 |
| 1.3 动脉粥样硬化与巨噬细胞炎症反应 |
| 1.3.1 不同巨噬细胞表型分布 |
| 1.3.2 巨噬细胞功能的多样性 |
| 1.3.3 巨噬细胞极化与动脉硬化 |
| 1.3.4 巨噬细胞与炎性介质 |
| 1.4 动脉粥样硬化与KLF4 |
| 1.4.1 KLF4 与泡沫细胞 |
| 1.4.2 KLF4 与巨噬细胞极化 |
| 1.5 动脉粥样硬化与Phactr1 |
| 1.5.1 Phactr1基因与蛋白 |
| 1.5.2 Phactr1基因的心血管作用 |
| 1.5.3 Phactr1基因多态性及心血管疾病的影响 |
| 第2章 Phactr1缺乏通过促进M1 巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究材料、器材及方法 |
| 2.2.1 主要研究器材及试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加 |
| 2.3.2 Phactr1的消耗可加剧动脉粥样硬化进展 |
| 2.3.3 Phactr1在巨噬细胞中的消耗会加速M1 巨噬细胞极化,炎症和泡沫细胞形成 |
| 2.3.4 Phactr1促进CREB激活和KLF4 转录 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）WAP4二硫核心域蛋白2（Wfdc2）在造血干细胞从胎肝迁移至骨髓中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物模型建立 |
| 2.2.2 检测指标与方法 |
| 2.2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Wfdc2 在小鼠胎肝HSCS中呈高表达 |
| 3.2 Wfdc2 基因敲除致小鼠出生后不能存活 |
| 3.3 E14.5 Wfdc2~(-/-)胚胎肝脏中HSCS的数目变化 |
| 3.4 E18.5 Wfdc2~(-/-)胚胎骨髓中HSCS的数目变化 |
| 3.5 单纯性骨髓移植条件下,敲除Wfdc2 不影响胎肝HSCS体内重建能力. |
| 3.6 敲除Wfdc2 不影响竞争环境下HSCS的骨髓重建能力 |
| 3.7 敲除Wfdc2 降低化疗损伤条件下造血细胞的再生 |
| 3.8 Wfdc2 蛋白增强成年小鼠HSCS体内骨髓重建能力 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 小鼠胎肝HSCs迁移至骨髓的分子调控 |
| 参考文献 |
（6）在三阴性乳腺癌中LNK调控Jak2-Stat3通路的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 LNK在人乳腺癌中的表达情况 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第2章 LNK在人乳腺癌中的作用及其机制的初步探究 |
| 1. 实验材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 LNK蛋白的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
（7）视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究意义 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 视网膜血管的发育 |
| 1.2.2 视网膜血管生成异常眼病的治疗进展 |
| 1.2.3 小鼠模型在视网膜血管发育研究中的应用 |
| 1.2.4 家族性渗出性玻璃体视网膜病变的研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的结构安排 |
| 第二章 TMEM30A在视网膜血管生成中的功能研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验所需溶液的配制 |
| 2.2.3 人视网膜细胞的培养 |
| 2.2.4 人视网膜血管内皮细胞的感染 |
| 2.2.5 Trizol法提取细胞总RNA |
| 2.2.6 RNA的逆转录及实时定量PCR |
| 2.2.7 血管形成实验 |
| 2.2.8 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印记实验 |
| 2.2.10 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 2.2.11 实验小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.12 视网膜铺片的制备 |
| 2.2.13 视网膜铺片的免疫荧光染色 |
| 2.2.14 冰冻切片的制备 |
| 2.2.15 免疫组化染色 |
| 2.2.16 视网膜铺片增殖染色 |
| 2.2.17 小鼠组织蛋白提取 |
| 2.2.18 细胞凋亡检测 |
| 2.2.19 转录组测序分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR |
| 2.2.21 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 磷脂内翻酶及TMEM30A在血管内皮细胞中广泛表达 |
| 2.3.2 人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常 |
| 2.3.3 血管内皮细胞敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.4 全身敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.5 TMEM30A影响血管内皮细胞增殖与VEGF的信号传导 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 TWIST1在视网膜病理性血管生成中的功能研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 3.2.3 实验小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.4 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 3.2.5 人视网膜血管内皮细胞中TWIST1的过表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TWIST1 在正常血管内皮细胞中表达量较低 |
| 3.3.2 血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠视网膜表层血管发育异常 |
| 3.3.3 血管内皮细胞过表达Twist1促进血管内皮细胞增殖 |
| 3.3.4 血管内皮细胞过表达Twist1影响血管内皮细胞极性 |
| 3.3.5 血管内皮细胞过表达Twist1影响VEGF分泌 |
| 3.3.6 过表达TWIST1后Norrin/β-catenin信号通路活性上调 |
| 3.3.7 全身过表达Twist1的小鼠的视网膜血管发育异常 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 家族性渗出性玻璃体视网膜病变家系致病相关突变筛查 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 样本收集及伦理审查 |
| 4.2.3 外周血收集及DNA提取 |
| 4.2.4 全外显子测序 |
| 4.2.5 全外显子测序结果的生物信息学分析 |
| 4.2.6 致病基因筛选原则 |
| 4.2.7 Sanger测序验证筛选到的致病基因 |
| 4.2.8 点突变质粒的构建 |
| 4.2.9 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 4.2.10 人视网膜血管内皮细胞中DLG1的敲减 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者临床表型评估 |
| 4.3.2 家族性渗出性玻璃体视网膜病变致病基因筛选 |
| 4.3.3 S598G突变影响了DLG1功能的正常发挥 |
| 4.3.4 DLG1在人视网膜血管内皮细胞及小鼠各组织中广泛表达 |
| 4.3.5 敲减DLG1影响了血管内皮细胞的正常成管 |
| 4.3.6 敲减DLG1影响了VEGFR2的磷酸化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 早期人胚背主动脉的细胞异质性解析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验样本的获取 |
| 1.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 人胚背主动脉的解剖分离 |
| 1.4.2 单细胞悬液的制备 |
| 1.4.3 流式细胞分选和10x Genomics建库测序 |
| 1.5 数据分析和处理 |
| 1.5.1 测序原始数据预处理 |
| 1.5.2 表达矩阵降维和细胞聚类 |
| 1.5.3 细胞类型识别和差异表达分析 |
| 1.5.4 细胞群体的相关性分析 |
| 1.6 实验结果 |
| 第二章 人胚生血内皮细胞的富集及其转录组特征分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验样本的获取 |
| 2.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实验样本的获取 |
| 2.4.2 流式细胞分选及分析 |
| 2.4.3 STRT-seq建库及测序 |
| 2.5 数据处理和分析 |
| 2.5.1 测序原始数据预处理 |
| 2.5.2 降维和聚类,以及差异分析 |
| 2.5.3 基因表达的相关性分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 内皮细胞中CD44~+和CD44~-群体的分选及特征 |
| 2.6.2 RUNX1~+生血内皮细胞的特征鉴定 |
| 2.6.3 生血内皮细胞的特征基因分析 |
| 第三章 人胚背主动脉造血干祖细胞及内皮造血转化的解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验样本的获取 |
| 3.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 组织分离,单细胞悬液制备,流式分选和建库 |
| 3.4.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 3.4.3 内皮生血转化假时序分析 |
| 3.4.4 基因表达模式分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 人胚背主动脉中造血干祖细胞的转录组异质性 |
| 3.5.2 内皮细胞和造血干祖细胞的联合分析 |
| 3.5.3 内皮造血转化过程及其特征规律 |
| 第四章 极早期胚胎体生血内皮的转录组水平解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料和分析方法 |
| 4.3.1 实验样本的获取和单细胞建库 |
| 4.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 4.3.3 数据分析方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人胚极早期发育阶段的细胞异质性解析 |
| 4.4.2 极早期胚胎内皮和造血细胞异质性解析 |
| 4.4.3 极早期生血内皮和背主动脉生血内皮的差异比较 |
| 第五章 人胚早期背主动脉生血微环境的转录组解析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.3 实验材料和分析软件 |
| 5.3.1 数据样本 |
| 5.3.2 分析软件 |
| 5.4 数据分析方法 |
| 5.4.1 配-受体互相作用分析 |
| 5.4.2 配-受体基因的通路富集分析 |
| 5.4.3 细胞群体互作强度的可视化 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 背主动脉生血内皮与微环境细胞群体互作概览 |
| 5.5.2 内皮细胞群体与生血内皮的互作分析 |
| 第六章 人胚早期巨核细胞的异质性解析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验设计 |
| 6.3 实验材料和分析软件 |
| 6.3.1 数据样本 |
| 6.3.2 实验试剂、设备和分析软件 |
| 6.4 实验和数据分析方法 |
| 6.4.1 卵黄囊和胎肝的单细胞悬液制备 |
| 6.4.2 流式分选和单细胞建库 |
| 6.4.3 测序数据的预处理和质控 |
| 6.4.4 数据批次校正 |
| 6.4.5 降维,聚类和差异分析 |
| 6.4.6 巨核细胞分化假时序分析 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 人胚卵黄囊细胞群体的鉴定 |
| 6.5.2 人胚胎肝细胞群体的鉴定 |
| 6.5.3 巨核细胞群体的鉴定和差异比较 |
| 6.5.4 巨核细胞群体异质性分析 |
| 6.5.5 巨核细胞的分化路径分析 |
| 第七章 结论和展望 |
| 7.1 人类胚胎造血干细胞产生过程的单细胞解析 |
| 7.2 人类胚胎巨核细胞的发育分化规律 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（9）CD146三十年研究的回顾与展望（论文提纲范文）
| 1 CD146的发现及命名 |
| 2 CD146的表达调控及翻译后修饰 |
| 2.1 CD146的基因组定位及结构 |
| 2.2 CD146在胚胎发育时期的动态表达 |
| 2.3 CD146在正常组织中的表达 |
| 2.4 CD146在病变组织中的表达 |
| 2.5 CD146的表达调控 |
| 2.6 CD146的翻译后修饰 |
| 3 CD146与信号转导 |
| 3.1 CD146作为细胞膜受体参与信号传导 |
| 3.2 CD146参与调控细胞骨架重排 |
| 3.3 CD146的反馈调节机制 |
| 4 CD146与发育 |
| 4.1 CD146与神经系统发育 |
| 4.2 CD146与循环系统发育 |
| 4.3 CD146与胚胎植入和极性建立 |
| 4.4 CD146的“极性”特征 |
| 4.5 CD146在发育领域的应用前景 |
| 5 CD146与间充质干细胞 |
| 5.1 CD146是MSCs的标志分子 |
| 5.2 CD146推动对间充质干细胞认知的发展 |
| 5.3 CD146与MSCs功能的相关性及其在应用研究中的意义 |
| 6 CD146与肿瘤及肿瘤微环境 |
| 6.1 CD146是肿瘤“恶性”的标志分子 |
| 6.2 CD146调控肿瘤增殖和转移的机制 |
| 6.3 CD146重塑肿瘤微环境 |
| 6.4 CD146成为肿瘤治疗新靶点 |
| 7 CD146与免疫 |
| 7.1 CD146是T细胞活化的标志分子 |
| 7.2 CD146+T细胞的功能 |
| 7.3 CD146与T细胞免疫相关疾病 |
| 7.4 CD146与其他免疫细胞 |
| 8 可溶性CD146 |
| 8.1 sCD146的来源 |
| 8.2 sCD146与疾病诊断 |
| 8.3 sCD146的生理功能 |
| 9 CD146抗体 |
| 9.1 CD146抗体与靶向治疗 |
| 9.2 CD146抗体的临床诊断意义 |
| 9.3 CD146的其他抗体 |
（10）创伤性脑损伤后VEGF/FLK-1信号、MMP-7基因的表达及法医学意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语中英对照表 |
| 前言 |
| 1 创伤性脑损伤 |
| 2 创伤性脑损伤鉴定中生物学标志物的研究 |
| 3 VEGF/FLK-1 信号及MMP-7 因子 |
| 4 本课题研究的目的和意义 |
| 实验材料 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验试剂、仪器及主要用品 |
| 实验方法 |
| 1 实验试剂的配制 |
| 1.1 免疫组化常用试剂的配制 |
| 1.2 Western Blot检测法常用试剂的配制 |
| 2 实验动物分组 |
| 3 建模方法 |
| 3.1 TBI动物模型的建立 |
| 3.2 正常对照组的处理 |
| 4 标本获取及处理 |
| 5 病理学染色技术 |
| 5.1 防脱载玻片制作 |
| 5.2 石蜡切片的制作 |
| 5.3 H-E染色 |
| 5.4 免疫组织化学染色 |
| 5.5 免疫荧光染色 |
| 6 Western Blot检测法 |
| 6.1 制备样本 |
| 6.2 制胶 |
| 6.3 上样及电泳 |
| 6.4 蛋白转印 |
| 6.5 牛奶封闭 |
| 6.6 抗体孵育 |
| 6.7 图像曝光和采集 |
| 7 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 行为学及形态学观察 |
| 1.1 创伤性脑损伤后实验动物观察 |
| 1.2 大体形态观察 |
| 1.3 H-E染色观察 |
| 2 免疫组织化学染色观察 |
| 2.1 VEGF、FLK-1、MMP-7 基因在大鼠海马区中的表达 |
| 2.2 VEGF、FLK-1、MMP-7 基因在大鼠海马区外大脑组织中的表达 |
| 3 免疫荧光染色结果分析 |
| 3.1 正常对照组 |
| 3.2 模型组 |
| 4 Western Blot检测结果分析 |
| 4.1 VEGF、FLK-1、MMP-7 基因在海马组织中表达量的变化 |
| 4.2 VEGF、FLK-1、MMP-7 基因在海马区外大脑组织中表达量的变化 |
| 讨论 |
| 1 TBI模型的建立 |
| 2 海马的分区及功能 |
| 3 VEGF/FLK-1 信号及MMP-7 因子在脑损伤后再生与修复中的作用 |
| 4 VEGF、FLK-1及MMP-7 基因在海马组织中的表达 |
| 5 VEGF、FLK-1及MMP-7 基因在海马区外大脑组织中的表达 |
| 6 VEGF、FLK-1及MMP-7 基因在不同组织中表达的比较 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 VEGF/FLK-1信号通路的生物学特性及作用机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
四、血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]整合eGWAS和eQTL分析绵羊全血转录组与繁殖激素的关联[D]. 孙燕勇. 内蒙古农业大学, 2021
- [2]VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究[D]. 呼啸. 内蒙古大学, 2021(10)
- [3]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [4]Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展[D]. 李特. 吉林大学, 2021(01)
- [5]WAP4二硫核心域蛋白2（Wfdc2）在造血干细胞从胎肝迁移至骨髓中的作用研究[D]. 成姣岐. 南昌大学, 2021
- [6]在三阴性乳腺癌中LNK调控Jak2-Stat3通路的机制研究[D]. 孙佳. 扬州大学, 2021(08)
- [7]视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究[D]. 张珊珊. 电子科技大学, 2021(01)
- [8]单细胞转录组解析人类胚胎造血干细胞与巨核细胞的发育[D]. 贺健. 军事科学院, 2021(02)
- [9]CD146三十年研究的回顾与展望[J]. 段红霞,熊朝亮,景林,徐庆吉,刘晶玉,马欣然,王大吉,向建全,何志恒,冯静,阎锡蕴. 中国科学:生命科学, 2020(12)
- [10]创伤性脑损伤后VEGF/FLK-1信号、MMP-7基因的表达及法医学意义[D]. 储冰冰. 大理大学, 2020(05)
标签：内皮细胞论文; 血管生成论文; 血管内皮生长因子论文; 细胞生长因子论文; 基因合成论文;