一、人类有望不再献血 干细胞可生成血细胞（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中指出癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
杨玉兰[2]（2021）在《Cetuximab联合自然杀伤细胞对乳腺癌细胞体外作用的研究》文中进行了进一步梳理
钱婷婷[3]（2021）在《毛细管内多层SiO2纳米粒内衬支架构建及其循环肿瘤细胞高载量捕获》文中提出
颜悦[4]（2021）在《普乐沙福联合雷帕霉素或者环孢素A对心脏移植的影响》文中研究表明
梁昌玖[5]（2021）在《RDW及NLR对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后意义的临床研究》文中研究指明
阮迎春[6]（2021）在《OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究》文中提出人毛囊间充质干细胞（Human hair follicle mesenchymal stem cell,hHFMSC）来源于毛囊并具有多向分化潜能。转导多潜能因子OCT4后,hHFMSC的细胞形态和粘附性发生变化,出现贴壁和悬浮两种亚群,其中悬浮亚群经过一系列造血因子诱导能向红细胞转分化。目的:检测贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4的过表达水平,观察细胞形态、骨架、粘附性以及增殖能力的改变,转录组测序分析两种亚群的去分化差异,验证OCT4通过ZO-1调控骨架蛋白、粘附分子及增殖相关基因的表达,从而初步揭示OCT4通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径重塑细胞骨架并促进自我更新的分子机制,为体外获得可大量扩增的造血前体细胞奠定实验基础。方法:在前期建立的OCT4转导hHFMSC的细胞模型基础上,进行如下研究:（1）免疫荧光染色检测贴壁和悬浮亚群中OCT4的表达与定位,qPCR和Western blot进一步检测两种亚群中OCT4的表达量差异。（2）利用Wright-Giemsa染色观察贴壁和悬浮亚群的细胞形态变化,考马斯亮蓝染色观察细胞骨架结构,鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白F-actin的形态与分布;细胞粘附实验和细胞分离实验比较粘附性变化。（3）转录组测序分析两种亚群中组织特异性基因表达谱以及增殖相关基因表达谱并进行GO功能富集分析。（4）CCK8实验检测细胞的增殖能力;二维克隆形成实验检测细胞的克隆形成率;免疫细胞化学检测Ki67增殖指数;qPCR检测增殖细胞核抗原PCNA的表达。（5）qPCR和Western blot检测ZO-1、ACTN2、E-cadherin和β-catenin的表达,qPCR检测Cyclin D1的表达。（6）si RNA敲低ZO-1反证上述实验结果。结果:（1）OCT4表达定位于贴壁和悬浮亚群的细胞核,两种亚群中OCT4显着过表达且悬浮亚群中OCT4的过表达量较高;（2）转导OCT4后hHFMSC形态和细胞骨架均显着改变,由长梭形变为短梭形或多边形的贴壁亚群和小而圆的悬浮亚群,细胞骨架微丝由相对平行的纤维状转变为不规则网状,丝状肌动蛋白F-actin形态由平行束状变为凝结块状;转导OCT4后hHFMSC粘附性减弱,且悬浮细胞与贴壁细胞相比粘附性更低。（3）贴壁亚群和悬浮亚群中下调基因显着富集于毛囊及皮肤发育相关GO条目,包括表皮发育及角化相关基因KRT15、基底膜形成相关基因COL17A1以及毛囊发育相关基因FZD3、FOXQ1、FGF7以及ALX4等;贴壁亚群和悬浮亚群中上调基因显着富集于增殖相关生物过程,包括有丝分裂细胞周期的调节、细胞周期阻滞的负调控、细胞生长调节、细胞周期G1/S转换以及干细胞增殖调控等。（4）转导OCT4后细胞的自我更新能力和克隆形成率显着提高,且贴壁亚群的增殖能力、克隆形成率显着高于悬浮亚群;但贴壁亚群Ki67的阳性百分比低于悬浮亚群,增殖细胞核抗原PCNA的m RNA表达水平也低于悬浮亚群。（5）转导OCT4后悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、β-catenin和Cyclin D1的m RNA表达水平均显着高于贴壁亚群,而E-cadherin表达无显着差异。（6）ZO-1沉默后悬浮细胞中ZO-1、ACTN2和β-catenin的m RNA和蛋白表达水平均显着下调,而E-cadherin及Cyclin D1的表达水平未见显着改变;ZO-1沉默后悬浮细胞骨架略舒展,F-actin交织呈类似于环形的网格状且向细胞核周围聚集趋势更加明显。结论:OCT4可能通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径重塑细胞骨架及粘附性,并可能进一步调控Cyclin D1表达而影响hHFMSC的自我更新,且不同的OCT4过表达量对hHFMSC自我更新的影响不同。意义:本研究旨在探索OCT4可能通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径调节hHFMSC细胞骨架及粘附的作用,并进一步促进hHFMSC自我更新及重编程,为后期深入研究OCT4通过重塑细胞骨架与粘附来调节多潜能与造血转分化之间平衡的分子机制奠定重要的实验基础,为体外获得可大量扩增的造血前体种子细胞提供新的研究策略。
程丹[7]（2021）在《PLT、MPV、PDW、RDW和CA125在子宫内膜癌中的筛查价值》文中提出目的:本研究旨在探讨血小板计数（PLT）、平均血小板容积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、红细胞分布宽度（RDW）和糖类抗原125（CAl25）在子宫内膜癌（EC）中的诊断价值,为EC的早期筛查提供参考。方法:选取2013年01月至2020年10月在湖北民族大学附属民大医院行子宫内膜癌分期手术且术后病理诊断为子宫内膜样腺癌的患者143例（EC组）;同时期同年龄段子宫内膜息肉患者99例（子宫内膜息肉组）和体检中心健康女性103例（正常对照组）;三组患者均行血清CA125及全血细胞计数检查。用非参数检验比较三组全血细胞计数中的PLT、PDW、MPV、RDW及血清CA125表达水平,用Spearman分析EC组各指标的相关性,用受试者工作曲线（ROC）和Logistic回归分析评价5项指标单独和联合诊断EC的效能。结果:1.EC组、子宫内膜息肉组与正常对照组的差异性检验:与正常对照组相比,EC组的年龄明显偏大（P<0.05）,子宫内膜息肉组无明显差别（P>0.05）;EC组的PDW和MPV显着降低（P<0.05）,RDW、PLT、CA125显着升高（P<0.05）,但这五个指标在子宫内膜息肉组与EC组之间无显着差异（P>0.05）。2.EC组的各指标相关性分析:得出CA125与EC的FIGO分期相关;PDW与MPV相关;PDW与PLT相关;MPV与PLT相关。3.通过ROC曲线对EC组的PLT、PDW、MPV、RDW及血清CA125诊断EC的效能进行分析:得出CA125最佳截断值为28.42U/ml,灵敏度0.22,特异度0.66,曲线下面积（AUC）为0.588（P=0.026）;PLT最佳截断值为226×109g/L,灵敏度0.55,特异度0.75,AUC为0.649（P=0.001）;PDW最佳截断值为15.6f L,灵敏度0.65,特异度0.75,AUC为0.651（P<0.001）;RDW最佳截断值为43.25f L,灵敏度0.65,特异度0.63,AUC为0.649（P<0.001）;MPV的AUC为0.69,无统计学意义（P=0.229）。4.通过Logistic回归分析建模及ROC曲线分析得到:PDW、CA125联合诊断EC的AUC为0.759（P=0.002）,灵敏度0.87,特异度0.58;PLT、CA125联合诊断EC的AUC为0.663（P=0.004）,灵敏度0.59,特异度0.75;RDW、CA125联合诊断EC的AUC为0.725（P=0.002）,灵敏度0.76,特异度0.59;PDW、PLT联合CA125诊断EC的AUC为0.780（P=0.001）,灵敏度0.86,特异度0.57;RDW、PLT联合CA125诊断EC的AUC为0.749（P<0.001）,灵敏度0.82,特异度0.70;RDW、PDW联合CA125诊断EC的AUC为0.779（P<0.001）,灵敏度0.82,特异度0.65;RDW、PDW、PLT联合CA125诊断EC的AUC为0.796（P<0.001）,灵敏度0.83,特异度0.71。结论:1.血清CA125、PLT、PDW、RDW对EC的诊断均有一定的临床意义;联合筛查的效能高于单一值的筛查,四者联合筛查效能最强。2.CA125、PLT、PDW、RDW诊断EC的最佳截断值分别为28.42U/ml、226×109g/L、15.6f L和43.25f L。3.EC组中CA125与FIGO分期呈正相关;PDW与MPV呈正相关;PDW与PLT呈负相关;PLT与MPV呈负相关。
王世才[8]（2021）在《声表面波器件在微量细胞前处理中的研究与应用》文中提出声表面波（Surface acousticwave,SAW）是自然界中存在的声波之一,其在地震波的研究中首先被发现。随着人们对SAW原理理解的深入和电子器件的制备工艺提升,人们于上个世纪利用压电晶体成功构建了 SAW电子器件。SAW器件诞生后,迅速在精密电子传感器件领域占据了重要的地位。随着微纳加工技术的进一步发展,SAW应用越来越广泛,近年来被应用于生物医学材料领域,并显示了重要的应用前景。利用声场结构设计以及声波强度调节等方式可以对微纳米材料进行精确操控,因此诞生了“光镊”技术相对应的被称为“声镊”的技术。顾名思义,SAW声镊技术可以在微纳米尺度实现细胞的驱动、输运、富集、操控甚至裂解等一系列功能,在生物样品的处理中具有巨大的应用意义。在对多细胞生物组织的样品中特定细胞中的目标生化分子进行传感测试之前,经过液化处理的生物样品常常需要经过三个必要且相关的步骤来进行处理,即样品的中细胞的分离提纯,细胞富集以及细胞裂解。从具有两种或两种以上尺寸相差仅为几微米的不同细胞的生物样品中将目标细胞进行精准分离往往使用离心的方法,分离效率率和样本捕获效果都较差。此外,当液体样本中出现样品浓度过低不能满足检测最低需求量的情况时,常用高速离心的方法解决。这不仅对设备性能要求更高,而且需要大量样本多次富集才能符合要求,因此亟待发展一种对微量液体样本中微纳米颗粒或者细胞的富集方法。对于经过分离纯化与富集的细胞样品而言,需要进行裂解才可以获得细胞内蛋白质和核酸等关键化合物以进行后续检测。常用的裂解设备常需要相当大的样本量,细胞裂解试剂因具有较强毒性对操作者具有一定的危害,因而迫切需要一种小样品、低浓度的细胞样品的的快速无害裂解方法。基于以上问题,本论文将提出研究新型SAW微流体技术在微纳尺度上实现精确操控,实现细胞液体样品的前处理,提供新技术与新型SAW器件以实现细胞内容物的检查提供有效可靠的细胞操控与细胞内生化分子的释放。本研究将声学物理场的设计与生物细胞材料的声学特性进行结合,深入理解SAW在固体-液体界面传播特性,探究SAW对液体中对细胞和微粒行为的影响。同时,在对应的功能器件的设计制备的基础上,实现并观察了 SAW微流体系中发生的声学干涉效应和声致微流效应,实现对动植物细胞的分离和细胞的高效裂解。还从理论上指出了自聚焦富集效应。本论文研究内容主要包括以下四个方面:（1）SAW激发传播特性及功能声场的设计和SAW功能器件的设计与制备通过有限元仿真模拟在128°Y切X传的铌酸锂（128° YX-LiNbO3）晶体表面实现了 SAW的激发与传播,观察到了特征模态与瞬态传播,验证了相关理论。进一步通过仿真实现了在层流结构中对中心样品流的位置分布调控,结合SAW驻波场仿真,实现了声驻波场对流体中直径分别为5 μm和10 μm的聚苯乙烯微粒（Polystyrene,PS）的快速分离。通过MATLAB建模计算讨论了在声驻波场与微流通道具有相对倾角时输入功率、通道流速和倾角角度对微粒的分离距离的影响。讨论了在铌酸锂衬底-微流通道壁上发生的声波耦合及其在通道壁-液体域界面处发生的全反射现象,进而发现了在铌酸锂衬底-微流通道壁-流体域的交点处的衍射波对流体域中声波传输的重要影响。经过平面波近似提出了衍射波与由铌酸锂衬底耦合进入流体域的漏波发生干涉的效应,进而指出这一发现有望实现微纳米微粒富集。此外,利用SAW对微量液滴中的声致微流效应,研究了微量细胞液滴中加入的尺寸不同的微粒后对细胞的冲击与破碎作用机制,优化条件实现了细胞的高效裂解。根据以上理论利用微纳加工技术设计并制备了相应的功能器件,搭建了驱动测试系统。（2）基于驻波SAW的微粒偏移和动植物细胞分选通过调节入口鞘层流和样品流的流速,实现对微流通道中样品流及其中微粒的位置进行调控。发现了在层流界面的溶解度变化导致的磷酸盐缓冲液的析晶浑浊现象,利用这种现象实现了对SAW驻波场的可视化观察。在与声场相平行的微流通道中观察到人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）与人白血病细胞（Jurkat）细胞在声场作用下的快速偏移,实现了对两种细胞混合样本的快速分选。在与声场有倾角的微流通道中观察到了对应倾角角度的聚乙烯微粒侧向偏移以及其在出口的分选。针对不同材料具有的不同声学特性在相对倾角为15°的微流通道中分别实现了聚苯乙烯微粒、动物细胞、植物细胞的不同尺寸同种微粒的分选,以及相近尺寸不同密度两种微粒的分选。首次在SAW微流体系中实现了花粉分选以及完整花粉与生殖细胞的分选。（3）自聚焦SAW干涉场诱导的微纳米颗粒富集对微流通道壁-铌酸锂衬底-流体域界面交汇点的振动场进行研究,讨论其经压电衬底振动激发产生的“衍射波”的形成机制。讨论平面波近似下,该“衍射波”与由铌酸锂衬底表面耦合进入流体中漏波引起的干涉现象。研究了在特定尺寸通道内仅存在单个时域平均后的低声压中心时的干涉声场特征。通过体积力以及声流场分析确定流体中的微粒富集趋势。发现不同流道壁材料以及液体声速中的干涉声场,分析其对声场分布的影响。通过对声场中的微粒流动轨迹分析,实现了对直径为10 μm和5μm微粒的快速富集。在分析具有不同通道尺寸比例的通道内曳力和声辐射力的大小以及力之比的分布的基础上,优化了具有更强富集能力的微流通道尺寸比例,实现了直径为800 nm和500 nm的亚微米颗粒快速富集,并有望实现纳米颗粒的快速分离与富集技术。（4）SAW诱导的液滴内细胞-微粒碰撞致细胞高效裂解利用声致微流效应,实现在SAW传播路径上液滴内部的流体的高速运动。液滴内流体的高速运动能够带动液滴内的细胞与其他微粒快速运动,因为不同密度、不同尺寸的颗粒活细胞的运动速度与加速度不同,细胞与颗粒之间发生高频碰撞,从而实现细胞快速裂解。对细胞裂解的原理及过程进行了系统研究,提出了细胞在裂解前后的合外力变化分析。通过台盼蓝染色快速判断经由SAW作用前后的细胞裂解效果,研究微粒存在、输入功率、裂解时间、液滴体积以及微粒尺寸对细胞裂解效率的影响。通过活细胞染色试剂Calcium AM染色确定细胞裂解前后膜功能的完整性,通过细胞膜染色试剂DiO与红色荧光蛋白RFP的共同作用确定细胞裂解前后细胞膜结构和功能的变化。结合扫描电镜图提出细胞-微粒碰撞裂解模型,通过对选用的微粒材料和细胞的动力学估算辅证了模型的理论可行性。此外,本文实现了多种细胞的高效裂解,为低浓度、微量细胞的裂解与细胞质释放的应用提供了指导。综上所述,本论文提出了基于SAW的微流体生物样品前处理方法,实现了基于SAW驻波场、SAW干涉场和声致微流效应在细胞分选、富集和裂解方面的应用。通过仿真理论设计并构建了不同的应用器件,使用驻波SAW器件实现了声驻波场中的微粒偏移,进一步实现了动植物细胞的分选并首次实现了花粉与生殖细胞的分选。通过微扰理论对SAW干涉场进行研究,实现了快速的微米尺寸微粒富集,通过调节微流通道结构参数实现了亚微米尺寸微粒富集,并为纳米微粒富集提供了方法。此外,利用声致微流新效应驱动了液滴内细胞与微粒的高速运动与碰撞,实现了多种细胞的快速高效裂解。本文的研究工作为SAW开拓了新的应用领域,其研究结果将对微量细胞的分离、聚集和细胞内生化分子的释放提供了多种“声镊”操作平台。
杜鹃[9]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中研究表明1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
冯新哲[10]（2021）在《基于单细胞测序探究强直性脊柱炎炎症和骨化进程中巨噬细胞和干细胞的交互关系》文中研究指明一、研究背景强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）是一种遗传相关性显着的慢性自身免疫性疾病。目前,AS没有公认的特异性标志物,其发病机制尚不十分清楚。经流行病学调查,中国约有0.3%的人口罹患此病,患者群体数量庞大。AS多始发于20至40岁的中青年,起病隐匿,它以骶髂关节慢性进行性炎症为始发症状和主要特征。炎症病变常向上蔓延至中轴骨骼、向下累及外周关节,晚期则可导致脊柱或髋关节周围软组织纤维性或骨性融合,甚至造成严重的身体畸形和残疾,给病患及其家庭带来了巨大的痛苦。强直性脊柱炎的发病机制虽然在过去二十年里已经在世界范围内进行了广泛而深入的研究,但人们对其炎症和骨化的发病机制及相互关系仍没有形成统一认识。同时,AS的临床治疗一直未有突破性进展,公认疗效最好的生物制剂（肿瘤坏死因子（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）抑制剂）虽然能够短期缓解部分人群的临床症状,但对于有效阻止病人晚期骨化强直并不理想。AS病变部位一旦累及脊柱及外周关节,病人生活质量将大大下降。因此深入了解这些部位病理环境的微观构成和细胞之间的生物学行为更有助于我们理解AS的发病机制,也为药物开发提供有价值的作用靶点。到目前为止,人们对AS炎症和骨化的关系观点不一。AS韧带局部病理微环境中有哪些细胞构成以及他们发挥的功能也未见报道。因此,本课题利用单细胞转录组学测序,对AS脊柱韧带附着点微环境中各种细胞的亚群构成和交互形式进行分析。并通过体内、体外两种方式深入探讨以巨噬细胞为代表的炎症细胞和具有成骨分化潜能的韧带来源干细胞之间交互的分子机制,探索了AS中炎症和骨化间的关系。二、研究目的第一部分:通过对强直性脊柱炎脊柱附着点处韧带进行单细胞转录组学分析找到与炎症和骨化相关的细胞交互类型并且对关键分子进行表达量的验证。第二部分:探究强直性脊柱炎脊柱韧带微环境中巨噬细胞影响韧带来源干细胞成骨分化进程和细胞迁移的机制。第三部分:验证VEGFA靶向VEGFR2受体介导异位成骨的体内、体外机制。三、研究方法第一部分:（1）收集了5例脊柱矫形的AS病人和3例脊柱骨折的健康对照者的相同腰椎节段棘上韧带、棘间韧带和黄韧带附着点组织,制作单细胞悬液,基于BD Rhapsody技术在全程质控下对收集的细胞进行单细胞转录组学测序。（2）利用生物信息学手段处理了单细胞转录组学结果,着重探究脊柱韧带附着点部位病理性微环境中的细胞亚群构成,并重点分析了与AS炎症和骨化表型相关的细胞之间的交互关系及靶信号分子,并对靶分子在疾病组和对照组目的细胞中的表达进行差异分析。（3）采集AS和正常人的血清、单核细胞和腰椎骨折病人的腰椎韧带组织,并使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质免疫印迹（Western Blot）、实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和免疫组织化学（IHC）技术对靶分子VEGFA表达量进行了检测。第二部分:（1）选取AS和腰椎骨折病人腰椎附着点处韧带组织切片,用免疫荧光（IF）的方法对巨噬细胞及VEGFA进行标记,并对他们的表达量和相关性进行分析。（2）对人外周血单核细胞进行M2方向的诱导,选取CD14、CD206作为标记基因对其进行流式细胞术鉴定;选取CD73、CD90、CD105、CD14、CD34和CD45作为标记基因,对提取的韧带间充质干细胞进行流式鉴定。（3）设计不同浓度TNF-α（0、5、20ng/ml）对AS的M2巨噬细胞进行干预,通过RT-q PCR和ELISA检测VEGFA的表达量。（4）对AS和对照组腰椎韧带干细胞同时行成骨诱导分化,分别在诱导分化7天行碱性磷酸酶（ALP）染色和活性定量,21天行茜素红染色和钙结节定量,对比其成骨分化能力。（5）选取上述实验中的最佳浓度TNF-α（20ng/ml）刺激后的M2巨噬细胞培养上清,并将实验分为对照组（只成骨诱导）、TNF-α刺激组和TNF-α刺激+VEGF抑制剂组,对成骨分化培养过程中的AS韧带干细胞进行干预,培养7天后进行ALP染色及活性检测;RT-q PCR检测ALP、Runx2、COL1A1三种成骨指标表达量以反映三组细胞成骨分化情况。（6）设计不同浓度下VEGFA的刺激实验对成骨分化诱导过程中的AS韧带干细胞进行干预,在3天、7天进行ALP染色和活性定量;9天、14天进行茜素红染色和钙结节定量;并使用RT-q PCR的方法检测成骨相关指标表达量,检验其促成骨的能力。（7）利用单细胞测序结果,通过GO分析对AS韧带干细胞中VEGFA受体相关富集基因进行分析,对得到的GO功能和关联基因网络进行Clue GO可视化,并深入挖掘VEGFA对AS韧带干细胞刺激后激活的胞内信号分子和相关通路。（8）VEGFA调控AS韧带干细胞成骨分化的分子机制的探究:荧光共定位标记AS韧带切片的VEGFA和其功能性靶受体（VEGFR1、R2、R3）,对它们的共定位进行检测;选取3例AS组和3例对照组韧带干细胞在VEGFA刺激下同时进行成骨诱导,使用Western Blot检测各个受体激活的程度;设计不同时间梯度下VEGFA对成骨分化进程中AS韧带干细胞的刺激实验,通过Western Blot验证激活通路的组学分析结果;通过目标通路和目标受体的抑制试验,并结合ALP染色及活性检测、茜素红染色和钙结节定量的成骨能力检测,对上述VEGFA介导成骨的分子机制进行进一步验证。（9）将实验分为对照组（加入等量DMSO溶剂）、单纯VEGFA刺激、单纯Ki8751（靶受体VEGFR2抑制剂）干预和Ki8751干预后VEGFA刺激组,通过迁移小室检测VEGFA对AS韧带干细胞迁移能力的影响。第三部分:（1）选取并构建VEGFA稳定干扰的U937细胞系,设计不同分组,通过与AS腰椎韧带干细胞共培养的方式验证巨噬细胞通过VEGFA介导韧带干细胞成骨分化的交互关系。（2）构建由人软骨蛋白聚糖诱导的AS小鼠模型（PGIA）,分离脊柱及周围组织并制作组织切片,应用小动物X线、苏木精-伊红染色（HE染色）、番红-固绿染色对脊柱进行摄片和病理染色,检验模型构建的成功与否。（3）通过IHC染色、ELISA检测AS小鼠模型和正常对照组脊柱关节盘及其周围组织和血清中VEGFA的表达。（4）对AS小鼠模型行Ki8751（VEGFR2抑制剂）干预实验:实验共分3组,分别是阴性对照组（抑制剂溶剂注射）、早期抑制剂干预组（实验进程0周开始干预）、中期抑制剂干预组（实验进程10周开始干预）。探究抑制AS小鼠动物模型VEGF受体信号对脊柱异位骨化和破坏的影响,以及对比不同干预时程的疗效。（5）选取成骨相关转录因子（Osterix）作为成骨细胞标记分子,选取CD44、CD90为干细胞标记分子。分别通过IHC和IF对AS模型脊柱组织切片成骨细胞和间充质干细胞进行病理学染色,比较上述注射了Ki8751的干预组和未干预组间关节盘周围两种细胞的数量变化,检验VEGFR2信号轴在小鼠脊柱部位干细胞迁移和成骨分化中的作用。四、研究结果第一部分:（1）通过单细胞转录组学测序及分析,结果在AS和对照组（腰椎骨折病人）腰椎韧带附着点共鉴定出26个细胞亚群,并且M2型巨噬细胞亚群和干细胞亚群之间存在强相关联,并在AS中均特征性高分化。生物信息学分析得到,在AS中M2型巨噬细胞（10亚群）可能通过过表达VEGFA进一步促进干细胞亚群（0亚群）的成骨分化。（2）对各样本VEGFA表达量的检测显示,其在AS患者的血清、单核细胞和腰椎韧带组织内均高表达。第二部分:（1）AS和对照组腰椎韧带巨噬细胞和VEGFA荧光标记,相关性分析结果显示,AS腰椎韧带处巨噬细胞数量和VEGFA表达量较对照组均增加,且二者成正相关。（2）流式鉴定结果显示M2型巨噬细胞和韧带干细胞均符合要求。（3）TNF-α的刺激实验表明,其可以促进AS患者M2型巨噬细胞分泌VEGFA,且分泌量随刺激浓度增加而增加。（4）韧带干细胞成骨诱导实验表明,AS韧带干细胞成骨分化能力较对照组增强。（5）AS患者M2型巨噬细胞培养上清及VEGFA的刺激实验表明,VEGFA能够促进韧带干细胞成骨分化能力和成骨相关基因表达。（6）通过GO分析对AS韧带干细胞中VEGFA受体相关富集基因进行分析发现,PI3K/Akt的激活可能参与AS腰椎韧带干细胞成骨分化。（7）综合VEGFA在AS腰椎韧带干细胞上的配体受体荧光共定位、刺激实验、VEGFA受体磷酸化检测以及信号通路检测,我们发现在AS腰椎韧带干细胞成骨分化进程中,VEGFA能够激活其表面VEGFR2受体磷酸化和PI3K/Akt信号通路。（8）上述通路抑制试验和受体抑制试验表明VEGFA介导的AS腰椎韧带干细胞成骨分化作用能够被抑制剂降低,提示其可能通过此二者介导成骨表型。（9）细胞迁移实验证实VEGFA可以促进AS腰椎韧带干细胞迁移,并且抑制VEGFR2可以阻止其迁移。第三部分:（1）通过RT-q PCR和Western Blot检测慢病毒干扰后的U937细胞系VEGFA表达,相比未干扰组U937细胞系中VEGFA表达量显着降低,提示VEGFA稳定干扰的U937细胞系构建成功;共培养实验表明以TNF-α为代表的炎症微环境刺激下,AS巨噬细胞能够以M2的形式分泌VEGFA刺激腰椎韧带干细胞成骨分化。对VEGFA进行干扰后,巨噬细胞的促成骨能力下降。（2）小动物X线、HE染色、番红-固绿染色显示:AS小鼠脊柱椎体间隙变窄、骨赘形成、椎间盘软骨丢失、椎体融合,整体呈现“竹节样改变”,提示模型构建成功。（3）检测显示,VEGFA在AS小鼠脊柱关节盘及其周围组织和血清中高表达。（4）通过设计疾病早、中期两种VEGFR2抑制剂（Ki8751）干预方式对AS模型鼠进行干预。结果表明,相比模型组,干预组能够降低AS小鼠脊柱关节炎性强直评分,且早期干预效果更佳。（5）对比有无抑制剂干预,干细胞荧光双标和成骨细胞免疫组化结果显示,阻断AS小鼠模型VEGFA/VEGFR2信号轴可以抑制其脊柱周围组织干细胞迁移和成骨分化。五、结论本课题通过三个部分的实验展示了强直性脊柱炎腰椎韧带附着点部位病理性微环境的细胞构成,并着重探讨了腰椎韧带附着点处巨噬细胞和韧带间充质干细胞的交互关系。揭示了在AS炎症微环境中,巨噬细胞大量表达VEGFA蛋白,通过旁分泌靶向周围韧带间充质干细胞表面VEGFR2受体,并通过激活PI3K/Akt通路介导其迁移和成骨分化的分子机制。VEGFA及其受体有望成为AS病理性异位骨形成的潜在治疗靶标,为临床上抗骨化的靶向药物的开发和使用提供理论依据。
二、人类有望不再献血 干细胞可生成血细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类有望不再献血 干细胞可生成血细胞（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料与试剂 |
| 1.1 细胞样本 |
| 1.2 主要实验仪器及设备 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.4 培养基及实验试剂的配制 |
| 1.5 qPCR所用引物信息 |
| 1.6 所用抗体及稀释倍数 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 包被培养皿 |
| 2.1.2 细胞复苏 |
| 2.1.3 细胞传代 |
| 2.1.4 细胞冻存 |
| 2.2 OCT4 在贴壁亚群和悬浮亚群中的定位和表达 |
| 2.2.1 细胞免疫荧光染色观察OCT4 在贴壁亚群和悬浮亚群中的定位 |
| 2.2.2 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4在m RNA水平的表达 |
| 2.3 Wright-Giemsa染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的形态、直径及核质比 |
| 2.4 考马斯亮蓝染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的骨架微丝形态 |
| 2.5 鬼笔环肽染色观察贴壁亚群和悬浮亚群中的丝状肌动蛋白F-actin的表达与分布 |
| 2.6 细胞粘附/分离实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的粘附性差异 |
| 2.6.1 细胞粘附实验检测细胞-细胞外基质的粘附 |
| 2.6.2 细胞分离实验检测细胞-细胞的粘附 |
| 2.7 转录组测序分析组织特异性基因和增殖相关基因表达谱 |
| 2.8 Cell Counting Kit(CCK-8)检测贴壁亚群和悬浮亚群的增殖能力 |
| 2.9 二维克隆形成实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的克隆形成能力 |
| 2.10 免疫细胞化学检测贴壁亚群和悬浮亚群中Ki67 增殖指数 |
| 2.11 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中增殖细胞核抗原PCNA的表达 |
| 2.12 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、E-cadherin、β-catenin以及Cyclin D1 的表达 |
| 2.13 免疫荧光检测β-catenin的入核情况 |
| 2.14 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因表达 |
| 2.14.1 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因表达 |
| 2.14.2 悬浮亚群中ZO-1 沉默效果验证 |
| 2.15 qPCR检测ZO-1 沉默后悬浮亚群中ACTN2、E-cadherin和 β-catenin以及Cyclin D1的表达 |
| 2.16 Western blot检测ZO-1沉默后悬浮亚群中Actin、E-cadherin和β-catenin的表达 |
| 3.统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的定位及过表达水平 |
| 1.1 OCT4 转导hHFMSC后产生贴壁亚群和悬浮亚群 |
| 1.2 贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的定位 |
| 1.3 贴壁亚群和悬浮亚群中OCT4 的表达水平 |
| 2.不同的OCT4 过表达量对hHFMSC形态、骨架及粘附性的影响 |
| 2.1 Wright-Giemsa染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的形态、直径以及核质比变化 |
| 2.2 考马斯亮蓝染色观察贴壁亚群和悬浮亚群的骨架微丝 |
| 2.3 鬼笔环肽染色观察贴壁亚群和悬浮亚群中丝状肌动蛋白F-actin的分布 |
| 2.4 贴壁亚群和悬浮亚群的粘附性差异分析 |
| 3.转录组测序分析贴壁亚群和悬浮亚群的去分化差异 |
| 3.1 组织特异性基因表达谱的分析 |
| 3.1.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.1.2 组织特异性基因的富集分析 |
| 3.1.3 毛囊、表皮及皮肤附属器等组织特异性基因的表达情况 |
| 3.2 增殖相关基因的GO富集分析 |
| 4.不同OCT4 过表达量对贴壁亚群和悬浮亚群自我更新能力的影响 |
| 4.1 Cell Counting Kit(CCK8)检测贴壁亚群和悬浮亚群的增殖能力 |
| 4.2 二维克隆形成实验检测贴壁亚群和悬浮亚群的克隆形成率 |
| 4.3 免疫细胞化学检测贴壁亚群和悬浮亚群的Ki67 增殖指数 |
| 4.4 qPCR检测贴壁亚群和悬浮亚群中PCNA的表达 |
| 5.OCT4 通过ZO-1/Actin/β-catenin分子途径影响细胞骨架及自我更新的机制探索 |
| 5.1 贴壁亚群和悬浮亚群中ZO-1、ACTN2、E-cadherin、β-catenin以及Cyclin D1 的表达情况 |
| 5.2 免疫荧光观察OCT4 转导后β-catenin入核表达情况 |
| 5.3 沉默ZO-1对ACTN2、E-cadherin、β-catenin和 Cyclin D1 表达的影响 |
| 5.3.1 siRNA技术沉默悬浮亚群中ZO-1 基因 |
| 5.3.2 沉默ZO-1 对细胞骨架分子、粘附分子和增殖相关基因表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 OCT4重编程的成体干细胞自我更新的分子机制和研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）PLT、MPV、PDW、RDW和CA125在子宫内膜癌中的筛查价值（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 第3章 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 子宫内膜癌早期血清学筛查及高危因素分析 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果、参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（8）声表面波器件在微量细胞前处理中的研究与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 背景及意义 |
| 1.2 声表面波概述 |
| 1.3 声表面波微流体应用 |
| 1.3.1 声表面波细胞分离 |
| 1.3.2 声表面波生物样品富集 |
| 1.3.3 声表面波细胞裂解 |
| 1.4 目前在分离、富集和裂解上存在的问题 |
| 1.5 本文内容安排及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 固体中声表面波的产生传输及声致微流效应 |
| 2.1 固体中的声波理论 |
| 2.1.1 弹性理论 |
| 2.1.2 压电效应 |
| 2.2 固体中的声波 |
| 2.3 压电材料的选定 |
| 2.4 叉指电极设定 |
| 2.4.1 叉指电极的基本结构及工作原理 |
| 2.4.2 叉指电极基本参数 |
| 2.4.2.1 指条宽度及指间间隔 |
| 2.4.2.2 叉指对数 |
| 2.4.2.3 电极孔径 |
| 2.4.2.4 IDT材料的选择及其厚度 |
| 2.5 声致微流效应 |
| 2.5.1 液滴中的声致微流效应 |
| 2.5.2 微流通道中的声致微流效应 |
| 2.5.2.1 重力 |
| 2.5.2.2 浮力 |
| 2.5.2.3 声辐射力 |
| 2.5.2.4 斯托克斯力 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 声表面波器件的分析、设计与制作 |
| 3.1 基于COMSOL的声表面波器件分析 |
| 3.1.1 模态分析与谐振分析 |
| 3.1.2 瞬态仿真分析 |
| 3.2 分选器件的声场特性及粒子运动分析 |
| 3.2.1 微粒在微流通道中的运动轨迹分析 |
| 3.2.2 声场作用下的粒子运动轨迹分析 |
| 3.3 富集芯片的声场特性分析 |
| 3.4 裂解芯片的声场特性分析 |
| 3.5 声表面波器件设计 |
| 3.5.1 分选器件的设计 |
| 3.5.2 裂解器件的设计 |
| 3.6 器件的制作与测试平台搭建 |
| 3.6.1 光刻工艺与器件制作 |
| 3.6.2 键合封装 |
| 3.6.3 后续处理 |
| 3.7 总结 |
| 参考文献 |
| 第四章 驻波声表面波调制的基于声特征尺寸的动植物细胞分选 |
| 4.1 分选原理及过程 |
| 4.2 实验所用材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 测试系统型号及设置 |
| 4.2.3 细胞培养和传代 |
| 4.2.4 细胞计数和样品制备 |
| 4.2.5 花粉的制备 |
| 4.2.6 荧光染色 |
| 4.2.7 测试样本制备 |
| 4.2.8 样本材料显微镜下照片 |
| 4.3 功能区效果展示 |
| 4.3.1 微粒汇聚功能展示 |
| 4.3.2 声表面波作用效果展示 |
| 4.4 α_0结构分选器件功能测试 |
| 4.5 α_5、α_(15)和α_(25)结构分选器件功能测试 |
| 4.6 影响分选结果的因素 |
| 4.7 功能应用 |
| 4.7.1 PS微粒与PS微粒的分选 |
| 4.7.2 231细胞与Jurkat细胞的分选 |
| 4.7.3 松花花粉与油菜花花粉的分选 |
| 4.7.4 PS微粒与231细胞的分选 |
| 4.7.5 PS微粒与油菜花花粉的分离 |
| 4.7.6 231细胞与油菜花花粉的分离 |
| 4.7.7 包被油菜花花粉与生殖细胞的分离 |
| 4.8 总结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于惠更斯-菲涅尔衍射原理的声表面波自聚焦微纳米颗粒富集 |
| 5.1 声表面波微粒富集介绍 |
| 5.2 富集原理 |
| 5.2.1 自聚焦干涉声场 |
| 5.2.2 控制方程 |
| 5.2.3 计算所用参数 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 行波的影响 |
| 5.3.2 微粒富集 |
| 5.3.3 基于流道尺寸变化的声流场调节 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 声表面波振荡诱导的细胞-微粒碰撞裂解 |
| 6.1 细胞样品裂解的介绍 |
| 6.2 实验所用材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 测试系统型号及设置 |
| 6.2.3 细胞培养和传代 |
| 6.2.4 细胞计数和样品制备 |
| 6.2.5 台盼蓝染色 |
| 6.2.6 免疫荧光染色 |
| 6.2.7 细胞-微粒碰撞界面观察 |
| 6.2.8 图像采集与数据分析 |
| 6.3 细胞裂解原理 |
| 6.4 细胞裂解的影响因素 |
| 6.4.1 细胞浓度与颗粒存在细胞裂解的影响 |
| 6.4.2 声场作用效果对裂解效率的影响 |
| 6.4.3 液滴体积对细胞裂解效率的影响 |
| 6.4.4 细胞-微粒尺寸和种类对细胞裂解效率的影响 |
| 6.5 基于细胞染色的细胞裂解作用评价 |
| 6.5.1 台盼蓝染色对细胞裂解的分析 |
| 6.5.2 荧光染色对细胞裂解的评估 |
| 6.6 不同微粒在细胞裂解上的效率变化和碰撞裂解作用机制 |
| 6.7 总结 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 需要进一步解决的问题 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录及参与的科研项目 |
| 致谢 |
| Paper |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）基于单细胞测序探究强直性脊柱炎炎症和骨化进程中巨噬细胞和干细胞的交互关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分:强直性脊柱炎脊柱韧带单细胞转录组学分析和靶分子验证 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第二部分:探究强直性脊柱炎脊柱韧带微环境中巨噬细胞影响脊柱韧带来源干细胞成骨分化进程和细胞迁移的机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第三部分:VEGFA靶向VEGFR2 受体介导异位成骨的体内体外验证 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 强直性脊柱炎的干细胞研究及其治疗应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
四、人类有望不再献血 干细胞可生成血细胞（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]Cetuximab联合自然杀伤细胞对乳腺癌细胞体外作用的研究[D]. 杨玉兰. 内蒙古医科大学, 2021
- [3]毛细管内多层SiO2纳米粒内衬支架构建及其循环肿瘤细胞高载量捕获[D]. 钱婷婷. 淮阴工学院, 2021
- [4]普乐沙福联合雷帕霉素或者环孢素A对心脏移植的影响[D]. 颜悦. 海南医学院, 2021
- [5]RDW及NLR对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后意义的临床研究[D]. 梁昌玖. 海南医学院, 2021
- [6]OCT4基于ZO-1重塑细胞骨架在促进hHFMSC自我更新中的作用机制研究[D]. 阮迎春. 青岛大学, 2021
- [7]PLT、MPV、PDW、RDW和CA125在子宫内膜癌中的筛查价值[D]. 程丹. 湖北民族大学, 2021(12)
- [8]声表面波器件在微量细胞前处理中的研究与应用[D]. 王世才. 山东大学, 2021(11)
- [9]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [10]基于单细胞测序探究强直性脊柱炎炎症和骨化进程中巨噬细胞和干细胞的交互关系[D]. 冯新哲. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)