一、如何防治桑花叶型萎缩病?（论文文献综述）
王冬雪[1]（2020）在《桑花叶型矮缩相关病毒编码的V2蛋白抑制转录后基因沉默研究》文中指出双生病毒是世界范围内广泛发生的植物单链环状DNA病毒,已在许多国家的棉花、木薯、番茄、烟草等作物上严重危害,导致了很大的经济损失。作为细胞内专性寄生物,双生病毒的复制和移动完全依赖于寄主。为了抵抗双生病毒的入侵,植物进化出了多种防御机制。RNA沉默是一种序列特异性的基因调控过程,已被证明是植物抗双生病毒防御的主要机制之一,而双生病毒在与植物长期的竞争过程中,进化出相应的反制武器,如:自身基因组编码的蛋白质具有抑制这种RNA沉默的功能,也就是RNA沉默抑制子。桑花叶型矮缩相关病毒（Mulberry mosaic dwarf-associated geminivirus,MMDaV）是在中国桑树中发现的一种引起寄主呈现出花叶、矮化症状的单组份双生病毒。MMDaV基因组的正义链含有5个开放阅读框（V1、V2、V3、V4和V5）、互补链含有2个开放阅读框（C1和C2）,但是这些蛋白的功能都尚不清楚。本论文鉴定了MMDaV编码的RNA沉默抑制子,并对其抑制RNA沉默的机理和亚细胞定位开展了以下研究:首先将MMDaV的病毒链和互补链编码的7个蛋白构建到35S启动子驱动的pCHF3载体上,通过农杆菌介导法将含有35S-GFP的农杆菌和MMDaV各个ORF的农杆菌共同浸润16c本氏烟叶片,发现在接种5天后35S-GFP与V2共同浸润的叶片在手提式紫外灯下能够表现出明显的绿色荧光,说明V2是一个局部RNA沉默抑制子。为了分析V2是否能够抑制双链RNA（dsRNA）诱导的RNA沉默,将35S-GFP、35S-dsGFP与V2共浸润,结果在共浸润的部位没有观察到GFP荧光,说明V2不能抑制dsRNA诱导的RNA沉默。为了解析参与V2抑制转录后基因沉默（Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS）的关键基序,在序列分析发现V2中含有F-box类似基序的基础上,构建了V2的F-box突变体,发现V2的F-box基序对于V2抑制PTGS是必需的。利用激光共聚焦显微镜分析了V2及其突变体的亚细胞定位,发现V2定位于细胞质、细胞核和核仁,而F-box突变后的V2不再定位于核仁,表明F-box对于V2在核仁中的定位是必需的。为了筛选参与V2抑制PTGS的寄主因子,通过酵母双杂交以及双分子荧光互补（BiFC）验证了V2与其候选互作蛋白NbSkp1.1的互作,并利用病毒诱导的基因沉默技术沉默了本氏烟中的NbSkp1.1基因,发现NbSkp1.1的沉默使得V2不再抑制PTGS,并且F-box的突变使得V2与NbSkp1.1的互作位点从细胞质、细胞核变为主要在细胞核。分析了MMDaV编码的V2蛋白的定位,发现V2蛋白在本氏烟的表皮细胞中瞬时表达时与核仁中的核仁蛋白纤维蛋白NbFib2共定位。通过酵母双杂交实验与BiFC实验证实了V2与NbFib2的互作。比较了MMDaV侵染状态下V2的亚细胞定位,发现MMDaV的存在使V2蛋白从核仁转移到核质,而且MMDaV编码的RepA（replication-associated protein A）与V2互作,使得V2以及V2自我互作位点都从核仁中排除,并且进一步发现RepA可能通过将NbFib2-V2复合物从核仁排除到核质从而促使V2从核仁中排出。
王仕波[2]（2020）在《不依赖组织培养的桑树遗传转化体系》文中认为近年来发展起来的不依赖植物组织培养的遗传转化方法,具有简便、快速、易操作等优点。桑树作为我国的乡土树种,是一种重要的生态经济林木。目前,桑树仍缺乏成熟稳定的再生体系,探索建立不依赖组织培养再生体系的桑树转基因方法对其基因功能研究具有重要意义。本研究采用纳米介导植物转基因技术和病毒诱导基因沉默（VIGS）技术对桑树进行了遗传转化的探索,获得的主要研究结果如下:1、花粉磁转染法在桑树中的初探用冷冻扫描电镜观察了桑树花粉的花粉粒结构,发现桑树花粉有1个花粉萌发孔,具备进行花粉磁转染的前提条件。为提高花粉磁转染的授粉效率,采用单一因素实验优化了桑树花粉离体培养基。构建超表达的融合棉花花青素合成通路转录因子PAP1和TT8的植物表达载体GhPAP1,经花粉磁转染获得554颗桑种子。种子萌发并长成桑苗后,未能在桑苗叶片中观察到预期的红色表型,进一步对桑树叶片进行GUS染色,叶片未能染出蓝色。构建编辑桑树八氢番茄红素去饱和酶（PDS）基因的植物基因表达载体Cas9-MaPDS,经花粉磁转染获得1031颗桑种子。种子萌发并长成桑苗后,未能在桑苗叶片中观察到预期的光漂白表型,进一步通过PCR检测桑树叶片,初步获得2株mCherry阳性桑苗。2、桑花叶型萎缩病相关病毒MMDaV对桑树的侵染能力在易感材料豇豆中接种桑树双生病毒MMDaV,豇豆叶片一周后出现明显病症,进一步通过PCR检测结果表明,MMDaV对植物具有侵染能力并且能在植株细胞间移动。在垂桑中分别用OD600值为1.0,1.5,2.0的农杆菌菌液进行了接种,结果表明农杆菌菌液OD600=1.0时,MMDaV对桑树的侵染率最高并且不会产生毒害作用。在12个桑树资源中接种了MMDaV,两周后,与野生型相比,被侵染的桑树没有表现出典型的MMDaV感染病症,但PCR检测真叶的结果表明,12个桑树资源均能被MMDaV侵染,各桑树资源的侵染率为31%-83%。从12个桑树资源中选择7个桑树资源进行了进一步侵染实验,结果表明,MMDaV对各桑树资源的侵染能力虽然有差异,但在不同组别实验间侵染能力差异具有不稳定性。3、利用MMDaV和2m DNA1沉默载体进行基因功能研究在豇豆中混合接种MMDaV和2mDNA1,豇豆叶片产生褐色病斑,而单独接种2mDNA1则与野生型表型一致。选择7个桑树资源进行了MMDaV和2mDNA1混合接种,两周后,被侵染的桑树没有表现出典型的MMDaV感染病症,各桑树资源的侵染率为67%-87%,高于单独接种MMDaV的侵染率。为了研究MMDaV作为VIGS载体的功能,构建MaPDS基因沉默载体2mDNA1-PDS,与MMDaV混合接种于5个桑树资源的子叶,各桑树资源的侵染率为33%-70%。此外,在被侵染桑苗的第1和2片真叶中观察到MaPDS基因沉默的表型,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR检测表明PDS基因明显下调表达。本研究为桑树不依赖组织培养遗传转化系统的研究提供了初步数据。
孙勋勋,周轶楠,黄吉雷,易辉玉,田铃,刘吉平[3]（2019）在《两种桑树病毒的形态观察与检测》文中提出桑树病毒病一直是影响蚕桑产业发展的重要因素之一,但其病原也尚未完全确认。本研究收集全国不同桑园、不同时间和不同品种的皱缩状和花叶状桑叶样品,分离病毒后使用透射电子显微镜观察病毒形态特征。结果在桑病叶中分离获得两种病毒,一种为双联体形态病毒,长（27.84±1.71）nm,宽（17.05±1.13）nm,形态特征与双生病毒属的病毒形态特征一致;另一种为球状体病毒（80～100 nm）,形态特征与番茄斑萎病毒属的病毒形态特征一致;桑叶切片观察,发现同一桑叶材料中存在这两种病毒。通过高通量测序发现其存在桑花叶型萎缩病相关病毒Mulberry mosaic dwarf associated virus（MMDaV）和桑脉带相关病毒Mulberry vein banding associated virus （MVBaV）。设计上述病毒的特异引物,对158份桑病叶进行PCR检测,MMDaV的检出率为93.04%;而MVBaV为60.13%,同时检出率为57.59%。结果表明,MMDaV和MVBaV在桑病叶中普遍存在,且同时存在。本研究首次在桑树病叶中同时观察并检测到MMDaV和MVBaV,二者在桑皱缩状和花叶状的桑叶中存在混合感染的现象,研究结果将为今后深入研究桑病毒病及防控奠定了基础。
孙勋勋[4]（2018）在《桑花叶病病原的鉴定与分子生物学研究》文中认为桑树是养蚕业的重要原料,也是药食两用的经济林作物,在食品保健、畜禽饲料、生态修复等方面得到了广泛的应用,且越来越受到人们的重视。桑花叶病是一种桑树病毒病,会导致桑树产生叶质量变差、产量下降、植株矮小和桑树抵抗力下降等问题,严重制约着蚕桑产业的健康稳定发展。在桑树产业蓬勃发展的新形势下,桑花叶病的发生规律、检测技术和防控手段等问题都亟待解决。本研究收集了广东、广西、海南、重庆四个省区共16个县市以及华南农业大学桑园不同季节的具有皱缩和花叶症状的182份桑叶样品、3份桑枝条样品以及3份蓟马与叶蝉两种桑园害虫。首先利用密度梯度离心对收集的病叶中的病毒进行分离纯化,使用电子显微镜进行形态特征观察,并按照柯赫式法则对分离病毒的致病性进行回感验证。接着,通过PCR检测以及高通量测序对桑病叶中病毒种类进行分析和确认,并对四个省区29份桑病叶样品中的病毒进行了全基因组测序和生物信息学分析。最后,根据病毒保守的核苷酸序列,设计特异检测引物,建立PCR及qPCR检测方法,并对182份桑叶样品、3份昆虫和桑组织样品进行PCR检测,分析病毒与病状、季节、地理等因素之间的关系并探究病毒的传播规律。获得的主要研究结果如下:（1）分离纯化获得一种桑花叶病的病毒样本,经电镜观察,病毒为二联体形态,病毒粒子长为27.84±1.71 nm,宽为17.05±1.13 nm,这符合双生病毒科病毒粒子的形态特征（2）PCR检测以及高通量测序结果显示,皱缩和花叶状的桑叶中均同时存在两种病毒,即双生病毒科（Geminiviridae）的桑花叶型萎缩病相关病毒（mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDaV）和正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding associated virus,MVBaV）。（3）对四个省区29份MMDaV进行全基因组测序和生物信息学分析的结果显示,MMDaV病毒存在明显的地理差异,分别归为华南株系HNZX和华东株系HDZX两大类群,而广东、广西和海南地区则同时存在MMDaV的两大株系。（4）根据MMDaV外壳蛋白基因和MVBaV核壳体蛋白基因核酸序列,设计特异PCR和qPCR检测引物,并分别构建阳性检测质粒。其中,MMDaV的PCR特异引物检测到的质粒浓度为1×10-66 ng/μL,qPCR的有效质粒检测浓度为1×10-66 ng/μL。MVBaV的PCR特异引物检测到的质粒浓度为1×10-55 ng/μL。（5）对采集的182份桑叶样品、3份蓟马与叶蝉等样品进行PCR检测的结果显示,MMDaV和MVBaV两种病毒存在混合侵染,其中MMDaV在皱缩和花叶两种症状的桑叶中普遍存在,而MVBaV仅在花叶状的桑叶中普遍存在。MVBaV受季节温度影响明显,高温条件下存在明显的潜隐现象。蓟马和叶蝉中均携带这两种病毒,病毒可在桑树根部越冬,来年随桑树的生长而繁殖。全文创新之处:研究发现桑花叶病的病叶中同时存在MMDaV和MVBaV两种病毒;建立了MMDaV病毒检测技术（专利申请号:201711281273.8）和MBVaV病毒检测技术（专利申请号:201810552526.9）。
陈梦姣,白锡川,吴岩,费建明,张德明[5]（2016）在《桑花叶型萎缩病类病毒疾病传播途径的研究》文中指出以桑花叶型萎缩病（Mulberry mosaic dwarf disease,MMDD）类病毒为侵染材料,通过、田间调查、试验以及RTPCR分子检测技术的应用,在被桑花叶型萎缩病病原污染的土壤上栽培的桑树的花、叶、病健桑树花粉杂交的果实以及果实培育的苗中都检测到小分子RNA,表明了桑花叶型萎缩病的小分子RNA可通过土壤、花粉、果实传染,这对类病毒侵染循环规律研究和防止病原扩散提供了一个新思路。
徐伟芳,王爱印,舒平,任慧爽,龙梦娴,陈洁,谢洁[6]（2015）在《几种常见桑树病害的识别与防治》文中指出桑树是蚕桑产业的重要物质基础。为确保桑树健康成长,促进产业发展,桑树病害的有效识别与及时防控尤为重要。真核微生物、原核微生物及非细胞类病毒中均存在能引发桑树传染性病害的病原微生物。其中由真核微生物引起的桑里白粉病与桑椹菌核病,原核微生物引起的桑青枯病与桑疫病是爆发频繁、危害极大的桑树病害。本文就这四种桑树病害的病原、侵染循环、病害识别及防治方法等进行系统梳理,并简要介绍几种非细胞类微生物引起的桑树病害,以期为生产上防治相关病害提供参考。
马宇欣[7]（2015）在《桑花叶型萎缩病病原的鉴定》文中认为桑花叶型萎缩病（Mulberry mosaic dwarf disease,MMDD）是一种困扰桑树生产长达数十年的重要病害,感病的桑树会表现出植株矮小、叶片花叶、畸形、皱缩、叶缘卷曲等症状,严重影响桑蚕产业的发展。虽然对该病害的研究开展了近一个世纪,但对于其病原却至今未明确。鉴于此,本研究以探究桑花叶型萎缩病的病原为目的,系统的开展研究工作。首先,选取陕西省安康学院蚕桑科研基地进行样品采集,重点采集表现花叶型萎缩病症状的桑树样品92份,无症状样品9份。选取感病和健康样品各1份进行高通量测序技术,从感病样品中检测到2种病毒:双生病毒、线虫传多面体病毒和一种小分子环状RNA,而此健康样品中未检测到病毒病原物。通过RT-PCR/PCR实验验证了这三种病原物确实存在于感病样品中。其次,对所有样品中这三种病原物的发生率进行了调查,发现感病的92份样品中,双生病毒的检出率为92.4%,线虫传多面体病毒的检出率为52.17%,小分子环状RNA的检出率为40.2%。因此,双生病毒与花叶型萎缩病的发生存在正相关关系;而线虫传多面体病毒的检出率也较高,与双生病毒可能存在混合侵染的情况存在;由于从健康的样品中也检测到小分子环状RNA的存在,因此小分子RNA与病害的发生没有相关关系。我们通过实验得出双生病毒与花叶型萎缩病具有极大的相关关系,但仍需根据科赫氏法则来进行致病性验证,最终确定是否为该病病原。最后,鉴于此双生病毒与花叶型萎缩病的相关关系,将其命名为桑花叶型萎缩病相关病毒（Mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDa V）,并对其进行了鉴定。采用PCR法和RCA的方法克隆得到了双生病毒的基因组全长序列（2952 nt）,单组份,单链环状DNA。除了具有双生病毒科病毒保守的结构之外,该病毒开放阅读框的个数及位置不同于其他双生病毒,病毒链含有5个,互补链含有2个,具有独特性。软件预测到互补链存在一个内含子（101 nt）,通过RT-PCR实验验证了这一预测,并结合高通量数据中存在139个RNA reads以外显子-外显子序列方式存在,进一步证明了体内剪切掉内含子的互补链转录本的存在,根据序列特征判断,该内含子属于U2型内含子。系统发育分析结果显示,桑树上的双生病毒与柑橘上发现的柑橘褪绿矮缩相关病毒（Citrus chlorotic dwarf associated virus,CCDa V）共同存在于一个单独的分支,且未归到已知的属中,因此,我们建议将这两种病毒共同归于一个新的属。由于传统检测技术的局限性,桑花叶型萎缩病的病原一直未能明确。本研究的创新之处在于,打破传统检测技术的瓶颈,利用高通量测序技术快速筛选到感病样品中所有的病毒,通过病原发生率的调查找到与病害的相关关系,根据科赫氏法则进行生物学实验,最终鉴定出引起该病害的病毒,解决“桑花叶型萎缩病的病原是什么”这一关键科学问题。
白锡川,吴岩,费建明,王文兵[8]（2014）在《高等植物类病毒疾病传播途径的研究》文中指出人类对类病毒研究历史虽然还较短,但在基础性研究已经取得了不小进步,类病毒的结构、不同区间的功能、在体内的复制和运动等[1-6]已逐渐清晰;因类病毒是不显性感染,症状表现时间较长,所以在传播方式等方面的研究相对比较薄弱;早期报道,类病毒的传播主要通过生产工具和嫁接;近年来其它方式的传播报道渐渐增多,1999年Wah等发现葡萄黄斑类病毒可以通过种子传播[7];Singh等（1992）通过分子检测技术,证实了马铃薯纺锤类病毒能
孔卫青,杨金宏[9]（2013）在《切割桑花叶萎缩类病毒的12串联体核酶基因克隆与转录载体构建》文中进行了进一步梳理通过人工合成和PCR扩增,克隆特异性切割桑花叶萎缩类病毒RNA的12串联体核酶基因,用于控制病毒基因的表达。将桑花叶萎缩类病毒正链RNA上10 nt的靶序列连接在锤头型核酶催化区3’端,构成具有自切割功能的核酶基因。克隆该核酶基因并将其连接于载体pMD18T-SP6。在SP6 RNA聚合酶的作用下对线性化的重组质粒进行体外转录,体外自切割反应显示转录的多体自切割核酶可以通过内部的顺式切割释放出核酶分子。同时,将该12串联体核酶基因导入双元质粒pBI121中,获得重组植物转录载体pBI121-12MRz,为进一步培育抗桑花叶型萎缩病的转基因桑树奠定了基础。
孔卫青,杨金宏[10]（2012）在《桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析》文中进行了进一步梳理旨在获得安康地区桑花叶萎缩病病原序列,为桑花叶萎缩病的防治提供更多的信息。用RT-PCR技术对安康地区染花叶型萎缩病病株的病原进行了分离,克隆测序并在Mfold网站预测其二级结构。该病的病原为桑花叶萎缩类病毒MMDVd-201110151（GenBank登录号:JQ809700）,核苷酸长度357bp,GC含量50.7%,219bp后38个碱基与樱桃小圆形类病毒样核糖核酸具有约85%的一致性。Mfold网站预测二级结构有58.3%的碱基配对,两端为分枝状结构。成功分离到安康地区桑花叶型萎缩病病原。
二、如何防治桑花叶型萎缩病?（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、如何防治桑花叶型萎缩病?（论文提纲范文）
（1）桑花叶型矮缩相关病毒编码的V2蛋白抑制转录后基因沉默研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 双生病毒 |
| 1.1.1 双生病毒的危害 |
| 1.1.2 双生病毒的分类与基因组结构 |
| 1.1.3 桑花叶型萎缩病病原研究进展 |
| 1.2 植物防御与双生病毒的反防御 |
| 1.2.1 宿主介导的抗病毒 |
| 1.2.2 双生病毒的反防御 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 MMDaV编码的RNA沉默抑制子的鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 病毒材料 |
| 2.1.3 菌株 |
| 2.1.4 试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常规DNA克隆技术 |
| 2.2.2 基本的连接转化技术 |
| 2.2.3 MMDaV ORF瞬时表达载体的构建 |
| 2.2.4 根癌农杆菌介导的植物接种 |
| 2.2.5 植物RNA的提取及RNA的反转录 |
| 2.2.6 Northern blot杂交 |
| 2.2.7 共聚焦显微镜技术 |
| 2.2.8 植物蛋白质相关技术 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 局部RNA沉默抑制子的鉴定 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 MMDaV V2 抑制PTGS的关键基序的鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 常规DNA克隆技术 |
| 3.2.2 基本的连接转化操作 |
| 3.2.3 V2 F-box 突变体的构建 |
| 3.2.4 根癌农杆菌介导的植物接种 |
| 3.2.5 共聚焦显微镜技术 |
| 3.2.6 植物蛋白质相关技术 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 MMDaV V2 含有F-box类似基序 |
| 3.3.2 F-box基序对于MMDaV V2 抑制PTGS是必需的 |
| 3.3.3 F-box类似基序对于V2在核仁中的定位是必需的 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 与MMDaV V2 抑制PTGS相关的寄主因子的鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 常规DNA克隆技术 |
| 4.2.2 基本的连接转化技术 |
| 4.2.3 载体的构建 |
| 4.2.4 根癌农杆菌介导的植物接种 |
| 4.2.5 共聚焦显微镜技术 |
| 4.2.6 植物蛋白质相关技术 |
| 4.2.7 RNA的提取 |
| 4.2.8 半定量PCR检测基因的沉默效率 |
| 4.2.9 酵母双杂交技术 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 与MMDaV V2 互作的寄主因子的鉴定 |
| 4.3.2 NbSkp1.1 对于V2 抑制PTGS是必需的 |
| 4.3.3 F-box对于V2和NbSkp1.1 互作的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 MMDaV V2 的亚细胞定位分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 常规DNA克隆技术 |
| 5.2.2 基本的连接转化技术 |
| 5.2.3 载体的构建 |
| 5.2.4 根癌农杆菌介导的植物接种 |
| 5.2.5 共聚焦显微镜技术 |
| 5.2.6 植物蛋白质技术 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 V2与fibrillarin互作且在核仁中共定位 |
| 5.3.2 病毒的侵染影响V2在核仁中的积累 |
| 5.3.3 RepA与 V2 的互作使V2 排除在核仁之外 |
| 5.3.4 RepA使V2的自我互作位点排除在核仁之外 |
| 5.3.5 RepA能改变V2与NbFib2 的互作位点 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）不依赖组织培养的桑树遗传转化体系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物转基因技术概述 |
| 1.2 桑树转基因技术 |
| 1.3 桑树转基因现状及存在的问题 |
| 1.4 植物非组织培养转基因技术研究进展 |
| 1.4.1 纳米介导植物转基因技术 |
| 1.4.2 病毒诱导基因沉默(VIGS)技术 |
| 1.5 双生病毒 |
| 1.5.1 双生病毒的发现 |
| 1.5.2 双生病毒科的分类 |
| 1.5.3 双生病毒的基因组结构和特性 |
| 1.5.4 DNA1的结构及生物学功能 |
| 1.5.5 桑花叶型萎缩病病毒 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 花粉磁转染法在桑树中的初探 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要使用试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制方法 |
| 3.1.4 主要使用仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 DNA提取 |
| 3.2.2 桑树PDS基因编辑载体构建 |
| 3.2.3 花粉磁转染法 |
| 3.2.4 桑树基因组快速提取 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 花粉粒的形态结构 |
| 3.3.2 影响花粉萌发的因素 |
| 3.3.3 表达载体构建 |
| 3.3.4 花粉萌发率的比较 |
| 3.3.5 转基因植株获得及分子鉴定 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 利用MMDa V和2m DNA1 沉默载体进行基因功能研究 |
| 4.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要使用试剂 |
| 4.1.3 使用试剂及溶液配制方法 |
| 4.1.4 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 2m DNA1-PDS载体构建 |
| 4.2.2 桑种子萌发 |
| 4.2.3 农杆菌重悬菌液配置 |
| 4.2.4 桑树幼苗注射 |
| 4.2.5 基因组提取 |
| 4.2.6 PDS基因表达水平检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 MMDaV对豇豆的侵染能力 |
| 4.3.2 不同菌液浓度对桑树侵染的比较 |
| 4.3.3 MMDaV对不同桑树资源的侵染 |
| 4.3.4 MMDa V异源辅助2m DNA1 载体复制 |
| 4.3.5 2m DNA1-PDS沉默载体构建 |
| 4.3.6 基于2m DNA1-Mn PDS沉默载体的VIGS体系建立 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章及参研课题 |
| 致谢 |
（3）两种桑树病毒的形态观察与检测（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的分离纯化及超薄切片的制作 |
| 1.2.2 桑树中病毒的形态学观察 |
| 1.2.3 桑叶总DNA的提取 |
| 1.2.4 桑叶总RNA的提取及反转录合成cDNA |
| 1.2.5 高通量测序及PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桑树病毒的形态特征 |
| 2.2 桑病叶高通量测序分析 |
| 2.3 PCR检测桑树中的病毒 |
| 2.3.1 两种桑树病毒的PCR检测结果 |
| 2.3.2 不同桑叶样品中MMDaV和MVBaV检出率分析 |
| 3 讨论 |
（4）桑花叶病病原的鉴定与分子生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 桑树产业的概况 |
| 1.2 植物病毒研究现状 |
| 1.2.1 植物病毒概况 |
| 1.2.2 植物病毒的防治方法 |
| 1.2.3 植物病毒的检测技术 |
| 1.3 桑树病毒研究现状 |
| 1.3.1 桑树病毒病病原的研究 |
| 1.3.2 桑树病毒病病原的检测与防治 |
| 1.4 双生病毒 |
| 1.5 番茄斑萎病毒 |
| 1.6 论文研究意义与内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及药品 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 桑树病毒的形态学研究 |
| 2.2.1 生物材料的收集与描述 |
| 2.2.2 桑树病毒的分离纯化与形态观察 |
| 2.3 桑树病毒的柯赫式法则验证 |
| 2.4 桑树中病毒的分子生物学鉴定 |
| 2.4.1 桑叶、桑树组织和桑园害虫总DNA的提取 |
| 2.4.2 桑叶、桑树组织和桑园害虫总RNA的提取及反转成cDNA |
| 2.4.3 桑树中病毒的PCR检测 |
| 2.4.4 高通量测序方法 |
| 2.4.5 病毒的全基因组测序 |
| 2.4.6 病毒全基因组开放阅读框、蛋白结构功能预测 |
| 2.4.7 病毒的系统发育进化树分析 |
| 2.4.8 不同地理株系病毒的比较及系统进化树分析 |
| 2.4.9 对病毒种群的选择压力、中性检验、核苷酸多样性及多态性进行分析 |
| 2.5 病毒检测方法的构建 |
| 2.5.1 构建病毒的PCR检测方法 |
| 2.5.2 构建病毒的qPCR检测方法 |
| 2.6 实验中使用的软件及相关网站 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 桑病叶的病状描述 |
| 3.2 桑树病毒分离纯化及柯赫式法则鉴定 |
| 3.2.1 桑树病毒的形态特性 |
| 3.2.2 病毒的致病性实验 |
| 3.3 桑树病毒的分子生物学鉴定 |
| 3.3.1 病毒PCR检测及高通量测序分析 |
| 3.3.2 MMDaV全基因组的生物信息学分析 |
| 3.3.3 MMDaV的系统进化树分析 |
| 3.3.4 各地MMDaV的亲缘关系及种群状态分析 |
| 3.3.5 MVBaV全基因组的生物信息学分析 |
| 3.3.6 MVBaV的系统进化树分析 |
| 3.4 病毒检测方法的构建 |
| 3.4.1 MMDaV的PCR检测方法 |
| 3.4.2 MMDaV的qPCR检测方法 |
| 3.4.3 MVBaV的PCR检测方法 |
| 3.5 不同材料中病毒存在性检测 |
| 3.5.1 所有桑叶材料中MMDaV和MVBaV检出率分析 |
| 3.5.2 桑树不同组织材料中MMDaV和MVBaV的检测 |
| 3.5.3 桑园害虫中MMDaV和MVBaV的检测 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 桑树中双生病毒的特征 |
| 4.1.2 MMDaV对桑树的致病性 |
| 4.1.3 华南地区桑病叶中病毒种类 |
| 4.1.4 MMDaV全基因组结构以及系统进化关系 |
| 4.1.5 MBVaV全基因组结构及系统进化关系 |
| 4.1.6 各地MMDaV的亲缘关系 |
| 4.1.7 MMDaV流行规律 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 各PCR反应条件 |
| 附录B 桑树和桑叶照片 |
| 附录C 质粒片段信息 |
| 附录D 样品材料两种病毒具体检测情况 |
| 附录E 测序对比结果 |
| 附录F 攻读学位期间的学术成果 |
（5）桑花叶型萎缩病类病毒疾病传播途径的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 花粉、果实、苗中的类病毒检测与试验设置 |
| 1.1.1 材料与主要试剂 |
| 1.1.2 试验设置 |
| 1.1.3 桑花叶型萎缩病类病毒RNA的提取 |
| 1.1.4 桑花叶型萎缩病类病毒的RT-PCR |
| 1.2 土壤中的桑花叶萎缩病类病毒检测 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 桑花叶型萎缩病类病毒检测 |
| 1.3 大田调查方法 |
| 1.3.1 随机抽样调查法 |
| 1.3.2 栽培调查法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病原体的分子检测 |
| 2.1.1 试验植枝桑花叶型萎缩病类病毒检测 |
| 2.1.2 接种感病株花粉的果实、苗检测 |
| 2.1.3 不同土壤处理的试验桑树检测 |
| 2.2 疫区新种桑树调查 |
| 3 讨论 |
（6）几种常见桑树病害的识别与防治（论文提纲范文）
| 1真核微生物引起的桑树病害 |
| 1.1桑里白粉病(Mulberrypowderymildew) |
| 1.1.1桑里白粉病的病原菌与侵染循环 |
| 1.1.2桑里白粉病的病害识别与防治方法 |
| 1.2桑椹菌核病(Sclerotediseaseofmulberryfruit) |
| 1.2.1桑椹菌核病的病原菌与侵染循环 |
| 1.2.2桑椹菌核病的病害识别与防治方法 |
| 2原核微生物引起的桑树病害 |
| 2.1桑青枯病(Mulberrybacterialwilt) |
| 2.1.1桑青枯病的病原菌与侵染循环 |
| 2.1.2桑青枯病的病害识别与防治方法 |
| 2.2桑疫病(Mulberrybacterialblight) |
| 2.2.1桑疫病的病原菌与侵染循环 |
| 2.2.2桑疫病的病害识别与防治方法 |
| 3非细胞类微生物引起的桑树病害 |
（7）桑花叶型萎缩病病原的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 桑花叶型萎缩病概述及研究进展 |
| 1.1.1 桑树萎缩病 |
| 1.1.2 桑萎缩病病原的研究 |
| 1.1.3 花叶型萎缩病病原研究进展 |
| 1.2 双生病毒的概述及研究进展 |
| 1.2.1 双生病毒的分类及基因组结构 |
| 1.2.2 双生病毒的命名 |
| 1.2.3 双生病毒寄主范围的扩大 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 高通量测序 |
| 1.3.2 高通量测序技术在病毒检测领域的应用 |
| 1.3.3 Small RNA测序 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章花叶型萎缩病桑树样品中病原物的检测及验证 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 试剂及溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 改良的CTAB法提取总DNA |
| 2.2.2 改良TRIzol法提取桑树植物组织总RNA |
| 2.2.3 Small RNA测序 |
| 2.2.4 原始数据处理 |
| 2.2.5 Small RNA比对、拼接和注释 |
| 2.2.6（RT）-PCR检测、克隆及测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 提取的总RNA的质量 |
| 2.3.2 Small RNA测序数据 |
| 2.3.3 Contigs的比对结果 |
| 2.3.4 候选病原物的确定及PCR验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章候选病原物与花叶型萎缩病发生的相关关系研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 试剂及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小分子环状RNA检测探针的制备 |
| 3.2.2 桑树双生病毒检测探针制备-PCR法 |
| 3.2.3 Northern杂交操作步骤 |
| 3.2.4 Southern杂交操作步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小分子环状RNA的检出率 |
| 3.3.2 线虫传多面体病毒的检出率 |
| 3.3.3 双生病毒的检出率 |
| 3.3.4 三种病原物与花叶型萎缩病害发生的相关关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章双生病毒全长序列克隆及基因组结构分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品准备 |
| 4.1.2 试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树植物组织总DNA的提取 |
| 4.2.2 PCR扩增、克隆MMDaV基因组全长序列和测序 |
| 4.2.3 滚环扩增（Rolling circle amplification, RCA）： |
| 4.2.4 Southern blot杂交 |
| 4.2.5 RT-PCR鉴定内含子的序列 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双生病毒基因组全长的克隆 |
| 4.3.2 基因组结构分析及编码蛋白质的预测 |
| 4.3.3 内含子的预测及RT-PCR验证 |
| 4.3.4 系统发育分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章双生病毒致病性的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 接种植物 |
| 5.1.2 菌株和载体 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 桑树双生病毒侵染性克隆的构建 |
| 5.2.2 酶切鉴定 |
| 5.2.3 载体的去磷酸化 |
| 5.2.4 农杆菌感受态的制备 |
| 5.2.5 重组质粒电击转化农杆菌 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 两端含有SacI和Hind III酶切位点的全长序列扩增 |
| 5.3.2 一个单位全长（SacI & Hind III）克隆至中间载体 |
| 5.3.3 一个单位全长（SacI & Hind III）克隆至植物表达载体pCAMBIA1305.1 |
| 5.3.4 另一个单位全长（Sac I & Sac I）克隆至植物表达载体 p CAMBIA-1.0 U |
| 5.3.5 农杆菌介导接种 |
| 第六章全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）高等植物类病毒疾病传播途径的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 花粉、果实、苗中的类病毒检测与试验设置 |
| 1.1.1 材料与主要试剂 |
| 1.1.2 试验设置 |
| 1.1.3 桑花叶型萎缩病类病毒RNA的提取 |
| 1.1.4 桑花叶型萎缩病类病毒的RT-PCR |
| 1.2 土壤中的桑花叶萎缩病类病毒检测 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 桑花叶型萎缩病类病毒检测 |
| 1.3 大田调查方法 |
| 1.3.1 随机抽样调查法 |
| 1.3.2 栽培调查法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病原体的分子检测 |
| 2.1.1 试验植枝桑花叶型萎缩病类病毒检测 |
| 2.1.2 接种感病株花粉的果实、苗检测 |
| 2.1.3 不同土壤处理的试验桑树检测 |
| 2.2 疫区新种桑树调查 |
| 3 讨论 |
（9）切割桑花叶萎缩类病毒的12串联体核酶基因克隆与转录载体构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌种和主要试剂 |
| 1.2 自切割核酶编码序列的设计、合成和扩增 |
| 1.3 12串联体核酶基因的克隆 |
| 1.4 12串联体核酶基因的体外自切割活性检测 |
| 1.5 12串联体核酶基因植物转录载体的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 自切割12串联体核酶基因的鉴定 |
| 2.2 自切割12串联体核酶基因的体外转录与活性分析 |
| 2.3 植物转录载体的鉴定 |
| 3 讨论 |
（10）桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 桑花叶萎缩类病毒序列分析与引物设计 |
| 1.2.2 桑树总RNA的提取与桑花叶萎缩类病毒的RT-PCR扩增和克隆测序 |
| 1.2.3 桑树花叶萎缩类病毒全长序列的获取和序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR结果 |
| 2.2 桑花叶萎缩类病毒序列测定和相似性比对分析 |
| 2.3 结构分析 |
| 3 结论与讨论 |
四、如何防治桑花叶型萎缩病?（论文参考文献）
- [1]桑花叶型矮缩相关病毒编码的V2蛋白抑制转录后基因沉默研究[D]. 王冬雪. 中国农业科学院, 2020(01)
- [2]不依赖组织培养的桑树遗传转化体系[D]. 王仕波. 西南大学, 2020(01)
- [3]两种桑树病毒的形态观察与检测[J]. 孙勋勋,周轶楠,黄吉雷,易辉玉,田铃,刘吉平. 植物保护, 2019(05)
- [4]桑花叶病病原的鉴定与分子生物学研究[D]. 孙勋勋. 华南农业大学, 2018(08)
- [5]桑花叶型萎缩病类病毒疾病传播途径的研究[J]. 陈梦姣,白锡川,吴岩,费建明,张德明. 江苏蚕业, 2016(04)
- [6]几种常见桑树病害的识别与防治[J]. 徐伟芳,王爱印,舒平,任慧爽,龙梦娴,陈洁,谢洁. 蚕学通讯, 2015(02)
- [7]桑花叶型萎缩病病原的鉴定[D]. 马宇欣. 中国农业科学院, 2015(01)
- [8]高等植物类病毒疾病传播途径的研究[A]. 白锡川,吴岩,费建明,王文兵. 2014年全国桑树病虫防控学术研讨会论文集, 2014
- [9]切割桑花叶萎缩类病毒的12串联体核酶基因克隆与转录载体构建[J]. 孔卫青,杨金宏. 蚕业科学, 2013(04)
- [10]桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析[J]. 孔卫青,杨金宏. 中国农学通报, 2012(36)