一、库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究（论文文献综述）
杨洁萍[1]（2020）在《基于转录组与小RNA测序的库尔勒香梨病毒检测》文中认为目的:通过高通量测序技术对库尔勒香梨花朵进行转录组测序和Small RNA测序,筛选出与植物病毒相关的基因序列作为候选病毒分析,并通过RT-PCR技术对筛选到有关病毒的基因序列进行验证。探索分析库尔勒香梨病毒的基因序列相关信息的新方法,为库尔勒香梨病毒的检测、病毒防治和培育无病毒苗木奠定基础。方法:将2014年、2017年、2018年4月中旬,采集的库尔勒香梨花朵分别于当年送至诺禾致源公司,委托其利用Illumina HisSeqTM2500测序平台进行转录组测序。将获得的原始序列过滤剔除低质量数据得到干净序列后,采用Trinity软件对干净序列进行拼接。Trinity拼接得到的转录本序列,Corset利用比对到转录本的序列和表达模式对转录本进行层次聚类,以Corset层次聚类后最长Cluster序列进行基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的长片段序列作为候选病毒,对候选病毒病毒序列设计引物进行RT-PCR验证;将2014年所获得的小RNA测序数据,所得的原始序列进行测序数据过滤,得到的为干净序列。在NCBI的GenBank数据库下载各种植物病毒的参考序列,将干净序列用本地BLAST程序与核酸数据库、蛋白数据库进行比对,筛选出和植物病毒序列相似性比较高的序列,从而得到候选病毒进行分析。研究结果如下:1、库尔勒香梨转录组测序分析根据三组转录组测序数据的生物信息学分析结果,对分别筛选出的66条、202条、921条注释为植物病毒的基因序列和1条注释为植物类病毒的基因序列分析,发现有3种是已报道的侵染梨的病毒和1种类病毒,分别是苹果茎痘病毒分离物PA66、苹果茎沟病毒分离物P-209、苹果茎沟病毒韩国分离物、苹果褪绿叶斑病毒、啤酒花矮化类病毒,一种未报道的病毒芸薹黄化病毒。根据设计的特异性引物,随机采集的库尔勒香梨枝条样品利用RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,只有苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒扩增出目的片段。2、库尔勒香梨Small RNA测序分析运用BLAST程序将获得的干净序列分别与NCBI的核酸数据库和蛋白质数据库进行比对,筛选出了22条注释为植物病毒的基因序列和32条注释为植物类病毒的基因序列进行分析,发现2种已报道的侵染梨的病毒和1种类病毒,分别为苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果锈果类病毒。
孙朱元吉[2]（2017）在《苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测技术》文中指出近年来,果树病毒病在全世界广泛发生流行,造成水果产业的产量和品质严重下降,甚至带来毁灭性的经济损失。其中,引起苹果茎痘病的苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）和引起苹果茎沟病的苹果茎沟病毒（Apple stem grooving Virus,ASGV）是果树病毒病中两种非常重要的病毒。果树一旦感染病毒则终生带毒,且无药剂可防治,所以建立病毒的检测技术和监控体系是果树病毒病防控的关键。血清学方法具有操作简单、快速、灵敏、高通量等优点,是果树病毒检测和调查最实用的方法。鉴于目前我国还没有建立ASPV和ASGV这两种病毒的血清学检测技术的现状,本论文利用杂交瘤技术分别制备了 ASPV和ASGV的单克隆抗体,并以制备单抗为核心分别建立这两种病毒的特异、灵敏的血清学检测技术,从为这两种病毒的果园诊断和检测、流行病学研究和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。1.ASPV的单抗制备及其血清学检测技术:将ASPV梨分离物的外壳蛋白基因（CP）用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌中进行表达,并用Ni2+-NTAagarose胶纯化,纯化蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合、筛选和克隆后获得4株分泌抗ASPV单抗的杂交瘤细胞株（2H2,14C3,20G6和20F9）4株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达10-6,抗体类型及亚型为IgG1、κ链。Western blot分析表明,4株单抗均能与ASPV重组外壳蛋白和感染ASPV的梨树病叶中的病毒衣壳蛋白发生特异性免疫反应,不与感染ASGV、ACLSV和感染ASPV苹果分离物的苹果病叶和健康果树叶片发生免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASPV的dot-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA方法,它们的检测感染ASPV梨病叶粗提液的灵敏度分别达到了 1:1,280、1:10,240和1:10,240倍稀释（w/v,g/ml）。应用建立的血清学方法对采自湖北武汉、北京和陕西西安和浙江杭州的168份疑似病毒病样品进行检测,结果发现用血清学方法检测到共有96份样品感染ASPV,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到94.8～96.9%,说明建立的血清学方法能有效、准确地检测梨树中的ASPV,且该病毒在我国果园发生普遍。ASPV单抗的制备及其血清学检测技术的建立对我国ASPV梨分离物的检测、诊断和防控具有重要意义。2.ASGV的单抗制备及其血清学检测技术:利用大肠杆菌原核表达的ASGV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,制备了两株抗ASGV的特异性单抗（9B10和19B10）和1个ASGV CP蛋白的兔多抗。9B10和19B10单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7。2株单抗的抗体类型及亚型均为IgG1、κ链。单抗的特异性分析发现,2株单抗均能与感染ASGV果树病叶和重组表达的ASGV CP蛋白发生特异性免疫反应,而不与感染ASPV和ACLSV的果树病叶组织、健康苹果、梨树和柑橘的叶片组织粗提液发生任何免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASGV的dot-ELISA和TAS-ELISA两种血清学方法。其中dot-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶粗提液的灵敏度达到了 1:640倍稀释,检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:2,560倍稀释（w/v,g/ml）,而TAS-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶的灵敏度达到了 1:5,120倍稀释（w/v,g/ml）,检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:10,240倍稀释（w/v,g/ml）。对采自湖北、陕西、北京、浙江各地的187份疑似果树病叶样品进行血清学方法的检测,共检测到79份样品显示ASGV阳性,且dot-ELISA和TAS-ELISA的检测结果和RT-PCR的结果符合率达到96.3%以上,说明建立的检测ASGV的血清学方法能有效、准确地检测果树中的ASGV。ASGV单抗的制备及其血清学技术的建立为我国ASGV的诊断和检测、流行病学研究和无毒种苗的生产提供技术支撑。
王淑华[3]（2016）在《‘嘎啦’苹果试管苗脱毒体系建立及生根移栽研究》文中研究表明近年来,果树病毒病严重影响着果树的生长发育及生产。目前苹果生产中还没有能够有效防治果树病毒病的药剂。苗木的检疫及推广使用脱毒苗木是从源头上杜绝果树病毒病的关键。高效稳定的脱毒体系是无毒苗木生产的关键。热处理、茎尖培养是果树常用的脱毒方法。茎尖成活率低、热处理植株死亡率高是试管苗脱毒的两大瓶颈。试验采用不同方法进行脱毒,筛选不同脱毒方法的最佳培养条件,分析影响脱毒效率的主要因子,并以PCR与ELISA方法进行病毒检测,以优化建立苹果高效脱毒技术体系。取得如下研究成果:1、2/3MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,p H为5.8的培养基最适合’嘎啦’茎尖培养,分化率及增殖系数均显着高于其他培养基,分别达到56.67%和6.36。大量元素减少1/3的MS培养基更适合茎尖培养,褐化率比同等条件下的MS培养基低。所有培养基在暗培养下第7d茎尖的转绿率均高于第5d的转绿率,达到70.00%。2、在不同热处理条件中,逐渐升温的热处理（30℃下处理2d后每天升高1℃,至36℃,36℃下处理2d,37℃下处理2d,然后在38℃下恒温处理的方法）成活率下降最缓慢,材料成活数最高,达75.56%,显着优于其他处理。3、在含有四个不同浓度利巴韦林培养基的处理下,随着利巴韦林浓度的增加材料成活率降低。10mg/L及20mg/L的利巴韦林处理成活率分别达到93.06%、87.50%,显着高于其他处理。4、利用PCR技术检测出’嘎啦’同时带有ASPV和ASGV两种病毒,品种’长富2号’带有ASPV,砧木’B9’带有ASGV各一种病毒。茎尖培养、热处理、热处理与茎尖培养结合与利巴韦林四种脱毒方法脱毒后利用PCR及ELISA两种检测方法分别检测其脱毒率,检测结果表明,热处理与茎尖培养结合的方法脱毒率最高,ASPV病毒脱毒率达100.00%,ASGV病毒脱除率达80.56%,均显着优于其他三种单一脱毒方法。PCR对病毒的检测率均高于ELISA检测方法。5、’嘎啦’试管苗在不同激素组合培养基上进行生根处理,试验结果表明生长素种类及浓度均显着影响试管苗的生根率,1/2MS显着优于MS培养基,IAA优于IBA及NAA。外源SA可以显着提高试管苗的移栽成活率,且存在浓度效应。适宜’嘎啦’生根的培养基为1/2MS+0.2 mg/L IAA,0.8 mg/L SA处理可显着降低气孔开度、提高叶片叶绿素含量,显着提高移栽成活率。
秦子禹[4]（2015）在《苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立》文中研究表明病毒病严重影响苹果的生长、产量以及果品质量,尚无有效防治药剂,树体一旦侵染很难根除,繁育无病毒苗木实行无毒化栽培是其防治的最有效途径。高效、灵敏、稳定的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的重要技术保障之一。本研究在筛选出适用于苹果的内参基因的基础上,分别建立了苹果Actin基因及苹果茎沟病毒、茎痘病毒、褪绿叶斑病毒三种苹果潜隐性病毒的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,旨在为进一步研究三种潜隐性病毒的侵染、增殖、分布以及时序变化等规律提供有效的技术手段,并为苹果病毒的多重实时荧光定量RT-PCR检测体系的研发奠定基础。主要研究结果如下:1、本研究采用SYB GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,对Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六个持家基因在苹果幼叶、成龄叶、枝皮、根皮和种子中的表达量进行了检测。经GeNorm软件分析发现,6个内参基因在五种不同组织器官中的表达稳定性由高到低排列顺序为:Actin=UBQ﹥GAPDH﹥nad5﹥TUB﹥18SrRNA,Actin和UBQ为优选内参基因。2、首次建立了苹果Actin基因的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据已公布的Actin基因序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。结果显示建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为106.5%;该方法的引物和探针特异性强;检测灵敏度为1.48×10 copies·μL-1的cRNA,比常规RT-PCR高1000倍;重复性好,组内和组间重复变异系数均小于2.65%。3、建立了苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ASGV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为96.8%;该方法特异性好,与苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）均无交叉反应;灵敏度为10copies·μL-1,比常规RT-PCR高1000倍;组内和组间重复变异系数均小于1%。表明该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASGV的快速准确检测。4、建立了苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ACLSV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与ASGV、ASPV和ASSVd均无交叉反应;灵敏度为100 copies·μL-1,比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于0.84%。表明TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。5、建立了苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ASPV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与ASGV、ACLSV及ASSVd均无交叉反应;其最低检测限为1.31×102 copies·μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASPV的快速定量检测。
马小方[5]（2015）在《植物与病毒互作机理研究的遗传分离》文中指出在长久以来的进化中,植物发展出一系列对病毒的免疫机制,其中包括：R基因介导的抗病毒机制,RNA沉默（RN A silencing）,凝集素蛋白介导的抗病毒机制和其他一些寄主蛋白如一些翻译起始因子和内质网蛋白等；另一方面,植物病毒为能成功侵染植物,或通过突变、重组等使自身进化,或通过编码蛋白如RNA沉默抑制子来抵抗植物的免疫防卫反应。本文分别从这两方面阐述植物与病毒互作机理：一方面以苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）病毒为研究对象阐述病毒抵抗寄主植物的免疫反应机理,另一方面以烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）和模式植物拟南芥互作系统为研究对象,探索植物对病毒的免疫反应机理。分别取得了如下研究结果：1.源于梨的ASPV分子变异及遗传进化分析为了明确我国梨树上ASPV群体结构以及分子进化机制,本研究从国内不同的的梨产区采集总共451份梨树样品进行ASPV检测,共检测到145份ASPV阳性样品,克隆部分阳性样品完整CP（31份）,TGB（44份）和部分RdRp片段（P1和P2）（3份）。其中测序了来源于31个分离物的169个CP克隆,44个分离物的95个TGB克隆,RdRp的部分片段P1和P2分别测序了来源于3个分离物的17和14个克隆。分别基于本研究测序的这三个基因序列以及GenBank上报道的序列构建进化树,结果表明：1)ASPV在进化树上的分组与寄主（苹果,梨和来自中国新疆的库尔勒香梨）存在相关性；2)来源于梨分离物的ASPV CP序列在进化树被上分为6个亚组（A-F）,其中B和F亚组序列在本研究中首次报道；3)本研究首次系统研究ASPV TGB基因序列,在进化树上将其分为5个小组。序列多重比对结果表明源于梨分离物的ASPV CP和RdRP序列存在连续的核苷酸插入或者缺失。重组分析结果表明本研究测序的完整CP, TGB和部分RdRp片段（P2）中均检测到重组事件。选择压力分析结果表明ASPV CP和TGB在自然进化过程中被负向压力选择（Negative Selection）。以上结果表明碱基突变（插入或者缺失）、重组和负向选择压力是我国ASPV群体结构多样性的主要原因。2. ASPV沙梨分离物HB-HN1全长和vsiRNA特性分析本研究扩增了湖北省某果园的沙梨（二十世纪）样品的ASPV基因组全长（9270nt,除去polyA尾）,命名为HB-HN1。 HB-HN1与已经报道的11个ASPV分离物的全长核苷酸序列相似性在72.4%-80.0%之间。将12个ASPV全长的5个基因序列分别进行比对,发现不同的基因比对结果与全长的相似性存在差异。ASPV基因组的5’端非翻译区相对保守而3’端非翻译区则变异相对较大。基于这12个ASPV分离物全长核苷酸序列构建系统进化树,结果表明：ASPV在进化树上的分组与寄主有关。分析ASPV-vsiRNAs的结果表明ASPV正负链RNAs在生成vsiRNAs时贡献相当（分别是59.1%和40.9%）,而且这些vsiRNAs几乎平均分布在ASPV整个基因组。ASPV-vsiRNAs5’端碱基偏向性分析结果发现,除了常见的5’端A和U偏向性,本研究中出现vsiRNAs 5’端C的偏向性的几率也很大。3.源于不同分离物的ASPV编码蛋白功能多样性分析本研究构建了ASPV CP 5个梨分离物（HB-HN1-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、 HB-HN9-3、YN-MRS-17）和1个苹果分离物（LN-AP-1）的原核表达载体,在大肠杆菌中特定条件下（30℃,含50mg/L Kan, 1mM/L IPTG的LB培养基中诱导表达6h）可以高效的表达ASPV不同分离物重组外壳蛋白。重组CP经纯化后免疫大耳白兔,制备了ASPV 3个不同分离物的多克隆抗血清,分别命名为PAb-HB-HN9-3, PAb-HB-HN6-8和PAb-YN-MRS-17。Western-blot结果表明本研究制备的3个不同抗血清在检测ASPV不同分离物（HB-HNl-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、HB-HN9-3、 YN-MRS-17和LN-AP-1）原核表达蛋白时反应强度存在明显差异。RNA沉默抑制子鉴定的结果表明ASPV CP具有抑制RNA沉默功能。利用PVX病毒载体表达ASPV CP （PVX-ASPV-CP）,将构建好的重组载体转入农杆菌后,农杆菌浸润接种接种西方烟,发现相比PVX （wt）, PVX-ASPV-CP能够在西方烟上引起严重的症状。本研究通过分析ASPV不同分离物CP沉默抑制功能以及在西方烟上的致病性,发现不同分离物CP分子变异并不影响CP抑制RNA沉默功能及其在西方烟上的致病性。然而,ASPV TGB3不同分离物分子变异却影响了其编码蛋白跨膜区域。4.RNA沉默和P-bodies相关组分在病毒Recovery以及VIGS过程中扮演的作用RNA沉默是植物主要的抗病毒机制之一。病毒诱导的RNA沉默的原理就是植物体内的Dicer-like酶识别病毒的dsRNA并将其切割成siRNA,随后这些siRNA与AGO蛋白家族结合并引导这些蛋白靶标目标同源RNA。在植物病毒研究领域,一方面RNA沉默的机制很长一段时间解释了病毒的Recovery现象,认为植物通过RNA沉默机制沉默了病毒RNAs导致植物从病毒引起的症状中Recovery;另外一方面病毒诱导的RNA沉默用来沉默植物的内源基因（virus-induced gene silencing, VIGS）。虽然Recovery和VIGS的机理被认为基于RNA沉默,但是引起这两种现象的真正机理尚不清楚。本研究采用目前应用非常广泛的烟草脆裂病毒沉默载体（Tobacco rattle virus, TRV）作为研究工具,为达到研究的目的,将拟南芥内源基因八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, PDS）口外源基因绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein, GFP）插入该病毒载体,分别作为VIGS以及Recovery的研究工具。研究结果显示AG02和AG04在拟南芥中起到抵抗TRV的作用而AGO1却参与病毒介导的内源基因的沉默。然而所有接种TRV-GFP的拟南芥AGO基因的突变体植株最终都Recovery,说明病毒引起的Recovery现象可能是由不同的机制介导的。提取核糖体RNAs的结果显示Recovery的植株中病毒RNA翻译效率降低,而这些没有翻译的病毒RNA可能进入细胞内P-bodies。
李文慧[6]（2010）在《库尔勒香梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达》文中研究指明我国商业果园果树主栽品种携带病毒十分普遍。在果树种植面积不断扩大和栽培时间延长的同时,病毒危害越来越重,因此研究人员、果树生产与经营者加大了对病毒的重视。苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus, ASPV）为Foveaviris （Martelli G.P等，1998）的代表种,该病毒寄主范围和分布较广,能侵染多种果树。早期曾将梨茎痘病、梨黄化病、梨红色斑驳病、梨脉黄病、梨石痘病、苹果茎痘病的病源归为不同的病毒种（吴雅琴等,2000）,但Jelkmann等证实以上几种病害均由ASPV所引起。ASPV因其寄主及地理分布不同而存在差异,目前已分离多个分离物。现对苹果茎痘病毒外壳蛋白新疆库尔勒香梨分离物进行克隆,测序,序列分析以及诱导该分离物原核表达,研究苹果茎痘病毒的功能区域。1.采集经RT-PCR检测确定已带有苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）的香梨一二年生的枝条为试验材料,根据GenBank中的EU095327序列设计合成引物,扩增ORF5外壳蛋白的核酸序列片段。将目的片段转入到克隆载体中,经酶切,测序证实所得片段为目的片段,与MHczAp、ASPV isolate24、ASPV isolate38分离物核苷酸同源序列分别为81%-83%,氨基酸的同源率分别为70%-71%。2.酶切连接有目的片段的克隆载体,将目的片段纯化,转入表达载体pET-3a中。挑取阳性菌落,测序,证实该基因序列表达框正确。将连接目的基因片段的表达载体转入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导表达,在不同时间均获得了表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。另外,该基因在BL21的表达具有时效性特点,1-3h里表达量较高,4h后重组蛋白表达量开始下降。预测ASPV CP的蛋白相对分子质量为43.7kDa,与实验检测的重组蛋白相对分子质量基本一致。本文将克隆与原核表达技术应用于新疆库尔勒香梨苹果茎痘病毒的研究,通过苹果茎痘病毒载体构建和表达的研究,获得了苹果茎痘病毒新疆分离物,与国内外分离物进行比较,为今后抗血清的制备提供了一定的依据
李丽丽,董雅凤,张尊平,张志宏,范旭东,裴光前[7]（2010）在《苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析》文中认为利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒（Applestem pitting virus,ASPV）进行了检测,ASPV感染率为63%（19/33）。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白（Coat protein,CP）基因进行了扩增、克隆和测序,测序结果显示CP基因全长为1191nt,编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2%91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群,呈现一定的寄主相关性,并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果,第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大,推断可能由于序列变异引起抗原表位变异,从而引起血清型差异。
刘英华[8]（2009）在《苹果茎痘病毒cp基因介导病毒抗性研究及其植物表达载体的构建》文中研究表明苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的潜隐病毒之一,该病毒与其它病毒的复合侵染可导致这些果树的衰退。利用基因工程技术导入病毒外壳蛋白（cp）基因,培育抗病毒品种,为病毒病的防治开辟了新的途径。本研究通过PCR扩增和Western blot分析,对转化ASPV的cp基因的14个西方烟（Nicotiana occidentalis）芽系中外源基因的插入及表达进行了检测;采用汁液摩擦接种方法,进行了转化植株的病毒抗性测定;构建了植物表达载体pCAMBIA1301S -cp（+）-gfp和pCAMBIA1301S -cp（-）-gfp,采用农杆菌EHA105介导的叶盘转化法成功转染西方烟。具体研究结果如下:1、以实验室保存的转ASPV cp基因正义链和反义链的14个转基因西方烟芽系为材料,提取基因组DNA,用三对引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分析,得到三个不同的特异性条带,分别为316bp（CP基因的其中一段）、565bp（潮霉素基因）、1203bp（CP基因全长）,确认有13个芽系经6次继代筛选后外源基因得到稳定遗传。2、取PCR鉴定含有ASPV cp的转基因烟草植株S1提取总蛋白,同时以未转基因烟草植株为对照,进行SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色结果表明,含ASPV cp的转基因植株有分子量约44 kDa的特异性蛋白条带,而未转基因植株则没有相应的蛋白条带产生。以ASPV多克隆抗体为一抗,碱性磷酸酯酶标记羊抗兔抗体为二抗,对转基因植物中外源基因的表达进行Western blot分析,结果显示,44 kDa大小的特异性表达产物与ASPV多克隆抗体产生明显的免疫反应,表明所转化的ASPV CP基因正义链在转基因烟草植株中能正常表达。3、对部分T0代转基因烟草离体植株进行生根移栽,在幼苗长至4-6叶龄时接种ASPV进行抗性评价,同时以未转基因植株作为对照。接种15d后观察症状,所有的未转基因植物表现出典型的白色坏死斑;8个芽系S1、S5、S6、S7、S8、S10、A1、A3中的24株都无症状发生,表现出对该病毒的抗性。6个芽系S2、S3、S4、S9、A2、A4中的18株均出现典型症状,表现为感病。4、采用PCR扩增和酶切的方法,回收纯化gfp和ASPV的cp基因,分别构建了ASPV的cp基因正义链和反义链与gfp基因融合的植物表达载体pCAMBIA1301S -cp（+）-gfp和pCAMBIA1301S -cp（-）-gfp。将重组质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞,运用叶盘法转化5-6叶期的健康西方烟叶片。经共培养和抗性筛选,已得到转pCAMBIA1301S -cp（+）-gfp和转pCAMBIA1301S-cp（-）-gfp的植株各12和18株。
赵英,牛建新[9]（2008）在《利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中苹果茎痘病毒的分布》文中认为【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛（DIG）,通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min为宜,要获得良好的扩增效果,RT反应体系中RNasin的量需大于0.2 U.μl-1,dNTPs大于0.4 mmol.L-1,SuperScriptⅡ在0.1～1.3 U.μl-1,引物在0.9μmol.L-1以上。PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃,循环35次,引物浓度应在0.8～1.2μmol.L-1,LA Taq酶浓度大于0.5 U.100.μl-1。【结论】梨树茎尖顶端分生组织0.25 mm的区域为无病毒区域。
杨绍丽[10]（2008）在《苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达》文中认为苹果茎痘病毒（Apple stem piHing virus,ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的一种潜隐性病毒,广泛分布于世界各苹果和梨种植区。在砧木感病时该病毒可引起树体的严重衰退,对果树生长、产量和果品质量等造成严重的影响。栽培无病毒种苗是解决苹果和梨上ASPV危害的有效途径,病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。本研究采用生物学、分子生物学等方法对来源于砂梨（Pyrus pyrifolia）的P-HH和P-3-2-67及来源于葡萄的G-L3共3个样品进行了ASPV检测和鉴定。通过采用汁液摩擦接种的方法从葡萄上分离获得分离株G-L3,经生物学表现分析、病毒粒子形态电镜观察以及序列比较分析,确定来源于葡萄的分离物为ASPV。构建了来源于砂梨的ASPV的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因原核表达载体,并成功诱导表达,制备了表达蛋白的特异性抗体。具体研究结果如下:1.通过汁液摩擦接种草本指示植物西方烟（Nicotiana occidentalis‘37B’）后,症状观察,两个来源于砂梨的分离物（P-HH、P-3-2-67）和一个来源于葡萄的分离物（G-L3）均显症明显:P-HH在接种叶片上表现凹陷坏死白斑,叶脉坏死,皱缩症状;P-3-2-67出现黑色斑点、叶脉坏死和支脉黄化;G-L3出现叶片褪绿斑点、黑色斑点和坏死症状。通过试管捕捉反转录PCR（Tube capture-reverse transcription PCR,TC-RT-PCR）对3个分离物进行扩增后,PCR产物经6%PAGE电泳后,3个分离物均在316bp处出现特异性条带。进一步提纯病毒和电镜观察,结果显示3个分离物的病毒粒子形态一致,均为弯曲的长线形病毒。由此,推测上述3个来源于砂梨和葡萄的分离物（P-HH、P-3-2-67和G-L3）均为ASPV。2.以P-HH、P-3-2-67和G-L3接种表现症状的西方烟为材料,通过TC-RT-PCR,对这3个分离物CP基因的部分序列（316 bp）进行了扩增、克隆与序列测定。经序列分析,3个分离物的扩增片段与本实验室前期从砂梨（Pyrus pyrifolia）获得的分离株P1同源性最高达98.4%,与国外报道的来自于杂种榲椁（Pyronia veitchii）上的分离株Quince同源性达93%,与来自于楹椁（Cydonia oblonga）的分离物N1最低为77.8%。3个分离物间的核苷酸序列也有一定差异,P-HH/P-3-2-67为99.1%、P-HH/G-L3为99.1%、G-L3/P-3-2-67为99.4%。由此,我们进一步判断来自于葡萄的分离物G-L3为ASPV,这是ASPV侵染葡萄首次发现。3.采用本实验室前期克隆获得的来源于梨树的ASPV分离物6-1-13的CP基因,根据其序列特征设计引物,并在两端加酶切位点,对该基因进行扩增、序列验证后,与载体pET-28a（+）连接构建了该基因的原核表达载体（pET-ASPV-CP）,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中经IPTG诱导表达、表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析,表明该CP基因在大肠杆菌中BL21（DE3）得到正确表达,融合蛋白大小约45 kDa,并且具有免疫原性。通过回收表达蛋白并免疫大耳白兔,制备了ASPV重组CP的多克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:1 000,Western-blot分析证明该抗体可与重组CP发生免疫反应。
二、库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究（论文提纲范文）
（1）基于转录组与小RNA测序的库尔勒香梨病毒检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物病毒检测技术研究进展 |
| 1.1.1 生物学测定法 |
| 1.1.2 电子显微镜检测法 |
| 1.1.3 血清学检测法 |
| 1.1.4 分子生物学检测法 |
| 1.1.5 第二代测序检测法 |
| 第二章 库尔勒香梨转录组测序的分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要的仪器和试材 |
| 2.1.3 转录组测序及序列分析 |
| 2.1.4 总RNA提取 |
| 2.1.5 RT-PCR验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 提取RNA检测结果 |
| 2.2.2 转录组测序结果 |
| 2.2.3 病毒相关序列注释 |
| 2.2.4 RT-PCR验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 库尔勒香梨小RNA测序的分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 小RNA测序 |
| 3.2.2 筛选候选病毒 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测技术（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒研究进展 |
| 1.1 苹果茎痘病毒的研究进展 |
| 1.1.1 苹果茎痘病毒分类地位及株系划分、病毒粒子特性 |
| 1.1.2 苹果茎痘病毒分子生物学特性 |
| 1.1.3 苹果茎痘病毒的发生范围、寄主及传播途径 |
| 1.1.4 苹果茎痘病毒的细胞病理 |
| 1.1.5 感染苹果茎痘病毒的症状 |
| 1.2 苹果茎沟病毒的研究进展 |
| 1.2.1 苹果茎沟病毒分类地位及株系划分、病毒粒子特性 |
| 1.2.2 苹果茎沟病毒分子生物学特性 |
| 1.2.3 苹果茎沟病毒的发生范围,寄主及传播途径 |
| 1.2.4 苹果茎沟病毒的细胞病理 |
| 1.2.5 苹果茎沟病毒的侵染症状 |
| 1.3 果树病毒检测技术研究进展 |
| 1.3.1 指示植物法 |
| 1.3.2 电子显微镜检测技术 |
| 1.3.3 分子生物学检测方法 |
| 1.3.4 血清学检测技术 |
| 1.4 果树病毒的防治策略 |
| 1.4.1 果树的脱毒技术 |
| 1.4.2 田间生产防控 |
| 2 单克隆抗体技术 |
| 2.1 单克隆抗体的结构 |
| 2.2 单克隆抗体的原理 |
| 2.3 单克隆抗体的基本操作流程 |
| 2.4 单克隆技术的发展 |
| 2.5 单克隆抗体在植物病毒检测中的应用 |
| 3 研究目的和意义 |
| 第二章 苹果茎痘病毒梨分离物单克隆抗体的制备及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料 |
| 1.2 实验生化试剂 |
| 1.3 pET-28a-ASPV-CP原核表达载体的构建 |
| 1.4 ASPV CP蛋白的原核表达及纯化 |
| 1.4.1 ASPV CP大量表达 |
| 1.4.2 重组ASPV CP蛋白的纯化 |
| 1.4.3 重组ASPV CP重组蛋白的透析处理 |
| 1.5 ASPV单克隆抗体的制备 |
| 1.5.1 小鼠免疫 |
| 1.5.2 免疫脾细胞的制备,细胞融合及筛选培养 |
| 1.5.3 杂交瘤细胞的单克隆筛选和克隆 |
| 1.5.4 杂交瘤细胞株的冻存和复苏 |
| 1.5.5 腹水抗体的制备及纯化 |
| 1.5.6 间接ELISA法测定单抗腹水效价 |
| 1.5.7 单克隆抗体的类型及亚类鉴定 |
| 1.6 ASPV多克隆抗体的制备 |
| 1.7 血清学检测方法的建立 |
| 1.7.1 ACP ELISA方法的建立 |
| 1.7.2 TAS-ELISA方法的建立 |
| 1.7.3 DAS-ELISA检测方法的建立 |
| 1.7.4 dot-ELISA检测方法的建立 |
| 1.8 建立的血清学方法的田间检测应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ASPV CP蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.2 ASPV单克隆抗体制备、抗体类型和亚类鉴定、效价测定 |
| 2.3 Westem blot检测ASPV单抗的特异性 |
| 2.4 ACP-ELISA方法的建立及单抗特异性分析 |
| 2.5 DAS-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度 |
| 2.5.1 检测梨树中ASPV的DAS-ELISA方法的建立与特异性分析 |
| 2.5.2 DAS-ELISA方法检测梨树病叶中ASPV的灵敏度分析 |
| 2.6 TAS-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度 |
| 2.6.1 检测梨树中ASPV的TAS-ELISA方法的建立与特异性分析 |
| 2.6.2 检测梨树中ASPV的TAS-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 dot-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度 |
| 2.7.1 检测梨树中ASPV的dot-ELISA方法的建立与特异性分析 |
| 2.7.2 检测梨树中ASPV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.8 血清学方法的果园应用 |
| 3 讨论 |
| 第三章 苹果茎沟病毒单克隆抗体的制备及其检测应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料 |
| 1.2 生化试剂 |
| 1.3 ASGV CP蛋白的原核表达和纯化 |
| 1.4 ASGV单克隆抗体和多克隆抗体的制备 |
| 1.5 ASGV血清学方法的建立 |
| 1.6 检测ASGV的RT-PCR方法 |
| 1.7 血清学方法检测果园中的ASGV |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ASGV抗原的制备 |
| 2.2 分泌ASGV单克隆抗体的杂交瘤细胞及其腹水单抗的制备 |
| 2.3 Western blot分析ASGV单抗的特异性 |
| 2.4 ACP-ELISA分析ASGV单抗方法的建立及特异性分析 |
| 2.5 检测ASGV的TAS-ELISA方法 |
| 2.5.1 检测不同寄主中ASGV的TAS-ELISA方法的建立和特异性分析 |
| 2.5.2 检测不同寄主中ASGV的TAS-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.6 检测ASGV dot-ELISA方法的建立及其特异性和灵敏度分析 |
| 2.6.1 检测不同寄主中ASGV的dot-ELISA方法的建立和特异性分析 |
| 2.6.2 检测不同寄主中ASGV的dot-ELISA方法的灵敏度分析 |
| 2.7 血清学方法和RT-PCR检测果园中的ASGV |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录A 本论文中所用病毒名称及缩写 |
| 附录B 生化试剂及分子生物学试剂 |
| 附录C 常用试剂提取配方及缓冲液、培养基配方 |
（3）‘嘎啦’苹果试管苗脱毒体系建立及生根移栽研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 果树病毒侵染及危害 |
| 1.2 果树病毒病研究概况 |
| 1.3 果树病毒检测技术 |
| 1.3.1 生物学鉴定法 |
| 1.3.2 电子显微镜技术检测法 |
| 1.3.3 血清学鉴定法 |
| 1.3.3.1 酶联免疫吸附法 |
| 1.3.3.1.1 双抗体夹心法 |
| 1.3.3.1.2 间接法 |
| 1.3.3.2 点免疫结合测定技术 |
| 1.3.4 分子生物学检测法 |
| 1.3.4.1 分子杂交技术 |
| 1.3.4.2 双链RNA（ds RNA）分析法 |
| 1.3.4.3 聚合酶链式反应（PCR） |
| 1.3.4.4 酶联免疫结合PCR技术（PCR-ELISA） |
| 1.3.5 其他方法 |
| 1.3.5.1 免疫电镜法 |
| 1.3.5.2 免疫捕获PCR(IC-PCR) |
| 1.4 植物病毒的脱毒技术 |
| 1.4.1 热处理法 |
| 1.4.2 茎尖组织培养法 |
| 1.4.3 热处理结合茎尖脱毒法 |
| 1.4.4 茎尖微体嫁接 |
| 1.4.5 花药培养法 |
| 1.4.6 抗病毒剂法 |
| 1.4.7 超低温脱毒法（冷疗法） |
| 1.5 苹果病毒的研究进展 |
| 1.5.1 苹果病毒种类 |
| 1.5.2 苹果脱毒方法 |
| 1.5.3 苹果病毒检测方法 |
| 1.6 试管苗生根与移栽 |
| 1.7 研究内容及目的意义 |
| 1.8 技术路线图 |
| 第二章 ‘嘎啦’苹果试管苗脱毒体系的建立 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.2.1 茎尖培养诱导分化培养基的筛选 |
| 2.1.2.2 热处理的温度试验 |
| 2.1.2.3 不同浓度RBV处理脱毒 |
| 2.1.2.4 结果统计方法 |
| 2.1.2.5 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同培养基及激素浓度对茎尖培养的影响 |
| 2.2.2 不同培养基及激素浓度对茎尖分化增殖的影响 |
| 2.2.3 不同热处理方法对组培苗生长的影响 |
| 2.2.4 不同浓度利巴韦林对组培苗成活率的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 不同培养基及激素浓度对茎尖培养的影响 |
| 2.3.2 不同热处理对组培苗生长的影响 |
| 第三章 苹果病毒检测体系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.1.1 四个苹果材料的病毒检测 |
| 3.1.1.2 脱毒材料检测 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.2.1 四种脱毒方法 |
| 3.1.2.2 PCR检测 |
| 3.1.2.3 ELISA检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 四个苹果材料的带毒状况检测 |
| 3.2.2 四种脱毒方法的PCR检测 |
| 3.2.2.1 茎尖脱毒效果检测 |
| 3.2.2.2 热处理脱毒效果检测 |
| 3.2.2.3 热处理结合茎尖脱毒效果检测 |
| 3.2.2.4 抗病毒剂利巴韦林脱毒效果检测 |
| 3.2.3 四种脱毒方法的ELISA检测 |
| 3.2.3.1 茎尖培养脱毒效果的ELISA检测 |
| 3.2.3.2 热处理脱毒效果的ELISA检测 |
| 3.2.3.3 热处理结合茎尖培养脱毒效果的ELISA检测 |
| 3.2.3.4 不同浓度利巴韦林处理脱毒效果的ELISA检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 PCR检测与ELISA检测的比较 |
| 3.3.2 四种脱毒方法脱毒效果的比较 |
| 第四章 ‘嘎啦’苹果试管苗生根培养基的筛选及SA对试管苗移栽的生理效应 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验设计及方法 |
| 4.1.2.1 诱导生根的不同培养基及激素组合 |
| 4.1.2.2 生根培养基的筛选 |
| 4.1.2.3 测定方法及数据分析方法 |
| 4.1.2.4 试管苗的移栽 |
| 4.1.2.5 水杨酸浓度的筛选 |
| 4.1.3 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同处理组合对‘嘎啦’试管苗生根率的影响 |
| 4.2.2 不同处理对单株生根条数的影响 |
| 4.2.3 不同处理组合对‘嘎啦’试管苗根重的影响 |
| 4.2.4 不同处理组合对‘嘎啦’试管苗根长的影响 |
| 4.2.5 不同生根培养基对‘嘎啦’试管苗根系活力的影响 |
| 4.2.6 SA对‘嘎啦’试管苗移栽的效应 |
| 4.2.6.1 SA对移栽试管苗成活率的影响 |
| 4.2.6.2 水杨酸对移栽试管苗叶片叶绿素含量的影响 |
| 4.2.6.3 水杨酸对移栽试管苗叶片气孔开度的影响 |
| 4.2.6.4 移栽成活率与叶绿素和气孔开度的相关性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 生根培养基的筛选 |
| 4.3.1.1 基本培养基对生根的影响 |
| 4.3.1.2 激素对生根的影响 |
| 4.3.1.3 不同处理对试管苗根系活力的影响 |
| 4.3.2 SA对 ‘嘎啦’试管苗移栽的影响 |
| 4.3.2.1 SA处理对移栽试管苗叶绿素含量的影响 |
| 4.3.2.2 SA处理对移栽试管苗叶片气孔开闭的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 实时荧光定量PCR技术概述 |
| 1.1 实时荧光定量PCR基本原理 |
| 1.2 实时荧光定量PCR检测方法 |
| 1.2.1 荧光嵌合法（SYBR GreenⅠ） |
| 1.2.2 TaqMan探针法 |
| 1.2.3 分子信标法（Molecular beacons） |
| 1.3 实时荧光定量PCR技术的定量方法 |
| 1.3.1 绝对定量法 |
| 1.3.2 相对定量法 |
| 1.4 实时荧光定量PCR在植物植物病理学研究中的应用 |
| 2 内参基因概述 |
| 2.1 常用的内参基因 |
| 2.2 内参基因的选择 |
| 3 苹果病毒病概述 |
| 3.1 苹果病毒病概况 |
| 3.2 苹果病毒的传播途径 |
| 3.3 苹果病毒病的防控措施 |
| 3.4 苹果潜隐性病毒的检测方法 |
| 3.4.1 指示植物法 |
| 3.4.2 电子显微镜技术 |
| 3.4.3 血清学方法 |
| 3.4.3 分子生物学技术 |
| 3.5 三种苹果潜隐性病毒 |
| 3.5.1 苹果茎沟病毒 |
| 3.5.2 苹果茎痘病毒 |
| 3.5.3 苹果褪绿叶斑病毒 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 第二章 苹果六个内参基因的优选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 总RNA的提取 |
| 1.3.2 总RNA完整性和纯度的检测 |
| 1.3.3 总RNA的纯化 |
| 1.3.4 cDNA的合成 |
| 1.3.5 引物的设计与合成 |
| 1.3.6 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度筛选 |
| 1.3.7 六个内参基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应 |
| 1.3.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的提取 |
| 2.2 总RNA的纯化及cDNA合成 |
| 2.3 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度的筛选 |
| 2.4 六个内参基因的实时荧光定量PCR反应 |
| 2.5 六个内参基因的筛选 |
| 2.5.1 六个内参基因的表达水平分析 |
| 2.5.2 六个内参基因的稳定性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 苹果Actin基因TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 总RNA的提取 |
| 1.4 cDNA的合成 |
| 1.5 引物与探针的设计与合成 |
| 1.6 阳性重组质粒的构建 |
| 1.6.1 Actin基因的常规PCR扩增 |
| 1.6.2 目标片段的回收 |
| 1.6.3 目标片段的克隆 |
| 1.6.4 重组质粒的提取 |
| 1.6.5 重组质粒的鉴定 |
| 1.7 cRNA标准品的制备 |
| 1.7.1 阳性重组质粒的线性化处理 |
| 1.7.2 cRNA的体外转录及纯化 |
| 1.8 Actin基因TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系的建立 |
| 1.8.1 标准曲线的制作 |
| 1.8.2 反应体系与常规RT-PCR灵敏度的对比 |
| 1.8.3 反应体系的特异性 |
| 1.8.4 反应体系的重复性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Actin基因的常规PCR扩增及其产物的回收 |
| 2.2 阳性重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 cRNA的体外转录 |
| 2.4 实时荧光定量RT- PCR标准曲线的制作 |
| 2.5 实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度的对比 |
| 2.6 实时荧光定量PCR的重复性 |
| 2.7 实时荧光定量PCR的特异性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂和仪器： |
| 1.3 引物和探针的设计合成 |
| 1.4 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.5 阳性质粒标准品的构建 |
| 1.6 标准曲线的绘制 |
| 1.7 实时荧光定量RT-PCR反应体系的方法学测试 |
| 1.7.1 实时荧光定量RT-PCR的特异性试验 |
| 1.7.2 实时荧光定量RT-PCR的灵敏性试验 |
| 1.7.3 实时荧光定量RT-PCR的重复性试验 |
| 1.8 实际样品的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阳性质粒标准品的构建 |
| 2.2 标准曲线的建立 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR特异性 |
| 2.4 实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR灵敏度的比较 |
| 2.5 实时荧光定量RT-PCR重复性 |
| 2.6 实际样品检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物及探针的设计与合成 |
| 1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.3 重组质粒标准品的制备及标准曲线绘制 |
| 1.2.4 实时荧光定量RT-PCR特异性、灵敏性、重复性试验 |
| 1.2.5 实际样品检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒标准品的鉴定及标准曲线的绘制 |
| 2.2 实时荧光定量RT-PCR的特异性 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度 |
| 2.4 实时荧光定量RT- PCR的重复性 |
| 2.5 实际样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物及探针的设计与合成 |
| 1.3 总RNA的提取及RT-PCR |
| 1.4 阳性质粒的构建 |
| 1.5 标准品cRNA的制备及标准曲线的绘制 |
| 1.6 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证与实际样品检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阳性质粒的构建 |
| 2.2 标准曲线的绘制 |
| 2.3 实时荧光定量RT-PCR的特异性 |
| 2.4 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度 |
| 2.5 实时荧光定量RT-PCR的重复性 |
| 2.6 实际样品的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）植物与病毒互作机理研究的遗传分离（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物对病原物的免疫反应 |
| 1.2 植物内源RNA Silencing |
| 1.2.1 什么是RNA Silencing |
| 1.2.2 RNA Silencing信号在植物内的非细胞自主性 |
| 1.2.3 植物内源小RNA种类 |
| 1.2.4 RNA沉默的抗病毒作用 |
| 1.2.5 植物病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.3 拟南芥内源RNA沉默相关的蛋白 |
| 1.3.1 Dicer-like酶 |
| 1.3.2 Argonaute(AGO)蛋白 |
| 1.3.3 RDR以及其他参与RNA沉默途径的蛋白 |
| 1.4 烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV) |
| 1.5 Recovery现象 |
| 1.6 病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS) |
| 1.7 凹陷病毒属病毒研究进展 |
| 1.7.1 凹陷病毒属病毒分子特征 |
| 1.7.2 凹陷病毒属病毒株系分化 |
| 1.7.3 凹陷病毒属病毒寄主范围和传播方式 |
| 1.7.4 凹陷病毒属各个病毒之间分子和血清学关系 |
| 1.8 研究目的与意义 |
| 第二章 源于梨的ASPV分子变异及遗传进化分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 RT-PCR、克隆和测序 |
| 2.2.3 序列比对,进化树、遗传距离和重组分析 |
| 2.2.4 选择压力分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 基于ASPV CP进化树分析 |
| 2.3.2 基于ASPV TGB进化树分析 |
| 2.3.3 基于ASPV RdRP进化树分析 |
| 2.3.4 CP 5'端一种新的核苷酸插入方式 |
| 2.3.5 ASPV各基因内潜在重组事件分析 |
| 2.3.6 ASPV各基因选择压力和群体多样性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ASPV梨分离物HB-HN1全长和vsiRNA特性分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 植物毒源材料 |
| 3.2.2 总RNA的提取,RT-PCR以及克隆测序 |
| 3.2.3 5'-RACE,3'-RACE |
| 3.2.4 HB-HN1沙梨样品小RNA测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 HB-HN1基因组全长分析 |
| 3.3.2 HB-HN1与已报道的ASPV全长亲缘关系分析 |
| 3.3.3 源于沙梨分离物HB-HN1 ASPV-vsiRNA分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 不同ASPV分离物编码蛋白功能多样性分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株,载体以及试剂 |
| 4.2.2 本研究所用ASPV各个基因表达载体的构建 |
| 4.2.3 ASPV CP的原核诱导表达方法以及SDS-PAGE分析 |
| 4.2.4 不同抗ASPV CP重组外壳蛋白的抗血清的的制备 |
| 4.2.5 间接ELISA(Indirect ELISA,ID-ELISA)检测多克隆抗体效价 |
| 4.2.6 农杆菌侵染接种本氏烟和西方烟 |
| 4.2.7 Western blot分析表达的重组外壳蛋白的正确性和抗原性 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同来源ASPV分离物生物学多样性 |
| 4.3.2 不同来源ASPV CP融合蛋白制备抗血清多样性分析 |
| 4.3.3 不同来源ASPV分离物TGBp3跨膜区域多样性分析 |
| 4.3.4 ASPV各基因沉默抑制子分析 |
| 第五章 RNA沉默和P-bodies相关组份在病毒Recovery以及VIGS过程中的作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 植物和病毒来源 |
| 5.2.2 总RNA提取以及Northern blot杂交 |
| 5.2.3 Western Blotting分析 |
| 5.2.4 核糖体RNA分离 |
| 5.2.5 激光共聚焦扫描显微镜观察P-bodies及其定量 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 拟南芥RNA沉默突变体中TRV的Recovery现象 |
| 5.3.2 AGO2和AGO4突变体植株对烟草脆裂病毒更易感 |
| 5.3.3 拟南芥RNA沉默突变体中TRV诱导的基因沉默(VIGS) |
| 5.3.4 温度对dcl2/dcl3/dcl4突变体植株VIGS程度的影响 |
| 5.3.5 翻译抑制以及PB参与烟草脆裂病毒的Recovery过程 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 本研究中使用病毒或病毒载体基因组结构 |
| 附录2 RT-PCR方法检测三种常见仁果类果树病毒结果统计表 |
| 附录3 本研究中所有测序CP克隆在GenBank上登录号汇总 |
| 附录4 本研究中所有测序TGB克隆在GenBank上登录号汇总 |
| 附录5 预测ASPV CP 6个分离物的B细胞线性表位 |
| 附录6 间接ELISA测定基于CP原核表达融合蛋白制备的多克隆抗血清的效价 |
| 附录7 多克隆抗体PAb-HB-HN6-8检测ASPV CP原核表达融合蛋白效价测定 |
| 附录8 多克隆抗体PAb-HB-HN9-3检测ASPV CP原核表达融合蛋白效价测定 |
| 附录9 多克隆抗体PAb-YN-MRS-17检测ASPV CP原核表达融合蛋白效价测定 |
| 附录10 pGEM-T载体信息 |
| 附录11 pET-28a(+)载体信息 |
| 附录12 本研究使用各类试剂配方 |
| 附录13 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）库尔勒香梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 果树病毒病国内外研究概况 |
| 1.2 蛋白质纯化的研究概况 |
| 1.2.1 蛋白质纯化的意义 |
| 1.2.2 蛋白质纯化的一般原则 |
| 1.2.3 蛋白质纯化的方法 |
| 1.3 果树病毒基因组研究 |
| 1.3.1 果树病毒基因组国外研究现状 |
| 1.3.2 果树病毒基因组国内研究现状 |
| 1.4 苹果茎痘病毒基因组研究进展 |
| 第二章 苹果茎痘病毒外壳蛋白基因载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 供试菌株及供试质粒 |
| 2.1.3 抗生素 |
| 2.1.4 限制性内切酶及主要试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外壳蛋白片段的引物设计及克隆 |
| 2.2.1.1 苹果茎痘病毒外壳蛋白cDNA的获得 |
| 2.2.1.2 引物设计 |
| 2.2.1.3 PCR反应 |
| 2.2.2 扩增片段的克隆及序列测定 |
| 2.2.3 载体构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ASPV CP片段扩增 |
| 2.3.2 克隆载体的构建 |
| 2.3.3 表达载体的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 关于苹果茎痘病毒核苷酸序列序列分析 |
| 2.4.2 关于苹果茎痘病毒氨基酸序列序列分析 |
| 第三章 苹果茎痘病毒外壳蛋白表达鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 苹果茎痘病毒外壳蛋白的表达分析 |
| 3.2.2 外壳蛋白的纯化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 构建了苹果茎痘病毒外壳蛋白的克隆载体 |
| 4.1.2 构建了苹果茎痘病毒外壳蛋白的表达载体 |
| 4.1.3 构建了良好的体系 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师评阅表 |
（7）苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 总RNA提取 |
| 1.5 RT-PCR |
| 1.6 克隆、测序和序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ASPV的RT-PCR检测 |
| 2.2 外壳蛋白基因的扩增、克隆及测序 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.3.1 同源性分析 |
| 2.3.2 系统进化分析 |
| 2.3.3 抗原指数差异分析 |
| 3 讨论 |
（8）苹果茎痘病毒cp基因介导病毒抗性研究及其植物表达载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果茎痘病毒研究进展 |
| 1.1.1 ASPV的生物学特性 |
| 1.1.1.1 ASPV的寄主及分布 |
| 1.1.1.2 ASPV的株系特征 |
| 1.1.1.3 ASPV的传播途径 |
| 1.1.2 ASPV的基因组结构 |
| 1.1.3 ASPV的病毒粒子特性 |
| 1.1.4 ASPV的检测 |
| 1.1.4.1 生物学鉴定 |
| 1.1.4.2 血清学法 |
| 1.1.4.3 分子生物学检测 |
| 1.2 植物病毒病防治策略 |
| 1.2.1 无病毒苗木的培育 |
| 1.2.2 交叉保护 |
| 1.2.3 抗病毒转基因工程 |
| 1.2.3.1 CP介导的抗病研究 |
| 1.2.3.2 反义RNA技术 |
| 1.3 RNAi的研究进展 |
| 1.4 转基因植物的检测 |
| 1.5 GFP的研究进展 |
| 1.5.1 GFP的发现 |
| 1.5.2 GFP的发光机制 |
| 1.5.3 GFP的改良 |
| 1.5.4 GFP在植物生物技术研究中的应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 苹果茎痘病毒CP基因介导的抗病毒研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 转基因植物 |
| 2.1.2 供试毒源 |
| 2.1.3 ASPV抗体 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗性植株的生根 |
| 2.2.2 转基因植株的分子生物学鉴定 |
| 2.2.2.1 PCR检测 |
| 2.2.2.2 Western blot分析 |
| 2.2.3 转基因植株的抗病性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 转ASPV cp基因正义链和反义链烟草植株的分子生物学检测 |
| 2.3.1.1 转基因植株的PCR检测 |
| 2.3.1.2 Western blot分析 |
| 2.3.2 转基因植株的抗病性分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 苹果茎痘病毒cp与gfp基因融合的植物表达载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 供试材料 |
| 3.1.3 叶盘法转化所用西方烟叶片 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GFP基因的克隆和测序 |
| 3.2.1.1 引物的设计 |
| 3.2.1.2 gfp基因的PCR扩增与检测 |
| 3.2.1.3 gfp基因的回收与纯化 |
| 3.2.1.4 目标片段与载体的连接 |
| 3.2.1.5 连接产物转化宿主菌 |
| 3.2.1.6 菌液的保存及质粒DNA的制备 |
| 3.2.1.7 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1.8 序列测定和分析 |
| 3.2.2 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(+)-gfp的构建 |
| 3.2.2.1 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(+)-gfp的构建策略 |
| 3.2.2.2 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(+)-gfp的构建方法 |
| 3.2.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.3 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(-)-gfp的构建 |
| 3.2.3.1 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(-)-gfp的构建策略 |
| 3.2.3.2 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(-)-gfp的构建方法 |
| 3.2.4 植物表达载体转化农杆菌 |
| 3.2.5 叶盘法转化西方烟 |
| 3.2.5.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 |
| 3.2.5.2 重组植物表达载体电击转化根癌农杆菌感受态细胞 |
| 3.2.5.3 烟草的转化和筛选 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 gfp基因的克隆和测序 |
| 3.3.1.1 gfp基因的PCR扩增 |
| 3.3.1.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.1.3 gfb基因的序列分析 |
| 3.3.2 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(+)-gfp的构建 |
| 3.3.2.1 载体pCAMBIA1301S-cp(+)的验证 |
| 3.3.2.2 重组植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(+)-gfp的PCR鉴定 |
| 3.3.3 植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(-)-gfp的构建 |
| 3.3.3.1 载体pCAMBIA1301S-cp(-)的验证 |
| 3.3.3.2 重组植物表达载体pCAMBIA1301S-cp(-)-gfp的PCR鉴定 |
| 3.3.4 植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 3.3.5 叶盘法转化西方烟 |
| 3.3.5.1 叶盘的选择培养 |
| 3.3.5.2 叶盘的分化 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录:主要试剂及溶液的配制 |
| 致谢 |
（9）利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中苹果茎痘病毒的分布（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂及酶类 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 梨组织中总RNA的提取 |
| 1.2.2 梨树苹果茎痘病毒RT-PCR体系 |
| 1.2.2. 1 cDNA的合成 |
| 1.2.2. 2 PCR扩增 |
| 1.2.3 电泳检测 |
| 1.2.4 目的片段克隆及酶切鉴定 |
| 1.2.5 地高辛标记的c DNA探针制备 |
| 1.2.6 石蜡切片制备 |
| 1.2.7 组织预处理 |
| 1.2.8 库尔勒香梨切片中苹茎痘病毒的原位RT-PCR检测 |
| 1.2.8. 1 反转录体系 |
| 1.2.8. 2 原位PCR扩增 |
| 1.2.8. 3 对照的设置 |
| 1.2.8. 4 原位杂交 |
| 1.2.8. 5 原位RT-PCR及原位杂交产物免疫检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原位杂交与原位RT-PCR的优化 |
| 2.1.1 非放射性标记Dig探针的鉴定 |
| 2.1.2探针显色灵敏度的检测 |
| 2.1.3 碱性磷酸酶显色系统可靠性检测 |
| 2.1.4 茎尖切片厚度对检测效果的影响 |
| 2.1.5 蛋白酶处理时间的影响 |
| 2.1.6 RT组分浓度对原位PCR效果的影响 |
| 2.1.7 原位扩增中各因素对PCR效果的影响 |
| 2.2 茎尖切片直接原位RT-PCR检测结果 |
| 2.3 茎尖切片间接原位RT-PCR检测结果 |
| 2.4 梨叶片中ASPV在组织中的分布 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（10）苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ASPV的生物学特性 |
| 1.1.1 ASPV的地理分布与寄主范围 |
| 1.1.2 ASPV的症状特点 |
| 1.1.3 ASPV的传播途径 |
| 1.2 ASPV的病毒粒子特性和细胞病理学 |
| 1.3 血清学及株系 |
| 1.4 ASPV的基因组结构和组成 |
| 1.5 ASPV的检测技术 |
| 1.5.1 指示植物检测 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学检测 |
| 1.6 病毒抗血清的制备 |
| 1.6.1 以提纯病毒粒体为抗原制备抗体 |
| 1.6.2 以病毒CP基因体外表达产物为抗原制备抗体 |
| 1.7 病毒病害的防治 |
| 1.7.1 培育和栽培无病毒苗木 |
| 1.7.2 抗病毒转基因工程 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 第二章 苹果茎痘病毒的生物学及分子生物学鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 菌株及主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 生物学鉴定 |
| 2.2.2 分子生物学检测 |
| 2.2.2.1 反转录合成cDNA |
| 2.2.2.2 PCR扩增 |
| 2.2.2.3 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(PAGE) |
| 2.2.3 病毒粒子形态观察 |
| 2.2.3.1 镁-皂土悬浮液的制备 |
| 2.2.3.2 病毒提纯方法 |
| 2.2.3.3 电镜观察 |
| 2.2.4 基因克隆 |
| 2.2.4.1 目的片段的扩增 |
| 2.2.4.2 目的片段的回收 |
| 2.2.4.3 载体的连接 |
| 2.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.4.5 热击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞 |
| 2.2.4.6 阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4.7 质粒DNA的小量制备 |
| 2.2.4.8 序列测定与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ASPV的生物学鉴定及分子检测结果 |
| 2.3.1.1 生物学特性 |
| 2.3.1.2 TC-RT-PCR检测结果 |
| 2.3.2 病毒粒子形态观察 |
| 2.3.3 CP基因部分序列的克隆与序列分析 |
| 2.3.3.1 克隆与鉴定 |
| 2.3.3.2 核苷酸序列分析 |
| 2.3.4 小结与讨论 |
| 第三章 ASPV CP基因原核表达载体构建及表达蛋白抗体制备 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 CP基因来源及克隆所用质粒和菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 CP基因克隆与序列测定 |
| 3.2.1.1 CP基因的PCR扩增 |
| 3.2.1.2 CP基因PCR产物的克隆 |
| 3.2.1.3 质粒DNA的制备及重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1.4 序列测定与分析 |
| 3.2.2 CP基因的原核表达 |
| 3.2.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2.2 CP基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.2.2.3 SDS-PAGE分析 |
| 3.2.3 重组蛋白的大量制备及定量 |
| 3.2.4 抗血清的制备 |
| 3.2.4.1 免疫注射 |
| 3.2.4.2 抗血清的收集与保存 |
| 3.2.4.3 吸附去除非目的蛋白产生的抗体 |
| 3.2.5 间接ELISA(Indirect ELISA,ID-ELISA)测定抗血清的效价 |
| 3.2.6 Western-blot分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因克隆与序列测定 |
| 3.3.1.1 CP基因的扩增 |
| 3.3.1.2 重组克隆质粒的PCR及质粒酶切鉴定 |
| 3.3.1.3 CP基因序列分析 |
| 3.3.2 原核表达及抗血清制备 |
| 3.3.2.1 表达载体的构建 |
| 3.3.2.2 重组质粒转化表达菌BL21(DE3) |
| 3.3.2.3 原核表达及SDS-PAGE分析 |
| 3.3.2.4 表达蛋白的Western-blot分析 |
| 3.3.2.5 重组蛋白的浓度测定 |
| 3.3.4 ID-ELISA法测定抗血清的效价 |
| 3.3.5 制备抗血清的Western-blot分析 |
| 3.3.6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录:主要试剂及溶液的配制 |
| 致谢 |
四、库尔勒香梨的苹果茎痘病毒cDNA探针检测技术研究（论文参考文献）
- [1]基于转录组与小RNA测序的库尔勒香梨病毒检测[D]. 杨洁萍. 石河子大学, 2020(08)
- [2]苹果茎痘病毒梨分离物和苹果茎沟病毒基于单克隆抗体的血清学检测技术[D]. 孙朱元吉. 浙江大学, 2017(01)
- [3]‘嘎啦’苹果试管苗脱毒体系建立及生根移栽研究[D]. 王淑华. 甘肃农业大学, 2016(08)
- [4]苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[D]. 秦子禹. 河北农业大学, 2015(08)
- [5]植物与病毒互作机理研究的遗传分离[D]. 马小方. 华中农业大学, 2015(03)
- [6]库尔勒香梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达[D]. 李文慧. 石河子大学, 2010(03)
- [7]苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析[J]. 李丽丽,董雅凤,张尊平,张志宏,范旭东,裴光前. 园艺学报, 2010(01)
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- [10]苹果茎痘病毒的鉴定及其外壳蛋白基因的原核表达[D]. 杨绍丽. 华中农业大学, 2008(03)