一、IE家族最新成员（论文文献综述）
刘爽[1]（2021）在《“七丘之城”：从里斯本、果阿到澳门 ——跨文化视野下15-18世纪罗马“圣城”景观在欧亚大陆的复制与改写》文中指出城市的拓展亦是一个征服高地的过程,从罗马城的“七丘”到帝国境内的大量山地城市,“山地建城”的理念也成为多数罗马城市的一大共性,在中世纪的宗教狂热中催生出一座座“山巅之城”,那些在图像中高悬山巅的建筑,成为与神明最为接近的“圣地”,赋予了城市一顶形制特殊的“冠冕”。在文艺复兴时期,这种理想在“七丘之城”罗马得到极大强化,通过一系列的城市改造、在罗马之劫的废墟上建立起一个新的圣城,不仅引起境内城市的竞相效仿,更在海权时代再度拓展到地中海的“边缘”,从而在曾经历罗马化的伊比利亚半岛获得了自由,发展出更具适应性的本土化山城格局。但与4世纪已将自身打造成“第二罗马”的君士坦丁堡不同,这些城市虽与罗马教廷的宗教运动息息相关,却同本国的海外事业有着更大的关联。在葡萄牙,首都里斯本不仅通过系列“重建罗马”的计划向圣城靠拢,更将其改造成以“下城区”为核心的“滨海山城”,以此展现海权时代的核心推动力——跨洋贸易。在这一过程当中,经过葡萄牙“本土化”的山城理念被带往印度洋的各个海岸和岛屿,罗马教廷的强盛势力也通过里斯本王室渗透其中,最终以一座座群山环抱下的新城塑造了葡萄牙帝国的海疆。正是在这一过程中,果阿凭借绝对的政治、宗教地位被打造成一个东方的罗马,它不仅与地中海的第一罗马遥相呼应,更使“高地建城”的理念进一步向远东传递,借助完备的山地建设和系列适应政策,将“真十字之地”澳门营建成一座特征鲜明的“妈港神名之城”。然而,在这种不断“移动”的圣城背后,是罗马人“从山地到海滨”的城市化进程,并在海权时代“从地中海到印度洋”的贸易局势下,经历了建城“媒介”的一次次转变,从而在适应山区、平原、海滨与岛屿的过程中,由古典向近代社会迈进,最终在中西交汇的“十字路口”,将遥想中的“真十字之地”（澳门）化作了现实。
王静[2]（2021）在《斯坦利·卡维尔的电影哲学研究》文中研究表明斯坦利·卡维尔（Stanley Cavell,1926-2018）是美国当代着名的哲学家,同时也是英语哲学界（Anglophone philosophy）最重要的电影研究学者之一。卡维尔的哲学思想以抵制英美传统和欧陆传统的分裂为特征,主张在日常生活中减少概念化因素对哲学认知的干扰,并坚持把文化和艺术纳入哲学探究的范畴。他以本体论和伦理学作为具有普遍意义的核心议题,提出哲学反思是基于语言交流关系之上的对自我和世界关系的认知活动,并认为这种认知是艺术和哲学的恒久追求,因此他被认为是一位具有“人文主义”和“现代主义”精神的当代哲学家,而此基本思想也贯穿了他对电影的研究。①卡维尔继承了经典现实主义电影理论对现实生活的观照精神,擅长从哲学视角探讨电影与人性、电影与世界的关系。他提出电影的本质具有浑然天成的思想性和哲学性,并在此基础上形成了基于媒介特性的电影本体论和类型发展观,为电影媒介本身和电影的阐释行为赋予了“哲学合法性”②,开启了电影研究中的哲学转向,因此被认为是当代电影理论时期“电影哲学”学派的杰出代表。同时,作为一位当代主流哲学家,卡维尔早在五十年代就将电影带到大学课堂中探讨,设立了基于电影解读的哲学理论课,对电影学科在美国高校体制内的建立起到了开拓性的作用。③卡维尔的电影哲学中和了新好莱坞电影对艺术形式的反思以及经典好莱坞电影对美国生活的表现,是对欧洲电影理论的美国式解读,从理论上提高了好莱坞流行电影在电影研究中的艺术地位。卡维尔主张从哲学视角来研究电影的本体特征和艺术价值,其观点在“电影作为语言”盛行的七八十年代并没有受到足够的重视,直到进入数字电影时代以后才受到追捧,并在九十年代得到重新阐释,成为“电影作为哲学”（Film as Philosophy）派系的主要理论来源,为重新界定电影本体概念提供了理论支持;同时,他的电影类型观对商业化程度极高的当代电影产业也具有指导作用和现实借鉴意义。统观卡维尔的电影哲学着述,可以发现其理论是从哲学的视角探讨电影本质和电影体验的研究,主要内容由三部分构成:电影本体论、电影的类型分析和电影阐释与批评。为了完整地呈现卡维尔的电影哲学思想,本文以这三部分的核心问题为支撑点,挖掘其中的内在联系,把分散于卡维尔着述中涉及电影意义的观点进行整理,甄别和归纳他对电影阐释批评的立场和特点,并以此作为电影本体、类型研究和批评阐释之间的关联和延伸,形成完整的逻辑链条。基于该思路,本文的主要内容大致安排如下:绪论部分简述选题缘由、研究目的、思路和主要研究方法。从卡维尔电影哲学的内容上看,卡维尔提出电影本身的内在逻辑使其具有自主性和思想性,该观点引领了正在发生的电影研究的哲学转向,具有重要的理论意义;从电影理论史的发展进程来看,卡维尔的电影哲学属于当代电影理论阶段“本体论2”①思想的代表,在电影理论史上具有特殊的地位和研究价值,值得进行系统地研究和借鉴。但是,已有的相关研究成果大都呈碎片化特征,缺少对其电影哲学理论的系统性和整体性研究。本文在全面地搜集和整理了相关文献之后,意欲对卡维尔的电影哲学进行整体理论研究,揭示其电影哲学中的内在逻辑关系,并在此基础上对其主要观点和理论框架作出系统的分析和呈现。论文第一章梳理了卡维尔电影哲学的思想来源和形成过程。鉴于卡维尔对于国内学术界来说还比较陌生,本章使用较多篇幅勾画其学术成长道路,并圈点出了对其电影哲学有重要影响的理论。首先,略述卡维尔的求学生活,指出正是对电影的迷影情结引导他从作曲专业转到哲学专业,并引导他把电影纳入哲学研究范畴。其次,分别论述了实用主义哲学、现象学、现实主义电影理论和伦理学对卡维尔电影哲学的影响。最后,分析其电影哲学理论形成的文化语境,指出经典好莱坞电影和新好莱坞影片在他的理论中所起的不同作用。第二章阐述了卡维尔电影哲学的基础和核心——电影本体论。首先,把卡维尔的电影本体论具象为他对电影媒介的本体反思,通过对比卡维尔的本体论与巴赞的摄影影像本体论,将两者的根本性差异放在电影媒介中摄影和投影装置的区别上,并进一步剖析卡维尔基于“一系列自动的世界投影”的本体描述,指出其电影本体论的核心为投影装置及其产生的现象学关系之和。该观点是其电影哲学理论大厦的基石,直接影响了他后来对电影艺术现象和电影体验的看法。接着,本章展开对电影媒介特性的分析,说明电影具有“单向性”“自动性”和“自指性”,因此电影媒介本身具有内在逻辑性和自主性,并非再现现实的工具。最后,分析电影媒介的素材来源一—现实世界,指出卡维尔所理解的电影中的世界是一个现象学意义上的艺术空间,具有过去时间性和空间延展性的特征。第三章论述了卡维尔的电影类型观。卡维尔对电影类型的归纳和论述是其电影本体论在电影艺术现象层面的具体体现,因此他对电影类型的探讨也围绕电影最本质的意义展开。本章通过三个小节,分别阐释了卡维尔的“类型基因”概念、以“类型作为媒介”的论点,和类型的再叙述与发展演变;并结合具体案例分析,指出卡维尔的电影类型观没有拘泥于标准化的外显特征,而是强调对人文主义内核的把握,并且突出文化和社会演变给电影类型带来的变化,形成了一种动态发展观,具有很高的实际应用价值。第四章分析卡维尔的电影阐释与批评观。这部分内容是从电影本体论到电影批评实践的延伸,并呈现了两者之间的互动作用。首先从电影如何对观看者产生意义谈起,指出电影是通过“承认”的心理前提和“移情投射”的认知行为产生意义,并指出卡维尔在阐释电影意义时对直觉和科学论证方法的双重依重。接着,阐明卡维尔电影批评的基本立场是把“电影作为哲学”看待。在此基础上,继续说明卡维尔电影阐释批评中的伦理性和社会性特征,指出他的阐释和批评最终还是以现实存在作为界限,其普世的哲学追求始终落实于具体的伦理关系和社会关系之中。第五章分析卡维尔电影哲学在学术界的接受状况、理论意义和局限性。首先指出卡维尔的电影哲学受历史语境的影响以及自身表述风格的限制,始终没有成为主流电影理论。但是,其跨学科的研究特点也使卡维尔的理论具有自己的独特立场和学术价值,十分契合当下的电影文化和电影研究语境。同时,结合我国电影理论的发展历史及现状可以发现,过度集中于中观层面的理论研究或者沉迷于具体作品的微观批评都不利于建构科学的理论体系,卡维尔所采取的微观批评与宏大理论结合的研究路径有一定的借鉴和参考意义。另外,他的电影哲学体现了媒介和技术背后的文化心理和社会意义,是一种凸显人文性和日常性的电影哲学,为当代的电影理论研究带来了更宽广的方法论视域和多样化的阐释角度。结语部分首先简要回溯了本文的主要研究内容,其次总结了本文在明晰卡维尔电影本体论概念、归纳电影媒介的特性、通过卡维尔的伦理学思想脉络解析其电影阐释观、对其电影哲学进行整体评价这四个方面取得了一定的研究成果。本文把卡维尔电影本体论的核心问题浓缩为电影的投影装置和意义,较为清楚地阐明了他的观点;在此基础上,本文归纳了由此产生的电影媒介特性,并将这些特性作为进一步理解卡维尔电影阐释批评的重要依据和参考;此外,本文将卡维尔具有争议性的方法论和研究路径也作为其电影哲学的一部分,指出其电影哲学的意图不在于设立任何判断标准,而在于创建一个由电影通达哲学认知的思想路径。最后,指出本文的不足之处:本文未把卡维尔的电影哲学置于电影理论和哲学理论并行发展与交错影响的综合语境中研究,缺少对电影和哲学关系的历时性发展的详细论述,影响了对电影哲学范畴和研究边界的明晰;另外,将卡维尔与电影哲学流派中的其他学者进行更广泛的横向对比也将有助于明确其观点的原创性和继承性关系。这两方面的未尽之处也是笔者未来进一步研究的方向和目标。
王璐[3]（2021）在《泛基因组工具变量孟德尔随机化方法及其应用研究 ——以食管鳞癌mGWAS为例》文中提出研究背景病因推断是流行病学研究的永恒主题,然而,由于受到混杂因素和逆向因果作用的干扰,在常规观察性研究中得到的暴露和结局的关联往往并不可靠。针对因果方向的确定及混杂因素的控制,孟德尔随机化方法（Mendelian Randomization,MR）使用遗传变异作为工具变量（instrumental variable,Ⅳ）,在推定暴露到结局因果方向的前提下,准确估计从暴露到结局的因果关联效应,成为基因组学时代进行因果关联分析的重要方法。目前,随着高通量组学技术的普及,基于大型队列的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies,GWAS）为MR提供了丰富的数据信息。随着MR方法应用领域的不断扩展,其理论方法研究也在不断深入。不同的MR方法在选择工具变量,水平多效性效应建模假设以及进行参数估计和统计推断的方式等方面有所不同。但是,在工具变量SNP选择策略上,现有MR方法都依赖于选择一小部分效应强度较强的SNP作为工具变量,而且考虑到SNP之间复杂的连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）关系,往往需要选取独立的SNP作为工具变量。然而,此种选择策略将会不可避免的导致估计偏倚问题和统计效能的降低。为了克服上述SNP选择策略带来的缺陷,一个很自然的想法便是全基因组SNPs不加选择的全部纳入工具变量集G;这便是新近发展的基于泛基因组（omnigenic）的工具变量思想（即,假设基因组的全部遗传变异都对表型性状产生贡献）。然而,将如此海量的全基因组SNPs（几百万到几千万）一并纳入两样本孟德尔随机化模型后,如何实现模型参数的高效、准确、无偏估计是必须解决的关键科学问题,也是本研究的核心研究内容。为此,本论文在方法学研究部分中首先提出泛基因组遗传假设,即由全基因组SNPs综合而成的基因工具变量G表征了遗传因子G对暴露X的全部效应,同时遗传因子G也允许直接对结局Y产生效应（即允许水平多效性存在）;同时,允许两样本（Two Sample）孟德尔随机化中的两样本间可以存在样本重复。基于遗传学中的复杂性状泛基因组学遗传模式,遵循上述泛基因组假设而构建的两样本孟德尔随机化模型,本研究称之为泛基因组孟德尔随机化（Omnigenic Mendelianrandomization,OMR）模型。在当今生物组学时代,本研究所构建的OMR模型在各种跨组学分析中,具有广泛的应用前景。在理论意义上,利用MR可以确定因果方向的独特优势,将跨组学MR分析结果融合,便可构建DNA→RNA→蛋白质→代谢物→疾病表型的因果网络,从而打开暴露→疾病结局的“黑盒子”,为系统流行病学病因网络构建、药物靶点设计、预防或诊疗措施制定及评估提供支撑。作为实际应用案例,本论文依托国家食管癌早诊早治项目,在山东省食管癌高发区建立了食管癌早诊早治筛查队列。采用本研究构建的OMR模型,分析血清代谢物对食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）的因果效应。通过整合基因组和代谢组数据,探索血清代谢物→食管鳞癌的因果关联。基于泛基因组工具变量的孟德尔随机化方法研究（OMR）研究方法针对两独立样本的情形,本研究首先在遗传效应服从正态分布的假设下,采用复合似然估计策略,同时估计工具变量G对暴露X以及工具变量G对结局Y的效应;此外,为了能够包含基因组上广泛存在的LD信息,在构建复合似然函数时,采用了 LD信息作为边际似然函数的权重,对复合似然函数进行加权。针对两重叠样本及单样本的情形,在上述模型中引入样本的协方差项,从而有效的避免了样本重复相关对参数估计的影响。进而,开发EM-NR联合算法,将期望最大化（Expectation-Maximization,EM）算法与牛顿-拉夫森（Newton-Raphson,NR）算法有机结合的以实现模型参数的高效、无偏估计。然后,采用刀切法（Jackknife resampling）通过重抽样策略进行模型参数的假设检验。为了全面评估泛基因组孟德尔随机化模型（OMR模型）的有效性、准确性和稳健性,本研究设计了系统的统计模拟实验。基于人群中SNP基因型的真实分布及其LD模式,产生符合客观实际的模拟数据集;设定并遍历不同大小的遗传度、水平多效性、暴露X对结局Y的因果效应;同时,考虑不同遗传效应模式（包括基因组全部SNP具有遗传效应、基因组中1%的SNP有遗传效应、以及基因组中10%的SNP有遗传效应等多种情形）;在上述各种条件组合下,通过统计模拟实验评价OMR模型的参数估计偏倚（覆盖率）、一类错误的稳定性、统计检验效能。此外,为了比较本研究所提出的OMR模型与目前最新MR分析模型的优劣性,在上述一系列模拟实验中,同时考察了 IVW、Egger回归、MRMix、BWMR和CAUSE共五种方法。最后,为了评价上述模型对实际数据因果关联分析的效果,采用了两类实际数据集。第一类数据集设定为理论上因果关联必定存在的假想情形,包括分类变量“心血管疾病（cardiovasculardisease,CAD）-CAD”和连续变量“身高-身高”两种情形。第二类数据集设定理论上因果关系可能存在的实际情形,包括20种数量性状→CAD和20种数量性状→哮喘两种情形。研究结果（1）理论证明结果:针对两独立样本、两重叠样本及单样本情形,分别构建基于汇总统计量的OMR模型,进一步开发EM-NR联合算法,其中,通过EM算法获得参数初始估计值;为了加快参数估计的收敛速度,将EM算法的初估值作为NR算法的初始值,进行快速迭代;从而,达到模型参数估计的高效性和准确性。（2）统计模拟结果表明:1)在两独立样本情形下:①一类错误控制率:原假设成立时,在不存在水平多效性效应的模拟方案下,OMR模型可以给出合理或者轻度膨胀的一类错误控制率;当存在水平多效性效应时,OMR方法是唯一不受SNP遗传度以及遗传模式的影响,产生合理的一类错误控制率的方法。②检验效能:除极端稀疏遗传模式（即只有]0个SNP影响暴露的情况,效应SNP所占比例≈1/30000）以外,OMR模型在所有模拟方案中均能表现出最高的检验效能。③估计准确度:OMR模型在所有模拟方案中均可以对因果效应进行准确估计并产生合理准确的覆盖率。2)两重叠样本及单样本情形下:①一类错误控制率:在存在水平多效性的模拟方案下,OMR模型在两重叠样本和单样本情况下均可提供合理的I类错误控制率。②检验效能:OMR方法在两重叠样本及单样本情形均具有最高的检验效能。③估计准确度:OMR模型在两重叠样本和单样本情形下都能对因果效应进行准确估计。（3）实例分析结果表明:1)CAD→CAD和身高→身高分析:结果显示,在比较的6种MR方法中,OMR模型是唯一能够在两种情形中均检测到具有统计学意义的因果关联,同时95%置信区间包含真实值1的方法。2)20种数量性状→CAD和20种数量性状→哮喘分析:在两种情形下,对于具有统计学意义的数量性状,利用OMR方法进行检验的阳性结果最多,且其阳性结果通常能够得到其他至少一种MR方法的验证,同时大部分阳性结果进一步得到了临床试验或文献证据支持。应用研究:以血清代谢物对食管鳞癌的因果关联分析为例研究方法:依托国家食管癌早诊早治项目,分别构建食管鳞癌高发区人群mGWAS研究（纳入人数880人,数据子集1包含546人,数据子集2包含334人）和食管鳞癌病例对照研究（纳入人数1046人,其中对照969人,ESCC病例77人）。（1）在食管鳞癌高发区人群mGWAS研究中,使用Infinium Omni2.5Exome-8v1-3（Illumina）芯片对受试者全血样本进行基因分型检测。血清样本使用UHPLC-QTOF/MS进行非靶向代谢组学分析。对所有代谢物性状使用协变量（年龄、性别、内窥镜检查结果和前10个主成分）进行调整及标准化后,采用两阶段分析策略,分别在数据子集1和数据子集2中,使用线性回归模型分析全基因组约420万个SNPs与185种代谢物性状的关联性,使用meta分析整合两组分析结果。（2）在食管鳞癌病例对照研究中,首先将食管鳞癌结局使用协变量（年龄、性别和前10个主成分）进行调整及标准化后,使用线性回归模型分析全基因组约420万个SNP位点与食管鳞癌发生风险的关联性。（3）以185种血清代谢物mGWAS的汇总统计量作为暴露,食管鳞癌GWAS汇总统计量作为结局,使用全基因组4,085,890个SNP位点作为工具变量,采用OMR模型逐个检验血清代谢物对食管鳞癌发生风险的因果关联。研究结果:（1）食管鳞癌高发区人群人群mGWAS分析结果:经过统计检验,共有4327个SNP-代谢物关联强度小于全基因组和代谢组范围的显着性检验水平（Z检验,P<5×10-8/185=2.70×10-10）,其中包括19个独立的SNP代谢物关联,涉及10个独立的SNP位点和17种不同的血清代谢物。19个关联中,7个成功重复验证了先前报道过的具有统计学意义的关联,另外12个在之前的研究中尚未被报道过。（2）食管鳞癌GWAS分析结果:经过统计检验,共有1个SNP位点达到全基因组显着性检验水平（5×10-8）,42个SNP位点达到建议显着性检验水平（1 ×10-5）,取独立后,共计10个SNP位点被确定为top SNP位点。其中6个位点被报道与食管鳞癌相关,另外4个尚未被报道过与食管鳞癌的相关性,但已有文献探讨其与其他肿瘤或者食管鳞癌危险因素（如吸烟,饮酒等行为方式）的关联性,其与食管鳞癌的关联性有待进一步探索。（3）OMR分析结果:共有11个血清代谢物性状对食管鳞癌的因果关联检验P值小于一般检验水准（0.05）,其中9个小于Bonferrioni校正的检验水准（0.05/185=2.7×10-4）。肉豆蔻酸、吲哚-3-丙酮酸、次黄嘌呤、CDCA和PC 18:1是食管鳞癌的危险因素。L-组氨酸、肌酐、PG 24:1、PC 41:6、PC 38:4和PG 23:2是食管鳞癌的保护因素。肉豆蔻酸、CDCA和PC 38:4为mGWAS研究中发现的遗传调控代谢物,进而,构建潜在的基因组→血清代谢物→ESCC致病机制通路。结论:（1）分别在两独立样本、两重叠样本及单样本情形下,构建了基于泛基因组工具变量的孟德尔随机化分析方法（OMR方法）,基于复合似然框架和EM-NR联合推导算法实现高效计算,统计模拟结果表明,OMR模型可以得出准确的因果效应估计值、合理校准的I类错误控制率以及比现有MR方法更高的统计检验效能,并将上述算法编写为R包,方便研究者使用。（2）实例数据验证表明,在理论真实因果效应为1的情形下,OMR模型不仅能够检测到具有统计学意义的关联,同时估计的置信区间包含真实值1;在真实因果效应未知的情形下,OMR模型发现的具有统计学意义的数量性状最多,同时大部分关联结果得到了临床试验或文献证据支持。（3）为了验证OMR方法的实用性,首先通过食管鳞癌高发区人群mGWAS分析,获得血清代谢物全基因组关联分析汇总统计量,然后通过食管鳞癌病例对照人群GWAS分析,获得食管鳞癌全基因组关联分析汇总统计量,最后采用OMR模型探索血清代谢物与ESCC风险的因果关联,发现11个血清代谢物性状的因果关联显着性P值具有统计学意义（P<0.05）,其中9种血清代谢物的关联强度经过Bonferrioni校正后仍然具有统计学意义。
陈小荣[4]（2021）在《去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究》文中指出固有免疫是机体抵抗病原体侵袭感染的第一道防线,其激活依赖于细胞中众多的模式识别受体（pattern recongnitionreceptors,PRRs）对病原体病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）的识别。C 型凝集素（C-type lectin receptors,CLRs）可通过识别真菌表面的病原相关分子模式,进而激活一系列的信号通路,诱导炎性细胞因子的产生,最终清除真菌。CARD9是CLRs介导抗真菌免疫反应中重要的接头蛋白,通过招募BCL10和MALT1完成CBM复合体的组装,进而激活NF-κB和MAPK信号通路,诱导炎性细胞因子的表达。有文献报道称泛素化可以调控CARD9的活性,蛋白质的去泛素化是泛素化的可逆反应,底物蛋白的泛素链可通过去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）的作用被水解。DUBs 是否参与调控 CARD9 的活性,目前报道较少。我们通过筛选OTU家族成员发现去泛素化酶OTUD1是CARD9的重要调节蛋白。OTUD1可以直接与CARD9结合并去除其泛素链,促进CBM复合体的形成,继而引发核转录因子NF-κB的入核与MAPK信号通路的激活。OTUD1缺失会损伤真菌刺激后CARD9介导的信号通路以及炎性细胞因子的产生。进一步研究发现,OTUD1主要通过去除CARD9赖氨酸上的K33位泛素链,进而促进CBM复合物的形成。更重要的是,在体内实验中Otud1缺陷小鼠比野生型对照小鼠对真菌感染更易感。综上所述,本课题研究阐明了去泛素化酶OTUD1通过对CARD9的去泛素化调控,进而促进CARD9介导的信号通路的活化及抗真菌天然免疫反应。该研究丰富了 CARD9的活性调节机制,并对抗真菌信号通路的激活提供了新的分子机制,有助于真菌疾病新治疗策略的发展。研究目的1.筛选对CARD9有去泛素化作用的去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）;2.明确该DUB在调控抗真菌天然免疫反应中的作用与机制;3.通过敲基因小鼠动物模型明确该DUB调控抗真菌天然免疫的生理意义。研究方法1.筛选并确定调控CARD9泛素化的DUBs1.1.外源过表达实验筛选对CARD9有去泛素化作用的DUB将V5标签的CARD9,HA标签的ubiquitin（Ub）与Flag或者Myc标签的DUBs质粒一起转染到HEK293T细胞中,使用免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）和蛋白印迹（western blot,WB）筛选出对CARD9有去泛素化作用的DUBs。1.2.外源过表达实验明确OTUD1对CARD9的去泛素化作用将Myc标签的CARD9,HA标签的ubiquitin与梯度浓度Flag标签的OTUD1或者OTUD1的酶活突变体C320A质粒一起转染到HEK293T细胞中,通过IP与WB检测CARD9的泛素化水平。1.3.体外实验明确OTUD1对CARD9的去泛素化作用将纯化的泛素化修饰的CARD9蛋白与OTUD1或者OTUD1的酶活突变体C320A纯化蛋白在体外去泛素化反应体系中混合孵育,WB检测体外系统中CARD9的泛素化水平。1.4.细胞实验明确内源OTUD1特异性地对CARD9发挥去泛素化作用诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,给予加热致死的酵母态的白色念珠菌（heat-killed C.albicans yeast,HKCA-Y）刺激 20min。通过 IP 和 WB 检测内源CARD9或BCL10的泛素化水平。2.明确OTUD1与CARD9的相互作用及其相互作用的结构域2.1.外源过表达实验明确OTUD1与CARD9的相互作用将Myc标签的CARD9表达质粒分别与Flag-OTUD1或酶活突变体C320A表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测OTUD1与CARD9的相互作用。2.2.体外实验明确OTUD1与CARD9直接的相互作用将纯化蛋白Flag-OTUD1与Flag-CARD9在体外结合反应体系中混合孵育,使用IP和WB检测二者的相互作用。2.3.细胞实验明确内源OTUD1与CARD9的相互作用诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的BMDMs,给予HKCA-Y刺激不同时间点。使用IP和WB检测内源OTUD1与CARD9的相互作用。2.4.寻找OTUD1与CARD9相互结合的作用区域将 Flag-OTUDl 表达质粒分别与 Myc-CARD9、Myc-CARD9（6-98）、Myc-CARD9（117-420）、Myc-CARD9（420-536）表达质粒一起转染到 HEK293T 细胞,通过IP和WB检测结合情况;将Myc标签的CARD9表达质粒分别与Flag-OTUD1、Flag-OTUD1（1-185）、Flag-OTUD1（1-308）、Flag-OTUD1（1-450）、Flag-OTUD1（156-481）表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测结合情况。3.检测OTUD1对抗真菌免疫反应的调控3.1.利用CRISPR-cas9系统构建Otud1敲除细胞系首先利用亚克隆技术构建plenti-CRISPRv2-Otud1-sgRNA质粒,连同psPAX2和VSVG质粒共同转染至HEK293T细胞中包装慢病毒。将包装好的慢病毒感染RAW264.7细胞,并加入嘌呤霉素进行单克隆细胞的筛选,测序确定Otud1-KO RAW264.7细胞株,WB验证敲除效率。3.2.检测OTUD1对CLRs诱导的细胞因子产生的调控利用Otud1-KO与对照RAW264.7细胞,分别用Dectin-1的配体Zymd或Dectin-2的配体α-mannan刺激指定时间点,提取细胞的mRNA,RT-PCR检测IL-6,TNF-α和IL-1β的mRNA的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,收取细胞的上清,ELISA检测分泌在细胞上清中的促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的水平;提取细胞的 mRNA,RT-PCR 检测 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19的mRNA的表达水平。此外,分别用Dectin-1的配体HKCA-Y、Dectin-2的配体 HKCA-H（heat-killed C.albicans hyphae,HKCA-H）或 Mincle 的配体 TDB重复该实验,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6和TNF-α的水平;提取细胞的mRNA,RT-PCR检测IL-6和TNF-α的mRNA的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDCs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,收取细胞的上清,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12,CXCL1 和 CXCL2 的水平;提取细胞的 mRNA,RT-PCR 检测 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40 和 IL23p19 的 mRNA 的表达水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,并用慢病毒回补mOTUD1及酶活突变形式mOTUD1 C293A,用Zymd刺激24h,ELISA检测分泌在细胞上清中的IL-6和TNF-α的水平。3.3.检测OTUD1对CLRs信号通路的调控诱导Otudl缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB检测上游信号通路中重要接头蛋白（Syk、PLC-γ2、PKC-δ）以及下游NF-κB和MAPK信号通路中相关蛋白（IκBα、p65、Jnk、Erk、p38）的磷酸化水平;诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,用HKCA-Y或Calbicans刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB明确下游NF-κB和MAPK通路中相关蛋白（IκBκ、p65、Jnk、Erk、p38）的磷酸化水平。3.4.检测OTUD1对真菌吞噬的影响诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs与BMDCs,用FITC标记的HKCA-Y刺激指定时间点,利用流式细胞仪分析真菌吞噬率。4.OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用机制4.1.检测OTUD1对CBM复合体形成的调控将Myc标签的CARD9表达质粒、Flag标签的BCL10表达质粒、HA标签的Ub表达质粒、Flag标签的OTUD1或其酶活突变体C320A表达质粒一起转染至HEK293T细胞中,36h后提取细胞蛋白,使用anti-Myc Ab进行IP,WB检测CARD9与BCL10的相互作用。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,HKCA-Y刺激不同时间点,提取细胞蛋白,用anti-CARD9 Ab抗体进行IP,WB检测内源CARD9与BCL10的相互作用。4.2.检测OTUD1对CARD9调控的去泛素化类型将Myc标签的CARD9表达质粒,Flag-OTUD1表达质粒以及HA标签的ubiquitin（Ub）表达质粒或不同赖氨酸残基突变的Ub（K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63）表达质粒一起转染到HEK293T细胞,通过IP和WB检测CARD9的泛素化水平。4.3.检测OTUD1对CARD9何种形式的去泛素化调控影响CBM复合体的形成将Myc标签的CARD9表达质粒、Flag标签的BCL10表达质粒、HA标签的不同赖氨酸残基突变的Ub（K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63）表达质粒、Flag标签的OTUD1或其酶活突变体C320A表达质粒一起转染至HEK293T细胞中,通过IP和WB检测CARD9与BCL10的相互作用。4.4.明确内源OTUD1对CARD9蛋白稳定性与K27位泛素化的调控诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd或α-mannan刺激指定时间点,提取细胞蛋白,WB检测内源CARD9的蛋白水平。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,给予HKCA-Y刺激20min。通过IP和WB检测内源CARD9 K27位泛素化水平。5.检测OTUD1在C.albicans诱导的真菌模型中的功能取Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠（雄鼠,8周龄,各9只）,尾静脉注射C.albicans S5314（2×105真菌细胞量/小鼠）,每天监测小鼠体重与存活数;取感染小鼠的肾脏进行H&E染色、PAS染色及Ly-6G染色（中性粒细胞的marker）并进行组织评分展示肾脏炎症反应、真菌菌丝的生长及中性粒细胞浸润程度;取感染5天小鼠的肾脏、肝脏和脾脏,组织研磨后梯度涂板,统计各脏器的真菌滴度;取感染24h小鼠的血清,ELISA检测分泌在血清中的IL-6和TNF-α的水平。实验结果与结论1.OTUD1调控CARD9的去泛素化1.1.外源过表达实验筛选出OTUD1调控CARD9的去泛素化在 HEK293T 细胞中过表达 V5-CARD9、HA-ubiquitin 及 OTU 家族的 DUBs质粒,筛选出对CARD9有去泛素化作用的DUB:OTUD1。1.2.OTUD1依赖其去泛素化酶活性调控CARD9的去泛素化为明确OTUD1对CARD9的去泛素化调控是否依赖OTUD1的去泛素化酶活性,在HEK293T细胞中过表达V5-CARD9、HA-ubiquitin、梯度浓度的Flag-OTUD1或其酶活突变体Flag-OTUDl C320A。结果显示OTUD1可以去泛素化CARD9,并随着转染量的增加对CARD9的去泛素化作用增强,而酶活突变体OTUD1 C320A对CARD9没有去泛素化作用。该结果表明OTUD1依赖其去泛素化酶活性调控CARD9的去泛素化。1.3.OTUD1能够直接去泛素化CARD9为探究OTUD1是否直接去泛素化CARD9,在体外去泛素化体系中将已泛素化的纯化蛋白CARD9与纯化蛋白OTUD1或OTUD1 C320A共孵育,检测CARD9的泛素化水平。结果显示OTUD1可去泛素化CARD9而OTUD1 C320A对CARD9没有去泛素化作用,表明OTUD1可通过其去泛素化酶活性直接调控CARD9的去泛素化。1.4.OTUD1特异性调控CARD9的去泛素化为探究生理条件下OTUD1是否特异性调控CARD9的去泛素化,诱导Otud1缺陷与同窝野生型对照小鼠的BMDMs,HKCA-Y刺激20min,收取蛋白检测内源CARD9和BCL10的泛素化水平,结果表明Otud1缺陷小鼠的BMDMs中CARD9的泛素化水平显着高于对照组,而内源BCL10的泛素化水平没有影响,提示生理条件下内源OTUD1特异性调控CARD9的去泛素化。2.OTUD1通过与CARD9的相互作用调控CARD9去泛素化2.1.OTUD1与CARD9相互作用为探究OTUD1是否通过与CARD9的相互作用对其进行去泛素化的,在HEK293T细胞中一起转染Myc-CARD9与Flag-OTUD1质粒,发现外源过表达的Myc-CARD9与Flag-OTUD1具有相互作用。2.2.OTUD1与CARD9直接结合为进一步探究二者是否为直接结合,利用Flag-CARD9与Flag-OTUD1纯化蛋白进行免疫共沉淀实验（co-immunoprecipitation,Co-IP）,结果提示OTUD1与CARD9为直接结合作用。2.3.内源OTUD1与CARD9相互作用诱导小鼠BMDMs加入HKCA-Y刺激进行内源结合实验,结果显示内源OTUD1与CARD9相互结合,且随着刺激时间增加,结合程度明显增强。2.4.OTUD1通过OTU和UIM结构域与CARD9的CCD结构域结合为进一步明确二者的结合区域,在HEK293T细胞中过表达CARD9与OTUD1的截断突变体质粒,Co-IP实验结果显示OTUD1通过OTU和UIM结构域与CARD9的CCD结构域结合。3.OTUD1正向调控抗真菌免疫反应3.1.OTUD1正调天然免疫细胞中CLRs诱导的细胞因子的产生为探究OTUD1是否参与抗真菌免疫反应,首先利用敲除Otud1的克隆株,分别用Zymd和α-mannan刺激不同时间点,结果显示Otud1-KO细胞中的IL-6,TNF-α和IL-1β mRNA的表达水平显着低于对照组。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDMs,分别用Zymd和α-mannan刺激时,Otud1缺陷小鼠 BMDMs 中 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19 mRNA的表达水平、细胞上清中促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的分泌水平均显着低于对照组;分别用Dectin-1的配体HKCA-Y、Dectin-2的配体HKCA-H或Mincle的配体TDB刺激Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs,结果显示,Otud1缺陷小鼠BMDMs中IL-6和TNF-α mRNA的表达水平以及细胞上清中IL-6和TNF-α的分泌量均显着低于对照组。诱导Otud1缺陷与野生型同窝对照小鼠的BMDCs,分别用Zymd和α-mannan刺激时,Otud1缺陷小鼠 BMDCs 中 IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-12p35,IL-12p40和IL23p19 mRNA的表达水平、细胞上清中促炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IL-12以及趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2的分泌水平均显着低于对照组。利用慢病毒感染在Otud1缺陷小鼠BMDMs中回补mOTUD1 WT或mOTUD1 C293A,再给予Zymd刺激,结果显示缺陷组回补野生型mOTUD1后,细胞上清中IL-6和TNF-α的分泌回升,但回补酶活突变型mOTUD1 C293A后IL-6和TNF-α的分泌无明显回升。以上结果表明,OTUD1可正向调控细胞中CLRs诱导的细胞因子的产生。3.2.OTUD1正调CLRs诱导的NF-κB与MAPK信号通路的激活为进一步探究OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用,检测了真菌刺激后CLRs信号通路的活化。诱导Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs,用Zymd或α-mannan刺激时,Otud1缺陷BMDMs中CARD9上游的Syk、PLC-γ2和PKC-δ的磷酸化无明显变化,提示OTUD1不影响受体近端信号传导;而下游NF-κB和MAPK信号通路中相关蛋白IκBα、p65、Jnk、Erk、p38的磷酸化均显着降低,提示OTUD1正调CLRs诱导的NF-κB与MAPK信号通路的激活。3.3.OTUD1不影响真菌吞噬固有免疫细胞吞噬真菌进而杀伤真菌在抗真菌天然免疫反应中发挥重要作用,我们检测了 OTUD1缺失对巨噬细胞吞噬真菌的影响,结果显示OTUD1缺失不影响巨噬细胞吞噬真菌。4.明确OTUD1在抗真菌免疫反应中的作用机制4.1.OTUD1通过去泛素化CARD9促进CBM信号复合体的形成CBM复合体的组装在抗真菌免疫反应中发挥着至关重要的作用,因此我们探究了 OTUD1对CARD9的泛素化调控是否影响CBM复合体的组装。在HEK293T细胞中过表达Myc-CARD9,Flag-BCL 10,HA-Ub并同时过表达Flag-OTUD1或酶活突变体C320A,结果显示过表达HA-Ub后（CARD9的泛素化增强）CARD9与BCL10的结合减弱,但加入OTUD1后恢复了二者的结合,而加入OTUD1酶活突变体C320A的组没有恢复二者的结合;接下来,我们利用诱导的Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs进一步明确了在生理条件下OTUD1对CBM信号复合体形成的影响。结果显示,HKCA-Y刺激后显着增强了 CARD9与BCL10的结合,但OTUD1缺失明显减弱了二者的结合。综上这些结果表明OTUD1通过去泛素化CARD9促进了 CBM复合体的组装。4.2.OTUD1主要切割CARD9 K29、K33和K63位连接的泛素链为探究OTUD1调控CARD9的去泛素化形式,我们在HEK293T细胞中一起转染Myc-CARD9、HA-Ub或其赖氨酸突变体以及OTUD1-Flag或酶活突变体OTUD1-Flag C320A质粒,Co-IP结果显示CARD9可被多种泛素链修饰,但OTUD1只降低了 WT组、K29组、K33组和K63组中的CARD9的泛素化水平,该结果表明OTUD1主要调控CARD9 K29、K33和K63位的泛素化。4.3.OTUD1通过切割CARD9 K33泛素链促进CBM信号复合体的形成前期结果明确了 OTUD1通过调控CARD9去泛素化促进CBM复合体的组装并发现OTUD1主要切割CARD9 K29、K33和K63的泛素链,因此接下来继续探究了 OTUD1对CARD9的哪种形式的去泛素介导CBM复合体的组装,我们还发现除WT组外,K33连接的泛素链也会减弱CARD9与BCL10的结合,并且加入OTUD1后恢复了 CARD9对BCL10的招募,而被OTUD1切割的K29和K63连接的多泛素链以及不被OTUD1切割的其他泛素链（K6,K11,K27和K48）对CARD9-BCL10的相互作用没有影响。4.4.OTUD1不影响CARD9的蛋白稳定性与K27位连接的泛素链为探究OTUD1是否参与CARD9的降解过程,在Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs中分别用Zymd和α-mannan刺激,WB检测内源CARD9的蛋白水平。结果显示,刺激后CARD9的蛋白水平无显着变化,并且与对照组相比,Otud1缺陷组的CARD9的蛋白水平也无明显差异。该结果提示OTUD1不影响CARD9的蛋白稳定性。接下来,我们在诱导的Otud1缺陷与对照小鼠的BMDMs中进一步明确了OTUD1对CARD9 K27泛素化的调控。结果显示,与对照组相比,Otud1缺陷组内源CARD9 K27位泛素化水平无明显差异,提示OTUD1并不影响CARD9 K27位的泛素化水平。5.OTUD1在C.albicans诱导的真菌模型中具有保护作用为探究OTUD1是否介导体内的抗真菌免疫反应,我们利用Otud1缺陷小鼠与对照小鼠构建了白色念珠菌C.albicans诱导的真菌模型。结果显示,与野生型对照小鼠相比,Otud1缺陷小鼠体重下降更快、死亡率更高;组织病理结果显示Otud1缺陷小鼠肾脏炎症反应更严重、菌丝态的白色念珠菌更多、中性粒细胞的浸润也更显着;此外,Otud1缺陷小鼠肾脏、肝脏和脾脏中真菌载量更高、小鼠血清中细胞因子IL-6和TNF-α的分泌量更少。以上结果提示OTUD1是调节体内抗真菌免疫反应的保护性调节因子。创新性1.目前对CARD9的去泛素化研究较少,并且尚未发现CARD9的去泛素化调控CBM复合体的组装,我们首次发现去泛素化酶OTUD1通过切割CARD9 K33泛素链调控CARD9对BCL10的招募,为CARD9的功能探究提供了新的方向。2.已有文献报道OTUD1与抑制肿瘤发展、介导RNA病毒逃逸等相关,但尚未探究其在抗真菌天然免疫反应中的功能,我们证实OTUD1在天然抗真菌信号通路中发挥正向调控作用,增强细胞与机体抗真菌的能力。3.真菌感染已成为世界面临的重大公共卫生问题,尤其是对免疫低下的人群具有极高的发病率与死亡率,严重危害人类身心健康。本研究发现OTUD1可通过调控CARD9介导炎性细胞因子的产生发挥抗真菌功能。这一发现,可以为临床治疗真菌感染性疾病提供新的思路与治疗靶点。
姜雨[5]（2021）在《Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究》文中提出研究目的:肝脏作为特殊的免疫器官,免疫抑制的肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生发展进程中起到了关键作用。除肿瘤细胞外,肿瘤微环境主要由肿瘤相关基质细胞和细胞因子、生长因子等非细胞成分共同组成。在肿瘤相关基质细胞中,巨噬细胞是包括HCC在内的大多数实体肿瘤的主要组成部分。肿瘤组织浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）,主要由外周循环的单核细胞分化形成。TAMs与HCC细胞相互作用可以促进HCC生长、转移、干性形成、耐药以及血管生成和免疫应答的抑制,这提示我们靶向TAMs可以作为一种潜在的治疗肝癌的策略。在TAMs中,具有杀瘤作用的TAMs表现为M1型巨噬细胞的表型特征,而具有促瘤作用的TAMs表现为M2型巨噬细胞的表型特征。多认为肿瘤进展中,TAMs主要呈M2的特征。TAMs具有可塑性,肿瘤微环境中包括IL-10、TGF-β和IL-4在内的多种可溶性因子在TAMs的极化和功能调控中起着重要的作用。Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）作为重要的模式识别受体成员,主要表达于巨噬细胞等固有免疫细胞上。目前研究也发现,一些TLR激动剂单独使用或联合治疗可以逆转TAMs的M2极化,提示TLR激动剂在调控TAMs极化中的作用。Wnt配体作为一种分泌蛋白,其介导的信号通路在多种生理及病理过程中尤其是肿瘤的发生中发挥重要作用。在HCC患者中可以观察到Wnt/β-catenin信号通路的异常活化,该通路的活化与HCC的发生发展、干性及耐药的形成密切相关。除了对肿瘤细胞自身的影响,最近发现Wnt信号可以通过介导微环境中细胞之间的相互作用,促进免疫抑制微环境的形成。Wnt2b作为Wnt信号蛋白家族的重要成员,我们前期的研究发现HCC肿瘤细胞Wnt2b的表达可以促进HCC的增殖和干性形成并抑制HCC细胞的凋亡。然而,肿瘤微环境尤其是HCC微环境中Wnt2b及其介导的信号活化在巨噬细胞极化中的作用尚不清楚。近年来,细胞代谢的重塑被认为是恶性肿瘤发生发展的重要机制。除了肿瘤细胞外,微环境中多种免疫细胞在肿瘤进程中也会发生代谢重塑,并与其细胞功能的改变密切相关。在肿瘤微环境中,TAMs尽管与经典的M2型巨噬细胞有相似的表型特征,但是在代谢方式的选择上却存在差异。在多种代谢方式中,葡萄糖代谢受到最广泛的关注。微环境中,肿瘤细胞糖酵解的增强促进了肿瘤的发生发展。而关于HCC微环境中肿瘤对TAMs代谢表型的影响,以及代谢重塑对TAMs极化的调控作用还未完全阐明。目前发现Wnt信号的活化参与调控肿瘤细胞糖酵解的增强,但在TAMs中Wnt对糖酵解的调控作用及其作用机制还未阐述。本研究中,我们主要探讨HCC诱导的巨噬细胞的极化表型,以及HCC相关巨噬细胞（HCC-associated TAMs,HCC-TAMs）促进HCC发生上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,阐述 Wnt2b/β-catenin 信号通路在此过程中的作用机制,进一步揭示肿瘤组织中HCC细胞与巨噬细胞复杂的调控网络关系和免疫抑制微环境形成的新机制。研究方法:1.通过不同HCC细胞的条件培养基（HCC-TCM）处理THP-1诱导的巨噬细胞（THP-1-M）,分别使用流式细胞术（FACS）和荧光定量PCR（qPCR）技术检测HCC-TAMs中极化相关标志分子的表达情况。2.MTT法和划痕实验检测HCC-TAMs对HCC细胞增殖和迁移能力的影响。3.qPCR技术检测HCC-TAMs中Wnt2b的表达情况。4.免疫荧光技术检测HCC患者肿瘤组织及对应的癌旁组织中CD68阳性巨噬细胞浸润以及Wnt2b的表达情况。5.FACS和qPCR技术检测过表达THP-1-M中的Wnt2b对极化相关标志分子表达的影响。6.FACS和qPCR技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对极化相关标志分子的影响。7.Western blotting和免疫荧光技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b的表达,对β-catenin的表达及入核的影响。8.Western blotting技术检测过表达THP-1-M中的Wnt2b对HCC细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。9.Western blotting 技术检测沉默 HCC-TAMs 中 Wnt2b 或 β-catenin 的表达对 HCC细胞EMT的影响。10.MTT法和划痕实验检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对HCC细胞增殖和迁移能力的影响。11.qPCR技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对其糖酵解关键酶分子表达的影响。12.通过Seahorse能量代谢分析仪检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对其胞外酸化率（ECAR）的影响13.qPCR技术检测糖酵解抑制剂2DG处理对HCC-TAMs中极化标志分子表达的影响。14.Western blotting技术检测糖酵解抑制剂2DG处理对HCC-TAMs诱导HCC细胞EMT能力的影响。15.FACS和qPCR技术检测TLR9激动剂CpG ODN处理对HCC-TAMs极化相关标志分子的影响。16.qPCR技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中Wnt2b表达的影响。17.Western blotting和免疫荧光技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中β-catenin的表达及入核的影响。18.Western blotting 技术检测 CpG ODN 处理对 HCC-TAMs 诱导 HCC 细胞 EMT能力的影响。19.qPCR技术检测CpGODN处理对HCC-TAMs中糖酵解关键酶分子表达的影响。20.通过Seahorse能量代谢分析仪检测CpG ODN处理对HCC-TAMs ECAR水平的影响。21.qPCR技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中c-Myc表达的影响。22.通过对免疫缺陷小鼠进行HCC肿瘤细胞和不同处理的HCC-TAMs混合皮下共荷瘤,检测不同HCC-TAMs对小鼠皮下肿瘤的生长及肿瘤负荷的影响。并通过免疫组织化学染色检测肿瘤组织中EMT标志分子E-cadherin、Vimentin的表达以及β-catenin和c-Myc的表达。23.通过数据库分析临床HCC患者肿瘤组织中Wnt2b、N-cadherin和Snail的表达与预后的关系。24.qPCR 技术检测 IL-10、TGF-β 处理对 THP-1-M 中 Wnt2b、β-catenin 和 c-Myc表达的影响。研究结果:1.HCC-TCM可以诱导巨噬细胞发生M2极化HCC细胞的条件培养基（HCC-TCM）处理THP-1来源巨噬细胞（THP-1-M）得到HCC相关巨噬细胞（HCC-TAMs）,发现不同HCC细胞系来源的TCM可以不同程度地上调M2型巨噬细胞标志分子CD163、IL-10和CCR2的表达,下调M1型巨噬细胞标志分子IL-12、NOS2和TNF-α的表达。说明HCC-TCM孵育的巨噬细胞发生了 M2型极化。2.HCC-TCM诱导的HCC-TAMs可以发挥促肿瘤作用使用上述HCC-TAMs的分泌上清孵育HCC细胞可以促进HCC细胞发生EMT,并增强HCC细胞的增殖和迁移能力,发挥明显的促肿瘤作用。3.HCC-TCM通过活化Wnt2b/β-catenin信号促进巨噬细胞M2极化HCC-TCM处理可以上调巨噬细胞Wnt2b的表达。且HCC患者肿瘤组织与对应的癌旁组织相比,CD68阳性巨噬细胞的浸润数量明显增多,Wnt2b的表达上调,且巨噬细胞和Wnt2b存在共定位的现象。Western blotting和免疫荧光检测巨噬细胞胞质和胞核中β-catenin的表达情况,发现HCC-TCM处理后巨噬细胞胞质和胞核中β-catenin的表达均上调,而沉默Wnt2b可以抑制这个现象。过表达Wnt2b可以促进巨噬细胞M2型极化,而利用携载靶向Wnt2b shRNA的慢病毒感染的方法沉默HCC-TAMs中的Wnt2b可以抑制HCC-TCM诱导的巨噬细胞的M2型极化。进一步沉默β-catenin发现同样可以抑制HCC-TCM诱导的巨噬细胞的M2型极化。4.活化Wnt2b/β-catenin信号增强HCC-TAMs的促肿瘤作用我们分别用过表达Wnt2b或对照组THP-1-M的培养上清孵育HCC细胞48 h,发现过表达Wnt2b的巨噬细胞上清可以不同程度地上调HCC细胞中间质标志分子N-cadherin、Vimentin的表达,同时上调EMT相关转录因子Snail、Twist的表达。而沉默Wnt2b或β-catenin的HCC-TAMs上清所处理的HCC细胞间质标志分子N-cadherin、Vimentin的表达降低,上皮标志分子E-cadherin表达上调,同时EMT相关转录因子Snail、Twist的表达受到抑制。进一步发现,沉默Wnt2b或β-catenin的HCC-TAMs对HCC增殖和迁移的促进能力受到明显抑制。这些结果提示我们,巨噬细胞Wnt2b/β-catenin的表达可以影响HCC-TAMs的促肿瘤作用。5.Wnt2b/β-catenin 信号影响 HCC-TAMs 的糖酵解HCC-TAMs糖酵解关键酶分子的表达水平和胞外酸化率水平明显上调,而沉默Wnt2b或β-catenin明显下调HCC-TAMs中的糖酵解关键酶分子表达和胞外酸化率水平。接下来,我们也进一步检测了抑制巨噬细胞糖酵解后对HCC-TAMs极化的影响。我们发现,与单纯使用HCC-TCM诱导的TAMs组相比,在诱导过程中加入糖酵解抑制剂2DG处理的TAMs中M1型标志分子IL-12的表达上调,M2型标志分子IL-10表达下调。说明抑制TAMs的糖酵解可以抑制由HCC-TCM诱导的M2型极化,其培养上清诱导HCC细胞发生EMT的能力受到明显抑制。这些发现说明,Wnt2b/β-catenin通路参与调控HCC-TAMs的糖酵解过程,进而促进其促肿瘤作用。6.TLR9激动剂可以抑制TCM诱导的M2极化并下调HCC-TAMs中Wnt2b/β-catenin 信号与单独TCM处理的巨噬细胞相比,同时加入TLR9激动剂CpG ODN组的TAMs表达较低水平的M2标志分子CD163、IL-10和CCR2,同时表达较高水平的M1标志分子IL-12、TNF-α和NOS2。并且,我们发现CpGODN处理抑制了 HCC-TAMs中Wnt2b的表达,并且可以抑制由TCM导致的β-catenin表达和入核增加,下调信号下游特异性靶分子Axin2的表达。更为有意义的是,同时加入CpGODN组的TAMs对HCC细胞EMT的诱导能力明显低于TCM单独诱导的TAMs。这些结果表明,TLR9激动剂可以抑制HCC-TAMs中Wnt2b/β-catenin信号的激活,从而抑制M2极化。7.TLR9激动剂通过抑制c-Myc下调HCC-TAMs的糖酵解水平CpGODN处理可以明显下调HCC-TAMs中糖酵解关键酶（GLUT1、HK2、PKM2、TPI和LDHA）的表达及ECAR水平。沉默Wnt2b或CpGODN处理可以下调HCC-TAMs中c-Myc的表达,说明c-Myc参与Wnt2b/β-catenin信号对HCC-TAMs糖酵解的调控,而TLR9激动剂CpG ODN可以抑制这个过程。8.抑制Wnt2b/β-catenin信号可以减弱HCC-TAMs的体内促肿瘤作用我们将人肝癌细胞SMMC-7721单独或与不同处理的HCC-TAMs混合皮下接种,建立免疫缺陷小鼠皮下荷瘤模型。SMMC-7721细胞与TAMs混合接种的小鼠肿瘤生长速度比单独接种SMMC-7721细胞的小鼠更快,提示TAMs可促进肝癌细胞的体内生长,而CpGODN预处理可抑制TAMs的体内促肿瘤作用。同时发现,与SMMC-7721细胞单独接种组的肿瘤组织相比,混合接种组的肿瘤组织中E-cadherin的表达明显下调,但Vimentin、β-catenin和c-Myc的表达明显上调,而CpGODN预处理TAMs可以逆转这些现象。与SMMC-7721细胞和转染空载体的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织相比,SMMC-7721细胞和沉默Wnt2b或β-catenin的TAMs混合接种的小鼠,肿瘤生长速度和肿瘤负荷显着降低。同时发现,与SMMC-7721细胞和转染空载体的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织相比,SMMC-7721细胞和沉默Wnt2b或β-catenin的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织中E-cadherin表达明显上调,而Vimentin、β-catenin和c-Myc的表达明显下调。这些结果表明,Wnt2b/β-catenin信号通路介导TAMs对HCC的体内促进作用,TLR9激动剂可能是一种潜在的治疗药物。9.肿瘤组织中Wnt2b、N-cadherin和Snail的表达与HCC患者不良预后相关利用GEPIA2数据库分析Wnt2b表达对HCC患者预后的影响。发现肿瘤组织高表达Wnt2b的HCC患者的总生存率明显低于低表达组。此外,EMT相关标志物N-cadherin和Snail的表达也与患者预后不良有关。结论:我们的研究表明,HCC微环境中的多种促极化因子可通过上调巨噬细胞Wnt2b的表达,活化β-catenin信号,促进TAMs向M2型巨噬细胞极化,M2极化的TAMs可以反向促进肿瘤的上皮-间质转化并促进肿瘤的进展,而这个过程与HCC-TAMs糖酵解的激活相关,抑制糖酵解可以明显逆转TAMs的2型极化和促肿瘤作用。HCC-TCM诱导HCC-TAMs的过程中,TLR9激动剂CpG ODG可以作为Wnt2b活化信号的阻断剂抑制HCC-TAMs糖酵解过程并抑制M2极化。Wnt2b作为一个肿瘤治疗的潜在靶点不仅对于肿瘤细胞本身具有促进作用,其活化的信号在免疫抑制的肿瘤微环境形成中同样发挥重要作用。靶向TAMs中的Wnt2b可能是肝癌免疫治疗中的一个很有潜力的治疗策略,TLR9激动剂CpG ODN有可能作为Wnt2b/β-catenin/c-Myc阻断剂抑制HCC-TAMs糖酵解用于肝癌的治疗。
耿芳[6]（2021）在《汉日语气系统之功能视角对比研究》文中研究表明目前学界对语气的研究存在概念界定模糊、功能取向不明显、研究不系统等问题,从而语气对比领域也缺乏较为完善的研究。有鉴于此,本研究基于系统功能语言学理论,以功能为出发点,明确语气概念,在此基础上,对汉日语气系统进行对比,旨在达到以下三个研究目的:揭示汉日语气类别及其体现形式的异同;揭示汉日语气语势及其体现形式的异同;探讨汉日语气系统的异同。本研究的语气系统包含语气类别系统与语气语势系统,关注人际社会沟通与个人意志、情感在语言层面的体现,人际社会沟通由语气类别系统体现,个人意志与情感由语气语势系统体现。研究依托系统功能语言学理论,对汉日语气类别一致式、语气类别隐喻式、语气语势的精密度,句法、词汇等语言体现形式,语场、语旨、语式等语境特点进行描述、例证、对比,且由语言、思维、社会文化维度出发探讨汉日语气系统的异同。研究发现如下:汉日语气一致式精密度基本一致,功能类别均包含陈述语气、疑问语气、祈使语气。陈述语气中内含五类感叹语气,分别是对事物的感叹、对事物性质的感叹、对事物数量的感叹、对情形性质的感叹、对情形数量的感叹。汉日疑问语气均包含寻求正反及寻求新信息两类;日语中寻求正反选择类语气仅在级阶小句中出现。汉日祈使语气均包含命令、要求、支配、希愿、建议、提供、祝愿七类。语言体现形式方面,汉日语气一致式呈现出在语序调整、程式化表达、疑问词、语气词使用等方面的共性;包含基本语序、成分重叠、结构顺序、疑问词提示特征、语气词性别特征、词法变化等方面的差异性。汉日语气类别隐喻式的精密度较为一致,均有陈述语气疑问型隐喻、陈述语气反义型隐喻、疑问语气陈述型隐喻、疑问语气祈使型隐喻、祈使语气陈述型隐喻、祈使语气疑问型隐喻六类。语言体现形式方面,汉日语气类别隐喻式具有程式化表达、“否定”成分非常规使用、语气词高频使用、句法与词汇共现关联等共性;呈现出句式结构、程式化表达适用性、语气副词、词法变位、句法与词汇共现特点等差异。语境特点方面,汉日语气类别隐喻式在话轮潜势、口语特征、隐喻义与上下文依赖关联、体现形式与上下文依赖关联、权势关系与句法特征互动等方面表现出共性;具备会话双方权势关系多样性、权势关系与体现形式关联、上下文依赖程度、语体倾向性、隐喻义与语式关联、隐喻义多功能性等差异。汉日语气语势在功能系统精密度上程度一致,内在语势均包含确实、料悟、能力、必然、或然、允许、意愿、义务八类;外在语势均含程度、速度两类,其中程度语势包括高、中、低三个水平,速度语势包含急、平、缓三个水平。体现形式手段方面,汉日语气语势呈现出对成分重复、隐喻式表达、不完整表达、投射结构、骂詈语、填充词等手段使用的共性。此外,由于外在语势关注语言的物理特征,本文对其语音手段进行简要分析并发现,汉日外在语势语音手段在音量与情绪对应、元音发声变化等方面存在共性;日语还可使用卷舌、促音、非常规浊化等手段体现外在语势,其中促音、非常规浊化也可在文字书写系统中体现。从语序类型与形态类型探讨汉日语气系统的共性及差异,发现汉日语气系统的语气构成均不依赖语序,呈现出相似的问答模式;在前置语语言典型性、词汇性与词法性、句法成分与形式对应关系、句法顺序与规则侧重等方面展现出差异。从思维维度关注汉日语气系统的共性及差异,发现汉日民族对人际关系呈现出相似的理解模式,展现出务实性与情感性、整体性与群体性、直觉性与规约性三组对照思维差异。从社会文化观察汉日语气系统的共性及差异,发现中日社会在社会交往中均强调互动协商,中日社会宗族性架构与集团性架构的差异影响汉日民族思维,从而使其在语言类型、语气系统上呈现出差异。总的来说,本研究基于系统功能语言学对汉日语气系统进行描述、例证,基于理论框架对语气的语言体现形式及语境特点进行较为全面的对比分析,通过语言体现形式对比发掘汉日语言在语气表达上的异同,通过语境特点描写明确语气的互动属性,并最终从语言、思维、社会文化维度探讨汉日语气系统的共性与差异,丰富了系统功能语言学对语气的研究,回应了学界语气研究存在的问题。
董淑衡[7]（2021）在《Bcl-2家族中蛋白与蛋白结合机制的相互作用熵方法研究及蛋白质折叠》文中研究指明超大型B细胞淋巴瘤蛋白（B-cell lymphoma-extra large,简称Bcl-x L）和B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2,简称Bcl-2）是Bcl-2蛋白家族中发挥抗凋亡作用的成员,它们在调节细胞周期中起着重要作用。然而,Bcl-x L/Bcl-2与其拮抗剂,包括Bcl-2相关死亡启动子蛋白（Bcl-x L/Bcl-2 associated death promoter homolog,简称Bad）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,简称Bax）的结合机制尚不清楚。本研究采用最新发展的相互作用熵（interaction entropy,简称IE）方法计算熵贡献,并用丙氨酸扫描（alanine scanning,简称AS）手段确定了Bcl-x L/Bcl-2和Bad/Bax蛋白相互作用的热点。从计算得到的四个体系的结合自由能及其排序来看,其与实验结果吻合较好。对计算结果的分析表明,Bcl-x L/Bad复合物中的热点残基比Bcl-x L/Bax复合物中的热点残基多,从而使得前者具有了更强的结合亲和力。有趣的是,相比Bcl-x L体系中出现的这种情况,造成Bcl-2与Bad的亲和力比与Bax的亲和力强的原因却完全不同。尽管Bcl-2/Bax体系有着比Bcl-2/Bad复合物更多数量的热点残基,但与此同时在Bcl-2/Bax中也存在更多的不利残基。这在一定程度上削弱了热点残基对复合物的结合的贡献,最终使得Bcl-2/Bax的结合亲和力弱于Bcl-2/Bad体系。我们的研究确定了Arg104、Tyr105、Leu116和Leu134是有关Bcl-x L蛋白的体系中的共同关键残基,Arg107、Tyr108、Phe112、Gln118、Leu137、Arg146和Tyr202是Bcl-2复合物中均有的关键残基。这些结果为设计有效的Bcl-x L/Bcl-2抑制剂提供了有价值的信息。此外,蛋白质折叠是生物物理学的基础,对生物体的生命活动至关重要。蛋白质折叠过程及其动力学信息在蛋白质折叠领域具有重要意义,有关蛋白质折叠路径的研究已引起人们的广泛关注。本文从蛋白质的线性结构出发,分别用经典分子动力学（molecular dynamics,简称MD）和一种加速模拟的方法（selfguided Langevin dynamics,简称SGLD）对四个蛋白质体系（编码分别为1HOD,2AJJ,2DX3,2RLG）进行了折叠模拟,并研究了它们的折叠机制。SGLD可以增加蛋白质的低频运动,这与蛋白质的折叠过程密切有关。与MD方法相比,SGLD方法在回转半径、均方根偏差、聚类分析、天然接触、螺旋含量、蛋白质折叠过程和自由能地貌等方面都有明显的改善。对所选取的蛋白质体系的研究结果表明,使用SGLD均可以成功地实现在95 ns内将线状结构态折叠成相应的本征结构。此外,多轨迹的结果再次支持了上述结论。然而,同一模拟时间内,经典的MD并不能在最终显示出有任何稳定的螺旋形成。本文最终用SGLD方法阐明了这些蛋白质的详细折叠途径和机制。
董川[8]（2020）在《抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究》文中研究说明2013年,Bondy-Denomy等人首次发现了一类小分子蛋白,噬菌体和其它可移动分子可以借此逃脱细菌和古菌CRISPR-Cas系统的免疫伤害。这些蛋白可采用直接结合的方式、位点修饰的方式抑制Cas蛋白的活性,根据该类蛋白抑制CRISPRCas系统的特性,Bondy-Denomy等人将其命名为抗CRISPR-Cas蛋白,简称Acrs。本文的主要工作围绕Acrs进行。本工作从相关文章收集了目前已经报道的Acrs数据,并从相关资源库中收集了Acrs相关的信息。例如,本文从NCBI中收集了Acrs的物种来源、编码基因,从STRING（https://string-db.org/）、DIP（http://dip.doe-mbi.ucla.edu/）等数据库中收集了蛋白的相互作用信息,从毒力因子数据库VFDB（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）中收集了Acrs与毒力因子的序列相似性信息。进一步汇总这些信息,构建了一个在线、综合的数据库Anti-CRISPRdb（http://cefg.uestc.cn/anti-CRISPRdb2）,其中包括400多条记录。随着时间推移,越来越多的Acrs及其家族被发现,于是我们更新了第一个版本的数据库,可以从链接http://cefg.uestc.cn/anti-CRISPRdb/访问。更新版本中包含更多的家族和家族成员信息,新增加了6种抑制类型的Acrs;新版本将NCBI基因组浏览器整合进来,用户可以借此查看Acrs周边蛋白的情况;本工作通过将Acrs和PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中的所有蛋白质链进行比对,进而增添了更多的结构信息,其中包括320多个Acrs结构信息。本文工作又基于Anti-CRISPRdb数据库进一步分析了Acrs的特征,分析表明Acrs和非Acrs有明显可区分的特征,具体表现在:Acrs比非Acrs短很多,并且比非Acrs具有更显着的密码子使用偏差,原核生物基因组内大量的Acrs被注释为假设蛋白、功能未知蛋白。本文工作通过分析也发现Acrs演化上的一些特点:1)Acrs多数位于基因组岛和前噬菌体片段上表明了Acrs的水平转移事件;2)Acrs相对于基因组的密码子使用偏差表明Acrs是近期转入到宿主菌中;3)有些Acrs在邻近的物种间连续分布表明了某些Acrs近期的转入事件,并在近邻物种间进行了扩张。为了定量刻画基因位于基因组岛或者前噬菌体片段上的可能性,本文工作定义并提出了一个无序列比对的参数dev,该参数是基于基因密码子相对于基因组密码子使用偏差进行的度量。基于Acrs的特征和演化上的特点,本文工作又构建了基于随机森林的识别算法。多次不同随机状态下的交叉验证表明该方法可以获得平均99.75%的准确率、平均75.1%的召回率、平均86.1%的查准率,跨物种交叉验证表明该方法可以将71.4%的真正的Acrs排在预测结果的前10名,该算法也能从新近识别Acrs的物种中准确识别出4个Acrs。基于本文的Acrs识别算法,本论文工作设计了一个网络服务,与此同时也在Git Hub上发布了本地版本,并将其命名为Acr Detector（http://cefg.uestc.cn/acr Detector）。Acr Detector不依赖于同源搜索,因此可以发现新的Acrs。另外,Acr Detector依赖于基因组背景特征,可以作为其它基于序列组成特征的补充工具。虽然Acr Detector可以识别潜在的Acrs,但是却不能识别它所抑制的CRISPRCas系统类型,准确识别候选物种CRISPR-Cas系统类型是识别Acrs抑制类型的关键。为此,本工作将马尔可夫图聚类算法和延伸最大连续Cas子簇的方法引入到Cas蛋白、cas基因座和基因座类型的注释中,这使得本工作的方法可以识别融合的Cas蛋白,并可以识别更加精确的cas基因座。此外,本论文工作也开发了Cas Locus Anno工具（http://cefg.uestc.cn/Cas Locus Anno/index.html）用于Cas蛋白、cas基因座和类型的注释,将并行运算运用到Cas Locus Anno工具中,以便加速注释速度。本文工作测试了Cas Locus Anno的执行效率和识别能力,对于大部分的测试数据Cas Locus Anno可以在29秒内完成注释,大部分物种可以在27.5秒以内的时间完成注释,Cas Locus Anno和CRISPRCas Finder的比较结果表明Cas Locus Anno的准确性比CRISPRCas Finder高出5%,且附加预测率要比CRISPRCas Finder低1.4%。
赵德辉[9]（2020）在《小麦分蘖角度遗传解析与标记发掘》文中研究表明分蘖角度是小麦株型的主要构成因素,影响其群体光合效率和抗逆性,对产量和适应性具有重要作用,但关于小麦分蘖角度的遗传研究却很少。对该性状进行QTL定位并发掘相关基因,获得与其紧密连锁的分子标记或功能标记,对小麦株型和产量改良意义重大。本研究以中麦871/中麦895重组自交系和扬麦16/中麦895双单倍体群体、黄淮麦区166份品种（系）为研究材料,通过连锁和关联分析对分蘖角度进行QTL定位;同源克隆了分蘖角度调控基因Ta TAC-D1,对其等位变异进行分析,并发掘相应功能标记,分别利用安阳156份和北京93份亲本圃材料对Ta TAC-D1基因进行效应验证,利用近等基因系研究了Ta TAC-D1基因对产量相关性状的影响。主要结果如下:1.分析了8个环境中麦871/中麦895群体266份F6家系的分蘖角度,选择分蘖角度极大和极小各30份家系构建混池,通过BSR-seq和完备区间作图法在1AL和5DL染色体上定位到2个新的分蘖角度QTL,分别命名为QTA.caas-1AL和QTA.caas-5DL,可解释表型变异的5.1～8.9%和13.8～24.8%,优异等位（分蘖角度减小）变异均来自中麦895。上述QTL分别在包含121份BC1F4家系的中麦871/中麦895//中麦871群体和175份BC1F4家系的中麦871/中麦895//中麦895群体中得到验证。2.以扬麦16/中麦895双单倍体群体174份家系为材料,利用4个环境分蘖角度表型数据和660K SNP芯片基因型数据,构建高密度遗传连锁图,在2B、2DS、4A、4D、6BS、7AL和7D染色体上定位到7个分蘖角度QTL,分别命名为QTA.caas-2B、QTA.caas-2DS、QTA.caas-4AL、QTA.caas-4D、QTA.caas-6BS、QTA.caas-7AL和QTA.caas-7D,可解释表型变异的3.3～21.7%。其中,QTA.caas-2B、QTA.caas-4AL、QTA.caas-4D和QTA.caas-7D的优异等位变异来自中麦895,其他3个QTL的优异等位变异来自扬麦16。开发了主效稳定QTL QTA.caas-2B的KASP-2B标记,并以166份自然群体为材料对其效应加以验证。3.以166份品种（系）的自然群体为材料,利用灌溉和干旱两种处理4个环境的分蘖角度表型数据,结合90K+660K SNP高密度物理连锁图谱,关联到18个分蘖角度位点,分别位于1B、2A（3个位点,下同）、2B（3）、2D、4A、4B、5B（2）、5D（2）、6D、7A（2）和7B染色体,可解释表型变异的10.5～18.1%,优异等位变异频率的变化范围为0.06～0.94。开发5B（2）、7A和7B染色体4个KASP标记,并对其效应加以验证。关联分析时显着性阈值为P<0.001时,可以在自然群体中检测到中麦871/中麦895群体定位的QTA.caas-5DL位点和扬麦16/中麦895群体定位的QTA.caas-2B和QTA.caas-4D位点。4.将位于QTA.caas-5DL区间内的水稻分蘖角度基因Os TAC1同源基因Traes CS5D02G322600命名为Ta TAC-D1,并加以克隆,在第三外显子发现一个A/G碱基突变,造成第169位氨基酸残基由苏氨酸（Thr）变成丙氨酸（Ala）。根据第三外显子错义突变开发了一个KASP功能标记KASP-TAC-D1,可以有效区分Ta TAC-D1-A和Ta TAC-D1-G两种等位变异。利用KASP-TAC-D1检测分别来自安阳和北京的156份和93份亲本圃材料,发现70%以上的品种为Ta TAC-D1-A基因型,其分蘖角度显着大于Ta TAC-D1-G基因型的品种。5.以中麦871/中麦895重组自交系群体中的剩余杂合系为材料,构建了Ta TAC-D1基因的近等基因系NIL871（纯合871基因型）和NIL895（纯合895基因型）。产量试验表明,NIL871的分蘖角度在灌溉和干旱处理环境中均显着大于NIL895,株型较松散。灌溉处理环境中,NIL895的穗数和产量显着高于NIL871,但在干旱处理环境中,二者的产量差异不显着。灌溉和干旱处理环境中,NIL871和NIL895的株高、穗粒数和千粒重差异均不显着。本研究对小麦分蘖角度进行了较为全面的遗传解析,发掘了多个新的稳定QTL,克隆了Ta TAC-D1基因,对其与分蘖角度和产量相关性状的关系进行了分析,并开发了多个紧密连锁的分子标记和Ta TAC-D1基因的功能标记,为进一步开展分蘖角度和产量相关性状的遗传研究和分子改良工作奠定了基础。
刘定慧[10]（2020）在《语言接触视角下汉语俄源词演变研究》文中提出语言接触是语言演变的根本动因。在一个多世纪的发展中,其从学科发展到理论建设也都日臻完善。而语言接触引起的语言演变现象更是成为当前学界研究的热点问题。不过,由于语言接触现象本身的复杂性,学界对语言接触的研究存在着一定的不均衡现象。主要表现为对国内少数民族语言与汉语接触、普通话与方言接触着力较多,研究得也更为深入。而对汉语与外语之间相互接触的研究稍显薄弱,而就汉语与外语接触的研究而言,也主要集中于对汉语与英语、日语的接触研究,对汉语与其他外语的接触研究则关注不够。“五·四”时期开始,很多充满时代色彩的俄源词开始批量进入到汉语中,其所携带的社会文化意义对中国社会产生了十分重要的影响。然而,我国学者关于汉语外源词的论着中,大多比较重视英源词和日源词的研究,而对俄源词的研究则缺乏足够的关注。基于此,本文在先学研究的基础上以汉语中的俄源词为主要研究对象,从语言接触的视角出发对不同历史时期俄源词的引进特点、本土化规律和动因以及俄源词在汉语中的活力状态进行了全面细致的研究。本文共分六个章节:第一章为绪论。通过对已有语言接触研究、语言接触引发的语言结构演变研究、语言演变中的词汇借用研究、汉俄语言接触中的汉语俄源词研究成果进行梳理和分析后,指出了本文的研究对象、研究内容、研究意义和研究方法。第二章主要对不同历史时期俄源词的引进特点进行了研究。本章以重要的中俄（苏）交往历史事件为时间节点将俄源词的引进大致分为五个时期:恰克图边境贸易兴起时期、中东铁路修筑时期、“五·四”至解放前时期、中苏友好时期、苏联解体至今的新时期。通过参阅相关文献资料以及检索俄源词在《晚清、民国期刊全文数据库》和《BCC语料库》中的最早出现时间,界定了现有俄源词出现在汉语中的大致时间范围,从而将其归并到本文所划定的相应历史时期对其引进特点进行了分析。本文认为,汉俄语言接触范围、接触方式和接触主体的不同是造成不同历史时期俄源词呈现不同特点的主要原因。第三章主要对俄源词语音本土化及其主要动因进行了研究。本章在汉俄语音对比的基础上,对俄源词进入汉语后在音节结构演变及汉俄音系匹配方面呈现出的规律和特征进行了全面地分析研究。俄源词语音本土化首先体现在其进入汉语后发生了十分普遍的音节结构演变现象。本文发现,不仅俄语中独有的音节结构发生了演变,而且汉俄语言中共有的音节结构也发生了演变。据本文分析,增加音位和删减音位是俄源词音节结构演变主要方式,并且呈现出以增加音位为主的特点。汉俄音系匹配则是俄源词语音本土化的又一重要体现。本文发现,用汉语声母匹配俄语词首辅音、用汉语韵母匹配俄语元音的现象在汉俄语言接触中十分普遍。并且本文还发现了用汉语韵母匹配俄语辅音的特殊情况。通过对具体匹配形式进行归纳整理后,本文分析出了汉俄音系匹配的两种主要方式:相似匹配和条件匹配。结合对具体语言事实的分析后,本文认为,汉俄语音差异是促使俄源词音节结构演变的根本动因。而词汇借用过程中的知觉映射、音系知觉原则等汉语母语者的认知因素则是促成汉俄音系出现多种匹配形式的重要原因。这些因素同时也是俄源词语音本土化的主要动因。第四章主要对俄源词词汇本土化及其主要动因进行了研究。本章利用汉俄两种语言的大型综合语料库对俄源词在汉俄两种语言中的使用情况进行了分析对比,对俄源词进入汉语后在结构和表意方面的本土化规律和特点进行了详细地分析。俄源词进入汉语后在结构方面的本土化主要体现在产生了几种特殊的构词方式。这些构词方式不仅为汉语带来了全新的构词语素、构词模式,还将特殊构词中所蕴含的俄罗斯民族所特有的心理特征、文化背景和认知方式等也同时带到了汉语中,从而对汉语产生了影响。俄源词进入汉语在表意方面的本土化主要通过音义相兼、词义变化、语用意义变化、影响汉语固有词词义等多种方式来实现。通过一系列适应汉语语言体系的变化,俄源词在实现表意本土化的同时,也在填补汉语语义空缺、促使汉语语义系统重新调整方面影响了汉语。本文通过对具体语料进行分析后,认为俄源词进入汉语后词汇本土化的动因既有适应汉语语言环境的语言内部原因,也有社会、心理及文化因素等语言外部的原因。第五章主要从共时角度对俄源词在汉语中的活力状态进行了研究。本章结合几个大型语料库的检索结果对筛选出来的近1000个俄源词在汉语中的总体活力状态进行了宏观界定。本文的研究结果表明,超过半数以上的俄源词在汉语中已经失去活力,只有少部分俄源词继续在汉语中维持活力。为了进一步考察俄源词在汉语中的具体活力状态,本文从存有活力的俄源词中甄选出了被2016年出版的《现代汉语词典》（第7版）收录的俄源词作为考察样本,结合其在《人民日报》（2015-2019）中的使用情况,对其活力程度和活力特征进行了研究。本文发现样本中的俄源词虽然都属于本文所界定的有活力状态,但是其在汉语中的具体活力程度却存在差异。本文通过对具体语料进行分析后认为,使用频次、语义表达、语法功能、语用范围和语用领域等语言因素以及相关的社会因素均会对俄源词在汉语中的活力状态产生影响。第六章是本文的结语。主要对全文的主要观点进行了总结,并指出了本文的研究价值和存在的不足。通过本文的研究,我们不仅对汉语中的俄源词演变规律有了更全面、科学、客观地认识,而且对汉俄语言接触与语言演变也有了更系统地把握。本文的研究结论有助于深化对非亲属语言之间词汇借用规律的理解和认识。词汇借用现象是一个经久不衰的常新课题,还有很多问题值得探讨,在未来的研究中仍需不断完善和深化。
二、IE家族最新成员（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IE家族最新成员（论文提纲范文）
（1）“七丘之城”：从里斯本、果阿到澳门 ——跨文化视野下15-18世纪罗马“圣城”景观在欧亚大陆的复制与改写（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一节 研究缘起与意义 |
| 第二节 主要视角与方法 |
| 第三节 论文结构 |
| 第四节 15-18世纪欧亚大陆“罗马城市”图像的研究语境 |
| 一、葡萄牙“罗马城市”景观研究 |
| 二、葡萄牙殖民地城市景观研究 |
| 三、澳门城市图像的跨文化研究 |
| 第五节 问题的提出:罗马圣城景观在里斯本、果阿与澳门? |
| 第一章 、七丘:罗马“圣城”景观的形成 |
| 第一节 罗马早期的山地景观及其演变 |
| 一、“七丘”的建立 |
| 二、城市形象的早期传播 |
| 第二节 七丘之城:文艺复兴时期罗马的理想形象 |
| 一、尼古拉五世的“理想城市”图形式规划 |
| 二、利奥十世时期的“重建罗马”建筑计划 |
| 三、耶稣会与保罗三世时期的高地建设 |
| 四、世界的形象:新时期的“七丘之城” |
| 第三节 又见罗马?——圣城景观的转移 |
| 小结 |
| 第二章 、里斯本的山城建设与“水上罗马”的形象 |
| 第一节 背景:葡萄牙的“山城”传统与大航海时期的形象改造 |
| 一、山城传统与基督教的空间理念 |
| 二、高地与内城建筑、道路体系 |
| 三、高地防御的新发展 |
| 第二节 里斯本山城的早期“罗马化” |
| 第三节 曼努埃尔一世的理想城市与高地重心转移 |
| 第四节 若昂三世的“重建罗马”与“七丘之城”形象 |
| 一、罗马教廷与罗马城市图像的影响力 |
| 二、奥朗达的“重建罗马”城市改造 |
| 第五节 水上的罗马:若昂五世时期的“形象转变” |
| 一、耶稣会的高地争夺战 |
| 二、菲利波·尤瓦拉的里斯本“新罗马”计划 |
| 第六节 结束与开始:震后的里斯本 |
| 小结 |
| 第三章 、果阿与葡萄牙海外殖民地的“滨海山城”理想 |
| 第一节 山城理想初探:七城岛与真十字 |
| 第二节 葡萄牙亚洲殖民地中的山城与理想的图形式规划 |
| 第三节 前殖民时期的山城果阿 |
| 第四节 殖民时期果阿的高地景观演变 |
| 一、城市高地与圣城格局的形成(1510-1604年) |
| 二、又见“水上的罗马”:滨水区的建筑景观建设(1605-1759年) |
| 第五节 里斯本还是罗马?——果阿的“七丘之城”形象 |
| 小结 |
| 第四章 抵达远东:澳门半岛上的“东方圣城”景观 |
| 第一节 濠镜澳——被遗忘的“真十字”之地 |
| 一、东亚的“维拉科鲁兹地” |
| 二、“另一端的岛屿”:七洲山 |
| 三、十字与王冠之盟——十字门 |
| 第二节 开埠前的高地景观(1557年之前) |
| 第三节 开埠早期“中央高地”的建立(1558-1582年) |
| 一、“城市制高点”——圣保罗山 |
| 二、澳城的另一面相:本土力量对高地景观的影响 |
| 第四节 “山巅之城”格局的形成(1583-1700年) |
| 一、17世纪“高地建筑”的建立 |
| 二、七个“堂区”,一种格局 |
| 第五节 水上圣城的东方形象:妈港神名之城 |
| 一、“复原”记忆:源自地中海的岛屿“理想” |
| 二、新旧理想的交替:山城形象的革新与没落小结 |
| 小结 |
| 第五章 、从复制到改写:15-18世纪圣城景观在欧亚大陆的“转移” |
| 第一节 从山地、平原到海滨:罗马山城的“转移” |
| 第二节 “水上的圣城”及其形象的形成 |
| 第三节 从地中海、大西洋到印度洋:岛屿山城的崛起 |
| 一、贸易模式与滨海山城的形成 |
| 二、新媒介中心的出现:“岛屿”上的帝国理想 |
| 三、高地的竞争者——宗教团体 |
| 第四节 从里斯本、果阿到澳门:圣城景观的“改写” |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一、《葡萄牙东方殖民地所有要塞、城镇平面图之书》图像、部分文本列表 |
| 附录二、果阿、里斯本教区列表、示意图 |
| 附录三、从全景到街景——从里斯本东方艺术博物馆藏“十三行潘趣酒碗”看“长卷式”城市视野的形成 |
| 附录四、由“指针”导向的城市视野——一件东西城市瓷盘上的跨洋航路与家族版图 |
| 致谢 |
| 学术成果统计-作品、论文及专着发表 |
| 学术成果统计-展览及获奖 |
（2）斯坦利·卡维尔的电影哲学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 一、选题缘由及背景 |
| 二、文献综述 |
| (一) 国外研究现状 |
| (二) 国内研究现状 |
| 三、研究目的、思路和主要研究方法 |
| (一) 研究目的 |
| (二) 研究思路 |
| (三) 主要研究方法 |
| 第一章 卡维尔电影哲学的思想来源和形成语境 |
| 第一节 迷影情结和实用主义哲学观 |
| 一、卡维尔的迷影情结 |
| 二、实用主义哲学观 |
| 第二节 现实主义电影理论 |
| 一、作为方法的现实主义 |
| 二、现实主义理论的现象学渊源 |
| 第三节 从怀疑论到伦理学 |
| 一、怀疑论与反怀疑论启示 |
| 二、日常生活——怀疑论之争的伦理归宿 |
| 第四节 好莱坞电影文化的变迁 |
| 一、好莱坞电影的“黄金时期” |
| 二、新好莱坞电影的崛起 |
| 第二章 卡维尔的电影本体论 |
| 第一节 作为本体的电影媒介 |
| 一、电影媒介的基础装置——摄影 |
| 二、电影媒介的本体装置——投影 |
| 第二节 电影媒介的特性 |
| 一、电影媒介的单向观看性 |
| 二、电影媒介的自动性 |
| 三、电影媒介的自我指向 |
| 第三节 电影媒介的素材:现实 |
| 一、具有过去时间性的世界 |
| 二、现实空间的转换和延展 |
| 三、技术与现实——以《比利·林恩的中场战事》为例 |
| 第三章 卡维尔的电影类型观 |
| 第一节 类型基因说 |
| 一、“史前条件”和类型“基因” |
| 二、西部片类型发展中的颠覆和继承 |
| 第二节 作为媒介的电影类型 |
| 一、电影类型作为“电影艺术的可能性” |
| 二、电影类型与语言游戏的类比 |
| 第三节 电影类型的再叙述模式 |
| 一、类型的原型与演变 |
| 二、成为类型成员的标准——意义生成与复杂关系建构 |
| 第四章 卡维尔的电影阐释与批评论 |
| 第一节 电影的意义生产 |
| 一、意义生产的前提:“承认”主体与世界 |
| 二、意义生产的过程:“卡普拉时刻”与电影的体验 |
| 第二节 “电影作为哲学”的阐释观 |
| 一、电影阐释的方法论:带有哲学反思的审美批评 |
| 二、美学可能性的哲学阐释 |
| 三、以《西北偏北》为例 |
| 第三节 卡维尔电影阐释批评的伦理维度 |
| 一、卡维尔的道德至善论 |
| 二、电影体验中的伦理关系 |
| 三、一种空间和时间的伦理 |
| 第四节 卡维尔电影阐释批评的社会维度 |
| 一、“日常性”作为“世俗”的隐喻 |
| 二、从复婚式喜剧、陌生女人情节剧到《卡罗尔》中的女性成长 |
| 第五章 卡维尔电影哲学的接受和学术价值 |
| 第一节 对卡维尔电影哲学的接受与“回避” |
| 一、卡维尔电影哲学与电影研究历史语境的磨合 |
| 二、卡维尔的写作风格 |
| 第二节 卡维尔电影哲学的意义和价值 |
| 一、卡维尔电影哲学的理论史价值 |
| 二、卡维尔电影哲学的方法论意义 |
| 三、卡维尔电影哲学的文化价值 |
| 第三节 卡维尔电影哲学的局限性 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录: 斯坦利·卡维尔学术年表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）泛基因组工具变量孟德尔随机化方法及其应用研究 ——以食管鳞癌mGWAS为例（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 一、前言 |
| 二、基于泛基因组工具变量的孟德尔随机化方法研究(OMR) |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 理论模型 |
| 2.2 统计模拟 |
| 2.3 实例验证 |
| 2.4 OMR模型与最新MR方法对比分析 |
| 2.5 模型评价指标 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 理论证明结果 |
| 3.2 统计模拟结果 |
| 3.3 实例验证结果 |
| 3.4 R包使用说明 |
| 4. 讨论 |
| 三、应用研究: 以血清代谢物对食管鳞癌的因果关联分析为例 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 研究人群 |
| 2.2 全基因组分型与填补方法 |
| 2.3 非靶向血清代谢组学检测方法 |
| 2.4 食管鳞癌高发区人群mGWAS分析 |
| 2.5 食管鳞癌GWAS分析 |
| 2.6 OMR分析 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 人口统计特征 |
| 3.2 食管鳞癌高发区人群mGWAS分析结果 |
| 3.3 食管鳞癌GWAS分析结果 |
| 3.4 OMR分析结果 |
| 4. 讨论 |
| 四、结论 |
| 五、创新点与局限性 |
| 1. 创新点 |
| 2. 局限性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文发表文章 |
（4）去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 综述：OTU家族去泛素化酶在免疫调控中的功能和机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文一 |
| 发表论文二 |
| 原始结果附图 |
| 学位论文评阅及答辩情况报 |
（5）Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 肝癌进程相关机制及其免疫治疗研究进展(文献综述) |
| 1. HCC进程中相关机制 |
| 1.1 HBV对HCC的促进作用 |
| 1.1.1 HBx与HCC |
| 1.1.2 HBV与免疫微环境 |
| 1.2 Homeobox基因对HCC的促进作用 |
| 1.2.1 Hox与HCC |
| 1.2.2 HMBOX1与HCC |
| 1.2.3 其他Homeobox与HCC |
| 1.3 STAT3信号通路对HCC的促进作用 |
| 1.3.1 STAT3与microRNA |
| 1.3.2 STAT3与肿瘤微环境 |
| 1.4 Wnt信号对HCC的促进作用 |
| 1.4.1 Wnt信号异常活化调控HCC进程 |
| 1.4.2 Wnt信号与HCC糖酵解 |
| 1.4.3 Wnt信号与肿瘤微环境 |
| 1.5 代谢重塑对HCC的促进作用 |
| 1.5.1 葡糖糖代谢 |
| 1.5.2 脂质代谢 |
| 1.5.3 氨基酸代谢 |
| 1.6 肿瘤相关基质细胞促进HCC |
| 1.6.1 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 1.6.2 肿瘤相关中性粒细胞 |
| 1.6.3 癌症相关成纤维细胞 |
| 2. HCC免疫治疗 |
| 2.1 靶向免疫检查点的治疗 |
| 2.2 基于基因改造淋巴细胞的过继转输治疗 |
| 2.2.1 CAR-T治疗肝癌 |
| 2.2.2 NK细胞治疗肝癌 |
| 2.3 TLR激动剂 |
| 2.4 肿瘤疫苗 |
| 2.5 靶向肿瘤相关巨噬细胞治疗HCC |
| 3. 结束语 |
| 参考文献 |
| 第二部分: Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 主要材料及试剂 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 HCC-TCM可以诱导巨噬细胞M2极化 |
| 3.2 HCC-TCM通过活化Wnt2b/β-catenin信号促进巨噬细胞M2极化 |
| 3.3 活化Wnt2b/β-catenin信号增强HCC-TAMs的促肿瘤作用 |
| 3.4 Wnt2b/β-catenin信号影响HCC-TAMs的糖酵解 |
| 3.5 TLR9激动剂可以抑制TCM诱导的M2极化并下调HCC-TAMsWnt2b/βcatenin信号 |
| 3.6 TLR9激动剂通过抑制c-Myc下调HCC-TAMs的糖酵解水平 |
| 3.7 抑制Wnt2b/β-catenin信号可以减弱HCC-TAMs的体内促肿瘤作用 |
| 3.8 HCC微环境中的因子能上调TAMs中Wnt2b、β-catenin和c-Myc的表达 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及奖励 |
| 外文论文 |
| Paper 1 |
| Paper 2 |
| Paper 3 |
| 学位论文评阅及测情况 |
（6）汉日语气系统之功能视角对比研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 选题缘起 |
| 1.2 研究视角 |
| 1.3 研究目的与研究问题 |
| 1.4 研究对象与语料选取 |
| 1.5 研究方法及研究意义 |
| 1.5.1 研究方法 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 1.6 论文结构 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 汉语语气研究 |
| 2.2.1 汉语语气研究历史溯源 |
| 2.2.2 汉语语气类别一致式研究回顾 |
| 2.2.3 汉语语气类别隐喻式研究回顾 |
| 2.3 日语语气研究 |
| 2.3.1 日语语气研究历史溯源 |
| 2.3.2 日语语气类别一致式研究回顾 |
| 2.3.3 日语语气类别隐喻式研究回顾 |
| 2.4 汉日语气对比研究 |
| 2.5 系统功能视角下的语气研究 |
| 2.5.1 人际功能研究 |
| 2.5.2 人际隐喻研究 |
| 2.5.3 汉语语气研究 |
| 2.5.4 日语语气研究 |
| 2.5.5 语气对比研究 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 理论框架 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 系统功能语言学核心概念 |
| 3.2.1 系统 |
| 3.2.2 功能 |
| 3.2.3 精密度 |
| 3.2.4 盖然率 |
| 3.2.5 体现 |
| 3.2.6 例示 |
| 3.2.7 语境 |
| 3.3 语气系统 |
| 3.3.1 语气类别系统 |
| 3.3.2 语气语势系统 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 汉日语气类别一致式及体现形式对比 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 陈述语气一致式及体现形式对比 |
| 4.2.1 精密度对比 |
| 4.2.2 句法手段对比 |
| 4.2.3 词汇手段对比 |
| 4.3 感叹语气一致式及体现形式对比 |
| 4.3.1 精密度对比 |
| 4.3.2 句法手段对比 |
| 4.3.3 词汇手段对比 |
| 4.4 疑问语气一致式及体现形式对比 |
| 4.4.1 精密度对比 |
| 4.4.2 句法手段对比 |
| 4.4.3 词汇手段对比 |
| 4.5 祈使语气一致式及体现形式对比 |
| 4.5.1 精密度对比 |
| 4.5.2 句法手段对比 |
| 4.5.3 词汇手段对比 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 汉日语气类别隐喻式及体现形式与语境特点对比 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 陈述语气隐喻式及体现形式与语境特点对比 |
| 5.2.1 精密度对比 |
| 5.2.2 句法手段对比 |
| 5.2.3 词汇手段对比 |
| 5.2.4 语言形式共现手段对比 |
| 5.2.5 语场特点对比 |
| 5.2.6 语旨特点对比 |
| 5.2.7 语式特点对比 |
| 5.2.8 语境共现特点对比 |
| 5.2.9 语言-语境共现特点对比 |
| 5.3 疑问语气隐喻式及体现形式与语境特点对比 |
| 5.3.1 精密度对比 |
| 5.3.2 句法手段对比 |
| 5.3.3 词汇手段对比 |
| 5.3.4 语场特点对比 |
| 5.3.5 语旨特点对比 |
| 5.3.6 语式特点对比 |
| 5.3.7 语言-语境共现特点对比 |
| 5.4 祈使语气隐喻式及体现形式与语境特点对比 |
| 5.4.1 精密度对比 |
| 5.4.2 句法手段对比 |
| 5.4.3 词汇手段对比 |
| 5.4.4 语言形式共现手段对比 |
| 5.4.5 语场特点对比 |
| 5.4.6 语旨特点对比 |
| 5.4.7 语式特点对比 |
| 5.4.8 语言-语境共现特点对比 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 汉日语气语势及体现形式对比 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 内在语势及体现形式对比 |
| 6.2.1 精密度对比 |
| 6.2.2 句法手段对比 |
| 6.2.3 词汇手段对比 |
| 6.3 外在语势及体现形式对比 |
| 6.3.1 精密度对比 |
| 6.3.2 句法手段对比 |
| 6.3.3 词汇手段对比 |
| 6.3.4 语音手段对比 |
| 6.4 结语 |
| 第七章 从语言、思维、社会文化看汉日语气系统的共性和差异 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 汉日语气系统共性与差异总结 |
| 7.2.1 汉日语气系统共性 |
| 7.2.2 汉日语气系统差异 |
| 7.3 从语言类型看汉日语气系统的共性与差异 |
| 7.3.1 从语序类型看共性 |
| 7.3.2 从语序类型看差异 |
| 7.3.3 从形态类型看差异 |
| 7.4 从思维维度看汉日语气系统的共性与差异 |
| 7.4.1 从思维维度看共性 |
| 7.4.2 从思维维度看差异 |
| 7.5 从社会文化看汉日语气系统的共性与差异 |
| 7.5.1 从社会文化看共性 |
| 7.5.2 从社会文化看差异 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 总结 |
| 8.1 研究发现及创新 |
| 8.2 研究局限及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英汉、日汉对照人名术语表 |
| 附录2 莱比锡标注符号说明 |
| 附录3 文中语料 |
（7）Bcl-2家族中蛋白与蛋白结合机制的相互作用熵方法研究及蛋白质折叠（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 细胞凋亡与Bcl-2 家族蛋白 |
| 1.3 蛋白质折叠及其研究方法 |
| 1.4 本文结构 |
| 第二章 理论基础 |
| 2.1 分子力场 |
| 2.2 结合自由能计算方法 |
| 2.2.1 MM/PBSA方法 |
| 2.2.2 丙氨酸扫描计算 |
| 2.3 SGLD方法 |
| 第三章 对Bcl-x L/Bcl-2与Bad/Bax结合自由能、热点及结合机制的计算分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 体系的获取及构建 |
| 3.2.2 分子动力学模拟 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.3.1 稳定性测试 |
| 3.3.2 结合自由能分析 |
| 3.3.3 热点残基分析 |
| 3.3.4 结合机制分析 |
| 3.3.5 聚类分析 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 基于朗之万动力学的加速模拟方法对四种螺旋蛋白折叠的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 体系的选取、初始化与MD模拟过程 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.3.1 Rg与 RMSD |
| 4.3.2 聚类分析结果 |
| 4.3.3 天然接触情况 |
| 4.3.4 螺旋含量与折叠过程 |
| 4.3.5 自由能地貌与多轨迹结果 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 工作总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物信息学概览 |
| 1.1.1 生物信息学产生的背景 |
| 1.1.2 生物信息学的研究内容 |
| 1.2 原核生物基因组 |
| 1.3 原核生物基因组中的重复序列 |
| 1.4 CRISPR-Cas系统 |
| 1.4.1 CRISPR的发现 |
| 1.4.2 CRISPR的构成和特点 |
| 1.4.3 Cas蛋白 |
| 1.4.4 CRISPR-Cas系统的功能和免疫过程 |
| 1.4.5 CRISPR-Cas系统的分类 |
| 1.5 Acrs蛋白 |
| 1.5.1 Acrs的发现 |
| 1.5.2 Acrs的抑制机制 |
| 1.5.3 Acrs蛋白的应用 |
| 1.6 细菌和噬菌体之间的竞争 |
| 1.7 Acrs相关的生物信息学研究 |
| 1.8 本文主要工作 |
| 1.9 本文主要创新点 |
| 1.10 论文的结构 |
| 第二章 Anti-CRISPRdb:Acrs蛋白的综合在线资源库 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 数据库的构建 |
| 2.2.1 数据的来源 |
| 2.2.2 Acrs家族内部之间的序列相似性 |
| 2.2.3 Acrs与 VFDB数据库的序列相似性信息 |
| 2.2.4 非冗余数据集构建 |
| 2.2.5 数据库的构建 |
| 2.3 Anti-CRISPRdb数据库的使用 |
| 2.4 数据库进一步更新 |
| 2.4.1 进一步更新的背景 |
| 2.4.2 更新库中数据的收集 |
| 2.4.3 更新版本库和老版本库数据比较 |
| 2.4.4 新版本数据库允许用户查看Acrs的邻居基因 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 Acrs的生物信息学分析和预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 数据集的构建 |
| 3.2.2 基因组岛、前噬菌体片段以及两者的生物信息学识别 |
| 3.2.3 HTH功能域注释 |
| 3.2.4 决策树和随机森林 |
| 3.2.5 Acrs特征提取 |
| 3.2.6 评价指标和评价方法 |
| 3.2.7 交叉验证过程中样本的划分方式 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 Acrs特征 |
| 3.3.2 最优参数确定和不同随机状态下的交叉验证 |
| 3.3.3 跨物种交叉验证 |
| 3.3.4 应用该算法预测新近识别Acrs的物种 |
| 3.3.5 Acr Detector识别结果的特点 |
| 3.3.6 基于该算法建立网络服务和本地执行工具 |
| 3.3.7 Acr Detector的优点和缺点 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 Cas蛋白、cas基因座和类型注释 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 Cas蛋白家族的收集和构建 |
| 4.2.2 马尔可夫图聚类 |
| 4.2.3 识别Cas蛋白、cas基因座和基因座类型的基本流程 |
| 4.2.4 提交基因组序列时的注释 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Cas Locus Anno的使用 |
| 4.3.2 对于Cas Locus Anno的识别速度评价 |
| 4.3.3 对于Cas Locus Anno的识别准确性进行评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 工作总结与展望 |
| 5.1 本文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 Anti-CRISPRdb的后续工作 |
| 5.2.2 Acr Detector的后续工作 |
| 5.2.3 Cas Locus Anno的后续工作 |
| 5.2.4 基于Acr Detector和 Cas Locus Anno的后续工作 |
| 5.2.5 现有工作可扩展的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（9）小麦分蘖角度遗传解析与标记发掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 株型 |
| 1.1.1 株型概念 |
| 1.1.2 理想株型概念 |
| 1.1.3 株型与育种 |
| 1.2 水稻分蘖角度遗传研究进展 |
| 1.2.1 水稻分蘖角度QTL定位 |
| 1.2.2 水稻分蘖角度调控的分子机理 |
| 1.3 TAC1基因研究进展 |
| 1.4 作物数量性状遗传研究 |
| 1.4.1 连锁分析 |
| 1.4.2 关联分析 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 中麦871/中麦895 RIL群体分蘖角度QTL定位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 田间试验与性状调查 |
| 2.1.3 基因型分析 |
| 2.1.4 基于BSR-Seq的 QTL定位 |
| 2.1.5 基于KASP标记的遗传连锁图构建及QTL确认 |
| 2.1.6 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 中麦871/中麦895RIL群体多环境下分蘖角度的遗传变异分析 |
| 2.2.2 中麦871/中麦895 RIL群体遗传连锁图谱构建及QTL定位 |
| 2.2.3 QTL的累加效应 |
| 2.2.4 QTL效应的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 QTL定位结果分析比较 |
| 2.3.2 BSR-Seq分析在复杂性状QTL定位中的应用 |
| 第三章 扬麦16/中麦895DH群体分蘖角度QTL定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 田间试验与性状调查 |
| 3.1.3 基因型分析 |
| 3.1.4 连锁图谱构建 |
| 3.1.5 QTL定位 |
| 3.1.6 KASP标记开发与验证 |
| 3.1.7 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 扬麦16/中麦895DH群体多环境下分蘖角度的遗传变异分析 |
| 3.2.2 扬麦16/中麦895DH群体遗传连锁图谱构建 |
| 3.2.3 分蘖角度QTL定位 |
| 3.2.4 QTL的累加效应 |
| 3.2.5 矮秆基因对分蘖角度的影响 |
| 3.2.6 主效位点QTA.caas-2B的 KASP标记开发 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 高密度连锁图谱 |
| 3.3.2 分蘖角度QTL与其它相关QTL的关系 |
| 3.3.3 矮秆基因对分蘖角度的影响 |
| 第四章 小麦分蘖角度全基因组关联分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 田间试验与性状调查 |
| 4.1.3 基因型分析 |
| 4.1.4 图谱构建 |
| 4.1.5 关联分析 |
| 4.1.6 KASP标记开发与验证 |
| 4.1.7 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 多环境下自然群体分蘖角度的遗传变异分析 |
| 4.2.2 自然群体图谱构建 |
| 4.2.3 亲缘关系、群体结构和连锁不平衡 |
| 4.2.4 分蘖角度的关联分析 |
| 4.2.5 分蘖角度关联位点的聚合效应 |
| 4.2.6 分蘖角度和优异等位变异个数的区域差异 |
| 4.2.7 分蘖角度候选基因分析 |
| 4.2.8 KASP标记开发与验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 群体结构和亲缘关系对关联分析的影响 |
| 4.3.2 干旱处理对分蘖角度的影响 |
| 4.3.3 QTA.caas-5DL候选基因的效应 |
| 4.3.4 候选基因分析 |
| 第五章 小麦Ta TAC-D1 基因序列分析及其与分蘖角度的关系 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 Ta TAC-D1 基因近等基因系构建 |
| 5.1.3 田间试验与性状调查 |
| 5.1.4 基因组DNA和 RNA提取 |
| 5.1.5 Ta TAC-D1 基因测序和功能标记开发 |
| 5.1.6 Ta TAC-D1 基因表达量分析 |
| 5.1.7 Ta TAC-D1 基因进化分析 |
| 5.1.8 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 Ta TAC-D1 基因序列分析 |
| 5.2.2 Ta TAC-D1 功能标记开发及其与分蘖角度的关系 |
| 5.2.3 Ta TAC-D1 不同时期和部位表达量 |
| 5.2.4 Ta TAC-D1 近等基因系与产量相关性状的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 Ta TAC-D1 基因序列与进化 |
| 5.3.2 Ta TAC-D1 基因时空表达 |
| 5.3.3 Ta TAC-D1 基因近等基因系的产量性状 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）语言接触视角下汉语俄源词演变研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.0 选题缘起 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 语料来源 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.6 已有成果研究综述 |
| 1.6.1 语言接触研究 |
| 1.6.2 语言接触引发的语言结构演变研究 |
| 1.6.3 语言结构演变中的词汇借用研究 |
| 1.6.4 汉俄语言接触与俄源词研究 |
| 第二章 不同历史时期汉俄语言接触与俄源词的引进 |
| 2.1 恰克图边境贸易兴起时期俄源词的引进 |
| 2.1.1 “恰克图混合语”的形成与汉俄语言接触 |
| 2.1.2 俄源词的引进与特点 |
| 2.2 中东铁路修筑时期俄源词的引进 |
| 2.2.1 “哈尔滨汉俄混合语”的形成与汉俄语言接触 |
| 2.2.2 俄源词的引进与特点 |
| 2.3 “五·四”至解放前时期俄源词的引进 |
| 2.3.1 大批俄苏译着出版发行与汉俄语言接触 |
| 2.3.2 俄源词的引进与特点 |
| 2.4 中苏友好时期汉俄语言接触与俄源词的引进 |
| 2.4.1 自上而下的“苏联热”与汉俄语言接触 |
| 2.4.2 俄源词的引进与特点 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 俄源词语音本土化及主要动因 |
| 3.1 俄源词音节结构类型演变及方式 |
| 3.1.1 俄语A类音节结构在汉语中的演变 |
| 3.1.2 俄语C类音节结构在汉语中的演变 |
| 3.1.3 俄源词音节结构演变方式 |
| 3.2 汉俄音系匹配类型及方式 |
| 3.2.1 汉语声母匹配俄语词首辅音 |
| 3.2.2 汉语韵母匹配俄语元音 |
| 3.2.3 特殊匹配 |
| 3.2.4 汉俄音系匹配方式 |
| 3.3 俄源词语音本土化的主要动因 |
| 3.3.1 汉俄语音差异 |
| 3.3.2 汉语母语者的认知 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 俄源词词汇本土化及主要动因 |
| 4.1 俄源词结构演变类型 |
| 4.1.1 音译语素组合构词 |
| 4.1.2 汉俄混合式构词 |
| 4.1.3 借俄重组式构词 |
| 4.1.4 喻义仿造式构词 |
| 4.1.5 汉语简缩式构词 |
| 4.2 不同结构类型在汉语中的竞争 |
| 4.2.1 意译形式取代音译形式 |
| 4.2.2 意译形式与音译形式并存 |
| 4.2.3 音译形式独立 |
| 4.3 俄源词表意本土化 |
| 4.3.1 音义相兼 |
| 4.3.2 词义变化 |
| 4.3.3 语用意义变化 |
| 4.3.4 影响汉语固有词词义 |
| 4.4 俄源词词汇本土化的主要动因 |
| 4.4.1 适应汉语语言系统 |
| 4.4.2 社会、心理、文化等因素的促动 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 俄源词在汉语中的活力 |
| 5.1 俄源词在汉语中的总体活力 |
| 5.1.1 失去活力俄源词的分布 |
| 5.1.2 有活力俄源词的分布 |
| 5.2 有活力俄源词的特点 |
| 5.2.1 活力程度 |
| 5.2.2 活力特征 |
| 5.3 影响俄源词活力的因素 |
| 5.3.1 语言因素对俄源词活力的影响 |
| 5.3.2 社会因素对俄源词活力的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 后记 |
四、IE家族最新成员（论文参考文献）
- [1]“七丘之城”：从里斯本、果阿到澳门 ——跨文化视野下15-18世纪罗马“圣城”景观在欧亚大陆的复制与改写[D]. 刘爽. 中央美术学院, 2021(08)
- [2]斯坦利·卡维尔的电影哲学研究[D]. 王静. 山东大学, 2021(11)
- [3]泛基因组工具变量孟德尔随机化方法及其应用研究 ——以食管鳞癌mGWAS为例[D]. 王璐. 山东大学, 2021(12)
- [4]去泛素化酶OTUD1在抗真菌免疫反应中的功能与作用机制研究[D]. 陈小荣. 山东大学, 2021(11)
- [5]Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究[D]. 姜雨. 山东大学, 2021
- [6]汉日语气系统之功能视角对比研究[D]. 耿芳. 北京外国语大学, 2021(09)
- [7]Bcl-2家族中蛋白与蛋白结合机制的相互作用熵方法研究及蛋白质折叠[D]. 董淑衡. 山东师范大学, 2021(12)
- [8]抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究[D]. 董川. 电子科技大学, 2020(03)
- [9]小麦分蘖角度遗传解析与标记发掘[D]. 赵德辉. 西北农林科技大学, 2020
- [10]语言接触视角下汉语俄源词演变研究[D]. 刘定慧. 吉林大学, 2020(01)