一、TGF-α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及对肿瘤细胞的杀伤作用（论文文献综述）
王静[1]（2019）在《新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究》文中研究表明免疫毒素是一种由靶向部分连接毒素部分组成的融合蛋白。其中,靶向部分通常是抗体、抗体片段或生长因子等具有导向功能的生物活性分子,能够通过特异性识别细胞表面的受体将毒素部分靶向传递至病变细胞。毒素部分普遍具有较强的细胞毒性,通过受体介导进入细胞后,可以发挥杀灭病变细胞的功能。根据来源不同划分,毒素部分可以来自微生物、植物、昆虫和动物等。绿脓杆菌外毒素和白喉毒素是两种获得广泛研究的细菌毒素,目前已有相应的药品Lumoxiti和Ontak被批准上市,对许多不同类型的血液瘤具有明显的治疗效果。然而,临床上广泛应用免疫毒素还存在许多待解决的问题,例如,免疫毒素存在免疫原性、非特异性毒性和低渗透性等。免疫毒素的非特异性毒性主要来源于两部分,一部分是由于毒素分子与内皮细胞的非特异性结合,对内皮细胞的损伤导致血管渗漏综合征的发生;另一部分则是靶向部分与表达肿瘤相关抗原的正常细胞非特异性结合,对正常组织的损伤引发对机体的毒副作用。由于毒素本身的异源性以及肿瘤特异性抗原极少存在,所以免疫毒素的非特异性毒性问题较难解决,于是我们设计新型的免疫毒素,分别对传统免疫毒素的毒素部分和靶向部分进行修饰与改造,从而降低免疫毒素的非特异性毒性。本课题针对靶向表皮生长因子受体2的免疫毒素scFvPE38进行改造,首次设计并制备无毒性两段式免疫毒素。断裂型内含肽是一种能够自我剪切并将两侧蛋白（外显肽）以天然共价键进行连接的自处理功能序列。我们借助断裂型内含肽将免疫毒素分成两段,两段分别与断裂型内含肽融合,在到达靶细胞后,通过控制反应条件,发生内含肽介导的蛋白反式剪接反应,使两段式免疫毒素重新连接形成完整免疫毒素。实验表明,两段式免疫毒素均不具有毒素活性,即使在高浓度条件下,也不会产生细胞毒性。两段式免疫毒素可以在还原性条件下发生内含肽介导的反式蛋白剪接反应,生成完整免疫毒素,并且恢复免疫毒素的细胞毒性,通过受体介导的内吞入胞后,引起靶细胞的凋亡。本课题同时设计新型的抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24,通过连接抗原屏蔽肽至免疫毒素的靶向部分,降低免疫毒素对表达肿瘤相关抗原的正常组织产生的非特异性毒性。在免疫毒素Fab部分的轻链N端通过酶解型连接肽连接抗原屏蔽肽,屏蔽抗体的抗原结合位点,在循环过程中降低免疫毒素对正常组织的结合。在达到肿瘤部位后,接受肿瘤微环境特异性蛋白酶处理,切除屏蔽肽,释放Fab的抗原结合部位,恢复其抗原结合亲和力,选择性对肿瘤细胞发挥杀伤作用。本课题分别从体外和体内验证了抗原屏蔽型免疫毒素的抗原亲和力和生物活性。体外研究结果显示,抗原屏蔽型免疫毒素的抗原结合能力和细胞毒性明显下降,但在接受特定蛋白酶活化后,能够恢复原有的结合亲和力和细胞毒性;使用小鼠异种移植瘤模型进行药效研究显示,抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24具有明显的抑瘤效果,并且与未屏蔽型免疫毒素Fab-PE24相比,对肝脏的损伤较轻,显示出更好的安全性。本课题设计的两种新型免疫毒素分别从1)降低细胞毒性与肿瘤靶位定点恢复以及2)抑制抗原结合能力与肿瘤靶位定点恢复两个方面来研究降低免疫毒素非特异性毒性的通用方法,使其可以用于不同抗体和毒素的任意组合,而不用局限于毒素的来源以及抗原的特异性表达。对以上两种新型免疫毒素的研究,为降低免疫毒素非特异毒性建立了一定的基础,有助于推动免疫毒素广泛应用于临床。本论文首创的新型低非特异性毒性免疫毒素的设计具有较高的开发应用价值。
郭万美[2]（2018）在《大肠癌靶向的融合免疫毒素的研究》文中提出为了改善靶向治疗大肠癌的重组免疫毒素,本研究通过将抗癌胚抗原（serum carcinoembryonic antigen,CEA）纳米抗体和截短的铜绿假单胞菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin,PE）的融合成功制备出了具备安全、高效的新颖的重组免疫毒素。本研究为今后靶向治疗大肠癌的重组免疫毒素的应用打下了基础。本文先制备并筛选了一株特异性及亲和力比较好的抗CEA纳米抗体（11C12）,接着将11C12与结构改造的PE毒素（PE40）构建重组免疫毒素原核表达载体,即pET28a-11C12/PE40,进而对融合蛋白进行诱导表达分离纯化。然后为了研究保护性纳米抗体的作用,又构建了在重组质粒pET28a-11C12/PE40的基础上增加了PE40的保护性纳米抗体2F2的重组质粒,即pET28a-11C12/PE40/2F2,进而对融合蛋白进行诱导表达分离纯化。最后将得到的上述两种融合免疫毒素做了大肠癌细胞的毒性验证。本研究制备出的两种重组免疫毒素对表达CEA的结直肠癌细胞均表现出明显的抑制作用。通过这两种免疫毒素对人正常结肠上皮细胞2950做细胞毒实验表明了保护性融合免疫毒素表现出了一定的保护作用。本研究为结直肠癌的治疗提供了一个新型,安全和高效的方法。
陈伟芝[3]（2017）在《基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究》文中进行了进一步梳理由于基因工程和免疫疗法的发展,功能性多肽和蛋白质越来越多的用于肿瘤治疗领域的药物纳米传输系统。类弹性蛋白结构基于哺乳动物的原弹性蛋白,由VPGXG五肽序列重复组成,具有生物相容性好、生物可降解性、低免疫原性、药代动力学优良等一系列优势。更重要的是类弹性蛋白主要由大肠杆菌表达制得,而且可以通过自身的温度敏感可逆相变行为进行非色谱纯化,十分方便。利用基因重组技术,可以将几种功能性多肽片段或者蛋白质在基因水平融合,进而表达出具有多功能的融合蛋白。此外,改变基因编码,可以插入合适的活性位点,用于后期与小分子偶联。肿瘤细胞活动旺盛、生长迅速,因而形成了与正常组织和细胞不同的病理变化。主要表现为新生血管结构不完整,肿瘤血管渗透滞留增强、无氧代谢、细胞转化、生长失控、弱酸环境以及营养物质大量需求形成的肿瘤细胞表面相关受体的表达上调。利用肿瘤组织的微环境的特异性,可以实现药物的选择性靶向输送。本论文采用基因重组技术和分子生物学手段,构建了以类弹性蛋白为基础的纳米药物传输体系,并系统研究了他们的药物传输性能。具体内容如下:（1）利用原位自由基聚合合成了类弹性蛋白苯硼酸纳米粒子,透射电镜和扫描电镜显示其粒径均一,具有良好的球形形貌,动态光散射测得其水合粒径在100 nm左右。接着对纳米粒子的细胞摄取、细胞相容性以及3D细胞中的渗透情况进行了研究。其次,将纳米粒子负载上化疗药物阿霉素,考察了其体外释放情况和细胞毒性。最后在小鼠皮下H22肿瘤模型中评价载药纳米粒子的体内分布情况和抗肿瘤效果。（2）利用基因重组技术将anti-EGFR的纳米抗体和细胞穿膜肽iRGD与类弹性蛋白进行融合表达。圆二色谱测试显示融合蛋白保持了各部分的二级结构。进一步在细胞层面上,相对于类弹性蛋白,融合蛋白显示出优越的进细胞能力和3D细胞的穿透能力。其次在小鼠皮下CT-26肿瘤模型中,考察融合蛋白的体内分布情况和肿瘤的靶向能力以及与阿霉素共给药的抗肿瘤效果。（3）利用酸敏感的腙键将阿霉素偶联到融合蛋白上,形成双靶向蛋白大分子药物。动态光散射显示偶联体以分子状态存在。体外药物释放实验证实药物释放的酸敏感特性。进一步在细胞层面验证双靶向蛋白大分子药物对细胞的选择性以及细胞毒性。在小鼠皮下H22肿瘤模型中,相对于裸药,双靶向蛋白大分子药物达到降低了药物在正常组织中的分布,进而将药物的最大耐受量提高了 4倍,最终在体内抗肿瘤方面显示了显着的效果。
邓翠敏[4]（2017）在《重组免疫毒素rE/CUS的制备及体外抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理研究目的以靶向EGFR的纳米抗体7D12为载体,南瓜蛋白作为“弹头”,采用基因工程的方法,设计、构建、表达及纯化重组免疫毒素rE/CUS,检测其体外抗肿瘤活性。研究方法1.构建重组免疫毒素rE/CUS的表达载体:根据本课题组已知的CUS基因及纳米抗体7D12基因序列,设计引物,并引进合适的酶切位点和保护性碱基。以p ET-32a-CUS和p ET-32a-7D12为模版,进行聚合酶链反应（PCR）,扩增产物纯化后,挑选阳性克隆进行测序;将测序正确的CUS基因及纳米抗体基因通过（G4S）3连接,通过重叠延伸PCR进行扩增,扩增产物纯化后,进行酶切验证,挑选阳性克隆测序。经过重组克隆筛选,将测序正确的阳性克隆菌转化E.coli;通过原核表达系统表达重组免疫毒素rE/CUS,IPTG低温诱导表达,并通过Ni离子亲和层析纯化目的蛋白。2.采用SDS-PAGE与Western blot法鉴定重组蛋白rE/CUS表达结果。3.流式细胞术检测肿瘤细胞株肝癌细胞（HepG2）、非小细胞肺癌细胞（A549）、大肠癌细胞（SW116）和结肠癌细胞株SW620的EGFR的表达情况及重组免疫毒素rE/CUS与各肿瘤细胞株的结合活性。4.采用磺酰罗丹明B比色法,检测重组免疫毒rE/CUS对肿瘤细胞株肝癌细胞（Hep G2）、非小细胞肺癌细胞（A549）、大肠癌细胞（SW116）和结肠癌细胞株SW620的体外杀伤作用研究。5.采用流式细胞术检测不同浓度的rE/CUS诱导肝癌细胞（HepG2）、非小细胞肺癌细胞（A549）的凋亡情况。6.Western blot法检测rE/CUS对HepG2细胞PI3K、Akt、mTOR、P70S6K、Bax、Bcl-2、Caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白表达水平的影响。研究结果1.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见1100bp特异性条带,与预期大小一致,测序结果表明,rE/CUS全长基因1161bp,编码386个氨基酸,表明重组质粒构建成功。2.重组免疫毒素经IPTG诱导表达,获得带有多聚组氨酸（His）6的融合蛋白,超声裂解显示蛋白大部分以包涵体的形式存在于沉淀中,部分蛋白可溶性表达于溶液中,经Ni离子亲和层析柱纯化,每升菌液中获得5mg的可溶性蛋白。3.SDS-PAGE结果可见42k Da处有一特异性条带,与预期的重组免疫毒素的分子量大小一致,Western blot显示重组蛋白rE/CUS可与南瓜蛋白抗体及鼠-抗His抗体特异性结合。4.rE/CUS与EGFR高表达的肿瘤细胞株肝癌细胞（Hep G2）、非小细胞肺癌细胞（A549）、大肠癌细胞（SW116）具有结合活性,而与EGFR低表达的结肠癌细胞株SW620无结合活性。5.rE/CUS对肿瘤细胞株的杀伤作用研究结果表明,单用7D12对EGFR高表达的肿瘤细胞株（Hep G2、A549和SW116）和EGFR阴性细胞株SW620均无明显的增殖抑制作用,r CUS对上述四种细胞有一定的增殖抑制作用,作用72h的IC50分别为（466.3±0.483）nmol/L、（716±0.760）nmol/L、（208.33±0.056）nmol/L和（263±0.044）nmol/L;重组免疫毒素rE/CUS对Hep G2细胞、A549细胞和SW116细胞的增殖抑制作用明显,且呈剂量依赖性和时间依赖性,作用72h的IC50分别为（2.15±0.226）nmol/L、（18.33±0.018）nmol/L和（2.33±0.032）nmol/L,而对SW620细胞增殖抑制作用弱,作用72h的IC50为（463±0.086）nmol/L。6.流式细胞术显示,rE/CUS可诱导肝癌细胞HepG2和非小细胞肺癌细胞A549凋亡,32nmol/L rE/CUS诱导Hep G2的凋亡率为47.4%,10nmol/L rE/CUS诱导A549细胞的凋亡率为56.3%。7.Western blot法检测结果显示,不同浓度的rE/CUS作用于Hep G2细胞,细胞PI3K、AKT、m TOR、P70S6K、Bcl-2蛋白表达逐渐减弱,Bax、Caspase 9、cleaved-caspase 3蛋白表达逐渐增强,呈明显的浓度依赖性。结论1.本研究成功构建了重组免疫毒素rE/CUS的表达载体,诱导表达并纯化重组蛋白rE/CUS。2.rE/CUS对EGFR高表达的肿瘤细胞株肝癌细胞（Hep G2）、非小细胞肺癌细胞（A549）、大肠癌细胞（SW116）具有显着的杀伤作用。3.rE/CUS诱导Hep G2细胞凋亡的机制可能与下调PI3K、Akt、m TOR、P70S6K、Bcl-2蛋白水平的表达,进而激活caspase9,并最终激活下游caspase3有关。
欧阳清[5]（2017）在《单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定》文中提出HER2(p185erb B2/neu)是EGFR家族的成员,在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞中高表达,是肿瘤恶性行为以及不良预后的标志。靶向治疗是HER2阳性肿瘤的重要治疗手段,主要包括靶向HER2的单克隆抗体、单链抗体偶联效应分子等策略。HER2治疗性单克隆抗体能够有效抑制肿瘤细胞增殖、延长生存期,是HER2阳性进展期乳腺癌及胃癌的一线疗法。这些HER2靶向的治疗性抗体都由鼠源单克隆抗体经人源化改造而来,长期应用未观察到严重的免疫原性相关副作用。HER2单链抗体来源于单克隆抗体,常与生物效应分子融合表达或者表达于T细胞表面（CAR-T）靶向杀伤肿瘤细胞,具有广泛的应用价值。对鼠源单链抗体的人源化改造,是以其为基础的肿瘤靶向杀伤策略走向临床的重要一环。本研究以本组前期系列验证的、靶向效果明确的鼠源单链抗体e23sFv为模板,拟解决两个关键问题:一是在探索单链抗体人源化的技术改进;二是评价该人源化单链抗体用于肿瘤靶向治疗的有效性。针对第一个关键问题,本研究进行了两方面新的摸索。首先,在传统的鼠源互补决定区（CDR）—人源框架区（FR）移植策略的基础上,拓宽了人源化改造FR模板的选择范围,既选了与e23sFv同源性最高的全人抗体特异序列,也选了与e23sFv同源性最高的全人抗体亚类的通用序列,并将二者对比,为抗体人源化的FR模板选择提供线索。其次,针对所选的人源抗体亚类通用序列,将FR关键残基突变回鼠源亲本,以维持抗原构象、避免丧失亲和力。传统的突变策略有两种:一是定点突变,前提是抗体结构信息必须明确;二是随机突变,虽然可提高亲和力的多样性,但筛选工作量大。我们尝试将这二者相结合,选择13个关键氨基酸位点分别设计定点突变引物,同时又通过设计同位点的不突变对照、引物的随机组合分组等方法,增加这13个位点随机突变与组合的几率,最终结合噬菌体抗体展示技术,建立了库容为213的突变抗体库,经4轮亲和力淘选和噬菌体ELISA筛选,获得4株高亲和力的人源化单链抗体。基于上述构建和筛选,本研究得到2株特异序列来源的人源化单链抗体SGF1、SGF2,4株通用序列来源的人源化单链抗体P1h2、P1h3、P2h2、P2h5。通过同源建模的方法,模拟了e23sFv、SGF1、P1h2的结构并与HER2分子进行对接,预测人源化单链抗体的识别表位位于HER2胞外段第IV结构域,且SGF1主链碳原子构象比P1h2更接近e23sFv,而P1h2与HER2相互作用能比SGF1更强。经过原核蛋白表达纯化、包涵体复性,获得蛋白纯度大于90%,进行功能评价:（1）亲和力:通过表面等离子共振实验（SPR）观察人源化单链抗体对人重组HER2的亲和力,结果显示P1h2、P1h3、SGF1比e23sFv提高约10倍,P2h2、P2h5则与e23sFv相当;细胞ELISA观察它们对细胞表面天然表达HER2的亲和力,结果与SPR实验一致。（2）识别表位:荧光素标记人源化单链抗体,竞争性流式细胞术观察到,人源化单链抗体的HER2识别表位与e23sFv相同。（3）内化活性:激光共聚焦显微镜观察结果表明,荧光素标记的人源化单链抗体P1h2、P1h3、SGF1能够特异性结合并内化进入HER2阳性细胞;P2h2、P2h5、SGF2则不能内化。（4）免疫原性:ELISPOT及抗体偶联磁珠技术检测人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平,结果表明,人源化单链抗体刺激PBMCs产生IFN-γ、TNF-α细胞因子的水平较鼠源单链抗体大幅下降,减少到鼠源单链抗体刺激水平的1/20。值得注意的是,特异序列来源的SGF1比通用序列来源的4株人源化单链抗体刺激细胞因子分泌的水平更高,提示其免疫原性相对较强。综上,我们从6株不同序列来源的人源化单链抗体中,优选出两株免疫原性低、亲和力高并且具有内化活性的单链抗体P1h2和P1h3,进行后续功能研究。针对第二个关键问题,我们探索了P1h2和P1h3用于两种靶向治疗策略的有效性:一是基于补体依赖的细胞毒作用（CDC）的间接肿瘤杀伤;二是基于本组前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接肿瘤杀伤。（1）CDC策略:在人源化单链抗体的C端融合表达人IgG1Fc,构建获得系列scFv-Fc融合蛋白,进行真核系统表达纯化。流式细胞术和体外CDC实验结果表明,P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能与HER2阳性肿瘤细胞特异性结合,间接杀伤肿瘤细胞。HER2高表达的乳腺癌细胞及中度表达的肺癌细胞中,P1h2-Fc、P1h3-Fc的杀伤作用均强于e23sFv-Fc。（2）免疫促凋亡策略:将人源化单链抗体构建替换入课题组前期建立的免疫促凋亡分子,获得scFv-Fdt-tBid,进行原核系统可溶表达纯化。流式细胞术和细胞杀伤实验观察到,P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能够特异性结合HER2阳性肿瘤细胞,有效抑制细胞增殖;在HER2高表达的乳腺癌细胞、胃癌细胞、中度表达的肺癌细胞中,二者对肿瘤细胞的增殖抑制与e23sFv-Fdt-tBid相当。体内实验分别采用NOD-SCID鼠的三种不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤）,明确观察到人源化改构免疫促凋亡分子的体内抗肿瘤活性。在乳腺癌和胃癌模型中,P1h2-Fdt-t Bid、P1h3-Fdt-tBid的肿瘤抑制作用强于e23sFv-Fdt-tBid;而肺癌模型中,二者的抗肿瘤作用与e23sFv-Fdt-tBid相当。综上所述,本研究通过优化CDR移植策略,针对抗HER2鼠源单链抗体e23sFv进行人源化改构,成功筛选获得免疫原性降低、亲和力提高并具有内化活性的两株人源化单链抗体P1h2、P1h3,并通过体内外实验验证其用于CDC策略和免疫促凋亡策略的有效性,为单链抗体为导向的融合蛋白的人源化改造、安全性评价提供了实验依据。
惠琦[6]（2014）在《靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应》文中研究表明恶性黑色素瘤是恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，目前仍没有找到治疗转移性黑色素瘤最为有效的方法。重组毒素由于具有特异性高、细胞毒性强的特点，有望成为黑色素瘤（辅助）治疗的有效方法之一，特别是对转移性黑色素瘤的治疗可能是最好的方式。本研究利用恶性黑色素瘤细胞表面MC1R的结合位点为正常细胞及其它肿瘤的几十倍的巨大差异，并利用促黑色素细胞激素（Melanophore-stimulating hormone, α-MSH）可特异性的与恶性黑色素瘤表面的MC1R结合的特性，将α-MSH作为恶性黑色素瘤特异的靶向载体；将绿脓杆菌外毒素PE作为免疫毒素的毒性部分用于杀伤靶细胞，构建了重组毒素MSH-PE38KDEL，以基因工程方式表达黑色素瘤靶向免疫毒素。重组毒素MSH-PE38KDEL的构建与表达。本研究通过生物信息学分析，优化MSH与PE40的链接Linker，确保各自的结构与功能不受影响；然后对PE40进行修饰，降低其免疫原性（PE38），并增加其活性（PE38KDEL）；构建了MSH-PE38KDEL基因，将其连接到pET28a、pHis1525表达载体上，构建了pET28a-MSH-PE38KDEL、 pHis1525-MSH-PE38KDEL重组质粒，分别在Rosegami、WH320表达宿主菌内进行了表达，经SDS-PAGE分析及活性测定，最终筛选了高表达且具有生物活性的重组质粒pET28a-MSH-PE38KDEL。将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。以SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。同时用凝胶成像分析系统配套软件对MSH-PE38KDEL融合蛋白的表达量进行分析，证明其表达量可占全菌体的10%。重组毒素MSH-PE38KDEL的纯化。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析证明融合蛋白为可溶性表达。对表达后蛋白采用了菌体超声破碎、离心、疏水层析、离子交换及分子筛层析等纯化手段， SDS-PAGE分析MSH-PE38KDEL的纯度，其纯度可达90%以上。重组毒素MSH-PE38KDEL的体外抗黑色素瘤活性。采用α-MSH受体高表达的人黑色素瘤A875细胞及鼠黑色素瘤B16细胞进行了体外生物活性试验，同时以α-MSH受体低表达的鼻咽癌细胞CNE、乳腺癌细胞MCF及人正常细胞2BS做对照，证明其靶向杀伤作用。MTT检测MSH-PE38KDEL对黑色素瘤细胞A875及B16的杀伤作用在85%以上，而对人正常细胞2BS无杀伤作用。重组毒素MSH-PE38KDEL的体内抗黑色素瘤活性。以鼠黑色素瘤B16细胞在NIH/nu裸鼠体内建立黑色素瘤高转移动物模型。采用了瘤周围注射及静脉注射两种给药途径，对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示以MSH-PE38KDEL1.1mg/只连续注射10天，可显着抑制肿瘤生长，其抑瘤率＞90%，且瘤周注射组肿瘤消失率为30%，静脉注射组肿瘤消失率为40%。病理切片HE染色结果显示MSH-PE38KDEL有效抑制了黑色素瘤B16细胞的肝内转移；电镜观察肝脏超微结构结果显示，MSH-PE38KDEL抑制了黑色素瘤B16细胞对机体细胞的破坏作用。重组毒素MSH-PE38KDEL在体内具有明显的抗黑色素瘤的效应，毒副作用低，病理及电镜结果显示对实质脏器均未见损伤。MSH-PE38KDEL有望成为靶向治疗黑色素瘤的候选药物。
宋杰[7]（2013）在《重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究》文中进行了进一步梳理胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。全球每年约有100万新增胃癌患者，同时有80万患者死亡。中国胃癌发病率占全世界的42%，死亡率占35%，是世界平均水平两倍多。我国早期胃癌的检出率平均为10%，90%中晚期胃癌的5年生存率不足20%；手术是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能够进行手术治疗，而且这1/3的病人也不是纯粹的早期胃癌，对于中晚期病人除进行手术治疗外常配合化疗、放疗等治疗手段；但化疗和放疗副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。很多肿瘤的抗药性越来越严重，加大了治疗的困难。目前进行的疫苗等生物治疗尝试，尚未获得理想结果。本实验以反向17肽胃泌素为导向单元设计抗胃癌靶向药物，在此基础上优化表达条件、进行重组毒素的纯化，并进行细胞杀伤实验确证该重组毒素的癌细胞靶谱，以期为临床实验病例筛选和个性化治疗方案设计提供指导。胃癌发生时，肿瘤细胞膜上胆囊收缩素受体（CCK-2R）表达量与亲和力都明显增加，而正常组织不表达或表达量极低，形成几十至上千倍的差异，表明CCK-2R高表达与胃癌发生及恶化程度有关。本实验利用基因工程手段分别将正向与反向的17肽胃泌素与截短并修饰的绿脓杆菌外毒素（PE38KDEL）进行重组，制备胃癌靶向免疫毒素。大肠杆菌表达所得以反向胃泌素片段为导向单元的重组毒素rG17PE38对BGC-823、MGC-803与SGC-7901胃癌细胞系具有很好的杀伤作用，western blot证明其可被抗人胃泌素抗体及抗PE38抗体识别。密码子偏爱性是原核表达中最重要的一个影响因素，为便于蛋白纯化及下游实验，本文先后对靶基因进行了两次优化，最终获得一株高表达重组菌株Rosetta（DE3）（pET-rG17PE38），表达量可达全菌体蛋白的40%以上，28.7℃诱导时绝大多数目的蛋白以可溶形式表达；然而高表达只能在试管摇培条件下获得，三角瓶诱导不表达，遇到表达体系无法放大的问题。经培养基筛选及组分优化后，获得适合三角瓶生产的发酵条件：1%接种量接种SOB培养基，OD值约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，28.7℃继续培养4h。由于该蛋白自身的特性，常规方法纯化得率太低；本文以切胶回收方式制备免疫原，足垫免疫Balb/C鼠，以LHRH-PE38为检测原筛选杂交瘤细胞株；获得3株稳定分泌PE38单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3B9株分泌抗体呈现良好的醇洗脱反应性；温和条件下即可与PE38识别与解聚，最佳洗脱条件为50mM Tris-HCl, pH7.9,850mM NaCl,40%propyleneglycol,1mM EDTA。将辛酸-硫酸铵法纯化的3B9抗体与CNBr活化的Sepharose4FF介质偶联，制备PE38的亲和层析柱；同时优化组合硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析等纯化条件，最终获得纯度达92%以上的rG17PE38蛋白。对包括BGC-823、MGC-803、SGC-7901胃癌细胞，LOVO、HCT-8、SW480、SW620、Caco-2、SW116结肠癌细胞及PANC-1胰腺癌细胞在内的30余株细胞进行靶向杀伤实验；并利用CCK-8试剂盒，测定该免疫毒素对各细胞的IC50值。结果表明，rG17PE38对胃癌细胞具有靶向特异的杀伤活性，对部分结肠癌细胞有细胞毒作用，对其它癌细胞及正常细胞没有明显毒性。本文制备的rG17PE38重组毒素分子量小、靶向性好，其rG17单元可执行酰胺化胃泌素的靶向功能；细胞毒试验证实对胃癌细胞杀伤活力强，对正常细胞毒性小，具有良好的应用前景和坚实的科学基础，有可能成为胃癌非手术性治疗方法，为转移性或扩散性胃癌的生物性治疗开辟新途径。
李咏梅[8]（2012）在《免疫毒素EGF-TCSredlk的制备及其抗肿瘤疗效评价》文中研究指明肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,寻找有效的抗肿瘤药物与方法是世界医学界的重要研究课题。由于现有的化疗药物和放疗的选择性不高,杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内正常细胞,治疗中常出现较明显的毒副反应。免疫毒素是提高治疗效果的一条重要途径,是新一代的癌症治疗方法,此疗法与传统的化疗不同,其药物能在肿瘤部位有相对较高的浓度,存留较长时间,对肿瘤靶细胞有较强的杀伤活性,而对正常细胞无作用或毒性很小。[目的]构建新型免疫毒素EGF-TCSredlk,并进行抗人胃癌细胞活性的初步测定,使用EGF-TCSredlk重组蛋白对裸鼠的肿瘤模型进行体内抑瘤实验,观察其抗肿瘤效果。[方法]利用大肠杆菌系统表达抗胃癌重组免疫毒素EGF-TCSredlk,表达产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化并进行特异性杀伤活性检测。分别给裸鼠皮下接种人胃癌细胞,接种后第6天,尾静脉注射100、50和25μ g/kgEGF-TCSredlk进行治疗,设空白对照组,停药后第2天处死小鼠,称量瘤重,计算抑瘤率；肿瘤组织做免疫组织化学实验,从而研究其抑制肿瘤生长的途径。[结果]该新型免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清液中,并获得有效纯化,应用四甲基偶氮哗盐（MTT）法初步检测其对人胃癌细胞MGC803具有选择性杀伤活性。高、中和低剂量组的抑制率分别为75.5%、54.5%和35.4%。对治疗结束后各组平均瘤重进行统计学分析,结果有显着性差异（Welch=82.617, P=0.000）;免疫组化结果显示EGF-TCSredlk可以明显的抑制肿瘤血管的形成,高剂量组肿瘤组织未有可见血管,中低剂量组肿瘤组织血管明显少于模型组,其抑制肿瘤生长的途径可能是通过抑制肿瘤血管生长从而达到治疗目的。[结论]已成功地制备了具有抗人胃癌细胞活性的新型免疫毒素EGF-TCSredlk,它可以有效地抑制荷瘤小鼠实体瘤的生长,预示了该免疫毒素在肿瘤治疗中的潜在应用价值。
夏海华,于冲,曲晓军,孙建华,王金英[9]（2012）在《绿脓杆菌外毒素A的最新研究进展》文中认为在免疫缺失、囊肿性纤维化、烧伤烫伤等患者的临床继发感染中,绿脓杆菌是引起感染的主要病原菌之一,其合成的细胞外毒性物质—绿脓杆菌外毒素A（PEA）被认为是引起感染的最关键内在机制。该文对中外学者们在PEA的结构、功能、提取和纯化方法、重组毒素、基因工程疫苗以及应用等方面的研究进行归纳总结,并对研究和应用中存在的问题加以分析,对预防和治疗绿脓菌感染、抗肿瘤、抗移植排斥和治疗自身免疫性疾病等具有重要而深远的意义。
张慧瑛[10]（2008）在《HIV-Ⅰ TAT和PEA-Ⅱ转膜效率的研究》文中研究指明凋亡素（Apoptin）是鸡贫血病毒（CAV）的VP3蛋白,由121个氨基酸组成,多年来对Apoptin的研究证明它能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,而且在肿瘤的治疗中凋亡素是一个独立的因子,不受p53基因突变和Bcl-2基因的影响。这些特性预示凋亡蛋白有可能成为一种治疗因子选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。但是凋亡素的作用靶点位于细胞核内,必须进入细胞核内才能发挥生物活性,所以寻找高效、安全的导向分子和转膜系统是应用影响凋亡素治疗效果的关键。黄体生成激素释放激素（luteinizing hormone releasing hormone,LHRH）是下丘脑分泌的一种调节性腺功能的激素,研究表明LHRH受体在卵巢癌、子宫内膜癌等细胞膜上呈特征性分布,即在肿瘤细胞表面有过量表达,所以可利用LHRH为靶向载体将治疗药物定向带到肿瘤细胞,达到将药物富集于肿瘤组织目的。近十年来,陆续发现了一些具有蛋白质转导结构域（protein transductiondomain,PTD）的蛋白质或多肽,它们可以携带多种物质,包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间/内的传输,并且不受细胞类型的限制,如TAT（11肽、13肽）、Antp（16肽）、VP22（34肽）、Transportan（28肽）、MAP（18肽）和PEA-Ⅱ（66肽）。为了寻找高效的转膜系统,提高凋亡素重组蛋白内化效率,本研究选用肿瘤细胞导向因子LHRH为导向分子,目前研究热点的TAT和PEA-Ⅱ分别作为转膜系统,凋亡素蛋白作为效应部分,通过PCR重叠延伸技术将Apoptin基因与肿瘤细胞导向因子LHRH基因分别与HIV-1 TAT和PEA-Ⅱ转膜系统基因重组,分别获得导向部位（LHRH）-转膜系统（TAT和PEA-Ⅱ）-凋亡蛋白两种融合蛋白基因,并通过原核表达系统实现了两种凋亡素重组融合蛋白基因LHRH-TAT-Apoptin（LTA）和LHRH-PEA-Apoptin（LPA）的表达和纯化。两种重组融合蛋白LTA和LPA分别对Heta细胞的凋亡作用显示,以HIV-1 TAT为转膜系统的凋亡素重组融合蛋白组LTA作用Hela细胞后细胞凋亡率高于LPA重组融合蛋白组,说明TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ。同时为了进一步检测TAT和PEA-Ⅱ的转膜效率,本研究还构建了以荧光蛋白（GFP）为报告基因的凋亡素重组融合蛋白基因LHRH-TAT-GFP-Apoptin（LTGA）和LHRH-PEA-GFP-Apoptin（LPGA）原核表达载体,经IPTG诱导表达并纯化。通过两种重组融合蛋白LTGA和LPGA分别作用Hela细胞后荧光强度显示,以TAT为转膜系统重组融合蛋白组LTGA作用Hela细胞后的绿色荧光明显强于PEA-Ⅱ重组融合蛋白组LPGA,进一步说明TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ。通过上述实验,一致证实TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ,确定了以TAT作为转膜系统可提高重组蛋白的内化效率,增强凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的能力,为进一步应用凋亡素重组融合蛋白导向治疗肿瘤奠定了基础。
二、TGF-α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及对肿瘤细胞的杀伤作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TGF-α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及对肿瘤细胞的杀伤作用（论文提纲范文）
（1）新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.免疫毒素及其研究进展 |
| 2.免疫毒素的作用机制 |
| 2.1 植物毒素的作用机制 |
| 2.2 细菌毒素的作用机制 |
| 2.3 人源毒素的作用机制 |
| 3.免疫毒素的制备方法 |
| 3.1 化学偶联法 |
| 3.2 基因融合法 |
| 4.免疫毒素的缺陷及解决方法 |
| 4.1 借助蛋白内含肽设计两段式免疫毒素降低非特异毒性 |
| 4.2 设计抗原屏蔽型免疫毒素降低非特异性毒性 |
| 第二章 新型两段式免疫毒素的制备与鉴定 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、细胞和质粒 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 2.4 实验相关溶液 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 细胞毒性的检测 |
| 2.9 体外反式剪接反应 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的制备策略 |
| 3.2 构建免疫毒素表达载体 |
| 3.3 免疫毒素的表达与纯化 |
| 3.4 免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.5 两段式免疫毒素的载体构建 |
| 3.6 两段式免疫毒素的表达 |
| 3.7 两段式免疫毒素的纯化 |
| 3.8 体外蛋白反式剪接反应 |
| 4.讨论 |
| 第三章 新型两段式免疫毒素的活性检测 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞及其培养条件 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 抗原亲和力分析 |
| 2.4 细胞摄取分析 |
| 2.5 细胞毒性检测 |
| 2.6 细胞凋亡检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的抗原结合活性 |
| 3.2 两段式免疫毒素的细胞摄取 |
| 3.3 两段式免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.4 两段式免疫毒素诱导细胞凋亡 |
| 4.讨论 |
| 第四章 抗原屏蔽型免疫毒素的制备与验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 体外反式剪接反应 |
| 2.9 体外酶切反应 |
| 2.10 抗原结合亲和力检测 |
| 2.11 细胞毒性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 抗体片段的表达与分析 |
| 3.3 毒素片段的表达和鉴定 |
| 3.4 抗体片段的纯化 |
| 3.5 毒素片段的纯化 |
| 3.6 免疫毒素的生成 |
| 3.7 免疫毒素的纯化 |
| 3.8 免疫毒素的体外活化 |
| 3.9 免疫毒素抗原亲和力检测 |
| 3.10 免疫毒素细胞毒性检测 |
| 4.讨论 |
| 第五章 抗原屏蔽型免疫毒素体内药效学评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞和动物 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 肿瘤细胞培养 |
| 2.6 小鼠皮下接种 |
| 2.7 体内药效研究 |
| 2.8 肿瘤分布研究 |
| 2.9 非特异性毒性评价 |
| 3.结果 |
| 3.1 免疫毒素的抑瘤作用 |
| 3.2 免疫毒素的肿瘤分布 |
| 3.3 免疫毒素的非特异性毒性 |
| 4.讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.研究总结 |
| 2.特色与创新 |
| 3.课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间申请的专利 |
| 致谢 |
（2）大肠癌靶向的融合免疫毒素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤融合免疫毒素靶向治疗的发展状况 |
| 1.2.1 载体的应用 |
| 1.2.2 细胞毒效应分子绿脓杆菌外毒素PE的作用机制及设计 |
| 1.2.3 重组免疫毒素的制备 |
| 1.2.4 重组ITs的展望与挑战 |
| 1.3 论文研究目的和内容 |
| 第二章 抗CEA纳米抗体的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细菌菌株 |
| 2.2.2 质粒载体 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CEA免疫羊驼 |
| 2.3.2 CEA纳米抗体库的构建 |
| 2.3.3 针对CEA蛋白的纳米抗体的淘选 |
| 2.3.4 CEA纳米抗体的鉴定 |
| 2.3.5 CEA纳米抗体的原核表达及纯化 |
| 2.3.6 Biacore测定CEA纳米抗体亲和常数 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 CEA免疫纳米抗体的建库 |
| 2.4.2 针对CEA蛋白的噬菌体展示库淘选结果 |
| 2.4.3 细胞ELISA鉴定 |
| 2.4.4 CEA纳米抗体表达纯化结果 |
| 2.4.5 CEA纳米抗体亲和力测定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 PET28A-11C12/PE40的构建和融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细菌菌株 |
| 3.2.2 质粒载体 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 引物设计 |
| 3.2.6 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pET28a-11C12/PE40重组质粒的构建 |
| 3.3.2 pET28a-11C12/PE40重组质粒的转化 |
| 3.3.3 pET28a-11C12/PE40重组质粒的鉴定 |
| 3.3.4 11C12/PE40融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.5 11C12/PE40融合蛋白表达和纯化 |
| 3.3.6 Western blot鉴定融合蛋白11C12/PE40中的11C12和PE40 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 |
| 3.4.2 pET28a-11C12/PE40质粒及其双酶切验证结果 |
| 3.4.3 重组表达质粒pET28a-11C12/PE40测序结果 |
| 3.4.4 重组质粒pET28a-11C12/PE40的诱导表达 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 PET28A-11C12/PE40/2F2的构建和融合蛋白的表达与纯化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细菌菌株 |
| 4.2.2 质粒载体 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.2.5 引物设计 |
| 4.2.6 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 pET28a-11C12/PE40/2F2融合免疫毒素载体的构建 |
| 4.3.2 融合免疫毒素连接产物的转化 |
| 4.3.3 重组pET28a-11C12/PE40/2F2表达载体的鉴定 |
| 4.3.4 保护性免疫毒素的分离纯化及westernblot鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 11C12/PE40、2F2PCR扩增结果 |
| 4.4.2 pET28a-11C12/PE40/2F2质粒及其酶切验证结果 |
| 4.4.3 重组表达质粒pET28a-11C12/PE40/2F2测序结果 |
| 4.4.4 保护性免疫毒素的鉴定及分离纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 11C12/PE40和11C12/PE40/2F2的细胞毒性实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 主要溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 SW480和LoVo细胞中基质金属蛋白酶2和9活性比色法定量检测 |
| 5.3.2 SW480和LoVo细胞间接免疫荧光检测 |
| 5.3.3 两种重组免疫毒素对人结直肠癌细胞系SW480和LoVo的活性检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 SW480和LoVo细胞中MMP2/MMP9的检测 |
| 5.4.2 SW480和LoVo细胞免疫荧光检测 |
| 5.4.3 11C12/PE40和11C12/PE40/2F2对SW480和LoVo细胞的MTT实验 |
| 5.5 讨论 |
| 结论和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（3）基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.前言 |
| 2.类弹性蛋白 |
| 2.1 ELPs单聚体 |
| 2.2 ELPs胶束 |
| 2.3 ELPs的热靶向 |
| 2.4 ELPs凝胶 |
| 3.纳米抗体 |
| 3.1 纳米抗体与癌症治疗 |
| 3.1.1 纳米抗体直接用作拮抗剂 |
| 3.1.2 纳米抗体与活性分子连接 |
| 3.1.3 纳米抗体修饰的药物传输体系 |
| 3.2 纳米抗体与体内医学成像 |
| 4.其他靶向配体 |
| 5.现存的蛋白纳米药物传输体系存在的问题 |
| 6.本论文的主要内容及创新点 |
| 6.1 本论文的主要内容 |
| 6.2 本论文的创新之处 |
| 参考文献 |
| 第二章 含苯硼酸的类弹性蛋白纳米粒子药物传输系统 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料、细胞系以及动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 基因编码合成ELP |
| 2.3.1 含ELP基因的重组质粒构建 |
| 2.3.2 ELP的表达纯化 |
| 2.4 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.4.1 N-3-丙烯酰胺氨基苯硼酸(APBA)的合成 |
| 2.4.2 ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 2.5 载药量和包封效率 |
| 2.6 药物的体外释放 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的纳米粒子的制备 |
| 2.8 体外细胞毒性 |
| 2.9 体外细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 活体近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤效果 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 ELP和ELP-PAPBA纳米粒子的合成 |
| 3.2 体外药物释放 |
| 3.3 细胞毒性和细胞摄取 |
| 3.4 在SH-SY5Y 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 联合使用双靶向融合蛋白增强阿霉素的抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 蛋白表达与纯化 |
| 2.5 蛋白性质表征 |
| 2.6 癌细胞的EGFR表达量分析 |
| 2.7 FITC和NIR-797标记的蛋白质的制备 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 3D细胞中的渗透 |
| 2.11 实时近红外成像 |
| 2.12 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.13 体内分布 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 三种蛋白质的表征 |
| 3.2 细胞毒性实验 |
| 3.3 细胞摄取实验 |
| 3.4 3D细胞中的渗透 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 双靶向融合蛋白大分子药物的合成及其抗肿瘤效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 实验材料以细胞、动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 重组质粒构建与蛋白表达 |
| 2.4 腙键DOX的合成 |
| 2.4.1 2-羧乙基2'-吡啶基二硫化物的合成 |
| 2.4.2 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼基甲酸叔丁酯的合成 |
| 2.4.3 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼的合成 |
| 2.4.4 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼阿霉素的合成 |
| 2.5 双靶向融合蛋白大分子药物的合成 |
| 2.6 双靶向融合蛋白大分子药物的表征 |
| 2.7 药物的体外释放 |
| 2.8 细胞毒性实验 |
| 2.9 细胞摄取 |
| 2.10 实时近红外成像 |
| 2.11 肿瘤组织中的渗透 |
| 2.12 体内分布 |
| 2.13 最大耐受剂量 |
| 2.14 体内抗肿瘤 |
| 3.结果与讨论 |
| 3.1 双靶向融合蛋白大分子药物的合成与表征 |
| 3.2 药物的体外释放 |
| 3.3 细胞毒性实验 |
| 3.4 细胞摄取 |
| 3.5 实时近红外成像 |
| 3.6 肿瘤组织的渗透 |
| 3.7 体内分布 |
| 3.8 最大耐受剂量 |
| 3.9 体内抗肿瘤效果 |
| 4.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 今后的工作及展望 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（4）重组免疫毒素rE/CUS的制备及体外抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表Abbreviations |
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 前言 |
| 第一部分 重组免疫毒素rE/CUS的制备 |
| 一、材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1.载体和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 目的片段(AB3349)扩增 |
| 2.2 DNA电泳与目的片段回收 |
| 2.3 PCR纯化产物与载体酶切 |
| 2.4 目的片段与载体的链接 |
| 2.5 重组质粒pET-32a-rE/CUS的转化 |
| 2.6 重组质粒pET-32a-rE/CUS DNA 的提取 |
| 2.7 重组质粒pET-32a-rE/CUS 的鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.9 重组蛋白的纯化 |
| 2.10 重组蛋白的鉴定 |
| 二、结果 |
| 1.重组免疫毒素rE/CUS融合基因的构建图 |
| 2.CUS、7D12基因的扩增 |
| 3.重组质粒 pET-32a-rE/CUS 的鉴定 |
| 4.重组蛋白rE/CUS的表达和纯化 |
| 5.重组蛋白rE/CUS的鉴定 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 重组免疫毒素rE/CUS的体外抗肿瘤作用研究 |
| 一、材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞的培养 |
| 2.2 各肿瘤细胞株EGFR表达量的检测 |
| 2.3 重组免疫毒素rE/CUS的结合活性检测 |
| 2.4 rE/CUS对肿瘤细胞的体外杀伤作用研究 |
| 2.5 rE/CUS诱导细胞凋亡的检测 |
| 2.6 Western blot 法检测 r E/CUS 对 Hep G2 细胞 PI3K、Akt、m TOR、P70S6K 、 Bax 、 Bcl-2 、 Caspase 9 、 cleaved-caspase 9 、cleaved-caspase 3 蛋白表达水平的影响 |
| 2.7 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.各细胞株EGFR表达量的检测 |
| 2.重组免疫毒素rE/CUS的结合活性检测 |
| 3.rE/CUS对肿瘤细胞的体外杀伤作用研究 |
| 3.1 检测rE/CUS体外对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用 |
| 3.2 检测rE/CUS体外对人非小细胞肺癌细胞A549的增殖抑制作用 |
| 3.3 检测rE/CUS体外对人大肠癌细胞SW116的增殖抑制作用 |
| 3.4 检测rE/CUS体外对人结肠癌细胞SW620的增殖抑制作用 |
| 4.rE/CUS诱导细胞凋亡的检测 |
| 4.1 rE/CUS对非小细胞肺癌细胞A549凋亡的影响 |
| 4.2 rE/CUS对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响 |
| 5.Western blot法检测rE/CUS对HepG2细胞PI3K、AKT、mTOR、P70S6K、Bax、Bcl-2、Caspase 9 和cleaved-caspase 3 蛋白表达水平的影响 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HER2阳性肿瘤及其靶向治疗 |
| 二、抗体药物的免疫原性 |
| 第一部分 单链抗体e23s Fv的人源化基因构建及噬菌体筛选 |
| 第二部分 人源化单链抗体的原核表达、纯化和功能分析 |
| 第三部分 人源化单链抗体P1h2、P1h3在HER2靶向肿瘤杀伤中的应用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 黑色素瘤研究进展 |
| 1.1 我国黑色素瘤发生情况 |
| 1.2 恶性黑色素瘤的转移途径及发生机制 |
| 1.3 黑色素瘤的治疗 |
| 1.4 免疫毒素用于黑色素瘤治疗的展望 |
| 第2章 免疫毒素的研究进展 |
| 2.1 免疫毒素的概念及策略 |
| 2.2 免疫毒素的研究历程 |
| 2.3 重组免疫毒素靶向分子的选择 |
| 2.4 重组免疫毒素毒素配体的设计及作用机制 |
| 2.5 重组免疫毒素在肿瘤治疗中的研究 |
| 2.6 重组免疫毒素治疗实体瘤的研究进展 |
| 2.7 重组免疫毒素研发及应用的瓶颈 |
| 第3章 PE 类重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.1 PE 的结构与功能 |
| 3.2 PE 的细胞毒性机制 |
| 3.3 PE 衍生物 |
| 3.4 PE 衍生物基因重组免疫毒素的研究进展 |
| 3.5 PE 类毒素在肿瘤导向中的应用 |
| 第4章 促黑色素细胞激素及其受体研究进展 |
| 4.1 促黑色素细胞激素及其受体 |
| 4.2 以促黑色素细胞激素为靶向载体的重组毒素的研究进展 |
| 4.3 促黑色素细胞激素及其受体在人类疾病中的作用 |
| 4.4 促黑色素细胞激素为导向的研究策略 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 MSH-PE38KDEL 在巨大芽孢杆菌中的表达及活性测定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 MSH-PE38KDEL 在大肠杆菌中的表达及活性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 MSH-PE38KDEL 的表达、纯化及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 MSH-PE38KDEL 对黑色素瘤细胞生长的抑制作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 MSH-PE38KDEL 对鼠黑色素瘤模型的治疗试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果 |
| 致谢 |
（7）重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 免疫毒素在血液瘤治疗中的应用 |
| 1.1 免疫毒素 |
| 1.2 细菌毒素的作用机制 |
| 1.3 以截短的细菌毒素片段制备免疫毒素 |
| 1.4 免疫毒素的生产及临床试验 |
| 1.5 靶向血液瘤免疫毒素面临的困难及机遇 |
| 第2章 绿脓杆菌外毒素 A：从致病因子到抗癌药物 |
| 2.1 绿脓杆菌外毒素 A |
| 2.2 PE 为基础的免疫毒素 |
| 2.3 面临的问题 |
| 2.4 今后发展方向 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 以胃泌素为靶向的治疗药物 |
| 3.1 胃泌素结构及其功能 |
| 3.2 胃泌素受体类型与分布 |
| 3.3 胃泌素靶向 CCK2R |
| 3.4 胃泌素在胃酸分泌中的作用 |
| 3.5 CCK2R 拮抗剂在治疗酸分泌失调中的作用 |
| 3.6 胃泌素在癌症中的作用 |
| 3.7 CCK2R 拮抗剂在胰腺癌治疗中的作用 |
| 3.8 结论 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组免疫毒素 rG17PE38 原核表达载体的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 高效表达 rG17PE38 重组菌株的建立及发酵条件优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 醇洗脱型PE38单克隆抗体制备及rG17PE38重组免疫毒素纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 rG17PE38 重组免疫毒素的细胞靶向分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）免疫毒素EGF-TCSredlk的制备及其抗肿瘤疗效评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫毒素EGF-TCSredlk的构建、表达及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 EGF-TCSredlk表达质粒的构建 |
| 1.3 EGF-TCSredlk的诱导表达及鉴定 |
| 1.4 重组蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGF-TCSredlk的PCR结果 |
| 2.2 pQE30/EGF-TCSredlk表达载体的鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的纯化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 免疫毒素EGF-TCSredlk对肿瘤细胞的体外靶向杀伤作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 细胞株及细胞培养 |
| 1.5 EGF-TCSredlk对肿瘤细胞生长抑制实验 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 免疫毒素EGF-TCSredlk治疗实体肿瘤的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 荷胃癌裸鼠动物模型的建立 |
| 1.5 分组及给药 |
| 1.6 小鼠体内抑瘤实验 |
| 1.7 肿瘤的病理变化观察 |
| 1.8 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGF-TCSredlk对荷人胃癌小鼠体内抑瘤实验结果 |
| 2.2 肿瘤组织病理变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士后期间主要成果 |
| 致谢 |
（9）绿脓杆菌外毒素A的最新研究进展（论文提纲范文）
| 1 PEA的基础研究概述 |
| 1.1 PEA的结构和功能 |
| 1.2 PEA的产生、分离、纯化和鉴定 |
| 1.2.1 PEA的培养方法 |
| 1.2.2 PEA的分离、纯化和鉴定 |
| 2 PEA重组毒素的研究进展 |
| 2.1 对抗体的研究 |
| 2.2 对毒素的研究 |
| 2.3 存在的问题及前景展望 |
| 3 绿脓杆菌疫苗的研究进展 |
| 3.1 传统绿脓杆菌疫苗的研究 |
| 3.1.1 内毒素蛋白多价疫苗 |
| 3.1.2 超免疫血浆的研究 |
| 3.1.3 脂多糖疫苗的研究 |
| 3.2 绿脓杆菌多联疫苗的研究 |
| 3.3 基因工程疫苗的研究 |
| 3.3.1 PEA毒性的消除方法 |
| 3.3.2 重组融合蛋白疫苗 |
| 3.3.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.4 PA-MSHA菌毛株疫苗 |
| 4 PEA的应用 |
| 4.1 在菌种鉴定和检测方面的应用 |
| 4.2 在动物生育调控方面的应用 |
| 4.3 在癌症治疗上的应用 |
| 4.3.1 PEA细胞毒作用在癌症治疗上的应用 |
| 4.3.2 PEA作为蛋白质携带载体在癌症治疗上的应用 |
| 4.3.3 PEA的超抗原特性在治疗癌症上的应用 |
| 5 PEA研究展望 |
（10）HIV-Ⅰ TAT和PEA-Ⅱ转膜效率的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 LTA和LPA融合蛋白基因原核表达纯化及转膜效率的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 LTA-GFP和LPA-GFP基因表达原核载体的构建表达及转膜效率的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、TGF-α与绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及对肿瘤细胞的杀伤作用（论文参考文献）
- [1]新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究[D]. 王静. 上海交通大学, 2019(06)
- [2]大肠癌靶向的融合免疫毒素的研究[D]. 郭万美. 长春理工大学, 2018(01)
- [3]基于类弹性蛋白的纳米药物传输体系的设计及生物性能研究[D]. 陈伟芝. 南京大学, 2017(01)
- [4]重组免疫毒素rE/CUS的制备及体外抗肿瘤作用研究[D]. 邓翠敏. 福建医科大学, 2017(07)
- [5]单链抗体e23sFv的人源化抗体制备及其在HER2靶向肿瘤杀伤中的功能鉴定[D]. 欧阳清. 第四军医大学, 2017(02)
- [6]靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应[D]. 惠琦. 吉林大学, 2014(09)
- [7]重组毒素rG17PE38的表达、纯化及胃癌杀伤作用研究[D]. 宋杰. 吉林大学, 2013(08)
- [8]免疫毒素EGF-TCSredlk的制备及其抗肿瘤疗效评价[D]. 李咏梅. 中国人民解放军医学院, 2012(01)
- [9]绿脓杆菌外毒素A的最新研究进展[J]. 夏海华,于冲,曲晓军,孙建华,王金英. 生物技术, 2012(02)
- [10]HIV-Ⅰ TAT和PEA-Ⅱ转膜效率的研究[D]. 张慧瑛. 吉林大学, 2008(11)