一、Bak基因诱导P27~(KIP1)基因的过表达使HCC-9204细胞在G_1期停滞（论文文献综述）
叶冬雪[1]（2020）在《人肝细胞癌组织Mina53的表达及影响增殖、侵袭转移的体外实验研究》文中指出目的检测Mina53在肝细胞癌及相应癌旁非瘤组织中的表达差异,分析肝细胞癌中Mina53表达与肝细胞癌患者临床病理特征和生存预后的关系;检测Mina53在肝癌细胞系中的表达及其对细胞增殖、细胞周期及凋亡、迁移和侵袭能力的影响,初步探讨Mina53影响肝细胞癌生长和浸润转移的分子机制。方法应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）分别检测Mina53在18对新鲜肝细胞癌及相应癌旁非瘤组织中mRNA及蛋白质水平的表达;应用组织芯片及免疫组化方法检测284例肝细胞癌及相应癌旁非瘤组织中Mina53的表达同时分析其与临床病理特征和患者预后的关系;Western blot检测肝癌细胞系中Mina53的表达,瞬时转染过表达质粒至肝癌细胞系HCCLM3和QGY-7703,同时将小干扰RNA（siRNA）瞬转至肝癌细胞系Huh7,采用MTT、克隆形成实验、Transwell小室、划痕实验检测Mina53对肝癌细胞增殖活性、克隆形成能力和侵袭转移能力的影响,流式细胞术检测Mina53对细胞周期进展及细胞凋亡率的影响,光学显微镜下观察肝癌细胞形态的变化,Western blot检测PCNA、cyclinD1、cyclinE1、pRB、ppRB、E2F1、p21、pro caspase3、caspase3、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9的表达变化。结果qRT-PCR、Western blot结果显示,18对新鲜肝细胞癌组织中Mina53 m RNA和蛋白质的表达水平高于其相应癌旁非瘤组织（t=3.100,P=0.007;t=10.616,P<0.001）;免疫组化结果显示,Mina53在肝细胞癌中252例（88.73%）呈阳性表达,而相应癌旁非瘤组织中有37例（13.03%）阳性表达,Mina53表达差异具有统计意义（z=-18.739,P<0.001）;肝细胞癌中Mina53的表达水平与肿瘤大小（χ2=5.474,P=0.019）、脉管侵犯（χ2=8.965,P=0.003）、病理分级（χ2=12.006,P=0.002）、TNM分期（χ2=16.686,P<0.001）均有关,生存分析表明,Mina53高表达的肝细胞癌患者术后三年总体生存期（P=0.011）和无病生存期（P<0.001）较低表达者更短;在肿瘤大小（>5cm）及脉管侵犯的肝细胞癌患者中,Mina53高表达者的三年无病生存期均较低表达者更短（P<0.001;P=0.002）;Mina53阳性表达患者中,Mina53高表达者的三年总体生存期及无病生存期均较低表达者更短（P=0.002,P<0.001）;术后满五年的患者中,Mina53高表达者的五年总体生存期（P=0.048）和无病生存期（P<0.001）较低表达者更短。Cox回归模型分析结果发现,肝细胞癌中Mina53高表达及肿瘤多发是患者生存预后的独立危险因素（P<0.05）;过表达Mina53可以增强HCCLM3和QGY-7703细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）,流式细胞术发现Mina53过表达降低了G0/G1期细胞比例,增加了S期细胞比例,同时降低细胞凋亡率（P<0.05）;敲降Mina53减弱了Huh7细胞的增殖和侵袭迁移能力（P<0.05）,流式细胞术发现敲降Mina53增加了G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例,同时增加细胞凋亡率（P<0.05）;在肝癌细胞系中,过表达Mina53可上调PCNA、cyclinD1、cyclinE1、ppRB、E2F1、MMP2和MMP9的表达,抑制p21和caspase3的表达（P<0.05）;敲降Mina53可抑制PCNA、cyclinD1、cyclinE1、ppRB、E2F1、MMP2、MMP9的表达,而使p21、caspase3表达增加（P<0.05）,但Mina53对体外培养的肝癌细胞形态及pRB、pro caspase3、E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达无明显影响（P>0.05）。结论Mina53可能参与肝细胞癌的发生及演进过程,并且其与肝细胞癌患者的术后生存期有关,可作为判断肝细胞癌患者预后的潜在分子标志物;Mina53可能通过ppRB/E2F1信号通路调控细胞G1/S期转化进而改变肝癌细胞的增殖活性;肝细胞癌中,Mina53对细胞侵袭转移生物学行为的影响可能通过调控MMP2、MMP9的表达来完成,而与上皮间质转化无明显关系。
严晓波[2]（2018）在《p53在重组azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中的机制研究》文中提出前言:骨肉瘤（osteosarcoma）是青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤之一,预后较差。目前临床上对骨肉瘤的治疗主要采用手术+化疗等综合治疗,使得患者的五年生存率较以前得到显着的提高。但是大剂量化疗带来的严重副反应以及多药耐药等问题使得骨肉瘤的治疗进展收到限制。azurin就是近年发现的一种很有前途的抗肿瘤生物蛋白之一。近期的研究证实azurin在体外和荷瘤裸鼠体内可选择性的诱导某些黑色素瘤和人乳腺癌等肿瘤细胞凋亡,同时发现azurin在体内诱导肿瘤细胞凋亡时,对机体无毒副作用。针对骨肉瘤容易产生化疗耐药的特点,我们使用细菌氧化还原蛋白azurin处理骨肉瘤细胞U20S后发现其具有明显诱导细胞凋亡的作用。而azurin的合成价格昂贵,我们通过基因工程的方式制备了表达azurin细菌株,通过摸索表达条件,达到最优化效果。并利用重组的azurin蛋白,证实了其诱导凋亡的活性,并探索p53基因在骨肉瘤细胞中对azurin诱导的凋亡有何影响。研究目的:1.我们通过基因重组的方式将azurin的cDNA插入DH5α菌株,并证实其表达azurin蛋白。通过探索不同的细菌表达条件,摸索最佳条件已使其表达最大化。2.p53在azurin诱导的凋亡过程中具有重要的功能,我们尝试使用具有不同p53基因的骨肉瘤细胞株来研究野生型和突变型p53是否影响azurin的抗肿瘤效果。3.通过使用基因干扰技术,更准确高效的探索p53基因与azurin之间是如何作用来产生抗肿瘤效果的。研究方法:1.我们使用已有的pqe30/azurin质粒,该质粒中含有azurin的cDNA,通过pGEM T质粒转染系统将其转染进入DH5 α菌株。通过改变细菌孵育的温度、时间以及诱导剂ITPG的浓度,探索最佳的表达条件;2.我们使用含有野生型p53的U20S细胞株以及含有突变型p53的MG-63细胞株来研究azurin对不同p53基因细胞的影响。我们通过使用已知作用浓度的azurin分别作用这两个细胞株不同时间,通过MTT来检测细胞存活,通过显微镜观察细胞形态,通过电子显微镜观察细胞超微结构变化,通过流式细胞仪检测细胞周期改变,通过RT-PCR检测凋亡相关基因表达以及通过western blot检测凋亡蛋白的表达水平。以此来研究不同p53表达水平下azurin作用的变化;3.我们选择具有野生型p53的U20S细胞株,使用构建的p53 siRNA来干扰细胞内p53的表达,再次使用azurin作用细胞,检测细胞周期,细胞形态,凋亡相关蛋白等表达,来定位azurin的作用靶点。研究结果:1.当外界条件不变时,使用pqe30/azurin质粒转染的DH5α菌株在37摄氏度,0.8ug/ml的ITPG作用5小时后表达效率最高;2.由于MG-63细胞株为p53突变型,而U20S为野生型,因此在azurin作用后两种有明显差异。Azurin可以显着诱导U20S发生凋亡,其凋亡相关的细胞形态,超微结构变化均被观察到,同时细胞周期发生明显变化,凋亡相关蛋白水平明显上升,特别是与p53相关的Bax和Bcl-2的变化最为显着。而在MG-63细胞中这些变化均不明显。说明,p53可能在azurin诱导骨肉瘤细胞凋亡中是有重要作用的。但是,由于azurin是一种蛋白分子,其在细胞内的作用较为复杂,因此需要更精确的研究来证实。于是,我们再一次设计实验。3.我们通过使用p53 siRNA+azurin处理U20S细胞,由于p53 siRNA能且只能抑制p53基因的表达,我们发现此时使用azurin处理后更多的细胞存活,较低的凋亡率,caspase-3活性、Bcl-2的上调程度、Bax的下调程度均低于对照组,即未使用p53 siRNA抑制组。在TUNEL检测中,p53 siRNA+azurin处理后的细胞阳性率低于对照组。说明p53 siRNA可以抑制由azurin引起的凋亡。由于使用p53 siRNA为瞬时转染技术,随着时间的推移,其功能会出现下降。因此我们观察到在作用72小时后,再次出现凋亡相关的反应。说明,azurin是和p53结合后才能发挥作用,它可以直接作用于上游而引发下游各相关产物的变化。研究还发现p53的调控细胞周期中可能出现类似癌基因的作用,而azurin的结合可以逆转这一功能。结论:本研究通过使用RNA干扰技术精确的将azurin的作用靶点定位于p53基因,证实了其确实通过与p53结合产生作用,解释了 azurin在一些细胞株上诱导凋亡作用较弱的原因,并发现p53在野生型细胞株中类似癌基因的作用,为进一步探索肿瘤的发生及基因治疗开拓道路。
魏守海[3]（2017）在《胰岛素和葡萄糖在鹅肝细胞增殖中的调控作用及其机理研究》文中提出鹅肥肝是一种高档营养食品,具有很高的经济价值。在农业生产中,采用填饲富含碳水化合物的高能饲料生产鹅肥肝,伴随着血清胰岛素和葡萄糖浓度的升高,肝脏体积和重量增加5～10倍,肝细胞发生脂肪变性,但仍保持其生理功能。现有研究表明胰岛素和葡萄糖在细胞增殖中发挥了重要作用,因此在鹅肝脂肪变性过程中可能伴随着肝细胞的增殖。为探索胰岛素、葡萄糖对鹅肝细胞增殖的影响及调控机制,将同一天孵化的健康雄性天府肉鹅和钢鹅各80只群养至13周龄,天府肉鹅和钢鹅各60只用于填肥,作为试验组,另外20只作为对照组。其中填肥组经7天预填肥和21天正式填肥,对照组则按正常方式饲养。所有动物在17周龄时采血,并屠宰采集相关组织样品,以研究填肥对鹅生长性能,血清胰岛素、葡萄糖和甘油三酯（TG）浓度,以及与细胞增殖相关基因的mRNA表达水平的影响;同时,通过分离培养天府肉鹅原代肝细胞,采用实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA等技术,研究胰岛素、葡萄糖、PI3K-Akt-mTOR信号通路、转录因子FoxO1和Sirt1对鹅肝细胞增殖的影响,以揭示胰岛素、葡萄糖对鹅肝细胞增殖的调控机制,并阐明碳水化合物诱导鹅肥肝形成的机理,为解析鹅肝脂肪变性提供新思路。此外,作为肝脂肪变性模型,鹅肥肝为脂肪肝等疾病的预防与治疗提供可借鉴的研究“载体”,具有重要的科学价值和实践意义。取得的主要结果如下:1、与对照组相比,填肥21天后,天府肉鹅和钢鹅体重、肝脏重、腿肌重、腹脂重、皮脂重显着增加;血清胰岛素、葡萄糖和TG浓度均显着升高;天府肉鹅肝脏中PI3K、Akt1基因的表达量显着高于腿肌和胸肌中的表达量,而钢鹅肝脏中Akt1、mTOR基因的表达量显着高于腿肌和胸肌中的表达量,rictor、raptor、S6K在天府肉鹅肝脏中的表达量增加显着,而在钢鹅肝脏中的表达量增加不显着;天府肉鹅和钢鹅肝脏中Fox01、Sirt1基因表达量显着降低,而CyclinD1/D2/D3基因表达量显着增加。填肥后天府肉鹅和钢鹅肝脏、胸肌、腿肌中CyclinD1蛋白含量显着增加。2、胰岛素刺激细胞周期启动因子CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平,抑制p21、p27的基因表达和蛋白表达水平。同时,胰岛素刺激涉及PI3K-Akt-mTOR信号通路的基因表达和蛋白表达水平。LY294002、Rapamycin、NVPBEZ235三种PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂降低CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平,增加p21、p27的基因表达和蛋白表达水平,胰岛素能够在一定程度上逆转上述三种抑制剂的抑制作用。浓度为5 mmol/L或35 mmol/L葡萄糖均能促进鹅原代肝细胞增殖,激活PI3K-Akt-mTOR信号通路。三种PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂均显着降低葡萄糖诱导的鹅原代肝细胞增殖的作用。葡萄糖或胰岛素单一处理、与葡萄糖和胰岛素共同处理均显着增加鹅原代肝细胞的DNA合成率及其CyclinD1/D2/D3的基因表达和蛋白表达水平。3、干扰质粒（miRNA-FoxO1）抑制FoxO1后,导致鹅原代肝细胞的DNA合成率及其CyclinD1/D2/D3的基因表达水平显着增加,p21、p27的基因表达水平显着降低;miRNA-FoxO1使CyclinD1的蛋白表达水平增加。胰岛素、miRNA-FoxO1及二者共同处理均使鹅原代肝细胞增殖增加;PI3K-Akt-mTOR信号通路的双重抑制剂NVP-BZE235减弱了 miRNA-FoxO1对鹅原代肝细胞增殖的刺激作用。4、作为Sirt1的抑制剂,维生素PP使鹅原代肝细胞DNA合成率、BrdU阳性细胞率、增殖指数（PI）及CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而FoxO1的基因和蛋白表达水平下降;miRNA-FoxO1使鹅原代肝细胞增殖增强,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加,而Sirt1的基因和蛋白表达水平降低;维生素PP和miRNA-FoxO1共同处理使鹅原代肝细胞增殖增强,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而FoxO1和Sirt1的基因表达和蛋白表达水平均降低;维生素PP或胰岛素单一处理,以及二者共同处理均能刺激鹅原代肝细胞增殖,CyclinD1/D2/D3的基因和蛋白表达水平增加;而p21的基因表达和蛋白表达水平降低;PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂（LY294002、Rapamycin、NVP-BEZ235）均能减弱维生素PP诱导的鹅原代肝细胞的增殖。综上所述,在鹅肥肝中存在肝细胞的增殖;填肥、胰岛素、葡萄糖均可影响PI3K-Akt-mTOR信号通路,诱导细胞周期正调控因子CyclinD1/D2/D3的mRNA表达和蛋白表达,抑制细胞周期负调控因子p21、p27的mRNA表达和蛋白表达,促进鹅肝细胞增殖;FoxO1、Sirt1在鹅肝细胞增殖中起抑制作用。鹅肝细胞增殖可能是应对肝细胞脂肪变性,保持肝细胞正常生理功能的需要。
徐维果[4]（2013）在《化疗药物在p53缺陷型肿瘤细胞中对p21启动子激活机制的研究》文中指出恶性肿瘤,又称癌症,已成为严重危害人类生命健康的疾病之一,全球因癌症而死亡的人数呈逐年上升的趋势。多年来，肿瘤治疗一直是生命科学领域关注的重点。癌症从本质上来说是一种细胞增殖性疾病，因此控制细胞生长，抑制细胞增殖是治疗癌症的有效手段。正常细胞在转化成为癌细胞时，会在细胞生长周期上出现一系列的改变，而这些改变是造成细胞恶性增殖的直接原因。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinaseinhibitors, CKIs）是对细胞生长周期有重要负调节作用的蛋白因子，主要分为两大类：INK4家族和CIP/KIP家族。而p21WAF1/CIP1（p21）是后者的主要成员之一。作为最早被发现的CKI基因，其生物学作用及调控机制得到了广泛深入的研究。p21主要通过抑制细胞周期蛋白与相应激酶结合形成复合物，从而诱导细胞周期停滞,起到抑制细胞增殖的功能。同时，p21还与细胞分化、衰老、凋亡有重要关系，是细胞外各种生长分化信号作用的靶标，因此在细胞信号传递网络中具有中心节点的作用。大量研究发现，p21是一个潜在的肿瘤抑制基因，但它在生物体内高度保守，很少发生突变。p21在癌细胞中的主要变化是表达量的变化。p21在细胞内的表达水平往往是通过p53依赖型及p53非依赖型两种机制，从转录水平来调控的。许多治疗肿瘤的化学药物能够通过不同的方式上调p21表达，实现抑制肿瘤细胞生长的效果。研究发现，半数以上的人类肿瘤是p53功能缺陷或缺失的，在p53基因突变或缺失的肿瘤细胞中，p21的表达量相对较低，这类细胞中p21转录激活主要是通过p53非依赖型途径实现的。而基因的转录效率与启动子活性直接相关，因此对p21启动子的研究成为关注的重点。我们选取了卵巢癌细胞系SKOV3作为实验对象。该细胞系是p53基因缺陷型细胞，恶性程度较高，且对多种化学药物具有耐受性。为了研究化疗药物抑制肿瘤细胞生长的效果与p21表达量之间的关系，我们构建了p21启动子-荧光素酶报告基因系统，对常用化学药物进行了筛选检测，发现铂类化合物奥沙利铂（oxaliplatin, Oxa）具有明显的激活p21启动子，诱导p21表达，使细胞停滞在S期的作用，而其他化疗药物没有这一效果。说明奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制作用与其诱导p21表达具有正相关性。同时在动物水平也证明了奥沙利铂对SKOV3细胞移植肿瘤的抑制效果，而其他化学药物则没有显着作用。为了阐明奥沙利铂是通过启动子上哪种功能元件以及怎样的方式来激活p21启动子的，我们首先对该基因启动子进行了一系列突变，构建了10个不同的突变体。通过启动子-荧光素酶报告基因系统对这些突变体分析检测，将奥沙利铂的应答元件定位在了p21启动子转录起始点上游-216至-236bp之间的碱基序列。同时我们运用生物信息学数据库分析了转录起始点上游-1至-500bp的序列保守性，发现在这500个碱基的DNA片段上，存在一个此前未被报道过的，脊椎动物中序列高度保守的片段，其所在位置是-219至-237bp，恰好与奥沙利铂应答元件的序列重合。说明这一药物应答保守序列在p21启动子的转录调控方面可能具有关键作用。为了研究转录调控机制，我们用电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）检测了DNA-蛋白质体外结合的情况。针对奥沙利铂应答元件保守序列设计并合成了生物素标记和未标记的寡核苷酸探针，命名F3（wt-213/-242），同时也根据该序列上游相邻位置的DNA序列合成了另外两个寡核苷酸探针F1（-323/-352）和F2（-275/-306），用以和核蛋白提取物孵育反应。这些探针中只有F3能够与细胞核提取物中的蛋白结合，与药物处理与否无关，进一步证实了该区域的重要性。当我们用抗体对蛋白进行鉴定后，确定了该序列是转录因子Sp1/Sp3的结合位点，且Sp1/Sp3所结合的DNA序列恰好形成回文结构。通过对药物处理前后细胞内Sp1/Sp3蛋白量、细胞定位及蛋白磷酸化修饰的检测，发现药物处理的细胞Sp1/Sp3的蛋白量及胞内定位并没有改变，但是Sp1蛋白的磷酸化明显增多，而且Sp1/Sp3与DNA的结合更加紧密。推测奥沙利铂可能通过磷酸化修饰Sp1，进而改变Sp1/Sp3的结合活性而调控p21启动子。对p21全长启动子的分析结果显示，这一新发现的Sp1/Sp3结合位点与p21启动子上6个经典的Sp1/Sp3结合位点不同，它是唯一的具有高度保守性的元件。最后我们对F3在细胞内的生物学作用进行了初步研究。通过F3片段与p21启动子-荧光素酶报告基因（pFL-Luc）共转染SKOV3，F3与启动子上Sp1/Sp3回文序列进行竞争。发现在没有药物处理的情况下，转染F3片段能够激活p21启动子，得到与奥沙利铂处理细胞后类似的结果。通过免疫荧光证实p21启动子活化促进了p21蛋白表达。我们推测，在正常情况下，Sp1/Sp3结合在奥沙利铂应答保守元件上，并且募集其他转录抑制因子/辅因子与之结合，形成抑制转录的蛋白复合物，维持p21在正常细胞内的基础表达水平，维持细胞正常生长繁殖，当细胞受到DNA损伤物质刺激时，Sp1磷酸化，该保守元件上的转录抑制因子/辅因子脱落，原有的抑制功能丧失，使得p21启动子活化，从而促进蛋白表达。因此这段序列在奥沙利铂诱导p21的过程中起到了类似“开关”的作用。综上所述，我们首次报道了p21启动子上存在一个高度保守的、能与Sp1/Sp3结合的抑制性功能元件，是维持p21基础表达水平所必需的，并且在奥沙利铂诱导的启动子去抑制调控中具有重要作用。提示我们运用这一保守元件作为筛选诱导p21表达的药物可能是抗肿瘤药物筛选的新策略；而且在选择临床化疗药物和研发抗p53缺陷型肿瘤的新药方面具有应用前景。
戴维奇,徐凌,王锋,卫巍,沈杰,黄银实,杨丽娟,何姗姗,郭传勇[5]（2012）在《白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制》文中进行了进一步梳理目的:研究白藜芦醇（resveratrol,Res）对肝癌细胞LM3周期及凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法:分别用50、100、150、200μmol/L浓度的Res作用LM3肝癌细胞24、48和72h,CCK-8测定Res对细胞的增殖作用;分别以相同剂量的DMSO及无处理的LM3细胞为随机和空白对照,观察150μmol/L Res作用72小时后对肿瘤细胞周期及凋亡的影响;Real time-PCR及Western blot分析Res对LM3细胞中Bak和Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响。结果:Res体外能明显抑制肝癌细胞LM3的生长增殖,在一定范围内呈现作用浓度（F=101.183,P<0.001）和时间依赖性（F=192.371,P<0.001）;150μmol/L Res作用72小时后能显着减缓肝癌细胞LM3的周期转换（P<0.001）,并诱导明显的细胞凋亡效应（P<0.001）;进一步的检测发现Res作用LM3细胞后,Bak mRNA（P=0.002,0.007）及蛋白（P=0.004,0.01）表达增强,而Bcl-2 mRNA（P=0.027,0.007）及蛋白（P=0.001,0.001）表达出现显着下降。结论:Res可能通过对Bak及Bcl-2表达的调节来抑制肝癌细胞LM3的增殖,并诱导其细胞凋亡。
倪小兵[6]（2010）在《p21Waf1/Cip1和Skp2在涎腺肿瘤中的表达及意义》文中提出目的:研究细胞周期调控因子p21Waf1/Cip1与S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）在涎腺良恶性肿瘤中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学SABC法检测10例正常涎腺组织、20例涎腺良性肿瘤、33例涎腺恶性肿瘤组织中p21Waf1/Cip1和Skp2的表达情况,分析p21Waf1/Cip1和Skp2的表达与涎腺恶性肿瘤组织临床病理特征之间的关系,以及它们表达之间的相关性。结果:p21Waf1/Cip1在涎腺正常组织以及涎腺良恶性肿瘤的表达率依次降低,各组之间存在显着性差异（Χ2=11.113, p=0.006）。Skp2在涎腺正常组织不表达,在涎腺恶性肿瘤中的阳性表达率（75.76%）明显高于良性肿瘤组织（35.00%）,差异有显着性意义（Χ2=19.128,p=0.001）。p21Waf1/Cip1与涎腺恶性肿瘤的临床病理特征均无关联,而Skp2的表达与淋巴转移有关（p<0.05）。p21Waf1/Cip1与Skp2在涎腺良性肿瘤中的表达呈负相关,但相关性不明显（r=-0.390, p=0.089）;它们在涎腺恶性肿瘤中的表达呈显着性负相关（r=-0.467, p=0.006）。结论:p21Waf1/Cip1低表达以及Skp2高表达与涎腺肿瘤的发生、发展密切相关。Skp2可能通过下调p21Waf1/Cip1蛋白的表达而参与涎腺肿瘤的形成过程。
杨琳[7]（2009）在《SHIP基因在白血病发病机制中作用的研究》文中研究说明背景:白血病是原发于造血系统的恶性肿瘤。近年来,其发病率呈增加趋势。在35岁以下人群中,白血病的死亡率占恶性肿瘤第一位,严重危害中青年人的生命,所以值得特别重视。急性白血病的发生包括了复杂的基因突变、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多种分子生物学水平的异常。尽管许多基因在白血病发病中的作用及其机制已初步明确,但所有的基因异常仍不能解释全部白血病的发生机制,因此,寻找新的白血病相关基因并研究其生物学功能一直是白血病研究领域的热点之一,不仅有助于阐明白血病发生发展的机制,而且可能找到一些治疗靶位点。SHIP基因是继PTEN之后发现的仅在造血细胞表达的一种新的肌醇磷酸酶,其主要功能是降解PIP3成为PI3,4P2而负调控PI3K/Akt路径。本课题组多年来一直围绕SHIP基因功能与白血病发生发展关系开展研究工作,取得了一系列有意义的研究成果。我们首次报道急性白血病患者存在SHIP基因突变,并证实SHIP基因低表达和表达缺失与人白血病细胞恶性增殖密切相关,通过干扰RNA封闭K562细胞的bcr/abl融合基因使SHIP蛋白重新表达并可以逆转细胞的异常增殖表型,近年来也陆续发现和报道了一些白血病细胞中新的SHIP基因突变。这些都提示SHIP基因具有调控白血病细胞增殖、凋亡的结构基础。但是,有关SHIP基因调控白血病细胞系K562的PI3K/Akt信号传导通路的分子机理及其在抑制和/或逆转K562细胞增殖能力中的地位,以及SHIP基因突变对PI3K/Akt的调控有何改变等问题,目前国内外均无报道。本研究的目的是:（1）探讨野生型SHIP基因对人白血病细胞系K562中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平的影响;（2）构建携带突变型SHIP基因的慢病毒载体并转染K562细胞系;（3）探讨SHIP基因突变后在K562细胞中的功能变化,为进一步研究SHIP基因在白血病发病机制中的作用提供实验依据。第一部分野生型SHIP基因对白血病细胞系K562增殖凋亡的实验研究目的探讨肌醇5′磷酸酶基因SHIP对人白血病细胞系K562增殖、凋亡及细胞周期的影响,并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法将携带有野生型SHIP基因和空载体的慢病毒表达载体转染人白血病细胞系K562。MTT检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞转染效率和细胞周期分布;显微镜及透射电镜下观察细胞形态及超微结构改变,TUNEL、Hoechst33342荧光染色、细胞集落形成等实验检测细胞增殖及凋亡情况。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测转染前后SHIP mRNA表达变化, Western Blot检测各转染组SHIP、Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinD1、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白水平变化。Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3、Caspase-9活性。NFκB活性检测试剂盒检测NFκB活性变化。结果1转染48 h后,流式细胞仪检测慢病毒载体转染K562细胞效率为（74.6±5.8）%。FQ-PCR和Western blot显示,转染SHIP基因后K562细胞中SHIP呈高效表达,表明转染成功。2转染野生型SHIP基因的K562细胞表现为增殖受抑,增殖指数减低,克隆形成能力降低,DNA合成减少和凋亡增多,与转染空载体组和未转染组相比有统计学差异（P<0.01）。3野生型SHIP基因过表达导致细胞周期G0/G1期至S期和G2/M期阻滞。转染第5天,K562/wtSHIP细胞的G0/G1期百分数（60.69±8.3）%明显高于不表达SHIP的K562/FIV细胞（37.48±6.78）%和空白对照组（35.5±4.05）%。4转染野生型SHIP基因的K562细胞Akt308和Akt473磷酸化水平（分别为:0.125±0.016,0.351±0.064）明显低于K562/FIV细胞（Akt308:0.323±0.025,Akt473:0.788±0.102）和未转染组（Akt308:0.324±0.023,Akt473:0.801±0.095）（ P<0.01）,后两组间Akt-308和Akt473磷酸化水平均无统计学差异（P>0.05）。5野生型SHIP基因抑制IL-3诱导的K562细胞增殖,发现外源性野生型SHIP蛋白表达组K562细胞p-Akt308和p-Akt473水平增加程度明显低于对照组呈下降趋势,而总Akt表达水平无明显变化;撤除IL-3刺激后,K562/wtSHIP组细胞Akt磷酸化水平快速下降,而转染空载体组细胞Akt磷酸化水平下降缓慢,持续时间较长。6转染野生型SHIP基因的K562细胞能明显增加p27蛋白（0.302±0.059）和p21蛋白（0.335±0.027）表达,而cyclin D1蛋白表达（0.142±0.019）明显降低,转染空载体组的K562细胞p27、p21和cyclin D1蛋白的表达（p27:0.159±0.023;p21:0.188±0.032;cyclin D1:0.221±0.031）与未转染组（p27:0.152±0.022;p21:0.182±0.034;cyclin D1:0.228±0.033）相比无明显改变。7野生型SHIP基因对凋亡相关蛋白表达的影响7.1转染SHIP基因的K562细胞出现caspase-9和caspase-3酶活性增加[caspase-9 : 32.82±5.80 nmol/（h·mg） ; caspase-3 :16.80±1.98nmol/（h·mg）],转染空载体组的K562细胞caspase-9和caspase-3活性[caspase-9: 8.75±2.66nmol/（h·mg）;caspase-3:5.48±1.31nmol/（h·mg）]与未转染组[caspase-9 : 8.22±1.25nmol/（h·mg） ; caspase-3 :5.27±0.58nmol/（h·mg）]相比无显着改变;以上结果表明野生型SHIP基因过表达可激活K562细胞caspase-9和caspase-3。7.2转染野生型SHIP基因能明显下调K562细胞bcl-xL蛋白表达（K562/wtSHIP组:0.109±0.015;K562/FIV组:0.385±0.043;未转染组:0.392±0.049）;显着上调促凋亡蛋白bad表达（K562/wtSHIP组:1.018±0.216;K562/FIV组:0.315±0.052;未转染组:0.304±0.037）;K562/wtSHIP组bax蛋白表达（ 0.348±0.037 ）高于K562/FIV组（0.342±0.043）和未转染组（0.339±0.032）,但三组间无统计学意义（P>0.05）;各组bcl-2表达无显着性差异（P>0.05）。7.3转染野生型SHIP基因下调K562细胞NF-κB表达（K562/wtSHIP:0.483±0.027;K562/FIV组:0.924±0.081;未转染组:0.937±0.075）;各组IκBа表达水平无显着性差异（P>0.05）。K562/wtSHIP组NF-κB的活性随时间延长而降低,K562/FIV组和未转染组细胞无显着性变化。结论过表达野生型SHIP基因明显抑制白血病细胞系K562增殖,促进K562细胞凋亡,其机制可能通过抑制Akt磷酸化,进一步影响其下游与多种凋亡相关分子家族蛋白如Bcl-2家族、Caspase家族表达,并通过调控细胞周期相关蛋白表达使细胞周期阻滞在G0/G1期。第二部分SHIP基因突变体的构建目的急性白血病患者存在SHIP基因突变,可能与白血病发病有关,构建SHIP基因突变体（muSHIPP28L）,为研究突变基因的表达和功能与白血病的发病机制奠定基础。方法以重组表达质粒wtSHIP为模板,用Stratagen Mutant Kit试剂盒通过PCR定点突变技术对SHIP编码序列TTC进行定点突变→CTC,突变体经测序鉴定正确,连接到慢病毒载体Receiver-Lv31（ORF不带标签）。经重组慢病毒包装,病毒滴度测定,感染K562细胞,采用FQ-PCR和Western blot方法检测SHIP mRNA和蛋白表达。结果1构建的突变型SHIPP28L经DNA测序验证,其碱基序列与设计序列完全一致。2感染293T细胞48 h后在荧光显微镜下观察到GFP较强表达。制备的病毒滴度达4.9×106 pfu/ml。3 FCM分析表达GFP绿色荧光的阳性细胞百分率,计算活细胞转染效率。悬浮培养的人白血病细胞系K562细胞转染效率分别为K562/wtSHIP:74.6%,K562/FIV:82.5%,K562/muSHIP:76.3%。4 FQ-PCR和Western blot方法检测转染野生型和突变型SIHP基因的K562细胞中SHIP基因高表达,而K562/FIV组和未转染K562细胞中内源性SHIP基因表达极低,说明外源性野生型和突变型SHIP转染成功。结论运用基因定点突变基因重组技术成功构建了SHIP基因P28L突变体,为进一步探讨SHIP基因与白血病发病机制创造条件。第三部分SHIP基因突变体在白血病细胞系K562细胞中的表达及其功能的研究目的将构建的SHIP基因突变体稳定表达于人白血病细胞系K562中,观察SHIP基因突变后在K562细胞中的功能变化,为进一步研究SHIP基因在白血病发病机制中的作用提供实验依据。方法FQ-PCR和Western blot鉴定野生型和突变型SHIP基因在K562细胞中的表达;MTT比较K562/wtSHIP和K562/muSHIP两组细胞生长情况;流式细胞分析比较野生型和突变型SHIP基因对细胞周期的不同影响;Hoechst33342荧光染色比较细胞凋亡情况。Western Blot比较转染野生型和突变型SHIP基因后对K562细胞Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinD1、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白表达的调控。Caspase活性检测试剂盒检测各组Caspase-3、Caspase-9活性。利用高压液相色谱分析比较各转染组PIP3和PI3,4P2水平。结果1野生型SHIP基因明显抑制K562细胞生长,而SHIP基因突变体丧失了这种功能。流式细胞仪分析结果表明K562/wtSHIP细胞主要表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,PI降低。突变型SHIP基因对K562细胞周期无明显影响。2 Hoechest染色发现转染野生型SHIP基因的K562细胞早期凋亡率[（38.4±3.08）%]明显高于转染SHIP基因突变子（P28L）[（8.4±1.11）%]和空载体组[（8.06±0.95）%]。SHIP基因突变子不能促进细胞凋亡。3 SHIP基因突变体不能下调K562细胞p-Akt308和p-Akt473的磷酸化水平（p-Akt308:0.334±0.031;p-Akt473:0.826±0.163）。4转染野生型SHIP基因的K562细胞周期蛋白p21和p27蛋白水平显着增高,cyclin D1水平明显降低,但转染SHIP基因突变体的K562细胞中细胞周期蛋白表达无上述改变。5 K562/muSHIP组细胞caspase-3和caspase-9酶活性显着低于K562/wtSHIP组（P<0.05）,与K562/FIV组和未转染组相比无统计学差异（P>0.05）。6转染野生型SHIP基因组K562细胞bcl-xL表达降低,而SHIP基因突变体对K562细胞bcl-xL表达（0.367±0.028）无影响;K562/muSHIP基因组和未转染组、K562/FIV组间无显着性差异（P>0.05）。K562/muSHIP组细胞bad蛋白表达水平（0.322±0.063）较K562/wtSHIP组低,与K562/FIV组和未转染组相比无显着性差异（P>0.05）。K562/muSHIP组细胞bcl-2表达水平（0.155±0.035）较K562/wtSHIP组、K562/FIV组和未转染组间无统计学意义（P>0.05）。Bax在K562/wtSHIP组细胞表达水平略高于K562/muSHIP组（0.329±0.025）但无统计学差异（P>0.05）。7应用高压液相色谱分析结果显示:转染wtSHIP基因组K562细胞中PI(3,4,5P3水平下降,显着低于转染muSHIP组、转染空载体组和未转染组PIP3的水平（P<0.01）,后三组间PIP3水平无显着性差异（P>0.05）。K562/wtSHIP组K562细胞PI（3,4）P2水平明显高于K562/muSHIP组、K562/FIV组和未转染组K562细胞PIP2水平（P<0.01）,后三组细胞间PI3,4P2水平相比无统计学意义（P>0.05）。结论1 SHIP基因突变体SHIPP28L导致其增殖抑制及促凋亡功能丧失。2与野生型SHIP基因相比,SHIPP28L突变体导致其对K562细胞caspase-3、caspase-9和NF-κB活性的调节作用丢失。3 SHIP基因调控PI3K/Akt信号通路蛋白表达可能是其抑制人白血病细胞系K562增殖的重要分子机理之一,SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用及促凋亡作用有赖于其基因结构和功能正常。
翟惠虹[8]（2007）在《CacyBP/SIP核转位在结肠癌中的意义》文中进行了进一步梳理CacyBP （CalCyclin（S100A6）-binding-protein,钙周期素结合蛋白）,是1998年发现的以钙依赖的方式结合CalCyclin的蛋白;2001在研究P53刺激下β-catenin泛素化降解新通路时发现,SIP（Siah-1 Interacting Protein）,通过与泛肽连接酶（Skp1-Cullin-F-box,SCF Ebi）结合,参与P53刺激下β-catenin的降解。进一步的研究发现:SIP即CacyBP,因此目前命名为CacyBP/SIP。CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白,S100家族是Ca2+结合蛋白家族中最大的亚类,以组织特异性的方式作为钙信号的传导器,与特异的靶蛋白相互作用,介导钙信号对细胞的调控。现发现CacyBP/SIP可与S100A1、A6、A12、B、P结合,它们均与肿瘤的进展/转移有关。近有研究表明CacyBP/SIP与细胞分化、发育有关。在研究小鼠受孕子宫发育时发现,随着时间的推移,CacyBP/SIP的表达逐渐升高,第7天时达高峰,其表达受雌、孕激素的调节,表明它与受孕子宫内膜细胞的发育有关;心肌肥大时CacyBP/SIP表达上调,随后的研究发现它可促进H9C2细胞及小鼠心肌的分化及DNA合成。已有两家研究机构报道,在神经细胞内CacyBP/SIP具有依赖于Ca2+浓度的核转位及磷酸化现象。Ca2+是细胞内最重要的第二信使,通过其浓度的变化来传递信息。在神经细胞内Ca2+浓度升高,CacyBP/SIP转位至细胞核,同时发生磷酸化;细胞内Ca2+浓度降低时,CacyBP/SIP转位至细胞浆,同时发生去磷酸化。蛋白转位至细胞核且发生磷酸化对于传递细胞外信号,调控下游基因表达具有重要意义。但这种现象究竟有何意义呢?本课题将对此进行探讨。【目的】1、CacyBP/SIP单克隆抗体的制备;2、CacyBP/SIP在正常组织和肿瘤组织中的表达分布;3、CacyBP/SIP在结肠癌组织中的表达及功能;4、CacyBP/SIP核转位影响结肠癌细胞功能的可能机制。【方法】1、应用淋巴细胞杂瘤技术制备小鼠源性抗人CacyBP/SIP MAb,采用Western Blot及ELISA等方法鉴定抗体的特异性和敏感性;2、应用正辛酸-饱和硫酸铵方法纯化抗体,通过SP免疫组织化学技术,观察CacyBP/SIP在正常组织和肿瘤组织中的分布;3、利用免疫组化、Western Blot观察CacyBP/SIP在结肠癌、癌旁组织、结肠癌细胞中的表达和细胞定位;4、通过基因重组方法构建CacyBP/SIP的siRNA载体、全长载体、C端截短体;5、间接免疫荧光细胞内染色、Western Blot检测CacyBP/SIP在胃泌素诱导下在结肠癌细胞中的定位;6、利用细胞MTT实验、平皿克隆形成试验、细胞周期检测等研究CacyBP/SIP入核对结肠癌细胞SW480和HT29增殖的影响;7、通过Western Blot、激酶实验、co-IP观察CacyBP/SIP入核后细胞周期蛋白及活性的变化;8、应用蛋白酶抑制剂通过抑制泛素-蛋白酶体通路探讨细胞周期蛋白改变的机制;9、利用激光共聚焦观察C端截短体在细胞内定位;10、利用Western Blot、co-IP观察CacyBP/SIP截短体转染细胞后细胞周期蛋白表达变化。【结果】1制备了CacyBP/SIP单克隆抗体获得3株抗CacyBP/SIP的单克隆抗体,其亚型均为IgG（κ）亚类,间接ELISA测定腹水效价达1×10-7,Western Blot及ELISA表明三株MAb具有较高的特异性与敏感性,均能识别组织及细胞内天然及变性CacyBP/SIP蛋白。2 CacyBP/SIP在正常及肿瘤组织中的分布以获得单抗为工具,较系统研究CacyBP/SIP在正常组织及肿瘤组织中的表达。通过IHC染色发现:心脏、脑中CacyBP/SIP呈强染色,主要表达于心肌细胞、神经元及神经胶质细胞;在胃、结肠、肝等弱表达或表达缺失。在大多数腺上皮起源的肿瘤中,CacyBP/SIP均着色,包括胃癌、结肠癌、直肠癌等,其中在胰腺癌中显示出较强的着色,在鼻咽癌中着色最强。CacyBP/SIP亦可在鳞状上皮起源的肿瘤中着色,如肺鳞癌及食道鳞癌。我们还发现CacyBP/SIP在其它细胞来源的肿瘤中着色:如膀胱/输尿管移行细胞癌,神经胶质瘤,骨肉瘤。在肝癌、黑色素瘤及卵巢癌中着色罕见或缺失。CacyBP/SIP在多数正常组织不表达或弱表达,而在多数肿瘤组织中表达或表达增强,这一结果提示CacyBP/SIP可能在肿瘤的发生发展起作用。3 CacyBP/SIP在结肠癌中高表达我们利用免疫组化技术检测了CacyBP/SIP在10例正常结肠粘膜,50例结肠癌及癌旁组织中的表达,发现CacyBP/SIP主要定位于结肠癌细胞的胞浆和胞核,在正常结肠粘膜表达缺失,结肠癌表达阳性率（51%）,明显高于癌旁组织（26%,p<0.05）。Western Blot显示CacyBP/SIP在结肠癌中的表达明显高于相应癌旁组织（p<0.05）。对3种结肠癌细胞系中CacyBP/SIP表达显示,HT29及SW480细胞中均表达CacyBP/SIP。以上研究结果说明CacyBP/SIP在结肠癌中高表达,可能在结肠癌的发生发展中起作用。4胃泌素可诱导CacyBP/SIP转位至细胞核胃泌素作为内分泌激素,除具有促进胃酸分泌的功能,还是体内重要的生长因子,研究已证实它可促进正常结肠粘膜及结肠癌的增殖,与受体结合后可升高细胞内钙离子;而CacyBP/SIP具有依赖钙离子浓度的核转位。那么,胃泌素可否诱导CacyBP/SIP核转位呢?我们给予胃泌素刺激后,间接免疫荧光、Western Blot显示CacyBP/SIP转位至细胞核。我们进而构建了CacyBP/SIP的两个siRNA载体,稳定转染了结肠癌SW480和HT29细胞,发现CacyBP/SIPsi1载体能显着抑制结肠癌细胞中CacyBP/SIP的表达,命名为SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi,此细胞在胃泌素刺激后,间接免疫荧光、Western Blot显示CacyBP/SIP无转位现象发生。我们通过给予胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位,建立了研究CacyBP/SIP入核功能的细胞模型;通过抑制CacyBP/SIP的表达,建立了研究CacyBP/SIP入核受抑的细胞模型。5 CacyBP/SIP入核可促进结肠癌增殖我们采用MTT法、平皿克隆形成试验探讨胃泌素诱导CacyBP/SIP核转位后对结肠癌细胞增殖的影响,结果发现:与未加胃泌素的对照细胞相比,给予胃泌素后促细胞增殖的作用增强（P<0.05）,促细胞集落形成明显增加（P< 0.05）;细胞周期结果表明:与未刺激组相比,给予胃泌素后,SW480与HT29细胞的G1期明显缩短。在SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi中,CacyBP/SIP入核受抑,MTT、平皿克隆形成试验表明:与未加胃泌素的对照细胞相比,给予胃泌素后细胞增殖的差别无显着性差异（P>0.05）,促细胞集落形成的能力无明显差异（P>0.05）。细胞周期结果表明:与未刺激组相比,给予胃泌素后,SW480-CacyBP/SIPsi及HT29-CacyBP/SIPsi细胞的G1期无明显变化。以上研究提示CacyBP/SIP核转位可促进结肠癌增殖,这种增殖作用可能通过促进细胞周期进展而实现的。6 CacyBP/SIP通过增强泛素介导的P27kip1降解促结肠癌增殖为进一步明确CacyBP/SIP核转位后促进细胞周期进展的分子机制,我们首先应用Western Blot检测G1期进展中关键细胞周期蛋白的表达。应用同步化药物nocodazole处理结肠癌细胞SW480及HT29,结果表明:胃泌素刺激后,P27kip1表达降低,Cyclin E蛋白表达升高。抑制CacyBP/SIP核转位后P27kip1与Cyclin E的表达无变化。Cdk2激酶活性检测明显升高,同时细胞中P27kip1结合Cdk2的量减少。以此结果提示CaycBP/SIP入核后P27kip1蛋白量减少,Cdk2激酶活性增加,导致G1期进展。给予蛋白酶体抑制剂MG132抑制26S蛋白酶体的活性,结果发现: MG132处理细胞后,P27kip1、Cyclin E表达无明显变化,说明P27kip1降解的增强是通过26S蛋白酶通路。P27kip1是SCF泛素酶的靶蛋白,研究已发现CacyBP/SIP通过其C未端与Skp1结合,我们应用CacyBP/SIP免疫共沉淀亦证实:在结肠癌细胞HT29及SW480中,CacyBP/SIP可以与Skp1结合。我们进而构建了CacyBP/SIP的截短体,CacyBP/SIP （Δ73–228）,缺失了C末端结构域,并克隆入pEGFP/C1表达融合绿色荧光蛋白的质粒pEGFP/C1- CacyBP/SIP （Δ73–228）。转染SW480-CacyBP/SIPsi细胞,激光共聚焦观察C端截短体在胃泌素刺激后亦可入核。免疫共沉淀证实,该截短体不能与Skp1结合,与此同时,P27kip1的表达则无明显变化。这一结果说明CacyBP/SIP通过与Skp1结合,增强了泛素-26S蛋白酶体复合物对P27kip1的降解。【结论】本研究发现胃泌素诱导CacyBP/SIP入核后通过增强泛素介导P27kip1的降解促进结肠癌细胞的增殖。
刘俊茹,齐凤英,左连富,李丽,郭建文,刘江惠[9]（2006）在《尼美舒利对食管癌Eca-109细胞增殖及COX-2和P27kip1表达的影响》文中指出目的观察选择性COX-2抑制剂尼美舒利对食管癌Eca-109细胞增殖、凋亡及COX-2表达的影响,并探讨与抑癌基因P27kip1的关系。方法用MTT法测定Eca-109细胞增殖;透射电镜及流式细胞仪观察细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR法检测Eca-109细胞COX-2mRNA表达变化;Westernblot检测COX-2和P27kip1蛋白表达变化。结果尼美舒利以时间、剂量依赖方式抑制Eca-109增殖,增加G0/G1期细胞比例;呈剂量依赖性诱导细胞凋亡,降低COX-2mRNA和蛋白表达,上调P27kip1蛋白表达。结论尼美舒利可抑制食管癌Eca-109细胞增殖,使细胞周期受阻于G0/G1期并诱导细胞凋亡。其机制可能是通过下调COX-2表达和上调P27kip1蛋白表达水平实现的。
侯建青[10]（2006）在《手术、化疗联合诱导分化治疗晚期卵巢浆液性囊腺癌的临床研究》文中指出目的：探讨在手术和化疗的基础上联合维胺酸诱导分化治疗后，卵巢浆液性囊腺癌组织中肿瘤细胞超微结构的变化和Skp2、P27kip1蛋白在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达以及Skp2、P27kip1两者之间的相关性。进一步了解这种Skp2、P27kip1蛋白表达的差异和肿瘤细胞超微结构的变化与血清CA-125水平和患者存活时间的关系。方法 选取2000年1月-2005年12月间，烟台毓璜顶医院妇科初治的晚期卵巢浆液性囊腺癌患者37例为研究对象，随机分为两组，实验组20例，对照组17例；所有患者入院后先进行腹腔镜探查确定为Ⅲ期卵巢浆液性囊腺癌。术中进行腹腔转移灶电灼、腹腔灌注DDP化疗。在上述处理前采集标本，所采集标本分成两部分，一部分用做电镜超微结构分析；另一部分作病理组织学及免疫组化染色检查。腹腔镜探查后次日进行拓扑特肯（topotecan，TP）1.2mg／m2全身静脉化疗六疗程，其中实验组在此基础上加服诱导分化剂维胺酸50mg／d共六个月；对照组不加其它处理。三周后两组患者开腹行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，手术中再次留取组织标本作电镜分析和免疫组化检查，方法同上。所有手术由同一组医生完成，均达到理想的肿
二、Bak基因诱导P27~(KIP1)基因的过表达使HCC-9204细胞在G_1期停滞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Bak基因诱导P27~(KIP1)基因的过表达使HCC-9204细胞在G_1期停滞（论文提纲范文）
（1）人肝细胞癌组织Mina53的表达及影响增殖、侵袭转移的体外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 组织标本 |
| 1.4 肝癌细胞系 |
| 1.4.1 细胞培养 |
| 1.4.2 细胞复苏 |
| 1.4.3 细胞传代 |
| 1.4.4 细胞冻存 |
| 2.方法 |
| 2.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.1.1 提取新鲜组织总RNA |
| 2.1.2 逆转录mRNA |
| 2.1.3 qRT-PCR |
| 2.2 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.1 提取新鲜组织总蛋白 |
| 2.2.2 BCA法测总蛋白浓度 |
| 2.2.3 Western blot |
| 2.3 免疫组化 |
| 2.3.1 制作组织芯片 |
| 2.3.2 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 免疫组化结果判定标准 |
| 2.4 肝癌细胞系HCCLM3、QGY-7703、Huh7 细胞转染 |
| 2.4.1 过表达质粒转染 |
| 2.4.2 小干扰RNA(si RNA)转染 |
| 2.5 MTT实验 |
| 2.6 平板克隆形成实验 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 Transwell小室迁移、侵袭实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.qRT-PCR检测Mina53m RNA在肝细胞癌新鲜组织中的表达 |
| 2.Western blot检测Mina53 蛋白在肝细胞癌新鲜组织中的表达 |
| 3.免疫组化检测组织芯片中Mina53的表达 |
| 4.Mina53的表达与肝细胞癌临床病理特征的关系 |
| 5.Mina53的表达与肝细胞癌患者术后生存期的关系 |
| 6.Cox模型分析影响肝细胞癌患者预后的因素 |
| 7.不同肝癌细胞系中Mina53的表达水平 |
| 8.Mina53在HCCLM3、QGY-7703、Huh7 细胞系中的转染情况 |
| 9.Mina53对肝癌细胞增殖能力的影响 |
| 10.Mina53对肝癌细胞周期的影响 |
| 11.Mina53对肝癌细胞凋亡的影响 |
| 12.Mina53对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响 |
| 13.Mina53对肝癌细胞中上皮-间质转化和基质金属蛋白酶的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）p53在重组azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 使用DH5A菌株制备重组细菌氧化还原蛋白AZURIN最佳诱导条件研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 使用重组细菌氧化还原蛋白AZURIN诱导MG-63和U20S细胞凋亡研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 P53在重组细菌氧化还原蛋白AZURIN诱导U2OS细胞凋亡过程中的的机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）胰岛素和葡萄糖在鹅肝细胞增殖中的调控作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 专业名词缩写符号 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 鹅肝脏的特殊性 |
| 2.1 鹅肝脂肪变性的可逆性 |
| 2.2 鹅肥肝的营养特点 |
| 3 影响细胞增殖的因素 |
| 3.1 葡萄糖对细胞增殖的影响 |
| 3.1.1 葡萄糖通过细胞周期调控因子调控细胞增殖 |
| 3.1.2 葡萄糖通过PI3K信号途径调控细胞增殖 |
| 3.2 胰岛素对细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 胰岛素通过细胞周期调控因子调控细胞增殖 |
| 3.2.2 胰岛素通过PI3K信号途径调控细胞增殖 |
| 3.3 胰岛素和葡萄糖的联合调控作用 |
| 4 影响细胞增殖的因子 |
| 4.1 细胞周期调控因子与细胞增殖 |
| 4.1.1 细胞周期蛋白D(CyclinD)与细胞增殖 |
| 4.1.2 CDK抑制蛋白p21和p27与细胞增殖 |
| 4.2 FoxO1与细胞增殖 |
| 4.2.1 FoxO1的功能 |
| 4.2.2 FoxO1对细胞增殖的作用 |
| 4.3 Sirt1与细胞增殖 |
| 4.3.1 Sirt1的功能 |
| 4.3.2 Sirt1对细胞增殖的作用 |
| 5 本研究目的、意义 |
| 6 主要研究内容及技术路线 |
| 6.1 主要研究内容 |
| 6.2 技术路线 |
| 第二章 填肥对天府肉鹅和钢鹅组织细胞增殖相关基因表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物选取、饲养与样品采集 |
| 2.1.1 品种与数量 |
| 2.1.2 饲养管理 |
| 2.1.3 血样采集与处理 |
| 2.1.4 组织样品采集与处理 |
| 2.2 主要仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 石蜡组织切片法检测肝细胞脂肪变性 |
| 2.4 血清胰岛素、葡萄糖和TG浓度的检测 |
| 2.5 细胞增殖调控基因mRNA表达水平的检测 |
| 2.5.1 组织总RNA的提取与cDNA合成 |
| 2.5.2 被检测基因的引物设计与合成 |
| 2.5.3 实时定量引物特异性的检测与鉴定 |
| 2.5.4 基因表达分析 |
| 2.6 肝脏中与细胞增殖相关蛋白含量的测定 |
| 2.7 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 填肥对天府肉鹅和钢鹅生长性能的影响 |
| 3.2 填肥对天府肉鹅和钢鹅肝脏脂肪变性的影响 |
| 3.3 填肥对天府肉鹅和钢鹅血清胰岛素、葡萄糖和TG浓度的影响 |
| 3.4 填肥对天府肉鹅和钢鹅中PI3K-Akt1-mTOR信号通路相关基因表达的影响 |
| 3.5 填肥对天府肉鹅和钢鹅中CyclinD1/D2/D3、p27基因表达的影响 |
| 3.6 填肥对天府肉鹅和钢鹅中FoxO1和Sirt1表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 填肥对天府肉鹅和钢鹅生长性能和血清胰岛素、葡萄糖和TG浓度的影响 |
| 4.2 填肥对PI3K-Akt-mTOR信号通路相关基因表达的作用 |
| 4.3 填肥对CyclinD1/D2/D3、p27基因表达的影响 |
| 4.4 填肥对Sirt1和FoxO1表达的影响 |
| 5 小结 |
| 第三章 胰岛素对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂盒 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鹅原代肝细胞的分离、培养与处理 |
| 2.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活性 |
| 2.2.3 鹅原代肝细胞周期分析 |
| 2.2.4 Brdu-ELISA法检测肝细胞DNA合成率 |
| 2.2.5 细胞Brdu免疫染色检测鹅肝细胞增殖率 |
| 2.2.6 ELISA法检测与鹅肝细胞增殖相关因子的蛋白含量 |
| 2.2.7 鹅原代肝细胞总RNA分离提取和Rel-Time RT-PCR |
| 2.2.8 Western blot分析肝细胞CyclinD1、p21、S6K的蛋白表达 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胰岛素对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂对胰岛素刺激鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.3 胰岛素对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响 |
| 3.4 三种抑制剂对胰岛素刺激PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胰岛素对鹅肝细胞增殖的作用 |
| 4.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂在胰岛素刺激鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.3 细胞周期调控因子在胰岛素刺激鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 5 小结 |
| 第四章 葡萄糖及葡萄糖与胰岛素共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鹅原代肝细胞的分组与处理 |
| 2.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活性 |
| 2.2.3 鹅原代肝细胞周期分析 |
| 2.2.4 Brdu-ELISA法检测肝细胞DNA合成率 |
| 2.2.5 细胞Brdu免疫染色检测鹅肝细胞增殖率 |
| 2.2.6 ELISA法检测与鹅肝细胞增殖相关因子的蛋白含量 |
| 2.2.7 鹅原代肝细胞总RNA分离提取和Real-Time RT-PCR |
| 2.2.8 Western blot分析肝细胞CylinD1和p21的蛋白表达 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 葡萄糖对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.2 三种抑制剂对葡萄糖诱导鹅肝细胞增殖作用的影响 |
| 3.2.1 LY294002对葡萄糖诱导鹅肝细胞增殖作用的影响 |
| 3.2.2 Rapamycin对葡萄糖诱导鹅肝细胞增殖作用的影响 |
| 3.2.3 NVP-BEZ235对葡萄糖诱导鹅肝细胞增殖作用的影响 |
| 3.3 胰岛素和葡萄糖共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.3.1 胰岛素和葡萄糖对鹅肝细胞DNA合成率的影响 |
| 3.3.2 胰岛素和葡萄糖对肝细胞CyclinD1蛋白含量的影响 |
| 3.3.3 胰岛素和葡萄糖对鹅肝细胞CyclinD1/D2/D3 mRNA相对表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖的影响 |
| 4.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路在葡萄糖诱导鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.3 胰岛素和葡萄糖共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 4.4 鹅肝细胞增殖与肝细胞脂肪变性的关系 |
| 5 小结 |
| 第五章 FoxO1在鹅肝细胞增殖中的调控作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.2 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鹅FoxO1基因干扰载体的构建 |
| 2.2.2 鹅原代肝细胞的分离培养 |
| 2.2.3 鹅原代肝细胞转染miR-FoxO1干扰质粒 |
| 2.2.4 鹅原代肝细胞的分组与处理 |
| 2.2.5 CCK-8试剂盒检测细胞活性 |
| 2.2.6 细胞周期分析 |
| 2.2.7 Brdu-ELISA法检测肝细胞DNA合成率 |
| 2.2.8 细胞Brdu免疫染色检测鹅肝细胞增殖率 |
| 2.2.9 ELISA法检测与鹅肝细胞增殖相关因子的蛋白含量 |
| 2.2.10 鹅原代肝细胞总RNA分离提取和实时定量RT-PCR检测 |
| 2.2.11 Western Blot分析CyclinD1蛋白表达 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 干扰FoxO1对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.2 FoxO1对胰岛素调控鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.3 FoxO1对PI3K-Akt-mTOR信号通路调控鹅肝细胞增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 FoxO1对鹅原代肝细胞增殖的影响 |
| 4.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路在FoxO1抑制鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.3 胰岛素在FoxO1抑制鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.4 FoxO1在鹅肝细胞增殖及脂肪变性中的作用 |
| 5 小结 |
| 第六章 Sirt1在鹅肝细胞增殖中的调控作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鹅原代肝细胞的分组与处理 |
| 2.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活性 |
| 2.2.3 鹅原代肝细胞周期分析 |
| 2.2.4 Brdu-ELISA法检测肝细胞DNA合成率 |
| 2.2.5 细胞Brdu免疫染色检测鹅肝细胞增殖率 |
| 2.2.6 ELISA法检测与鹅肝细胞增殖相关因子的蛋白含量 |
| 2.2.7 鹅原代肝细胞总RNA分离提取和Real-Time RT-PCR |
| 2.2.8 Western blot分析肝细胞CyclinD1和FoxO1的蛋白表达 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 维生素PP与PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.2 维生素PP和FoxO1干扰质粒共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 3.3 维生素PP和胰岛素共同处理对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Sirt1对鹅原代肝细胞增殖的作用 |
| 4.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路在Sirt1抑制鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.3 FoxO1在Sirt1抑制鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.4 胰岛素在Sirt1抑制鹅肝细胞增殖中的作用 |
| 4.5 Sirt1在鹅肝细胞增殖及脂肪变性中的作用 |
| 5 小结 |
| 第七章 总结 |
| 1 本研究的主要结果 |
| 1.1 填肥对鹅生长性能及肝细胞增殖的影响 |
| 1.2 胰岛素和葡萄糖对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 1.3 FoxO1对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 1.4 Sirt1对鹅肝细胞增殖的影响 |
| 2 结论 |
| 3 创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（4）化疗药物在p53缺陷型肿瘤细胞中对p21启动子激活机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1. 导言 |
| 2. 细胞周期调控因子 |
| 2.1 正调控因子（positive regulators） |
| 2.2 负调控因子（negative regulator） |
| 3. p~(21wif1/cip1)与肿瘤 |
| 3.1 p21 的肿瘤抑制功能概述 |
| 3.2 p21 的调控 |
| 3.3 转录因子 Sp1/Sp3 概述 |
| 3.4 研究内容及意义 |
| 第二章 实验结果 |
| 1. 化疗药物的疗效与 p21 表达水平呈正相关 |
| 1.1 细胞转染条件确定 |
| 1.2 奥沙利铂诱导 p21 启动子活化 |
| 1.3 奥沙利铂诱导 p21 mRNA 增加 |
| 1.4 原位免疫荧光鉴定 p21 在细胞内表达量 |
| 1.5 奥沙利铂诱导 p21 蛋白表达增加 |
| 1.6 细胞周期分析结果 |
| 1.7 奥沙利铂对裸鼠异种移植肿瘤的抑制效果 |
| 2. 奥沙利铂对 p21 启动子转录调控的研究 |
| 2.1 p21 启动子上的奥沙利铂应答元件 |
| 2.2 奥沙利铂应答元件位置的独特性 |
| 2.3 启动子上-1 至-500bp 的生物信息学分析 |
| 3. Sp1/Sp3 是与奥沙利铂应答元件结合的主要蛋白因子 |
| 3.1 电泳迁移率(EMSA)实验条件确定 |
| 3.2 蛋白浓度标准曲线制作 |
| 3.3 细胞核提取物特异性的与 F3 结合 |
| 3.4 转录因子 Sp1/Sp3 特异性的结合在 F3 上 |
| 3.5 奥沙利铂诱导 Sp1 磷酸化 |
| 4. Sp1/Sp3 与 DNA 结合亲和力及结合位点分析 |
| 4.1 奥沙利铂增加 Sp1/Sp3 蛋白与药物应答元件(F3)的亲和力 |
| 4.2 F3 片段上 Sp1/Sp3 蛋白结合位点的重要性 |
| 5. F3(wt -213 /-242)在细胞内的生物学作用初探 |
| 5.1 片段 F3 能够诱导激活 p21 启动子 |
| 5.2 双链 DNA Sp1 及突变片段 mu4 均不能活化 p21 启动子 |
| 5.3 片段 F3 能诱导细胞内源性的 p21 表达 |
| 5.4 p53 与奥沙利铂应答元件协同作用诱导 p21 |
| 第三章 实验仪器和方法 |
| 1. PEI 介导的真核细胞转染 |
| 1.1 缓冲溶液及试剂 |
| 1.2 质粒 DNA 与 PEI 质量比的确定 |
| 1.3 pFL-luc 和 pCMV- -gal 共转染 SKOV3 |
| 1.4 定点突变构建 p21 启动子-报告基因突变体及重组质粒转染 |
| 1.5 pFL-luc 或 pFL- 9 与 pCMV-p53 共转染 SKOV3 |
| 1.6 质粒 pFL-luc 和双链寡核苷酸 DNA 共转染 SKOV3 细胞 |
| 1.7 生物素标记探针(biotin-labeled probe)转染 SKOV3 细胞 |
| 2. 免疫印迹实验(western blot) |
| 2.1 缓冲液、试剂和仪器 |
| 2.2 细胞裂解液的获得 |
| 2.3 配制 SDS-PAGE 蛋白胶及蛋白电泳 |
| 2.4 电泳转膜及抗体杂交步骤 |
| 3. 半定量 RT-PCR(reverse transcription- PCR) |
| 3.1 细胞总 RNA 提取 |
| 3.2 反转录及 PCR 扩增 |
| 4. 流式细胞术（FACS） |
| 4.1 溶液和仪器 |
| 4.2 实验步骤 |
| 5. 原位免疫荧光实验（immunofluorescence studies） |
| 6. 奥沙利铂对 SKOV3 异种移植肿瘤的抑制 |
| 7. 电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) |
| 7.1 DNA 探针合成及制备 |
| 7.2 细胞核提取物制备及浓度测定 |
| 7.3 电泳迁移率实验条件确定 |
| 8. 统计分析 |
| 9. 序列保守性的生物信息学分析 |
| 第四章 讨论和展望 |
| 参考文献 |
| 符号与标记（附录 1） |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表或待发表的学术论文及专利 |
（5）白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞和主要试剂 |
| 1.2 细胞增殖活性检测 |
| 1.2.1 LM3细胞培养及Res处理 |
| 1.2.2 CCK-8法检测 |
| 1.3 细胞周期和凋亡检测 |
| 1.3.1 制备Res作用72h后的LM3细胞 |
| 1.3.2 流式细胞仪检测 |
| 1.4 Real-time PCR |
| 1.5 Western blot |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Res对LM3增殖活力的影响 |
| 2.2 Res对LM3细胞周期的影响 |
| 2.3 Res对LM3细胞凋亡的影响 |
| 2.4 Res作用后肝癌细胞LM3中Bak及Bcl-2表达的改变 |
| 3 讨论 |
（6）p21Waf1/Cip1和Skp2在涎腺肿瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）SHIP基因在白血病发病机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 SHIP 基因在白血病发病机制中作用的研究 |
| 引言 |
| 第一部分 野生型SHIP 基因对白血病细胞系K562 增殖、凋亡的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 携带突变型SHIP 基因慢病毒载体的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因位点突变对SHIP 基因功能的影响及机制探讨 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 SHIP 基因研究进展 |
| 综述二 急性髓系白血病P13K/Akt 信号传导通路及其靶向治疗 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）CacyBP/SIP核转位在结肠癌中的意义（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 CacyBP/SIP单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CacyBP/SIP在正常组织及肿瘤组织中的分布 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：CacyBP/SIP核转位与结肠癌增殖的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分：CacyBP/SIP核转位促进结肠癌增殖的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
（9）尼美舒利对食管癌Eca-109细胞增殖及COX-2和P27kip1表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 细胞增殖抑制实验 (MTT实验) |
| 1.4 光镜观察 |
| 1.5 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 |
| 1.6 电镜观察 |
| 1.7 RT-PCR 检测COX- 2 mRNA表达 |
| 1.8 Western blot检测COX-2、P27kip1蛋白表达 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 尼美舒利对Eca-109细胞的生长抑制作用 |
| 2.2 光镜观察细胞形态学变化 |
| 2.3 尼美舒利对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 尼美舒利诱导Eca-109细胞凋亡 |
| 2.5 尼美舒利对Eca-109细胞COX-2表达的影响 |
| 2.6 尼美舒利对P27kip1蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
（10）手术、化疗联合诱导分化治疗晚期卵巢浆液性囊腺癌的临床研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Skp2、P27~(kip1)蛋白在晚期卵巢浆液性囊腺癌治疗中的临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分 手术、化疗联合诱导分化治疗晚期卵巢浆液性囊腺癌肿瘤细胞超微结构的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三部分 手术、化疗联合诱导分化治疗晚期卵巢浆液性囊腺癌患者血清CA-125值的变化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述一 维甲酸诱导分化的药代动力学和抗肿瘤机理研究进展 |
| 综述二 维甲酸诱导分化治疗恶性肿瘤的研究近况 |
| 综述三 Skp2、P27~(kip1)与妇科肿瘤 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、Bak基因诱导P27~(KIP1)基因的过表达使HCC-9204细胞在G_1期停滞（论文参考文献）
- [1]人肝细胞癌组织Mina53的表达及影响增殖、侵袭转移的体外实验研究[D]. 叶冬雪. 青岛大学, 2020(01)
- [2]p53在重组azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中的机制研究[D]. 严晓波. 浙江大学, 2018(08)
- [3]胰岛素和葡萄糖在鹅肝细胞增殖中的调控作用及其机理研究[D]. 魏守海. 四川农业大学, 2017(12)
- [4]化疗药物在p53缺陷型肿瘤细胞中对p21启动子激活机制的研究[D]. 徐维果. 上海交通大学, 2013(07)
- [5]白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制[J]. 戴维奇,徐凌,王锋,卫巍,沈杰,黄银实,杨丽娟,何姗姗,郭传勇. 现代生物医学进展, 2012(01)
- [6]p21Waf1/Cip1和Skp2在涎腺肿瘤中的表达及意义[D]. 倪小兵. 华中科技大学, 2010(02)
- [7]SHIP基因在白血病发病机制中作用的研究[D]. 杨琳. 河北医科大学, 2009(10)
- [8]CacyBP/SIP核转位在结肠癌中的意义[D]. 翟惠虹. 第四军医大学, 2007(04)
- [9]尼美舒利对食管癌Eca-109细胞增殖及COX-2和P27kip1表达的影响[J]. 刘俊茹,齐凤英,左连富,李丽,郭建文,刘江惠. 基础医学与临床, 2006(07)
- [10]手术、化疗联合诱导分化治疗晚期卵巢浆液性囊腺癌的临床研究[D]. 侯建青. 四川大学, 2006(03)