一、原位检测IL-12/IL-10对干扰素治疗乙型肝炎的意义（论文文献综述）
刘皎皎[1]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
马宁[2]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中研究说明第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
朱艳芳[3]（2020）在《慢乙肝细胞因子的变化与干扰素治疗疗效的相关性分析》文中研究说明目的:探讨经干扰素（Peg IFNα-2b）治疗前后,慢乙肝患者体内辅助性T淋巴细胞（Th）1类细胞因子（INF-α2、IFN-γ、TNF-α、IL-18）、辅助性T淋巴细胞（Th）2类细胞因子（IL-1β、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-23、IL-33）的变化与疗效的相关性,旨在寻求干扰素疗效的预测指标。方法:选择2017年10月至2018年10月就诊于新疆医科大学第一附属医院感染科门诊的成年慢乙肝患者58例,给予Peg IFNα-2b 180ug,每周皮下注射1次,疗程48周,除去5例中途退出研究者,实现临床治愈者（R组）11例,未获得慢乙肝临床治愈者（NR组）42例,同时选入健康对照者（HC组）20例,用CBA技术检测健康者及慢乙肝患者治疗基线、治疗12周、治疗24周、治疗36周及治疗48周细胞因子水平。结果:慢乙肝患者经干扰素治疗48周时HBsAg清除率为20.75%,Th1类细胞因子（IFN-α2、IFN-γ、TNF-α、I L-18）均低于健康对照者（P=0.004;P=0.009;P=0.012;P=0.039）;而Th2类细胞因子（IL-1β、MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-23、IL-33）均高于健康对照者（P均<0.001）,但这两类细胞因子在R及NR组存在差异,但差异无统计学意义（P>0.05）;R组中,Th1类细胞因子IL-18水平经治36周时较治疗前明显升高（P=0.001）,48周时较36周降低（P=0.01）,而NR组中未见此变化;NR组中,Th1类细胞因子I FN-α2水平经治24周时较治疗前明显升高（P=0.03）,48周时较治疗24周明显下降（P=0.000）,TNF-α水平经治36周较治疗前则降低（P=0.037）,R组无此变化;而Th1类细胞因子IFN-γ水平在R及NR组经治36周时较治疗前均升高,但两组之间差异无统计学意义（P=0.149）;R组中,Th2类细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-23、IL-33水平经治48周时均较治疗前降低（P=0.000;P=0.009;P=0.002;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.001;P=0.002）,但在NR组无此现象。而Th2类细胞因子MCP-1可能与干扰素疗效无关。结论:慢乙肝患者体内存在细胞因子的失衡,经干扰素治疗后,Th1类细胞因子升高,Th2类细胞因子降低,可能利于清除HBsAg,可能利于实现慢乙肝患者的临床治愈。
邓丽霞,徐军,王春娟,李艳芳,范璐,孙婧,刘友德,邹志强[4]（2019）在《慢性HBV感染者血清IL-10、IL-12和IFN-γ水平的差异研究》文中认为目的 探讨不同慢性HBV感染分期及不同HBV DNA载量患者白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12（IL-12）和干扰素γ（IFN-γ）水平的差异。方法 选择2016年3月至2017年3月于烟台市传染病医院就诊的慢性HBV感染者135例作为研究对象,其中慢性HBV携带者32例,慢性肝炎61例,肝硬化42例。选择同期40例健康体检者为对照组。采用ELISA法检测血清细胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ水平。结果 4组间IL-10和IL-12水平差异均有统计意义（F＝22.06,15.67,P＝0.013,0.021）；Student－Newman－Keuls（SNK）法两两比较发现,肝硬化组的IL-10和IL-12水平显着高于慢性肝炎组（均P<0.001）,慢性肝炎组的IL-10和IL-12水平显着高于HBV携带组（均P<0.001）。采用方差分析进行IFN-γ水平组间差异比较,结果显示,4组间IFN-γ水平差异有统计学意义（F＝18.36,P＝0.017）。SNK两两比较发现,其中肝硬化组的IFN-γ水平显着高于慢性肝炎组（P＝0.027）,慢性肝炎组的IFN-γ水平显着高于HBV携带组（P<0.001）,HBV携带组的IFN-γ水平显着高于对照组（P<0.001）。HBV-DNA载量越高,IL-10水平越高,而IL-12和IFN-γ水平越低。血清IL-10、IL-12和IFN-γ水平在低、中、高HBV-DNA载量组的差异均有统计学意义（F＝18.27,21.65,19.66,P＝0.017,0.013,0.015）。pearson相关分析结果显示,IL-10与IFN-γ无相关性（r＝0.103,P＝0.063）,IL-12与IFN-γ具有显着正相关性（r＝0.687,P<0.05）。结论 细胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ在慢性HBV感染过程中起重要作用。
王冬耀[5]（2019）在《Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究》文中研究说明慢性感染性疾病以及恶性肿瘤严重威胁着当今世界人类的健康。近年来虽然出现了众多抗感染药物,对肿瘤的发病机制也从细胞水平到分子水平有了更为深入的认识,同时肿瘤靶向药物和小分子抑制剂的应用也取得了一定程度的临床疗效,然而在治疗过程中仍然存在着各种需要改善的问题,如何提高慢性感染性疾病以及恶性肿瘤的临床治疗效果已经成为亟待解决的重要问题之一。慢性乙型肝炎在世界范围内,尤其在亚洲地区,感染者数目仍然很多。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要分为干扰素和核苷或者核苷酸类似物等。然而在临床治疗过程中发现,只有干扰素才能够在部分乙肝患者中达到清除HBsAg及HBeAg的效果,其机理有很多,主要认为可能是通过STAT1分子向下游传递信号,从而诱导干扰素刺激基因的表达。因此对于干扰素应答与不应答患者之间的免疫学机制研究,从而寻找能够提高干扰素疗效的策略,已经成为关注的重要问题。T细胞与自然杀伤细胞（NK细胞）对抗病毒感染等起着至关重要的促进作用,但在慢性感染过程中,T细胞和NK细胞往往处于功能耗竭的状态。细胞因子IL-2对多种免疫细胞有着活化与扩增的作用,而且曾经应用于多种肿瘤的临床治疗。但是对于继干扰素使用后能否再序贯使用IL-2治疗尚未见报道。考虑到干扰素以及IL-2下游均能够通过STAT1分子传递信号,所以针对经过干扰素治疗后无效的慢性乙肝患者,能否序贯使用IL-2从而起到协同提高T细胞和NK细胞的免疫应答能力?该方法是否适合应用于乙肝患者的临床治疗?能否有利于提高临床治疗效果?我们主要针对上述三个问题,对经干扰素治疗无应答的乙肝患者展开临床试验研究。由慢性乙型肝炎逐渐进展,可能发展为肝硬化,最终进展为肝癌。而目前针对肝癌的药物并不多且效果并不理想,无论免疫卡控点治疗还是索拉菲尼,都无法显着延长患者生存期。手术一直是肝癌治疗的主要方式之一,但是手术也存在着很大的风险,即术后易于原位复发。肝脏本身具有强大的术后再生能力,IL-6家族成员均可通过STAT3向下游传递信号,促进肝脏再生,同时有报道认为IL-11与肝切除后肝脏细胞的代偿性增生有关,IL-11-STAT3信号通路对于结直肠癌的发生起到至关重要的作用。因此术后的再生过程是否也伴随或者促进了肿瘤的生长?IL-11-STAT3信号是否起到促进肝癌生长的作用?能否寻找一种行之有效的方式抑制肝癌术后的复发?围绕着这三个问题我们对于肝癌的术后展开了研究。本文主要从寻找提高无应答乙肝患者治疗临床效果和防止肝癌术后复发两个方面展开研究,获得了如下结果。Ⅰ.序贯使用IL-2可提高经干治疗无效的患者抗病毒应答能力通过第一项临床试验,我们选取了 92例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者。接受48周的标准长效干扰素治疗,并进行24周的随访。我们对入组的患者及正常人对照组的PBMC进行了系统的临床特征及免疫学分析,发现干扰素治疗为IL-2治疗提供了基础。继而我们通过第二项临床试验,对于经干扰素治疗无效的患者进行24周的序贯IL-2治疗。通过使用流式细胞术、ELISA、免疫荧光、western blotting、RTCA及相关性分析等,发现了序贯使用IL-2治疗能够提高临床治疗效果的机制。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.干扰素治疗后大多数患者为无应答患者,且IL-2Rα在CD4+T细胞表达降低通过分析经干扰素治疗后患者免疫学指标及临床指标,发现经过干扰素标准化治疗后多数患者为无应答患者,HBeAg未能转阴。IL-2R发生了显着变化,尤其IL-2Rα在CD4+T细胞表达显着下降。同时NK细胞表面的IL-2Rβ及IL-2Rα的表达在干扰素治疗后显着升高。总之,IFN-α治疗后,IL-2R主要传递正向免疫信号,从而为序贯IL-2治疗做铺垫。2.体外使用IL-2刺激可提高无应答患者T细胞及NK细胞的效应功能。当体外使用IL-2刺激从无应答患者外周血分离出的PBMC后,发现可以显着提高该部分患者T细胞及NK细胞的抗病毒效应功能,使产生IFN-γ及TNF-α的能力显着增强。CD38、NKG2D等活化分子表达升高,同时并未升高负调分子如PD-1,Tim-3的表达,且Treg细胞比例也未见升高。3.使用IL-2刺激可提高CHB患者肝脏组织淋巴细胞的效应功能。通过从乙肝患者肝穿组织分离的淋巴细胞进行IL-2体外刺激,发现不仅可以上调活化分子CD38、NKp30的表达,同时可以提高IFN-γ在淋巴细胞中的表达。4.体内经IL-2序贯治疗后不升高负调分子表达。通过对无应答患者进行IL-2治疗后检测发现,Treg细胞比例及PD-1分子表达均未见升高,反而有所下降。IL-2Rβ在NK细胞的表达显着升高。5.序贯IL-2治疗后增加p-STAT1表达同时下调p-STAT5表达通过western blotting检测发现对于体外使用IL-2刺激的无应答乙肝患者PBMC,p-STATl表达升高,p-STAT5表达下降。通过流式细胞术检测,经IL-2治疗后的患者,CD4+T细胞中p-STAT5表达下降。通过免疫荧光检测发现,淋巴细胞中的p-STAT1表达呈现出显着增加。6.使用IL-2治疗显着提高CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-γ。通过对不同时间点动态检测发现,经干扰素治疗无效的患者在IL-2治疗后,CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α及CD107a的水平显着升高。对患者治疗前后的血清进行比较,发现IFN-γ,IFN-αα水平在治疗后显着升高,而IL-10水平则保持稳定。7.使用IL-2治疗显着提高HBV特异性CD8+T细胞比例及杀伤作用。通过对不同时间点动态检测发现,在IL-2治疗后,pentamer+CD8+T细胞比例显着升高,此外CD44+CD62I-CD8+T细胞比例以及NKp30表达也有着显着升高。pDC细胞及CD80、CD86分子的表达也是呈现出显着增多。继而通过RTCA检测发现,从经IL-2治疗后的患者PBMC中分离出的CD8+T细胞具有更强的杀伤PLC/PRF/5细胞的功能。8.体内IL-2治疗可提高临床治疗效果通过对入组的23例患者临床资料分析发现,HBeAg水平在干扰素治疗前后未发生显着变化;然而经IL-2治疗后,HBeAg水平则显着下降。同时有5位患者HBeAg转阴,此外一位患者HBsAg转阴且伴有抗体的产生。对于免疫学指标与HBeAg进行相关性分析发现,pentamer+CD8+T细胞比例及 IFN-γ+CD107a+CD8+T细胞比例与HBeAg呈现明显负相关关系。9.CD24+CD38hiB细胞负调IFNα治疗效果然而并非所有乙肝患者经干扰素治疗后都适合序贯IL-2治疗,因此对于这部分患者则可能需要其他治疗策略。在研究过程中,除上述结果外,我们还发现了CD24+CD38hiB细胞比例及数目随干扰素的治疗呈现出动态增加,且CD24可作为CD24+CD38hi B细胞的标志分子。CD24+CD38hi B细胞可分泌高水平IL-10从而负调免疫应答。通过分选去除CD24+CD38hi B细胞后,则可以提高T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α的能力。最后通过构建的HBV小鼠模型使用anti-CD24抗体联合干扰素治疗,发现与单独干扰素治疗相比,发现可显着促进HBeAg及HBsAg的下降。综上所述,本研究表明虽然CHB患者经干扰素治疗后多数呈现无应答状态,但是CD4+T细胞表面的IL-2Rα表达下降,并且IL-2的高亲和力受体IL-2Rαβy表达降低,从而限制了 IL-2通过其下游STAT5分子磷酸化诱导FOXP3的表达,进而抑制了负向免疫应答。而序贯使用IL-2治疗后,则能够通过升高IL-2中亲和力受体IL-2Rβγ表达、促进STATI分子磷酸化,同时降低STAT5磷酸化,发挥正向免疫应答效应,包括提高CD8+T细胞和NK细胞的效应功能,以及pentαmer+CD8+T细胞比例等。与此同时,并不增加免疫负调分子表达及FOXP3+Treg细胞的比例。这些机制最终促进了抗病毒应答能力,并一定程度上促进了 HBeAg或HBsAg的清除。因此序贯IL-2的治疗对提高临床使用干扰素之后的HBeAg转阴率具有重要意义。而对于不适合序贯使用IL-2治疗的患者,anti-CD24抗体治疗或许又是一个有前景的、可供选择的方案。Ⅱ、肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发通过使用原位接种肿瘤模型,化学诱导致癌模型,原位移植瘤模型,研究手术对肿瘤的影响。通过基因芯片分析及基因敲除鼠验证IL-11是否对肿瘤生长起到促进作用。最后通过小分子抑制剂证明其能够有效的防止术后复发。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.肝癌术后可复发通过对不同国家的不同肿瘤术后五年复发率进行研究,发现肝癌在不同国家中术后复发率都很高。继而通过将肝癌模型小鼠的肿瘤切除后,发现确实可以术后复发。术后存在着更显着的PCNA和CD31的表达。2.肝切手术促进肿瘤生长通过肝损及部分切除后构建小鼠肝癌模型,发现肿瘤生长更为迅速。与对照组相比,手术损伤组小鼠肝脏纤维化程度更为严重,PCNA和CD31的表达更强。通过核磁拍照也同样证明经过手术切除部分肝脏再构建的肝癌模型,肿瘤生长更为致密,更为严重。3.术后肝脏局部IL-11表达升高通过对肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织进行基因芯片分析,发现IL-11在肿瘤组织中显着高表达。而IL-6在癌和癌旁中的表达水平均较高。通过对肝切后不同时间点的小鼠肝脏进行组化及ELISA检测,也发现IL-11在肝切后显着升高。最后通过GEO数据库,对374例肝癌组织与50例癌旁组织进行基因分析,发现仍然IL-11在肝癌组织中呈现出显着性高表达。4.IL-11信号对肝癌术后复发是必须的通过对Il-RaαKO鼠研究,我们发现当小鼠敲除IL-11信号后,可显着减缓肝癌术后的复发。无论肿瘤数目、重量,PCNA、AFP及p-STAT3表达均显着低于对照组。说明IL-11信号对肿瘤术后的复发是必要的。5.抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡通过体外使用IL-11刺激Hepa1-6细胞后,发现可以促进细胞增殖。当使用STAT3抑制剂Napabucasin阻断IL-11-STAT3信号后,则细胞发生明显凋亡。通过流式检测发现抑制IL-11信号后,7AAD+细胞比例显着增多;通过免疫荧光检测发现当使用Napabucasin处理细胞后,PCNA的表达显着降低。通过western blot检测发现在使用Napabucasin处理后,无论是否在细胞培养条件中加入IL-11或IL-6,细胞的p-STAT3表达都受到了显着抑制。6.Napabucasin可抑制术后复发通过使用Napabucasin治疗肝内接种肿瘤细胞后的小鼠,发现可以有效抑制肿瘤的生长。且HE染色发现肝脏病理损伤较轻,同时组化染色发现PCNA表达显着降低。继而通过术后复发模型,即手术切除肝脏肿瘤后再给小鼠注射Napabucasin,同样发现肿瘤生长受限。7.IL-6对肝癌术后复发不是必要因素我们发现Il-6KO鼠在接种肿瘤细胞后,可以正常成瘤。当手术切除肿瘤后能够正常复发。但在术后给予Napabucasin治疗则显着抑制复发。无论肿瘤大小、数目、重量以及PCNA表达都显着降低。8.抑制STAT3磷酸化可抑制IL-11对肿瘤生长的促进作用通过对WT鼠接种肝癌细胞系后,再给小鼠注射IL-11则能够显着促进肿瘤生长,而一旦使用Napabucasin治疗,则显着抑制肿瘤。同时发现当小鼠加入使用IL-11后肝脏纤维化程度加重,PCNA及AFP表达升高;而当使用Napabucasin治疗后,则显着抑制肿瘤生长,纤维化程度减弱,PCNA及AFP表达也明显受到抑制。此外,对DEN诱导的自发肝癌组织再经过同种异体移植后,发现经过手术切除肝脏肿瘤后,肿瘤依旧可以复发。然而在术后给予Napabucasin治疗后,则明显该模型中肝癌的术后复发。PCNA及p-STAT3的表达也相应的显着降低。综上所述,本研究表明在肝癌环境下,将肝脏肿瘤切除后,肝脏再生的过程中产生的细胞因子IL-11可通过IL-11-STAT3信号途径促进肿瘤生长,因此肝再生的同时也伴随了肝癌的复发。而对于肝癌患者又无法不进行手术,因此在术后联合使用如STAT3抑制剂Napabucasin可能起到较好的防止肝癌复发的作用,具有潜在的临床意义。
杨凯[6]（2019）在《白介素-35与乙型肝炎病毒感染关系及其抗病毒活性的机制研究》文中研究指明背景 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染导致的慢性乙型肝炎是严重威胁人类健康的重要传染病。有效地抗病毒治疗,对于延缓或阻断慢乙肝患者的疾病进程具有重要意义。干扰素类（普通干扰素和聚乙二醇化干扰素）和核苷（酸）类似物（拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替诺福韦等）是临床慢乙肝抗病毒治疗的一线药物。然而,长期用药所带来的干扰素抵抗和核苷（酸）类似物耐药等问题,严重影响抗病毒疗效。因此,迫切需要寻找更加有效的新型抗病毒生物制剂。现已明确,机体免疫系统的多种细胞因子（IFN、IL-12、IL-15、IL-29、IL-27及IL-32γ等）均具有不同程度地抗HBV活性。其中,与IL-12、IL-27同属于IL-12家族的IL-35是新发现的细胞因子,由IL-27β链EBI3和IL-12α链P35两个异源亚基组成。据报道,在多种自身免疫性疾病动物模型（免疫相关性血细胞减少症、原发性干燥综合征、Beh?et病、溃疡性结肠炎及克罗恩病等）,发现IL-35能够减轻体内炎症程度进而显着缓解疾病症状,提示IL-35具有治疗自身免疫性疾病的临床应用价值。最新研究发现,在感染宿主的非免疫细胞中,IL-35能通过促进细胞分泌干扰素继而发挥广谱的抗病毒活性,包括甲型流感病毒、人肠道病毒71、水疱性口炎病毒等。我们前期研究发现,无论是瞬时转染HBV全基因组的HepG2和LO2细胞,还是稳定转染HBV基因组的PLC/PRF/5细胞,IL-35均能抑制HBV复制和抗原分泌,提示IL-35可能具有潜在抗HBV活性。目的 通过临床与体外实验研究,探讨HBV感染与IL-35表达可能存在的关系,并阐明IL-35在抗病毒治疗的作用,从而揭示IL-35影响病毒复制及IFN-α抗病毒活性的机理,以期为今后研发新型抗HBV生物制剂提供新的线索。方法 以169例未治疗的慢性HBV感染患者和54例健康人群为研究对象,运用ELISA技术分析血清IL-35含量,免疫组化技术分析肝组织中IL-35表达水平与分布情况;随访36例接受48周Peg-IFN-α抗病毒治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者,动态监测患者血清IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-5、IL-10、IL-6和IL-35含量;依据抗病毒疗效,将患者分为持续性应答和不应答患者,分析不同疗效患者血清IL-35含量的基线水平和动态变化特征。以HepG2、HepG2.2.15、Huh7、LO2和PLC/PRF/5细胞为模型,通过转染HBV全基因质粒pHBV1.3或HBV编码蛋白表达质粒（pEGFP-HBs、pEGFP-HBc、pEGFP-HBx和pEGFP-HBp）至肝细胞,实时荧光定量PCR和ELISA技术分析IL-35 mRNA和蛋白含量;通过启动子报告质粒pGL3-EBI3-promoter和pGL3-p35-promoter与HBV编码蛋白表达质粒共转染细胞,再以NF-κB抑制剂SN50处理,光度计测定细胞荧光素酶活性;采用不同浓度IL-35或与IFN-α联合处理转染HBV基因的肝细胞,分析细胞内HBV-DNA、上清液HBV抗原含量;共转染pcDNA3.1/EBI3或pcDNA3.1/P35与HBV全基因质粒,分析细胞内病毒复制水平;IL-35处理肝细胞后,Western-blotting和细胞免疫荧光技术等分析IFN-α-JAK-STAT信号通路分子表达、干扰素应答元件ISRE活性;共转染pGL3-IL-6-promoter与HBV全基因质粒至肝细胞,IL-35处理后分析细胞荧光素酶活性;以siRNA干扰（转染siRNA-STAT1、siRNA-STAT2和siRNA-IRF-9）肝细胞JAK-STAT信号通路分子,IFN-α处理后分析上清液IL-6含量;IL-6单独处理或与IFN-α联合处理细胞,Western-blotting检测细胞内SOCS3蛋白表达,并进一步分析其对细胞抗病毒蛋白表达及HBV复制的影响;最后,以IL-35处理转染病毒质粒的肝细胞,整体分析IL-35可能存在的抗病毒机理。结果 临床研究发现,在慢性HBV感染患者血清和肝组织IL-35含量较健康人群显着升高,尤其是HBeAg阴性慢性HBV感染患者。除肝细胞外,患者肝组织炎症细胞也表达IL-35;IFN-α治疗过程中,患者血清IL-2、TNF-β和IL-6分别在治疗48周、12周和12周降低最为明显,而IL-35、IFN-γ和IL-10则分别在12周、24周和36周升高最为显着。持续性应答组患者较不应答组患者的血清IL-35含量在基线水平高,同时在治疗12周时上升也更为明显。基线和治疗12周的IL-35含量预测HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒疗效的曲线下面积分别为0.74和0.85。体外细胞实验研究发现,IL-35两个异源亚基EBI3和P35在HBV全基因稳转的HepG2.2.15细胞中含量显着较HepG2细胞升高,并且瞬时转染pHBV1.3至HepG2、Huh7和LO2细胞后,细胞EBI3和P35的mRNA和蛋白含量也均上升;HBx通过NF-κB增强EBI3和P35启动子活性进而能诱导上述肝细胞分泌IL-35。IL-35在体外能抑制HepG2、LO2细胞HBV复制和PLC/PRF/5细胞分泌HBsAg;IL-35与IFN-α联合处理HepG2和LO2细胞后,显着提高IFN-α抗HBV活性。IL-35对HepG2、LO2和PLC/PRF/5细胞内JAK-STAT分子表达及干扰素刺激应答元件ISRE活性无显着影响,却能通过下调IL-6启动子活性继而减少肝细胞分泌IL-6,从而发挥抑制HBV复制的作用。IFN-α呈时间和浓度依赖性诱导HepG2和LO2细胞IL-6表达,而加入外源性IL-6能抑制IFN-α抗HBV效应。转染siRNA-IRF-9显着抑制IFN-α诱导肝细胞IL-6上调表达,而转染pcDNA3.1/IRF-9促进IFN-α诱导效应。IL-6或IFN-α诱导肝细胞表达SOCS3;而IL-35处理转染HBV全基因组的HepG2和LO2细胞,能下调细胞分泌IL-6和SOCS3和上调抗病毒蛋白MxA,OAS和PKR的表达。结论 （1）HBV感染导致慢性HBV感染患者体内IL-35含量升高;（2）高水平IL-35有利于IFN-α抗病毒疗效;（3）HBV通过HBx/NF-κB信号通路增强IL-35亚基启动子活性进而诱导肝细胞分泌IL-35;（4）HBV和IFN-α均能诱导肝细胞分泌IL-6,其中JAK-STAT信号通路重要分子IRF-9介导IFN-α诱导效应;（5）IL-35通过抑制IL-6/SOCS3信号通路继而发挥直接抗病毒活性和与IFN-α协同抗病毒效应。
薛源[7]（2016）在《乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究》文中研究表明背景与目的乙型肝炎病毒（HBV）基因组中存在富含CpG的DNA片段,包括CpG岛和寡聚脱氧核苷酸片段（CpG ODN）。CpG岛是甲基化介导基因沉默的重要靶区,与病毒复制有关。HBV准种基因组中CpG岛的特征未见报道。本研究第一部分对来源于不同临床感染阶段或结局的、不同基因型的HBV准种基因组中CpG岛的特征进行分析,探讨HBV准种中CpG岛与基因型及临床结局的关系。另外,CpG ODN是Toll样受体9的配体,具有免疫调节功能。第二部分从HBV基因组中筛选CpG ODN,探讨其免疫调控机制和潜在的抗病毒应用价值。研究对象与方法第一部分共纳入40例患者,其中10例急性乙型肝炎（AHB）,9例慢性HBV携带者（免疫耐受期,IT）,11例慢性乙型肝炎（CHB）,10例慢加急性肝衰竭（ACLF）。其中B基因型18例,C基因型22例。通过克隆测序方法得到599个HBV全长基因组序列,分析这些序列中CpG岛的分布、长度和准种异质性。第二部分纳入CHB患者16例,通过体外刺激外周血单个核细胞（PBMC）筛选具有免疫功能的CpG ODN（CpG2408）,分别用流式细胞技术和ELISA方法检测浆液样树突细胞（p DC）的活化和IFN-α的产生。此后,通过尾静脉高压注射p AAV/HBV1.2质粒建立携带HBV小鼠模型,隔天一次静脉注射筛选获得的CpG2408,在造模后第1、4、7、14、21天采血检测HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶（ALT）,以验证其可能的抗病毒作用。结果第一部分:HBV基因组中CpG岛的分布和长度在B基因型和C基因型之间有差异。268个B基因型的HBV克隆中,214个（79.85%）含有三个经典的CpG岛（CGI、CGII和CGIII）,169个（63.06%）克隆的CGII呈断裂型;331个C基因型的HBV克隆中,仅40个（12.08%）克隆含有3个CpG岛（CGI、CGII、CGIII）,16个（4.83%）克隆的CGII呈断裂型。B基因型HBV准种中CGI和断裂的CGII较C基因型更常见;B基因型HBV准种中的CGII和CGIII短于C基因型,而两种基因型之间CGII和CGIII的准种异质性无显着差异。对于同一患者的HBV准种中CpG岛分布的一致性,B基因型为18.75%～100%,其中94.44%的患者其一致性>75%;C基因型为0%～100%,其中86.40%的患者其一致性>75%。另外,不同感染结局或阶段的患者外周血HBV基因组中CpG岛的准种特点也不同。AHB组的CGII短于慢性感染组,且其准种异质性低于慢性感染组;在慢性感染的亚组中,IT组的CGII和CGIII均最长,且异质性最低。CHB组和ACLF组之间CGII和CGIII的准种特征均无显着差异。第二部分:体外细胞实验发现来源于HBV基因组的寡聚脱氧核苷酸片段CpG2408可以使p DC细胞内TLR9表达增加,p DC活化并产生大量IFN-α;还可以活化NK细胞,产生少量IFN-γ;动物实验显示CpG2408显着降低HBV携带小鼠的血清HBs Ag和HBV DNA,且呈剂量依赖性;联合重组乙型肝炎疫苗（r HBs Ag）时降低HBs Ag的作用更加明显;联合恩替卡韦时可显着降低小鼠血清HBs Ag和HBe Ag水平。C57BL/6小鼠对CpG2408单用、联合r HBs Ag或恩替卡韦均显示出很好的耐受性。结论HBV全长基因组中CpG岛的准种特点因基因型和感染临床阶段或结局不同而异,具体机制还有待于进一步研究;另外,本研究从HBV基因组中筛选出免疫调节功能较强的寡聚脱氧核苷酸片段CpG2408,可以显着降低HBV携带小鼠的血清HBs Ag及HBV DNA,能否用作抗病毒药物或免疫佐剂,值得进一步研究。
李茂仕[8]（2014）在《血清CCL20水平在慢性HBV感染不同临床表型中的诊断价值》文中研究说明目的：研究慢性HBV感染者不同临床表型细胞因子谱的特征及血清CCL20水平在HBV相关肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌中的诊断价值。方法：90例慢性HBV感染者，根据HBsAg浓度、HBV DNA、HBV血清标志物及ALT水平将其分为持续ALT正常和慢性乙型肝炎两部分。持续ALT正常者包括免疫耐受、非活性HBsAg携带、HBsAg清除等三种表型，健康献血员做对照；慢性乙型肝炎根据HBeAg状态分为HBeAg阳性和HBeAg阴性两种表型。通过定制的蛋白质芯片检测血清IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、 IL-15、 IL-17A、 IL-17C、 IL-21、 IL-22、 IL-23p19、 IL-28A、 IL-29、CCL5、CCL16、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CD30、 GITR、IL-6R、 gp130和TGF-β1等30个细胞因子的表达水平，蛋白质相互作用分析工具STRING分析细胞因子间的相互作用。在此基础上，筛选出CCL20进行深入分析。共纳入85例慢性HBV感染者及45例HBV相关肝细胞癌患者，ELISA检测血清CCL20水平，PASW18.0统计学分析血清CCL20水平与其余反映肝脏病变程度的检测指标（血清肝纤维化指标、Fibroscan测定的肝脏硬度值、肝活检病理纤维化分期及肿瘤大小）的相关性，并对其在慢性HBV感染病情程度诊断的价值进行评估。结果：1.与健康对照相比，持续ALT正常的慢性HBV感染者JAK-STAT信号通路相关因子表达普遍上调，包括γ链细胞因子（IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15及IL-21）、IL-12家族成员（IL-12p40、IL-12p70及IL-23p19）和λ干扰素（IL-28A和IL-29）；非活动性HBsAg携带组IL-2、IL-4、IL-15、IL-21、IL-12p70、IL-23p19及IL-29表达升高是其区别于其他两种表型的重要特征。2.无论HBeAg阳性或阴性慢性乙型肝炎患者，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL20、IL-10、IL-4、IL-17C、IL-1β、IL-12p70、IL-17A与ALT均存在显着正相关性，CXC亚族的三个因子CXCL9、CXCL10、CXCL11的相关程度最高。gp130、IFN-γ、IL-23p19、IL-12p40、IL-22、IL-29、IL-6、IL-9、GITR与ALT的显着正相关仅见于HBeAg阳性慢性乙型肝炎中； IL-7、IL-21及TGF-β1与ALT的显着相关性仅见于HBeAg阴性慢性乙型肝炎。ALT＞5×ULN者与非活动性HBsAg携带组间的细胞因子表达差异数量分别为11个和17个，其中的11个因子在两种表型CHB组中一致，另外6个仅在HBeAg阴性慢性乙型肝炎组中呈现低表达的因子分别为IL-29、IL-6、IL-9、IL-6R、IFN-γ、TGF-β1。3.血清CCL20水平在HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中与肝纤维化指标（HA、PCⅢ、 CⅣ、 LN）的相关性分析结果分别为0.444（P=0.008）、0.396（P=0.019）、0.424（P=0.011）和0.415（P=0.013），而在HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中相关性分析结果分别为0.731（P=9.930×10-6）、0.634（P=2.932×10-4）、0.361（P=0.218）和0.284（P=0.134）；其与肝脏硬度值的相关系数为0.507（P=7.282×10-7）。4.血清CCL20诊断诊断肝纤维化的ROC曲线下面积为0.848，P=7.055×10-5，最佳临界值77.4pg/mL,敏感度70%，特异度96%；诊断不良预后肝癌的ROC曲线下面积0.718，P=0.03，最佳临界值66.9pg/mL。结论：1.JAK-STAT通路多种细胞因子表达上调是慢性HBV感染的重要免疫特征；IL-2、IL-15、IL-21、IL-12p70、IL-23p19及IL-29表达升高有利于HBV免疫清除；2.CXCL9、CXCL10、CXCL11及CCL20适合作为衡量慢性HBV感染炎症程度的免疫评估指标；IL-29、IL-6、IL-9、IL-6R、IFN-γ、TGF-β1上调缺陷可能与HBeAg阴性慢性乙型肝炎的免疫发病机制有关；3.CCL20在慢性乙型肝炎中具有促炎和致纤维化双重特征，其血清水平适合作为HBV相关肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的诊断和预后评估的免疫指标。
和欢[9]（2014）在《IL-12基因多态性及相关炎症因子血浆水平与慢性HCV感染及治疗应答关系的研究》文中研究表明目的：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是慢性肝病的主要致病因素，目前感染者在全球达1.8亿，感染率约为3％，我国人群抗-HCV阳性率为3.2％。丙型肝炎慢性化率为75％-85％，其中20％进展为肝硬化，肝癌发生率为1％-4％，严重危害人类健康和生命。目前尚无预防HCV感染的有效疫苗，临床标准治疗方案为干扰素联合利巴韦林，但其疗程较长，副作用大，持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）率仅为38％-60％，仍有很大一部分患者病毒感染持续存在。HCV致病机制复杂，研究发现，HCV感染的不同临床转归与某些细胞因子基因多态性相关。此外，机体的免疫状态与慢性HCV感染/病毒学应答的关系密切。与其他病毒感染一样，HCV感染诱导激活了非特异性免疫应答和特异性免疫应答，在诱导和激活HCV特异性细胞免疫应答中，Th1细胞扮演着重要的角色。方法：选择2012年1月2013年9月在河北医科大学第三医院、石家庄市五院、邢台市人民医院、邯郸市传染病院住院及门诊慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）患者256例，分别进行IL-12基因多态性与相关因子的表达与疾病进展及治疗应答的关系的研究。1IL-12rs3212227基因多态性与HCV感染的关系CHC患者256例，健康体检者129例作为对照，应用TaqMan探针法检测IL-12rs3212227位点基因多态性，分析CHC患者IL-12B等位基因、基因型分布与健康人群之间的差异。2血浆IL-12、IL-10、IFN-γ水平与HCV感染状况及治疗应答关系的研究CHC患者52例，年龄在1865岁，干扰素联合利巴韦林治疗，疗程为48周。另外选择年龄、性别匹配的健康体检者40例作为对照组，自发清除者40例，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测对照组、自发清除组及CHC患者治疗前、治疗12周和治疗结束后随访24周时血浆IL-12、IL-10、IFN-γ水平，分析CHC患者与健康人群和自发清除者血浆IL-12、IL-10、IFN-γ之间的差异；结果：1IL-12B基因多态性检测CHC患者与健康对照等位基因A/C分布及基因型AA（32%vs38%）、AC（48%vs42%）、CC（20%vs20%）分布比较均无统计学意义（χ2=0.573，P=0.449）。256例CHC患者中95例进行了基因型检测，HCV基因1型与2型CHC患者等位基因A/C分布及基因型AA（37%vs20%）、AC（45.2%vs50%）、CC（17.8%vs30%）分布比较均无统计学意义（χ2=2.645， P=0.267）。随访结束的患者中，100例获得SVR，60例未获得SVR，获得SVR和未获得SVR患者等位基因A/C分布及基因型AA（37%vs27.4%）、AC（45%vs51.6%）、CC（18%vs21%）分布差异均无统计学意义（χ2=1.582， P=0.453）。2IL-12、IL-10、IFN-γ血浆水平的变化CHC患者抗病毒治疗前基线血浆IL-12含量与健康对照组及自发清除组相比差异均具有统计学意义（P <0.001），自发清除组与健康对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。获得SVR与未获得SVR患者相比，在基线、治疗12周及治疗结束后随访24周时获得SVR患者IL-12水平显着高于未获得SVR组（P <0.001），且在治疗过程中呈上升趋势（P <0.001）；未获得SVR患者在不同时间点IL-12血浆水平差异无统计学意义（P>0.05）。CHC患者抗病毒治疗前基线和自发清除组血浆IL-10含量均明显高于健康对照组（P <0.001）。获得SVR与未获得SVR患者相比，基线、治疗12周及治疗结束后随访24周获得SVR显着低于未获得SVR患者（P <0.01，P <0.05，P <0.001），两组在治疗过程中血浆IL-10含量差异均无统计学意义（P>0.05）。CHC患者抗病毒治疗前基线血浆IFN-γ含量与健康对照组和自发清除组相比差异有统计学意义（P <0.001），自发清除组血浆IFN-γ含量显着高于健康对照组（P <0.01）；获得SVR与未获得SVR患者相比，在治疗12周及治疗结束后随访24周时获得SVR显着高于未获得SVR患者（P <0.001）；获得SVR患者在治疗过程中，IFN-γ含量呈上升趋势（P <0.001）；未获得SVR患者在不同时间点IFN-γ血浆水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1IL-12B基因多态性与HCV感染和预后可能无明确关系。2CHC患者血浆IL-12和IFN-γ含量在抗病毒治疗过程中升高，从而增强抗病毒免疫反应，清除体内的HCV，易获得SVR。3血浆IL-10水平可能为慢性HCV感染病毒自发清除的预测指标之一。
陈宇[10]（2013）在《促炎因子与抗炎因子水平的动态变化对HBV所致严重肝损伤结局的影响》文中认为目的：通过检测乙型肝炎病毒（HBV）严重肝损伤患者血清中促炎因子与抗炎因子水平在病程中的动态变化，探讨两者水平平衡改变在重型肝炎发病机制及临床治疗中的意义。材料与方法：37例患者根据临床表现、凝血功能、肝功能恢复时间分为快速恢复组、慢速恢复组及治疗失败组，同时设置20例肝功能轻度损害组对照。采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定患者发病初期（基线）、治疗1周后、缓解期或极期和出院时血清促炎因子IL-12、IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α及抗炎因子IL-10、TGF-β、IL-35的水平；比较不同组别中各细胞因子水平的动态变化。结果：1、严重肝损伤发病初期（基线）快速恢复组、慢速恢复组、治疗失败组、对照组TNF-α的含量分别为63.76±27.84（pg/ml）、107.7±54.92（pg/ml）、118.19±38.09（pg/ml）、16.43±2.81（pg/ml）；IL-12的含量分别为80.48±58.47（pg/ml）、121.46±39.27（pg/ml）、131.51±87.58（pg/ml）、32.81±16.78（pg/ml）；IL-17的含量分别为111.55±40.05（pg/ml）、143.46±36.25（pg/ml）、160.58±41.56（pg/ml）、35.50±33.97（pg/ml）；IFN-γ的含量分别为246.2±92.14（pg/ml）、360.41±96.53（pg/ml）、412.06±139.9（pg/ml）、64.11±15.48（pg/ml）；IL-1β的含量分别为290.39±55.58（pg/ml）、395.19±26.7（pg/ml）、449.78±118.4（pg/ml）、56.84±24.79（pg/ml）。均表现为治疗失败组＞慢速恢复组＞快速恢复组＞对照组，其中治疗失败组与慢速恢复组比较均无差异（P＞0.05），余两两比较均有统计学意义（P＜0.05）。2、严重肝损伤发病初期（基线）快速恢复组、慢速恢复组、治疗失败组、对照组中抗炎因子水平：a、IL-10的含量分别为104.84±28.02（pg/ml）、27.59±6.32（pg/ml）、29.25±3.21（pg/ml）、48.72±2.64（pg/ml），表现为快速恢复组＞对照组＞治疗失败组＞慢速恢复组，除慢速恢复组与治疗失败组之间无差异（P＞0.05）外，余两两比较均有意义（P＜0.05）；b、TGF-β的含量分别为170.97±71.38（pg/ml）、127.63±28.98（pg/ml）、39.91±8.53（pg/ml）、87.96±28.31（pg/ml），快速恢复组＞慢速恢复组＞对照组＞治疗失败组，两两比较均有差异（P＜0.05）；IL-35的含量分别为314.02±120.18（pg/ml）、287.03±39.95（pg/ml）、270.37±18.79（pg/ml）、102.67±49.35（pg/ml），表现为快速恢复组＞慢速恢复组＞治疗失败组＞对照组，但快速恢复组、慢性恢复组和治疗失败组之间两两比较均无显着差异（P＞0.05）。3、促炎因子的动态变化：a、快速恢复组中，促炎因子的水平一直呈下降趋势：基线＞治疗1周后＞出院时，且前后比较有显着差异（P＜0.05）。b、慢性恢复组中促炎因子IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平变化表现为：治疗1周后＞基线，两者比较有统计学意义（P＜0.05）；IL-12水平为治疗1周后＜基线，两者比较无统计学意义（P＞0.05）；5种促炎因子的水平在缓解期均下降并在出院时降至低水平：缓解期＜治疗1周后、出院时＜缓解期，前后比较均有统计学意义（P＜0.05）。c、治疗失败组：促炎因子IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α一直持续上升：出院时＞极期＞治疗1周后＞基线，前后比较有差异（P＜0.05）；IL-1β的水平变化为：极期＞治疗1周后＞基线，前后比较有差异（P＜0.05），出院时＜极期，但无统计学意义（P＞0.05）且其仍处于高水平。4、抗炎因子的动态变化：a、快速恢复组3种促炎因子均在治疗1周后达到峰值，出院时降至低水平：治疗1周后＞基线、治疗1周后＞出院时，两者互相比较有统计学意义（P＜0.05）。b、慢性恢复组IL-10和TGF-β表现为：缓解期＞治疗1周后＞基线，前后比较有差异（P＜0.05），但出院时则表现不同IL-10为出院时＜缓解期（P＜0.05），而TGF-β浓度仍继续升高即出院时＞缓解期（P＜0.05）；IL-35表现为治疗1周后＜基线（P＞0.05），缓解期＜治疗1周后（P＜0.05），出院时＞缓解期（P＞0.05）。c、治疗失败组IL-10表现为基线＞治疗1周后＞极期＞出院，前后比较有统计学意义（P＜0.05）；TGF-β表现为基线＞治疗1周后、极期＞治疗1周后、极期＞出院时，但两两比较均无意义（P＞0.05）；IL-35的水平会出现轻微的上升，基线＜治疗1周后＜极期＜出院时，但仍处于低水平状态，且前后比较均无统计学意义（P＞0.05）。结论：1、HBV严重肝损伤患者发病初期促炎因子IL-12、IL-17、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均升高：慢性恢复组和治疗失败组明显大于快速恢复组，说明初期促炎因子的升高在清除病毒时又可导致肝脏损伤，促炎因子水平越高，肝脏损伤越重。而抗炎因子水平的高低又可影响肝脏损伤程度，初期抗炎因子水平越高，肝脏损伤则更轻，且更易于恢复。2、两者之间的动态变化影响疾病结局：随着抗炎因子（主要是IL-10和TGF-β）水平升高而促炎因子水平下降或仍处于较低水平的患者病情趋于好转（快速恢复组和慢速恢复组），而促炎因子持续处于高水平无明显下降且抗炎因子水平处于低水平无明显上升时病情加重或迁延不愈（治疗失败组）；病情好转后抗炎因子TGF-β高水平与肝纤维化有关。因此，两者之间的动态变化将决定疾病的最终结局。
二、原位检测IL-12/IL-10对干扰素治疗乙型肝炎的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原位检测IL-12/IL-10对干扰素治疗乙型肝炎的意义（论文提纲范文）
（1）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）慢乙肝细胞因子的变化与干扰素治疗疗效的相关性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.实验材料 |
| 3.观察内容与方法 |
| 4.质量控制 |
| 5.统计学分析方法 |
| 6.技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间撰写和发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（5）Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论乙肝和肝癌治疗研究现状 |
| 1.1 乙肝 |
| 1.1.1 慢性乙型肝炎的诊断及其感染过程 |
| 1.1.2 乙肝病毒特征 |
| 1.1.3 乙型肝炎与STAT信号相关免疫应答 |
| 1.1.4 慢性HBV感染的治疗 |
| 1.1.4.1 核苷类似物的治疗 |
| 1.1.4.2 干扰素的治疗 |
| 1.1.4.3 核苷类似物及干扰素联合治疗 |
| 1.1.4.4 肝炎其他治疗策略及目前肝炎治疗过程中存在的其他问题 |
| 1.1.5 I型干扰素调控免疫细胞功能 |
| 1.1.6. IL-2及其免疫治疗 |
| 1.2 肝癌 |
| 1.2.1 肝癌的分类及诊断 |
| 1.2.2 肝癌的流行病学及发生机制 |
| 1.2.3 肝再生 |
| 1.2.4 肝癌的治疗 |
| 1.2.4.1 手术 |
| 1.2.4.2 肝移植 |
| 1.2.4.3 介入放射 |
| 1.2.4.4 肝癌的化学治疗 |
| 1.2.4.5 免疫治疗 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床标本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 原代细胞培养相关试剂 |
| 2.1.4 细胞系及培养基 |
| 2.1.5 细菌培养及相关试剂 |
| 2.1.6 质粒及抽提试剂 |
| 2.1.7 RNA体外转录质粒及相关试剂 |
| 2.1.8 细胞因子及小分子抑制剂 |
| 2.1.9 细胞分离和纯化试剂 |
| 2.1.10 总RNA提取和RT-PCR试剂 |
| 2.1.11 核酸序列 |
| 2.1.12 PCR试剂和核酸电泳试剂 |
| 2.1.13 Western blotting试剂 |
| 2.1.14 流式抗体 |
| 2.1.15 免疫荧光及流式细胞术检测相关试剂 |
| 2.1.16 免疫组化及HE染色试剂 |
| 2.1.17 细胞三维立体培养试剂 |
| 2.1.18 抗原特异性T细胞检测试剂 |
| 2.1.19 ELISA检测试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床试验 |
| 2.3.1.1 临床试验Ⅰ |
| 2.3.1.2 临床试验Ⅱ |
| 2.3.2 人单个核细胞分离及CD8~+T细胞的纯化 |
| 2.3.3 人肝癌组织基因芯片数据分析 |
| 2.3.4 细胞总RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.3.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.3.6 流式细胞术检测 |
| 2.3.7 小鼠血清采集 |
| 2.3.8 放射免疫检测 |
| 2.3.9 免疫荧光实验 |
| 2.3.10 免疫组化、HE染色、Masson染色及天狼猩红染色实验 |
| 2.3.11 抗原特异性CD8~+T细胞检测 |
| 2.3.12 ELISA检测细胞因子 |
| 2.3.13 RTCA检测细胞杀伤 |
| 2.3.14 Western blotting |
| 2.3.15 基因缺陷小鼠构建 |
| 2.3.16 小鼠原发肝癌模型构建 |
| 2.3.17 小鼠自发肝癌模型及移植瘤模型构建 |
| 2.3.18 小鼠HBV模型构建 |
| 2.3.19 小鼠肝癌手术切除 |
| 2.3.20 小鼠肝癌模型治疗 |
| 2.3.21 小鼠肝炎模型治疗 |
| 2.3.22 小鼠组织单个核细胞的分离 |
| 2.3.23 统计学分析 |
| 第三章 序贯IL-2治疗有利于提高难治性无应答乙肝患者的免疫功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 Peg-IFN-α-2b治疗后多数CHB患者呈现无应答状态 |
| 3.3 Peg-IFN-α-2b治疗后IL-2Rα在CD4~+T细胞表达显着降低 |
| 3.4 体外使用IL-2促进外周T细胞和NK细胞表达IFN-γ及TNF-α |
| 3.5 体外使用IL-2促进人肝脏淋巴细胞表达IFN-γ |
| 3.6 无应答患者序贯使用IL-2治疗可抑制负调免疫应答 |
| 3.7 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进STAT1活化 |
| 3.8 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进分泌IFN-γ及TNF-α |
| 3.9 无应答患者序贯使用IL-2治疗可提高CD8~+T细胞毒性及抗原特异性CD8~+T细胞比例 |
| 3.10 序贯使用IL-2治疗可提高难治性无应答患者临床治疗效果 |
| 3.11 经Peg-IFNα-2b治疗后CHB患者外周血中CD24~+CD38~(hi)B细胞显着增加 |
| 3.12 Peg-IFNα可诱导CD24~+CD38~(hi) B细胞形成并产生大量IL-10 |
| 3.13 CD24~+CD38~(hi)B细胞抑制T细胞及NK细胞抗病毒能力 |
| 3.14 靶向CD24分子可清除CD24~+CD38~(hi)B细胞 |
| 3.15 anti-CD24抗体联合干扰素提高HBV耐受小鼠的治疗效果 |
| 3.16 讨论与总结 |
| 第四章 肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 手术后肝癌可复发 |
| 4.3 手术诱导肝癌过度生长 |
| 4.4 手术后IL-11水平升高 |
| 4.5 IL-11信号对术后肝癌生长是必要的 |
| 4.6 抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡 |
| 4.7 Napabucasin可抑制WT鼠肝癌术后复发 |
| 4.8 Napabucasin可抑制Il6~(KO)鼠肝癌术后复发 |
| 4.9 Napabucasin能够抑制同种移植模型中肝癌术后复发 |
| 4.10 Napabucasin可防止IL-11诱导的肝癌过度生长 |
| 4.11 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（6）白介素-35与乙型肝炎病毒感染关系及其抗病毒活性的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 不同感结局患者的外周血HBV基因组中CpG岛的准种特染阶段或征分析 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒基因组中CpG寡聚脱氧核苷酸片段的免疫功能研究 |
| 引言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的主要成绩 |
（8）血清CCL20水平在慢性HBV感染不同临床表型中的诊断价值（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 慢性 HBV 感染者不同临床表型细胞因子表达谱 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清 CCL20水平在 HBV 相关肝纤维化、肝细胞癌中的诊断价值评估 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）IL-12基因多态性及相关炎症因子血浆水平与慢性HCV感染及治疗应答关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素-12 及其基因多态性在慢性 HCV 感染中作用及意义研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）促炎因子与抗炎因子水平的动态变化对HBV所致严重肝损伤结局的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究对象来源 |
| 2.1.2 入选标准 |
| 2.1.3 排除标准 |
| 2.1.4 分组依据 |
| 2.1.5 动态观测 |
| 2.2 标本采集及保存 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 试剂与方法 |
| 2.4.1 细胞因子检测方法 |
| 2.4.2 结果判断 |
| 2.5 统计学处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 HBV 所致严重肝损伤患者(基线)促炎因子及抗炎因子的水平 |
| 3.2.1 HBV 所致严重肝损伤患者（基线）促炎因子水平 |
| 3.2.2 HBV 所致严重肝损伤患者（基线）抗炎因子的水平 |
| 3.3 不同组别促炎和抗炎因子在各监测点的水平及动态变化 |
| 3.3.1 快速恢复组各细胞因子水平的动态变化 |
| 3.3.2 慢速恢复组各细胞因子水平的动态变化 |
| 3.3.3 治疗失败组各细胞因子水平的动态变化 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 促炎因子在 HBV 严重肝损伤中的作用及动态变化 |
| 4.2 抗炎因子在 HBV 严重肝损伤中的作用及动态变化 |
| 4.3 促炎因子与抗炎因子在严重肝损伤中的联系 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、原位检测IL-12/IL-10对干扰素治疗乙型肝炎的意义（论文参考文献）
- [1]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [2]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [3]慢乙肝细胞因子的变化与干扰素治疗疗效的相关性分析[D]. 朱艳芳. 新疆医科大学, 2020(07)
- [4]慢性HBV感染者血清IL-10、IL-12和IFN-γ水平的差异研究[J]. 邓丽霞,徐军,王春娟,李艳芳,范璐,孙婧,刘友德,邹志强. 中华实验和临床病毒学杂志, 2019(05)
- [5]Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究[D]. 王冬耀. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [6]白介素-35与乙型肝炎病毒感染关系及其抗病毒活性的机制研究[D]. 杨凯. 安徽医科大学, 2019(09)
- [7]乙型肝炎病毒基因组CpG DNA片段的准种特点及免疫功能研究[D]. 薛源. 上海交通大学, 2016(05)
- [8]血清CCL20水平在慢性HBV感染不同临床表型中的诊断价值[D]. 李茂仕. 第三军医大学, 2014(01)
- [9]IL-12基因多态性及相关炎症因子血浆水平与慢性HCV感染及治疗应答关系的研究[D]. 和欢. 河北医科大学, 2014(09)
- [10]促炎因子与抗炎因子水平的动态变化对HBV所致严重肝损伤结局的影响[D]. 陈宇. 南昌大学, 2013(07)