一、胶原Ⅳα_1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
边若菲[1]（2021）在《嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究》文中研究指明主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）作为一类与免疫应答密切相关的基因群,主要参与抗原的呈递作用。其中MHCI类基因α链的抗原结合部位,是变异最大的区域,与疾病的抗性密切相关。近些年来,由于自然环境变化和其他人为因素,两栖类动物的种群数量呈逐年下降趋势,甚至某些物种的数量已经处于濒临灭绝的边缘,微生物感染是其中的重要原因之一。研究MHC基因在抗感染中的作用已经成为两栖类抗病研究的热点内容。本研究以东北林蛙为主要研究对象,黑龙江林蛙为对比物种,克隆两种蛙MHCI类基因α链全长编码区,通过生物信息学软件分析MHCI类基因特性;同时构建MHCI基因肽结合区的重组原核表达载体,制备多克隆抗体;再采用嗜水气单胞菌和LPS进行胁迫,利用实时荧光定量PCR技术分析MHCI m RNA转录情况;再通过HE染色法和免疫组织化学法观察东北林蛙病理学变化及蛋白表达情况,为两栖类MHCI类基因的免疫功能研究提供理论基础。主要研究结果如下:（1）本研究克隆东北林蛙和黑龙江林蛙的MHCIα基因全长编码区,获得编码区长度均为1047bp,编码348个氨基酸。两种林蛙核苷酸和氨基酸同源性分别为88.7%和97%;东北林蛙有1个糖基化位点,33磷酸化位点,而黑龙江林蛙有3和19个;二者均含有一个IGc1功能域;进化关系表明,东北林蛙、黑龙江林蛙与中国林蛙的同源性最高,与哺乳类和禽类亲缘关系最远。（2）本研究构建了东北林蛙MHCI基因α链肽结合区的重组表达载体,诱导的重组蛋白大小为39k D,免疫家兔后获得多克隆抗体效价为1:20000。（3）采用实时荧光定量PCR技术检测,正常生理情况下MHCI类基因在东北林蛙和黑龙江林蛙各组织中均表达,但在脾脏中具有较高的表达量。（4）在嗜水气单胞菌和LPS胁迫下,东北林蛙和黑龙江林蛙肺脏、肾脏、脾脏和皮肤的MHCI类基因转录水平都偏高,而在肝脏和肌肉组织中MHCI类基因对LPS的响应更为积极。在嗜水气单胞菌感染模型中,东北林蛙肝脏、脾脏和皮肤在6h到达峰值,肺脏和肌肉组织中在12h达到峰值,而肾脏组织则在24h时达到峰值;黑龙江林蛙肝脏、脾脏、皮肤和肌肉中MHCIm RNA在6h就出现了最高峰,而在肺脏和肾脏中的峰值分别出现在感染后12h和24h。在LPS感染模型中,东北林蛙MHCI基因在被检组织中均呈现上调表达,其肺脏和皮肤在12h达到峰值,肝脏和脾脏分别在24h和48h达到最高峰,而肾脏和肌肉组织均在72h达到峰值;黑龙江林蛙肝脏和肌肉组织中MHCIm RNA分别在6h和12h达到最高峰,肾脏和皮肤组织在24h达到峰值;脾脏和肺脏中的峰值分别出现在48h和72h,而在心脏组织中两种蛙MHCI基因整体转录水平较低。（5）经HE染色显示,在嗜水气单胞菌和LPS胁迫下会导致东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉组织随着感染时间延长,细胞损害加剧。免疫组织化学结果显示,与对照组相比,感染嗜水气单胞菌和LPS后东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉出现了更多的棕黄色阳性颗粒,其中嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙肝脏和皮肤在6h就出现较多棕黄色颗粒,而肌肉组织在12h才出现阳性颗粒明显增多的现象;LPS胁迫下东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉MHCI蛋白表达量分别在24h、12h和72h为最高。本研究对东北林蛙和黑龙江林蛙MHCIα基因进行克隆,对东北林蛙MHCI肽结合区进行原核表达并制备多克隆抗体;对嗜水气单胞菌和LPS胁迫下两种林蛙MHCI在不同组织中的变化规律进行了分析。本研究为两栖类MHCI基因的免疫功能研究提供了理论依据,同时也为两栖类进化、传染病抗性等问题的研究提供新的思路。
盛露菲[2]（2021）在《Lactobacillus fermentum 4,6-α-葡萄糖基转移酶的克隆表达、酶学性质及应用研究》文中提出麦芽糊精作为淀粉的衍生物常被应用于食品、保健品、医药生产等领域,而用酶法以麦芽糊精为底物制备的改性麦芽糊精能使其原有的物化性质得到改善,同时还可降低麦芽糊精原有的热量,是一种更具有应用前景的膳食纤维。4,6-α-葡萄糖基转移酶（4,6-α-GTases）作为近些年刚被发现的一类酶,具有切割α（1-4）键转苷形成α（1-6）键的功能,因此这类酶在改性麦芽糊精的制备中具有较大的应用潜力。本论文主要研究结果如下:（1）4,6-α-GTases基因的筛选及截短表达。根据已报道的4,6-α-GTases的保守基序设计简并引物并以筛选得到的乳酸菌的基因组为模板进行PCR,结合数据库信息,成功筛选到一个假定的4,6-α-葡萄糖基转移酶基因（gtf16）。该全长基因在E.coli BL21（DE3）中不表达,通过不同的截短方式对目的基因（gtf16）进行截短,目的蛋白截短后的最高酶活为83.7U·m L-1,最适pH为5.0,最适温度为40℃,在40℃下的半衰期为30 min;该酶可以利用麦芽三糖及更大聚合度的麦芽寡糖作为供体底物;其与直链淀粉制备的α-葡聚糖产物是由连续α（1-4）键连接的还原端部分和连续α（1-6）键连接的非还原端部分组成（Ⅰ型）,其中α（1-6）键比例可达75.0%。（2）重组4,6-α-GTase在改性麦芽糊精制备中的应用。根据消化酶水解后产物中抗消化成分（RS）的含量对其制备工艺进行优化,确定反应的最佳条件为:温度45℃,pH 4.5,加酶量2000 U·g-1底物,反应时间6 h。此条件制备的改性麦芽糊精中,RDS含量为22.1%,SDS含量为4.9%,RS含量为73.0%。（3）改性麦芽糊精的体外益生效益探究。添加改性麦芽糊精的培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.5-0.9(OD600),pH从7.0下降至4.5-5.3;添加葡萄糖的培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.3-1.1(OD600),pH从7.0下降至4.0-5.5;基础培养基,各益生菌菌体的浓度在48 h达到0.04-0.16(OD600),pH从7.0下降至6.4-6.7;相较而言,益生菌可以将改性麦芽糊精作为碳源物质利用并可进一步合成短链脂肪酸。（4）改性麦芽糊精对面粉加工品质的影响。从粉质及淀粉糊化两个方面进行分析,改性麦芽糊精的添加会增强面粉的筋力和延缓淀粉的回生。添加7%改性麦芽糊精的高筋面粉,稳定时间从22.6 min延长至29.5 min,弱化度从31.0 Fu降至8.0 Fu,淀粉回生值下降约25.6%;添加5%改性麦芽糊精的中筋面粉,稳定时间从8.9 min延长至11.7 min,弱化度从103.0 Fu降至41.0 Fu,淀粉回生值下降约28.1%。（5）改性麦芽糊精对面包和馒头等面制品品质的影响。添加3%改性麦芽糊精的面包在第一天硬度比对照组低81.7%,常温储存7 d,硬度比对照低22.1%;添加7%改性麦芽糊精的馒头,第一天硬度比对照低53.2%,在4℃冷藏7 d,硬度比对照低54.1%。
侯亚茹[3]（2021）在《遗传操作引入非天然氨基酸形成硫醚键辅助胶原交联》文中指出胶原蛋白由三条多肽链缠绕折叠成三股螺旋,进一步通过组装、交联等方式形成胶原纤维、胶原网状蛋白等高阶结构蛋白,作为生物材料在组织工程等领域具有广泛的应用前景。为了降低动物组织提取可能引发的疾病传播风险,研究人员采用微生物重组表达的方式生产胶原蛋白,然而在重组胶原蛋白的生产中如何促进重组胶原分子交联,使其形成更加稳定的空间结构是设计重组胶原纳米材料需要克服的难点。本课题以来源于Streptococcus pyogenes的胶原蛋白为对象进行序列设计,通过遗传操作手段利用双质粒系统引入非天然氨基酸O-（2-溴乙基）-酪氨酸（O-（2-bromoethyl）-tyrosine,O2beY）并与引入半胱氨酸的胶原蛋白进行硫醚键的交联,为纤维蛋白的组装提供基础。具体内容分为以下四个部分:（1）引入非天然氨基酸共价键辅助胶原交联的设计策略。首先,以来源于S.pyogenes的胶原蛋白三股螺旋区片段B为对象,在其N端、C端、中间以及两端利用双质粒体系经遗传操作引入非天然氨基酸O2beY,分别表示为V-NZ、V-CZ、V-MZ和V-2Z,并在片段B两端设计引入半胱氨酸,以V-2C表示。在体外将带有O2beY和2C的重组胶原蛋白进行反应,通过形成的硫醚键辅助胶原蛋白的交联。并将此策略应用于三股螺旋全长区,分别设计两端引入O2beY的V-SC12-2Z及两端引入半胱氨酸的V-SC12-2C,进一步增大胶原蛋白溶液中的分子粒径,获得更大尺度的胶原纤维;（2）引入O2beY的重组胶原蛋白的表达优化。为获得高纯度含O2beY的重组胶原蛋白,以V-NZ为例对双质粒表达系统的阿拉伯糖浓度、诱导温度和时间以及IPTG浓度进行优化。结果表明在25℃下,以终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG和0.06%的阿拉伯糖诱导24 h可获得高纯度的重组胶原蛋白V-NZ,产量约为20.0 mg·L-1。以此条件对V-CZ、V-MZ、V-2Z 进行异源表达,产量分别为 22.0、25.0、17.0 mg·L-1;（3）胶原蛋白B段突变体的交联优化和表征。为了在体外交联时保持胶原蛋白的三股螺旋结构,选用15℃作为反应温度,研究了交联反应体系pH对成键效率的影响,结果表明,在pH为9.0的NH4HCO3缓冲液中进行交联,硫醚键形成率最高。引入单个O2beY的突变体与2C交联可形成最大分子粒径达1.0 μm的聚集体,但未观察到线性纤维,且未形成水凝胶;V-2Z与V-2C交联可形成最大分子粒径达1.0μm的聚集体,且可观察到少量线性纤维,但仍未形成水凝胶;（4）胶原蛋白SC12突变体的异源表达和交联。在大肠杆菌中异源表达野生型胶原蛋白 V-SC12 及突变体 V-SC12-2Z 和 V-SC12-2C,产量分别为 58.0、45.0、50.0 mg·L-1。在 20℃下,浓度为 1.0 mmol·L-1 和 2.5 mmol·L-1 的 V-SC12-2Z 和 V-SC12-2C 的混合溶液呈胶体状态,交联48 h后可形成最大分子粒径达1.8μm的聚集体,交联7 d后可形成较长的线性纤维。
王晶[4]（2021）在《中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证》文中认为中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国北方重要的海水虾虾类养殖品种,具有极高的经济价值,由于其放苗温度要求高于14℃,限制了它的养殖区域和养殖时间,从而影响了它的上市规格和单位产量。对中国明对虾耐低温品系的培育至关重要,能够扩增养殖区域和养殖大小。本研究通过对中国明对虾仔虾进行低温胁迫处理并进行低温胁迫组与常温对照组的转录组分析,筛选出与耐低温性状相关的基因进行生物信息学分析,并进行原核表达及耐低温验证,以期确定中国明对虾耐低温分子标记,为中国明对虾的耐低温良种培育奠定理论基础。通过对中国明对虾仔虾40日龄野生、40日龄选育、10日龄野生的常温对照组和低温胁迫组共12个样本进行转录组测序,测得576.53 M Raw Reads,过滤后得到521.39 M clean reads,占比90.43%,组装并去冗余后共得到75,905个Unigene。共有 41986 条 Unigene 获得注释,占 All-Unigene 的 55.31%,其中 KEGG数据库注释35.77%、GO数据库注释11.93%。10日龄野生组有14,618个差异基因,其中5,703个上调、8,915个下调;40日龄野生组有13,870个差异基因,其中6,821个上调、7,049个下调;40日龄选育组有22,914个差异基因,其中12,783个上调、10,131个下调。在差异基因的GO注释中,生物过程类注释有20项,富集最多的两类是代谢过程和细胞过程,根据富集气泡图可以看出,细胞过程中mRNA进程和基因表达调控富集最多;细胞组分类注释有14项,富集最多的依次是膜类、膜部分类、细胞类和细胞部分类、细胞器类;分子功能类注释有8项,富集最多的两类则是连接类和催化活性类,根据富集气泡图可以看出,连接类中染色质连接和序列特异性DNA连接富集最多,催化活性类中DNA结合转录因子活性最多。差异基因的KEGG注释主要富集在环境信息处理通路的信号转导通路、代谢及有机系统的免疫系统和内分泌系统相关途径中。以小亚基核糖体蛋白基因为内参基因,对 CL161.Contig1、CL2560.Contig1、CL2861.Contig5、CL5186.Contig2四个基因的real time RT-PCR验证与测序结果相同,表明转录组数据的可靠性。通过转录组数据分析,得到在7个以上比较组中上调的高表达量显着差异基因9个,包括:含bZIP的转录因子、rRNA、RRM域蛋白质、细胞色素b5样蛋白、肌钙蛋白C、胞外蛋白、微管蛋白亚型、lncRNAs。其中,rRNA、细胞色素b5样蛋白及lncRNAs在低温条件下上调表达,在响应低温的相关表达中属于新发现。选择显着上调差异表达基因生物信息学分析为细胞色素b5样蛋白的CL2861.Contig5序列进行了开放阅读框预测和蛋白序列分析,得到一个开放阅读框ORF2861,预测出ORF2861的分子量为16.7kDa,无信号肽、无跨膜区、亚细胞定位可能为内质网,二级结构预测为螺旋有21.33%、β-链有6%、环有72.67%。以大肠杆菌BL21为宿主,利用同源重组方法构建了 pET28a-2861、pET29b-MBP-2861两个重组表达载体,形成表达菌株。16℃ IPTG诱导表达时,pET29b-MBP-2861可溶性表达。通过对是否表达重组蛋白的菌株在0℃和-20℃低温处理12小时及0℃低温处理0-17天的存活率比较,结果表明,重组蛋白的表达明显提高了菌株在低温条件下的存活率。分离纯化后的重组蛋白在体外不能发挥耐低温作用。
蔡向东[5]（2021）在《病变胶原蛋白的靶向成像》文中研究说明胶原蛋白是人体含量最多的蛋白质,也是众多疾病的关键生物标志物。作为细胞外基质的主要成分,胶原蛋白在细胞的黏附、增殖、分化和转移等基本生理过程中扮演重要角色,而它的异常重塑则被认为是纤维化、关节炎、癌症等疾病的关键病理过程。纤维化相关疾病中常发现I型胶原蛋白的过度沉积,类风湿关节炎和骨关节炎病人中则普遍存在II型胶原蛋白的过度降解,而不同类型胶原蛋白的异常分布则被认为与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。因此,病变胶原蛋白的高效检测对这些严重疾病的机理研究、诊断、治疗和预后评价至关重要。本论文旨在开发病变胶原蛋白的靶向多肽探针及相关疾病的组织成像方法,主要内容如下:1)病变胶原蛋白由于其特殊的结构,它的靶向检测一直是巨大挑战。最新研究发现,具有（Gly-Pro-Hyp）n重复序列的多肽探针,在保持单链的状态下,可以特异性结合病变胶原蛋白中的解折叠位点。然而,该类多肽探针会自发形成三聚体,从而丧失对病变胶原蛋白的结合能力。我们首次通过向胶原多肽探针序列中间位置引入氨基脯氨酸,并修饰大位阻的羧基荧光素染料构建了新型多肽荧光探针。该多肽荧光探针保持稳定的单链结构,可以特异性识别不同组织中的病变胶原蛋白。该多肽探针不需要热处理和紫外线处理,消除了组织损伤的潜在风险,在胶原蛋白相关疾病的诊断和治疗中有广泛的应用潜力。2)我们通过将（Gly-Pro-Hyp）7序列与数个带电荷的氨基酸Asp连接,构建了一系列胶原蛋白靶向多肽探针PCTP-Dn（n为Asp的数量）。该系列探针三重螺旋结构的稳定性随Asp的数量增加而逐渐减弱,并且多肽探针PCTP-D6在生理条件下显着保持单链构象。我们构建的新型多肽探针通过静电排斥作用抑制（Gly-Pro-Hyp）n序列三聚体的形成,可以高效检测不同类型的动物结缔组织和人病理组织中的病变胶原蛋白,在胶原蛋白相关疾病的机理研究中有良好的应用前景。3)我们首次构建了一种由重复的（Gly-Hyp-Pro）n序列组成的新型多肽探针F-GOP-10,该探针即使在0°C时仍可保持单链构象。F-GOP-10可以靶向识别人骨关节炎组织中的病变胶原蛋白,但完全不染色正常的软骨组织。同时,F-GOP-10对人肝纤维化和各种癌组织的成功染色,证明它是一种强大的靶向识别病变胶原蛋白的工具。不同数量Gly-Hyp-Pro的F-GOP-n系列多肽探针均未形成三聚体,表明（Gly-Hyp-Pro）n序列本质上具有单链特性。这种100%纯单链的多肽探针,可以被精确定量,能用于石蜡切片和冰冻切片的染色,在临床应用中具有巨大潜力。4)量子点（QDs）具有波长易调节、高亮度等优良的光学性质,在生物传感器领域广泛应用。然而,如何在量子点上修饰靶向多肽并构建稳定的QDs靶向探针,目前仍然困难重重。我们首次设计了主-客体肽系统,用于构建稳定性和选择性俱佳的QDs-多肽探针。我们筛选发现,包含Cys和带负电荷氨基酸的短肽,可以作为主体肽,能够显着增强量子点的稳定性和水溶性;同时,包含Cys和靶向序列的客体肽,很容易非共价键合到量子点上。不同主-客体肽修饰的量子点均表现优良的稳定性和靶向性,并且成功地用于细胞器、膜蛋白和细胞外基质蛋白的成像以及3D肿瘤细胞模型的多组分成像。我们开发的主-客体肽体系,为构建稳定的QDs-多肽探针提供了一种广泛适用、简单可行的方法,为量子点在细胞和组织的靶向成像的应用提供了强有力的工具。5)胶原蛋白在纤维化、癌症等疾病中的病变是一个复杂的过程,中间常常有多种不同类型的胶原蛋白参与。我们利用新建立的主-客体肽体系,构建了多种稳定性和选择性俱佳的QDs-多肽探针,可以同时靶向检测I、II、IV型及变性胶原蛋白。因为量子点的大位阻效应,修饰在量子点上的变性胶原蛋白靶向多肽始终保持单链状态,完全避免了热处理和紫外线处理导致的组织损伤风险。同时,量子点波长易调节的优良性质,赋予了不同靶向多肽探针多色特性,方便实现不同组分的共成像。该新型QDs-多肽探针,成功用于纤维化和胚胎发育过程中不同类型胶原蛋白的靶向成像。我们开发的QDs-胶原蛋白靶向多肽探针体系,为同时、高灵敏、高特异性检测不同类型的胶原蛋白提供了一个高效的工具箱,为纤维化、癌症等严重疾病的机理研究和早期检测提供了新的机遇。
董晓敏[6]（2020）在《代谢工程改造枯草芽孢杆菌产乳酰-N-新四糖》文中研究说明乳酰-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNnT）是人乳寡糖中重要的成分之一,具有增强人体免疫力,调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局（EFSA）、欧盟（EU）和美国食品药品管理局（FDA）批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前,LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法,其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料,且以较低的环境代价获得高经济产出,因此具有更为广阔的应用前景。LNnT（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）是由D-半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖和D-葡萄糖依次连接组成的线性四糖,其合成途径较为复杂。目前生物合成法仍存在一些不足限制了产物的高效合成,如胞内的合成前体供给不足、合成途径与竞争途径之间代谢流不平衡、代谢压力过大可能影响菌株的遗传稳定性等。本论文以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）为研究对象,通过引入外源基因构建LNnT的合成途径;利用模块化工程优化前体合成途径,强化和平衡胞内前体的供给;进一步通过构建CRISPRi系统,降低竞争途径中关键基因的表达水平,实现产物的合成与细胞生长间代谢流的平衡,提高LNnT的合成效率;最后基于启动子工程和突变Spo0A启动子策略构建了一株无芽孢和无质粒的产LNnT的工程菌。主要研究内容如下:（1）通过共表达来自大肠杆菌K12的β-半乳糖苷通透酶（LacY）和来自脑膜炎奈瑟菌MC58的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶（LgtA）和β-1,4-半乳糖基转移酶（LgtB）,以乳糖和胞内的尿苷二磷酸乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc）和尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）为前体,实现了LNnT在枯草芽孢杆菌胞内的合成,产量达到0.61 g/L。然后通过优化关键酶LgtA和LgtB的表达量,有效地将LNnT产量提高到1.31 g/L。（2）采用模块化工程策略提高和平衡关键前体UDP-GlcNAc和UDP-Gal的供给。首先,采用过表达合成途径关键基因以及敲除分支途径关键基因的方法鉴定UDP-GlcNAc和UDP-Gal两个模块的关键酶。然后将每个模块中有利于LNnT产物合成的基因改造进行组装,分别获得4个不同强度的前体供给水平。在此基础上,将两个模块的不同强度进行组合,筛选到最优组合。最优组合是UDP-GlcNAc的中+强度和UDP-Gal的中+强度。在摇瓶发酵条件下,LNnT的产量达到1.95 g/L。最终,在3-L罐上,通过连续补料发酵LNnT的含量达到4.52 g/L。（3）通过利用木糖诱导的CRISPRi系统降低竞争途径中关键基因的表达至合适的水平,弱化竞争途径的代谢流,实现LNnT的胞内前体的合成模块与竞争模块（包括糖酵解途径（EMP）,磷酸戊糖途径（HMP）和磷壁酸合成途径）之间的代谢流分配平衡,有效地提高了LNnT的合成效率。其中竞争模块的关键基因分别是糖酵解途径中的pfkA,pyk基因,磷酸戊糖途径中的zwf基因和磷壁酸合成途径中的mnaA基因。对竞争途径中的每个关键基因分别设计了8个不同抑制效率的sgRNAs,并通过单基因抑制筛选出对LNnT合成有效的sgRNA。然后,将筛选出的sgRNAs进行组合,将竞争途径中的4个关键基因同时进行下调,有效地弱化了竞争途径中的代谢流,从而提高LNnT的合成。进一步敲除基因组上编码UDP-葡萄糖-脱氢酶的tuaD基因,并在基因组上增加1个拷贝数来提高β-1,4-半乳糖基转移酶（LgtB）的表达水平,解除了从中间产物乳酸-N-三糖II（Lacto-N-triose II,LNTII）转化为LNnT的限速步骤。通过研究诱导剂木糖的添加时间和添加量对LNnT产量的影响,实现LNnT合成模块和三个竞争途径之间的最佳代谢通量的平衡。最终,在摇瓶培养条件下,重组枯草芽孢杆菌的LNnT产量达到2.30 g/L,在3-L罐上达到5.41 g/L。（4）利用启动子工程构建无芽孢和无质粒的产LNnT工程菌。首先,基于枯草芽孢杆菌潜在的内源强启动子以及已有报道的的枯草芽孢杆菌高强度启动子,构建拥有强表达潜力的第一启动子文库。在此基础上,将启动子截短至80～100 bp,以获得拥有较短序列的第二启动子文库。进一步从第二文库中筛选多个强启动子进行关键位点饱和突变和流式细胞筛选,获得具有最高强度的第三启动子文库。通过用强启动子文库中的不同强度启动子控制关键基因lgtA和lgtB的表达,筛选出最适表达水平,获得无质粒遗传稳定性较高的工程菌。然后,通过突变Spo0A启动子消除菌株的产芽孢能力。最终在摇瓶培养条件下,LNnT产量达到2.51 g/L。
陶秀梅[7]（2020）在《Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造及制备AA-2G的研究》文中指出2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-抗坏血酸的糖基化衍生物,它既能保持性质稳定,同时能通过α-葡萄糖苷酶作用产生L-抗坏血酸,从而能够发挥L-抗坏血酸的生理功能,是L-抗坏血酸的绝佳替代品,因此在化妆品、医药、食品和饲料添加剂等领域具有广泛应用。环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGTase,EC 2.4.1.19）是用于催化合成AA-2G的酶中应用最广、研究最多的一种酶,但目前CGTase制备AA-2G存在转化率低、酶产量低等问题,导致AA-2G的生产成本高,限制其广泛应用。针对以上问题,本论文主要以Bacillus stearothermophilus NO2（Bs）CGTase为研究对象,通过序列比对分析及定点突变探究CGTase受体位点的芳香族氨基酸对CGTase制备AA-2G的影响,并对CGTase底物结合的受体位点非芳香族氨基酸和供体位点氨基酸进行分子改造,同时利用异淀粉酶和CGTase协同作用制备AA-2G。最后通过分子改造提高CGTase在大肠杆菌中的可溶性表达。主要研究结果如下:（1）CGTase受体位点芳香族氨基酸对受体特异性的影响。CGTase制备AA-2G的反应中存在葡萄糖和麦芽糖等副产物,可以作为受体与L-抗坏血酸竞争,导致AA-2G的转化率低。为探究受体位点芳香族氨基酸对受体底物特异性以及AA-2G转化率的影响,对CGTases进行序列比对分析,发现AA-2G转化率高的CGTase受体亚位点的191和255位点（按Bs CGTase氨基酸编号计）氨基酸均为苯丙氨酸（F）,而转化率最低的CGTase受体位点191和255位点均为酪氨酸（Y）,设计并获得Bs CGTase、Bacillus circulans 251（Bc）CGTase和Paenibacillus macerans（Pm）CGTase的五个突变体Bs F191Y、Bs F255Y、Bc Y195F、Pm Y195F和Pm Y260F进行验证。在最优条件下突变体Bs F191Y和Bs F255Y AA-2G的产量分别比Bs CGTase低34.3%和7.9%,突变体Bc Y195F AA-2G的产量比Bc CGTase高45.8%,突变体Pm Y195F和Pm Y260F AA-2G的产量分别比Pm CGTase高36.9%和12.6%。实验结果表明191和255位点氨基酸为F时,AA-2G的转化率高;而为Y时,AA-2G的转化率低。动力学研究表明,三个CGTases的191位点为F时,降低葡萄糖和麦芽糖的特异性,提高L-抗坏血酸特异性;Bs CGTase和Pm CGTase的255位点为F时,降低葡萄糖的特异性,提高L-抗坏血酸特异性。（2）CGTase受体位点非芳香族氨基酸突变提高L-抗坏血酸特异性。采用位于酸碱催化剂Glu 253 10?以内、位于受体底物结合位点、氨基酸的保守性≤30%三个原则选择8个非芳香族氨基酸构建Bs CGTase饱和突变库。筛选获得突变体Bs K228R、Bs M230L和Bs K228R/M230L,通过反应条件优化,确定制备AA-2G的最适温度为30°C、最适pH为5.0和最适加酶量为2000 U·g-1麦芽糊精。为提高生产强度,以250 g·L-1 L-抗坏血酸为底物,优化麦芽糊精浓度,当500 g·L-1麦芽糊精为糖基供体时AA-2G的产量达到210.3 g·L-1,比野生型提高48.9 g·L-1。动力学分析表明突变体Bs K228R、Bs M230L和Bs K228R/M230L的L-抗坏血酸Km值分别比野生型CGTase低20.3%、30.4%和34.8%,而kcat/Km分别是野生型的2.08、2.06和2.69倍。同时双突变体Bs K228R/M230L以葡萄糖作为受体的kcat/Km是野生型的1.67倍,以麦芽糖作为受体的kcat/Km是野生型的0.28倍,因此Bs K228R/M230L对L-抗坏血酸作为受体的特异性提高。（3）CGTase供体位点突变提高麦芽糊精特异性。选取-3亚位点和-6亚位点8个氨基酸构建Bs CGTase饱和突变库,筛选获得突变体Bs S90D、Bs G176H和Bs S90D/G176H,以500 g·L-1麦芽糊精和250 g·L-1 L-抗坏血酸为底物,Bs S90D/G176H的AA-2G产量达到185.0 g·L-1,比野生型提高23.6 g·L-1。动力学分析表明突变体S90D的麦芽糊精Km值比野生型CGTase高12.5%,Bs G176H和Bs S90D/G176H的麦芽糊精Km值分别比野生型CGTase低13.5%和8.7%,而Bs S90D、Bs G176H和Bs S90D/G176H的kcat/Km分别是野生型的1.17、1.30和1.47倍。将Bs S90D、Bs G176H分别与Bs K228R/M230L进行组合,获得AA-2G转化率最高的组合突变体Bs S90D/K228R/M230L,AA-2G产量为216.8 g·L-1,比双突变体Bs K228R/M230L的AA-2G产量高6.5 g·L-1,比野生型高55.4g·L-1。将异淀粉酶与突变体Bs S90D/K228R/M230L复配制备AA-2G,麦芽糊精浓度降低为350 g·L-1,AA-2G的产量能达到208.4 g·L-1,降低麦芽糊精成本,并且降低溶液的粘度与副产物浓度,有利于后期的分离纯化。（4）分子改造提高CGTase在大肠杆菌中的可溶性表达。采用易错PCR构建突变文库,筛选获得Bs CGTase三株酶活提高突变体,利用定点突变识别影响酶活的突变位点,发现Bs I631T、Bs I641T和Bs K647E的酶活分别是野生型(141 U·mL-1)的1.7、2.1和2.2倍,突变体Bs I631T/I641T、Bs I631T/K647E、Bs I641T/K647E和Bs I631T/I641T/K647E的酶活分别是野生型的1.9、1.8、1.3和1.2倍,未有叠加效果。通过CGTase多重序列比对分析发现K647在CGTase家族中较保守,选取Bc CGTase、Pm CGTase和Anaerobranca gottschalkii（Ag）CGTase引入相应位点的突变,获得三个突变体Bc K654E、Pm K655E和Ag K656E,酶活分别为62、39和113 U·mL-1,是其野生型的2.0、1.5和1.0倍。通过结构模拟分析四个CGTases及其突变体的表面负电荷,发现在具有低表面负电荷CGTase引入负电荷增加的突变可能会增加CGTase的可溶性表达。将Bs CGTase和酶活最高突变体Bs K647E在3 L发酵罐中发酵,Bs K647E的酶活为2150.6 U·m L-1,是野生型(960.3 U·mL-1)的2.2倍。将Bs K647E与Bs K228R/M230L和Bs S90D/K228R/M230L分别组合进行3 L发酵罐发酵,组合突变体Bs K228R/M230L/K647E和Bs S90D/K228R/M230L/K647E的最高酶活分别为2025.2和1344.5 U·m L-1,是野生型的2.1和1.4倍。同时将Bs K228R/M230L/K647E和Bs S90D/K228R/M230L/K647E进行AA-2G制备,发现组合突变体分别与Bs K228R/M230L、Bs S90D/K228R/M230L的AA-2G产量一致,酶活提高的突变体对AA-2G的转化率无影响。
王田田[8]（2020）在《Heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的发掘、研究及其大肠杆菌表面展示表达》文中认为硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是由葡萄糖醛酸（glucuronic acid,GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid,IdoA）和N位点硫酸化或乙酰化的葡糖胺（glucosamine,GlcN）之间以糖苷键连接的重复二糖单位组成的糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）。HS广泛存在于哺乳动物细胞和内皮细胞表面。通常区别HS和肝素（heparin,HP）的一个重要特征是N位点硫酸化修饰的程度。一般来说,HP的N-磺化程度高于70%,而HS通常低于50%,这与O-硫酸化程度的差异一致。HP是一种具有明确生物活性的大分子直链多糖,它除了具有抗凝活性外,还具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗感染和抗增殖的特性,这些活性是通过HP与蛋白质的相互作用来介导的。Heparosan是未经硫酸化的HP骨架,它与某些细菌荚膜多糖的结构一致。Heparosan可以作为前体物质合成具有抗凝活性的非动物来源的HP,或者非抗凝的HP衍生物。Heparosan制备方法主要包括细菌发酵提取以及体外酶法合成等。研究发现 Escherichia.coli O10:K5:H4（ATCC23506）以及Pasteurella multocida中的一些糖基转移酶（glycosyltransferases,GTs）能够合成heparosan。随着糖类药物的不断发展,在体外合成结构均一和确定的非动物来源的HP已经成为了研究的重点。通过模拟体内HP的生物合成过程,使用高效、专一的GTs合成heparosan,进而使用化学法或酶法对其进行异构化和硫酸化修饰。这种基于化学酶法合成HP已发展成为一套成熟的仿生合成体系。这种合成方法产率高,且能合成结构确定的HP。因此heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶（KfiAs）对合成非动物来源的HP具有很高的应用价值。KfiA 属于 Carbohydrate-Active enZYmes Database（CAZy）GT45 家族成员。但是目前为止,该家族成员就只有来自E.coli O10:K5:H4的EcKfiA。已知成员数量的不足限制了对KfiA超家族的分子结构和催化机理的研究,并限制了该酶家族在糖聚合物合成中的应用。发掘该家族新成员,并进行催化机理、关键氨基酸位点的研究不但具有重要的理论意义,而且为未来通过蛋白质工程改造KfiA,获得催化特性更为优秀的HP骨架合酶奠定了基础。因此,本论文就是围绕以上内容所展开,包括以下几个内容:1.自卡氏杆菌（Gallibacterium anatis）中发掘了一个KfiA家族新成员:通过生物信息学分析,G.anatis gcbd基因编码的酶与来源于E.coli O10:K5:H4的heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶EcKfiA的蛋白一级结构表现出很高的同源性（～58%）;成功实现该酶（命名为GaKfiA）在E.coli表达体系中的可溶重组表达,并建立了重组酶分子的蛋白纯化方法;以GlcA-pNP为受体底物,UDP-GlcNAc为单糖供体,系统分析了 GaKfiA酶促反应生成的二糖的化学结构,确定GaKfiA表现出明确的heparosan-α-1,4-GlcNAc转移酶活性。2.完成了 GaKfiA的动力学以及酶学性质的研究,并分析了该酶分子的供体底物特异性。3.确定了 DXD基序对KfiA家族成员催化活性的关键影响作用:通过蛋白-分子对接模型分析了 DXD基序对KfiA家族催化活性的影响;经过理性突变,重组获得突变分子GaKfiA（N56D）;系统比较了 GaKfiA（N56D）与GaKfiA的酶促反应动力学数据,明确了 GaKfiA的关键氨基酸位点。4.成功实现KfiA家族成员催化活性的表面展示:借助于冰核蛋白（ice nucleation protein,INP）将EcKfiA重组表达在大肠杆菌的表面;表面锚定表达EcKfiA的重组菌体具备将GlcA-pNP延长为肝素骨架结构二糖（GlcNAc-GlcA-pNP）的活性。
曾斐鸿[9]（2020）在《人胚胎肾细胞HEK293F表达重组胶原蛋白Ⅳ-α1》文中指出随着化妆品产业和组织工程快速发展的需要,与传统的动物源胶原蛋白相比,基因工程产生的重组人源胶原蛋白的应用具有巨大的产业潜力。本论文建立了关于重组人源胶原蛋白Ⅳ-α1的瞬时表达系统和稳定表达系统,通过氨基酸代谢分析和生化检测充分了解了其稳定细胞株的生长特性,发现了 HEK293F细胞培养过程中乳酸代谢的铜离子浓度效应,为后续工艺优化提供了依据。建立了重组Ⅳ-α1蛋白纯化工艺;进行了重组Ⅳ-α1蛋白理化性质的初步探究,为重组胶原蛋白Ⅳ-α1应用于组织工程材料打下坚实的基础。取得以下研究结果:首先,构建了重组Ⅳ-α1蛋白表达质粒pCDNA3.1（+）-Ⅳ-α1,并开展了重组Ⅳ-α1 蛋白在 HEK293F 细胞系的瞬时表达研究。通过表达绿色荧光蛋白优化转染效率,获得了 HEK293F细胞的最优电穿孔转染参数。将表达质粒pCDNA3.1（+）-Ⅳ-α1导入HEK293F细胞,实现了重组Ⅳ-α1的瞬时分泌表达。然后,进行了重组Ⅳ-α1蛋白稳定表达细胞株筛选。确定了 G418对HEK293F细胞系的最低致死浓度为0.25 mg/mL;mini pool筛选技术获得了 7株能稳定表达重组Ⅳ-α1蛋白的HEK293F pool细胞株,其批次培养产量最高达1.84 mg/L。对编号C09 pool细胞株进行7L发酵罐的工艺放大,发现该细胞株是因为乳酸累积过量而导致死亡。随后通过有限稀释法获取了 8株能稳定表达重组Ⅳ-α1蛋白的HEK293F单克隆细胞株,流加培养最高产量达6.28 mg/L。其次,在HEK293F培养过程中添加0.05-1.6 μmol/L浓度的铜离子时,能有效促进HEK293F细胞在培养后期由乳酸生成转变为乳酸消耗,并能明显延长细胞生长周期。最后,建立了重组Ⅳ-α1蛋白纯化工艺,进行了重组Ⅳ-α1蛋白理化性质分析。使用500mM咪唑洗脱缓冲液可将重组胶原蛋白Ⅳ-α1完全洗脱下来且纯度较好。使用iCIEF技术检测其等电点分布范围为4.0-5.6,主峰为4.8,相对含量为41.2%。采用SEC-MALS技术测定其分子量,单体为201.7 kDa,聚体分子量为696.0 kDa。
颜龙杰[10]（2019）在《刺参（Stichopus japonicas）胶原蛋白及自溶相关蛋白酶的研究》文中研究表明刺参是一种具有特殊质构的棘皮动物,作为传统的海珍品,在中国、日本、韩国等亚洲国家深受消费者喜爱。我国的刺参产量逐年递增,但是刺参在加工、运输过程中极易出现自溶现象,产生这一现象的主要原因是结构蛋白被降解。胶原蛋白是刺参最主要的营养成分,占总蛋白含量的70%左右,也是最主要的结构蛋白,赋予刺参体壁一定的韧性和强度。胶原蛋白的降解被认为是刺参自溶的主要原因,严重影响刺参体壁的稳定性。本文研究刺参胶原蛋白以及内源性蛋白酶对胶原蛋白的降解作用,为阐明刺参胶原蛋白的代谢和刺参自溶机理提供重要信息。首先,从刺参（Stichopus japonicas）体壁中纯化获得一种胃蛋白酶促溶型胶原蛋白（pepsin-soluble collagen,SjPSC）。SjPSC是由三条相同的α链构成的同源三聚体,α链的分子量约为130 kDa。傅立叶红外光谱、圆二色谱分析表明,制备的SjPSC具有完整的三股螺旋结构;差示扫描量热仪检测结果显示SjPSC的热变性温度为34.0±0.12°C。利用高纯度的SjPSC制备抗刺参胶原多克隆抗体,通过Western blot检测发现该抗体只与刺参（Stichopus japonicus）和东海乌参（Acaudina leucoprocta）两种海参的胶原蛋白发生反应,说明该抗体特异性良好。克隆获得SjPSCα的基因序列（SjCOLα）,该基因开放阅读框（opne reading frame,ORF）共4203个碱基,编码1400个氨基酸残基,推导的氨基酸序列包含信号肽、N-端前肽、N端、C-端前肽、C端和三股螺旋区,与多个物种的胶原蛋白α链氨基酸序列相似性均低于50%;三股螺旋区Gly-Gly-Y的数量（9个）多于鲍鱼、罗非鱼和猪的α链,而Gly-Pro-Pro的数量（21个）却少于这些生物胶原蛋白的α链,这种序列特征与SjPSC的热稳定性较弱有关。刺参胶原蛋白理化性质和氨基酸序列的分析结果为研究刺参自溶过程胶原蛋白的变化以及自溶相关蛋白酶作用机理提供了良好的理论基础。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是刺参自溶过程中参与降解胶原蛋白的关键酶类。尽管该酶活力很高,但在刺参体内含量极少,难以纯化获得天然蛋白酶。为研究MMP参与刺参自溶的机理,制备有活性的重组蛋白酶是更有效的方法。本研究克隆获得刺参MMP-2完整的编码区序列,共1977个碱基,编码658个氨基酸残基,推导的氨基酸序列含有信号肽、前肽、包含三个II型纤维连接蛋白结合域的催化区和C端类血红素结合区。在大肠杆菌表达系统中成功表达和纯化了MMP-2的催化区（rMMP-2）,其分子量约为40 kDa。rMMP-2分解明胶的活性需要Ca2+的参与,反应的最适温度为40°C,最适pH为8.5,说明它是一种弱碱性蛋白酶。圆二色谱分析结果显示,其变性温度为56.80±0.25°C。rMMP-2能有效分解刺参胶原,且产物具有清除DPPH自由基和羟基自由基的活性,EC50值分别为3.59 mg/mL和2.77 mg/mL。这些实验结果表明MMP-2在刺参自溶过程中具有降解胶原蛋白的作用。此外,从刺参肠道中纯化获得一种分子量约为34 kDa的蛋白酶,该酶具有分解胶原活性,通过肽质量指纹图谱鉴定其属于丝氨酸蛋白酶（serine proteinases,SP）。但天然SP难于分离纯化,不利于深入研究SP与胶原的关系。因此,运用基因工程表达获得具有活性的重组SP（rSP）显得尤为重要。本研究进一步克隆获得刺参SP完整的编码区序列,共1134个碱基,编码377个氨基酸残基。在大肠杆菌表达系统中成功融合表达并纯化了具有活性的rSP。运用荧光底物分析,表明rSP的最适温度为35°C,最适pH为7.5,与天然SP的性质相似。rSP能有效地降解胶原蛋白,高效液相色谱分析发现降解产物中,分子量小于5 kDa的小肽占88.6%。利用肽质量指纹图谱分析酶切位点,结果表明rSP更易切割蛋白质序列中P1位为Arg的肽键;同时当P1位为Lys或Gly时也具有切割作用,但效率较低。这些结果证明SP也是刺参自溶过程降解胶原蛋白的关键酶。一直以来,刺参是国内外研究者热点关注的水产动物之一。本研究以刺参为研究对象,首次报道刺参胶原的基因,对刺参胶原蛋白进行了分析;对刺参MMP-2和SP基因全序列、重组表达、生理生化性质及其与胶原蛋白的关系进行了深入的研究。首次将高纯度、高活性的rMMP-2用于水解刺参胶原蛋白制备生物活性肽。分析了海参SP对SjPSC的酶切位点。本研究结果为深入了解刺参胶原蛋白在新陈代谢过程中的作用,探索刺参胶原的生物活性奠定了基础,并揭示了刺参自溶所涉及的相关蛋白酶及其作用机理。
二、胶原Ⅳα_1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胶原Ⅳα_1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 主要组织相容性复合体概述 |
| 1.1.1 主要组织相容性复合体的遗传特征 |
| 1.1.2 主要组织相容性抗原的结构及功能 |
| 1.2 MHC的研究 |
| 1.2.1 哺乳类MHC的研究 |
| 1.2.2 爬行类MHC的研究 |
| 1.2.3 禽类MHC的研究 |
| 1.2.4 鱼类MHC的研究 |
| 1.2.5 两栖类MHC的研究 |
| 1.3 东北林蛙和黑龙江林蛙的研究现状 |
| 1.3.1 分布及地位 |
| 1.3.2 研究价值 |
| 1.3.3 抗病研究 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 东北林蛙和黑龙江林蛙MHCIα基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 载体、菌株及相对分子质量 |
| 2.1.3 引物设计及片段命名 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.1.1 RNA的提取 |
| 2.2.1.2 RNA的检测 |
| 2.2.2 RT-PCR扩增MHCIα基因 |
| 2.2.3 连接、转化及鉴定 |
| 2.2.3.1 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.3.2 目的片段与pMD18-T载体的连接 |
| 2.2.3.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.3.4 重组质粒的菌落PCR鉴定 |
| 2.2.3.5 重组质粒pMD18-T-RdMHCIα-A的酶切鉴定 |
| 2.2.4 目的基因的生物信息学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肌肉组织总RNA的检测 |
| 2.3.2 MHCIα基因RT-PCR检测 |
| 2.3.3 MHCIα基因的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 载体及菌株及相对分子质量标准 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的片段和原核表达载体的制备 |
| 3.2.2 连接和转化 |
| 3.2.3 重组表达质粒pET-32a-MHCIα1+α2 的鉴定 |
| 3.2.4 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区的抗原表位分析 |
| 3.2.5 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 3.2.6 抗血清的制备及检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区抗原表位预测 |
| 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 3.3.4 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.5 表达产物的Western Blot检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 嗜水气单胞菌和LPS胁迫下东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI基因的组织表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物炎症模型的建立 |
| 4.1.2 引物设计 |
| 4.1.3 主要生化试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 东北林蛙病理组织切片的制备 |
| 4.2.2 不同组织RNA的提取及反转录 |
| 4.2.3 qRT-PCR扩增东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI基因 |
| 4.2.4 免疫组织化学检测东北林蛙MHCI基因 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 东北林蛙病理学变化 |
| 4.3.2 Ah和 LPS胁迫下东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI转录水平的检测 |
| 4.3.3 Ah和 LPS胁迫下东北林蛙MHCI分子水平的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（2）Lactobacillus fermentum 4,6-α-葡萄糖基转移酶的克隆表达、酶学性质及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶的概述 |
| 1.1.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶的分类和来源 |
| 1.1.2 4,6-α-葡萄糖基转移酶及其产物结构特征 |
| 1.1.3 4,6-α-葡萄糖基转移酶的制备与应用 |
| 1.2 麦芽糊精概述 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统的简述 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 1.5 论文主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳酸菌的筛选 |
| 2.2.2 乳酸菌基因组的提取 |
| 2.2.3 重组质粒p ET-15b(+)-gtf16的构建与转化 |
| 2.2.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET-15b(+)-gtf16的摇瓶发酵 |
| 2.2.5 4,6-α-葡萄糖基转移酶的截短表达 |
| 2.2.6 4,6-α-葡萄糖基转移酶的纯化 |
| 2.2.7 益生菌的发酵 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 菌体浓度测定 |
| 2.3.2 蛋白浓度测定 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.5 4,6-α-葡萄糖基转移酶的酶活测定 |
| 2.3.6 4,6-α-葡萄糖基转移酶的酶学性质测定 |
| 2.3.7 酶转化方法 |
| 2.3.8 分子量测定 |
| 2.3.9 酶转化产物核磁光谱分析 |
| 2.3.10 酶转化产物对水解酶的抗性分析 |
| 2.3.11 GH70氨基酸序列系统进化树分析 |
| 2.4 改性麦芽糊精的制备工艺 |
| 2.4.1 改性麦芽糊精制备方法 |
| 2.4.2 改性麦芽糊精理化性质测定方法 |
| 2.4.3 体外消化性能分析 |
| 2.5 面粉加工性能测定方法 |
| 2.5.1 粉质实验测定方法 |
| 2.5.2 淀粉糊化测定方法 |
| 2.6 馒头和面包制作工艺 |
| 2.7 馒头和面包的质构测定方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶基因的筛选与克隆表达 |
| 3.1.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶基因的筛选 |
| 3.1.2 4,6-α-葡萄糖基转移酶基因的序列分析及克隆表达 |
| 3.1.3 4,6-α-葡萄糖基转移酶基因在E.coli中的截短表达 |
| 3.2 4,6-α-葡萄糖基转移酶的酶学性质及酶转化产物性质研究 |
| 3.2.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶的纯化 |
| 3.2.2 4,6-α-葡萄糖基转移酶的酶学性质 |
| 3.2.3 4,6-α-葡萄糖基转移酶酶转化产物性质 |
| 3.3 4,6-α-葡萄糖基转移酶在麦芽糊精改性中的应用条件研究 |
| 3.3.1 4,6-α-葡萄糖基转移酶对不同DE值麦芽糊精改性应用中的影响 |
| 3.3.2 反应温度对4,6-α-葡萄糖基转移酶在麦芽糊精改性应用中的影响 |
| 3.3.3 反应pH对4,6-α-葡萄糖基转移酶在麦芽糊精改性应用中的影响 |
| 3.3.4 不同加酶量对4,6-α-葡萄糖移基转酶在麦芽糊精改性应用中的影响 |
| 3.3.5 反应时间对4,6-α-葡萄糖基转移酶在麦芽糊精改性应用中的影响 |
| 3.4 改性麦芽糊精性质鉴定及其对面粉加工品质的影响 |
| 3.4.1 改性麦芽糊精理化性质分析 |
| 3.4.2 改性麦芽糊精的体外益生效益研究 |
| 3.4.3 改性麦芽糊精对面粉加工品质的影响 |
| 3.4.4 改性麦芽糊精对面包和馒头品质的影响 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）遗传操作引入非天然氨基酸形成硫醚键辅助胶原交联（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胶原蛋白 |
| 1.1.1 胶原蛋白简介 |
| 1.1.2 胶原蛋白的性质 |
| 1.1.3 胶原蛋白的应用 |
| 1.1.4 胶原蛋白的制备 |
| 1.2 胶原的交联 |
| 1.2.1 交联技术的介绍 |
| 1.2.2 特殊共价键辅助胶原交联的应用 |
| 1.3 遗传操作引入非天然氨基酸 |
| 1.3.1 非天然氨基酸的引入技术 |
| 1.3.2 引入非天然氨基酸的应用 |
| 1.4 本研究的立题依据和主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 仪器与主要试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.3 突变菌株的构建 |
| 2.3.1 单质粒系统感受态的制备 |
| 2.3.2 双质粒系统感受态的制备 |
| 2.3.3 突变菌株的转化 |
| 2.4 胶原蛋白在单质粒系统中的异源表达 |
| 2.5 胶原蛋白在双质粒系统中的异源表达 |
| 2.6 胶原蛋白在双质粒系统中的表达优化 |
| 2.6.1 阿拉伯糖浓度的优化 |
| 2.6.2 诱导温度及时间的优化 |
| 2.6.3 IPTG浓度的优化 |
| 2.7 胶原蛋白纯化 |
| 2.8 胰蛋白酶酶切优化 |
| 2.9 MALDI-TOF质谱法检测 |
| 2.10 圆二色谱表征 |
| 2.11 交联反应条件的优化 |
| 2.12 分子粒径表征 |
| 2.13 浊度表征 |
| 2.14 透射电镜(TEM)表征 |
| 2.15 杨氏模量表征 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 非天然氨基酸共价键辅助胶原交联的设计策略 |
| 3.1.1 引入非天然氨基酸胶原蛋白的设计策略 |
| 3.1.2 胶原蛋白突变体交联的设计策略 |
| 3.2 引入非天然氨基酸胶原蛋白CL的异源表达 |
| 3.2.1 CL突变体的发酵优化 |
| 3.2.2 引入非天然氨基酸的胶原蛋白的性质测定 |
| 3.3 胶原蛋白突变体的硫醚键共价交联 |
| 3.3.1 交联条件的优化 |
| 3.3.2 引入一个O2beY的突变体与2C交联后胶原蛋白的表征 |
| 3.3.3 引入两个O2beY的突变体与2C交联后的表征 |
| 3.4 引入非天然氨基酸胶原蛋白SC12的表达与交联 |
| 3.4.1 SC12突变胶原蛋白的表达与性质测定 |
| 3.4.2 SC12突变胶原蛋白的交联性质测定 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 序列 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 对虾环境耐受相关研究进展 |
| 1.2 转录组测序及生物信息学分析 |
| 1.2.1 转录组测序技术 |
| 1.2.2 生物信息学 |
| 1.3 耐低温相关基因的研究进展 |
| 1.4 真核基因在大肠杆菌中的可溶性表达及功能验证 |
| 1.4.1 真核基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究 |
| 1.4.2 基因的耐低温功能验证相关研究 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 中国明对虾仔虾的低温胁迫处理及转录组测序 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 中国明对虾 |
| 2.1.2 实验仪器和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 取样 |
| 2.2.2 转录组测序 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.2.4 Real time RT-PCR验证中国对虾转录组数据 |
| 2.3 实验结果及分析 |
| 2.3.1 测序数据组装 |
| 2.3.2 转录组数据注释 |
| 2.3.3 差异表达基因的初步筛选 |
| 2.3.4 差异基因GO富集分析 |
| 2.3.5 差异基因KEGG Pathway富集分析 |
| 2.3.6 Real time RT-PCR结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 高表达上调差异基因的筛选与分析 |
| 3.1 高表达水平的上调差异基因的筛选及分析方法 |
| 3.1.1 高表达水平的上调差异基因的统计 |
| 3.1.2 转录组的生物信息学鉴定 |
| 3.2 高表达水平的上调差异基因的分析结果 |
| 3.2.1 高表达水平的上调差异基因的筛选结果 |
| 3.2.2 九个高水平上调表达基因的生物信息学分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 耐低温相关基因的蛋白序列分析、原核表达及耐低温验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样品、菌株与质粒 |
| 4.1.2 实验仪器及耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ORF2861的蛋白序列分析 |
| 4.2.2 目的基因的获得 |
| 4.2.3 重组表达载体的构建 |
| 4.2.4 目的基因的原核表达 |
| 4.2.5 耐低温验证 |
| 4.3 实验结果及分析 |
| 4.3.1 ORF2861的蛋白序列分析结果 |
| 4.3.2 引物设计及目的基因扩增 |
| 4.3.3 同源重组及转化 |
| 4.3.4 原核表达结果 |
| 4.3.5 耐低温验证结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 附录一 实验仪器及试剂 |
| 附录二 实验方法 |
| 附录三 实验数据 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 资助情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）病变胶原蛋白的靶向成像（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胶原蛋白相关疾病及检测方法 |
| 1.1 胶原蛋白概述 |
| 1.1.1 胶原蛋白的结构 |
| 1.1.2 胶原蛋白的稳定性 |
| 1.1.3 胶原蛋白的体内合成 |
| 1.1.4 胶原蛋白的分类 |
| 1.1.5 胶原蛋白的功能基序 |
| 1.2 胶原蛋白相关疾病 |
| 1.2.1 心血管病 |
| 1.2.2 肿瘤 |
| 1.2.3 关节炎 |
| 1.2.4 纤维化疾病 |
| 1.2.5 遗传疾病 |
| 1.3 胶原蛋白的溶液检测 |
| 1.3.1 胶原蛋白的结构鉴定 |
| 1.3.2 胶原蛋白的定量检测 |
| 1.3.3 胶原多肽溶液检测 |
| 1.4 胶原蛋白的组织成像 |
| 1.4.1 无标记光学组织成像 |
| 1.4.2 标记的光学组织成像 |
| 1.4.3 非光学显微成像 |
| 1.5 胶原蛋白的活体成像 |
| 1.5.1 胶原蛋白疾病的临床活体成像方法 |
| 1.5.2 胶原蛋白的靶向活体成像 |
| 1.6 论文研究意义和研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 大位阻分子介导的单链多肽探针用于结缔组织成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 FCMP多肽探针的合成 |
| 2.2.3 ssFCMP多肽探针的合成 |
| 2.2.4 多肽探针性质的表征 |
| 2.2.5 胶原纤维靶向成像 |
| 2.2.6 结缔组织靶向成像 |
| 2.2.7 抑制实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 荧光多肽探针ss FCMP的设计 |
| 2.3.2 荧光多肽探针ss FCMP的表征 |
| 2.3.3 胶原纤维的靶向成像 |
| 2.3.4 组织中胶原蛋白的特异性成像 |
| 2.3.5 ssFCMP在结缔组织成像中的应用 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 静电排斥作用去稳定化的靶向病变胶原多肽探针 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 多肽探针PCTP-Dn的合成 |
| 3.2.3 多肽探针PCTP-Dn的表征 |
| 3.2.4 蛋白结合实验 |
| 3.2.5 结缔组织染色实验 |
| 3.2.6 烫伤皮肤组织染色实验 |
| 3.2.7 肿瘤组织染色实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 F-PCTP-Dn多肽探针的设计 |
| 3.3.2 多肽探针三重螺旋结构的稳定性 |
| 3.3.3 多肽探针F-PCPT-D6 特异性染色病变胶原蛋白 |
| 3.3.4 烫伤组织中病变胶原蛋白的染色 |
| 3.3.5 肿瘤组织中病变胶原蛋白的染色 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 非三聚体多肽探针靶向检测结缔组织的病变胶原蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 多肽探针的合成 |
| 4.2.3 多肽探针的性质表征 |
| 4.2.4 多肽探针的组织染色 |
| 4.2.5 组织病理学染色 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 靶向多肽探针的设计 |
| 4.3.2 多肽探针的三重螺旋稳定性研究 |
| 4.3.3 多肽探针的组织染色能力 |
| 4.3.4 多肽探针F-GOP-10 特异性染色病变胶原蛋白 |
| 4.3.5 多肽探针F-GOP-10 染色病理组织 |
| 4.3.6 多肽探针长度对结合能力的影响 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 主-客体肽多色量子点探针用于细胞及外基质成像 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 主体肽的合成 |
| 5.2.3 客体肽的合成 |
| 5.2.4 主-客体肽量子点探针的合成 |
| 5.2.5 主-客体肽量子点探针的性质表征 |
| 5.2.6 细胞成像 |
| 5.2.7 组织成像 |
| 5.2.8 3D肿瘤细胞成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 主-客体肽体系的设计 |
| 5.3.2 主体肽量子点探针的稳定性研究 |
| 5.3.3 主-客体肽量子点探针的稳定性研究 |
| 5.3.4 主-客体肽多色量子点探针的性质表征 |
| 5.3.5 主-客体肽多色量子点探针的特异性 |
| 5.3.6 主-客体肽多色量子点探针的细胞成像 |
| 5.3.7 主-客体肽多色量子点探针的组织成像 |
| 5.3.8 3D肿瘤细胞成像 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 胶原蛋白结构和分型鉴定的量子点工具箱 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 胶原蛋白靶向多肽的合成 |
| 6.2.3 胶原蛋白量子点探针的合成 |
| 6.2.4 胶原蛋白量子点探针的表征 |
| 6.2.5 胶原蛋白量子点探针的组织染色 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 QDs-Col探针的设计 |
| 6.3.2 QDs-Col探针的表征 |
| 6.3.3 QDs-Col探针的稳定性研究 |
| 6.3.4 QDs-Col探针的染色能力研究 |
| 6.3.5 量子点工具箱的病理组织成像 |
| 6.3.6 量子点工具箱的胚胎发育组织成像 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 论文总结 |
| 7.2 研究展望 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）代谢工程改造枯草芽孢杆菌产乳酰-N-新四糖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳酰-N-新四糖概述 |
| 1.1.1 乳酰-N-新四糖的性质 |
| 1.1.2 乳酰-N-新四糖的功能和应用 |
| 1.1.3 乳酰-N-新四糖及其衍生物的生产 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌概述 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌的特性及应用 |
| 1.2.2 B.subtilis发酵合成乳酰-N-新四糖分析 |
| 1.3 代谢工程策略概述 |
| 1.3.1 模块化工程 |
| 1.3.2 CRISPRi技术 |
| 1.3.3 启动子工程 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌中LNnT异源合成途径的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒和化学试剂 |
| 2.2.2 构建异源基因lgtA,lgtB游离表达质粒 |
| 2.2.3 整合表达异源基因lgtA,lgtB及 lacY |
| 2.2.4 敲除β-半乳糖苷酶基因yesZ |
| 2.2.5 过表达核苷二磷酸激酶基因ndk |
| 2.2.6 摇瓶发酵 |
| 2.2.7 分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 LNnT从头合成途径在B.subtilis中的构建 |
| 2.3.2 过表达lacY基因,敲除yesZ基因对LNnT合成的影响 |
| 2.3.3 优化关键基因lgtA和 lgtB对 LNnT产量的影响 |
| 2.3.4 强化ndk基因对LNnT合成的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 模块途径工程优化LNnT合成代谢网络 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、质粒和培养条件 |
| 3.2.2 前体UDP-GlcNAc合成途径关键酶验证 |
| 3.2.3 前体UDP-Gal合成途径关键酶验证 |
| 3.2.4 优化组装前体模块 |
| 3.2.5 3-L发酵罐条件 |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 关键前体UDP-GlcNAc模块的关键酶验证 |
| 3.3.2 关键前体UDP-Gal模块的关键酶验证 |
| 3.3.3 两个前体模块的不同强度组装对LNnT合成的影响 |
| 3.3.4 3-L罐间歇补料发酵及连续补料发酵对LNnT合成的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于CRISPRi系统的动态调控策略提高乳酰-N-四糖的合成 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和培养条件 |
| 4.2.2 sgRNA序列的设计 |
| 4.2.3 构建分别抑制pfkA,pyk,zwf和mnaA基因的sgRNA表达质粒 |
| 4.2.4 构建多重抑制pfkA,pyk,zwf基因sgRNAs表达质粒 |
| 4.2.5 分析方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 利用CRISPRi系统抑制竞争途径中的单个基因对LNnT合成的影响 |
| 4.3.2 多基因的抑制对LNnT合成的影响 |
| 4.3.3 解除LNTII转化为LNnT过程中的限速步骤 |
| 4.3.4 不同诱导剂的添加时间和添加量对LNnT合成影响 |
| 4.3.5 重组枯草芽孢杆菌的3-L罐连续补料发酵对LNnT合成的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 基于启动子工程的无质粒和芽孢的LNnT合成菌株的构建 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、质粒及培养条件 |
| 5.2.2 基因组30个位点表达框构建 |
| 5.2.3 枯草芽孢杆菌内源启动子质粒构建 |
| 5.2.4 流式细胞仪筛选突变启动子 |
| 5.2.5 基于启动子工程的合成LNnT无质粒工程菌的构建 |
| 5.2.6 Spo0A启动子的突变构建 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 基因组不同整合位点的筛选和验证 |
| 5.3.2 枯草芽孢杆菌高表达强度的短启动子文库的构建 |
| 5.3.3 合成LNnT无质粒枯草芽孢杆菌的构建 |
| 5.3.4 基于Spo0A启动子改造策略的无芽孢枯草芽孢杆菌的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论及展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间相关成果清单 |
| 附录 Ⅱ:论文中所用异源基因的核酸序列 |
| 附录 Ⅲ:论文中所用的部分引物 |
（7）Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造及制备AA-2G的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的概述 |
| 1.1.1 AA-2G的结构及理化性质 |
| 1.1.2 AA-2G的功能与应用 |
| 1.1.3 AA-2G的制备 |
| 1.2 环糊精葡萄糖基转移酶的概述 |
| 1.2.1 CGTase的结构与功能 |
| 1.2.2 CGTase催化合成AA-2G的反应机理 |
| 1.2.3 CGTase合成AA-2G的研究进展 |
| 1.2.4 CGTase发酵生产的研究进展 |
| 1.3 酶定向进化策略的概述 |
| 1.3.1 理性设计 |
| 1.3.2 非理性设计 |
| 1.3.3 半理性设计 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 CGTase受体位点芳香族氨基酸对AA-2G转化率影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 蛋白质序列比对分析 |
| 2.2.5 突变体的构建 |
| 2.2.6 CGTase以及突变体的摇瓶发酵 |
| 2.2.7 CGTase以及突变体的纯化 |
| 2.2.8 CGTase歧化活性测定 |
| 2.2.9 CGTase及其突变体的动力学分析 |
| 2.2.10 CGTase及其突变体制备AA-2G |
| 2.2.11 CGTase及其突变体的结构模拟 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CGTase序列、结构分析及突变位点的选择 |
| 2.3.2 CGTase突变体的构建、重组表达与纯化 |
| 2.3.3 CGTase及其突变体制备AA-2G的条件优化 |
| 2.3.4 CGTase及其突变体对受体底物特异性的影响 |
| 2.3.5 受体位点191和255 位点影响CGTase受体特异性的分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CGTase受体位点非芳香族氨基酸突变提高AA-2G产量 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 突变文库的构建 |
| 3.2.5 阳性突变株的筛选 |
| 3.2.6 CGTase及其突变体的摇瓶发酵 |
| 3.2.7 CGTase及其突变体的纯化 |
| 3.2.8 CGTase歧化活性测定 |
| 3.2.9 CGTase及其突变体制备AA-2G |
| 3.2.10 CGTase及其突变体的动力学分析 |
| 3.2.11 CGTase制备AA-2G的转糖基化产物分析 |
| 3.2.12 CGTase及其突变体的结构模拟和分子对接 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于结构分析及序列比对的突变位点的选择 |
| 3.3.2 突变文库的构建以及筛选 |
| 3.3.3 CGTase及其突变体的表达及纯化 |
| 3.3.4 CGTase及其突变体制备AA-2G的条件优化 |
| 3.3.5 CGTase及其突变体对受体底物特异性的影响 |
| 3.3.6 CGTase及其突变体制备AA-2G初始反应的产物分布分析 |
| 3.3.7 CGTase及其突变体与四糖基L-抗坏血酸分子对接 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 CGTase供体位点突变提高AA-2G产量 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 突变文库的构建 |
| 4.2.5 阳性突变株的筛选 |
| 4.2.6 组合突变体的构建 |
| 4.2.7 CGTase以及突变体的摇瓶发酵 |
| 4.2.8 CGTase以及突变体的纯化 |
| 4.2.9 CGTase歧化活性测定 |
| 4.2.10 CGTase以及突变体制备AA-2G的动力学分析 |
| 4.2.11 CGTase以及突变体制备AA-2G |
| 4.2.12 异淀粉酶与CGTase组合突变体复配制备AA-2G |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 突变文库的构建以及筛选 |
| 4.3.2 CGTase突变体的表达及纯化 |
| 4.3.3 CGTase及其突变体制备AA-2G反应条件优化 |
| 4.3.4 CGTase及其突变体制备AA-2G的动力学分析 |
| 4.3.5 CGTase突变体的组合、表达及制备AA-2G |
| 4.3.6 组合突变体与异淀粉酶复配制备AA-2G |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 分子改造提高CGTase在大肠杆菌中的可溶性表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 突变文库的构建 |
| 5.2.5 突变文库的筛选 |
| 5.2.6 定点突变 |
| 5.2.7 CGTase及其突变体的发酵 |
| 5.2.8 CGTase突变体的纯化 |
| 5.2.9 CGTase歧化活性测定 |
| 5.2.10 CGTase及其突变体的酶学性质测定 |
| 5.2.11 CGTase及其突变体的结构模拟和氨基酸序列分析 |
| 5.2.12 CGTase及其突变体制备AA-2G |
| 5.2.13 转化产物AA-2G的鉴定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 突变文库的构建与筛选 |
| 5.3.2 识别与酶活提高相关的功能位点 |
| 5.3.3 CGTase及其突变体的纯化与酶学性质分析 |
| 5.3.4 可溶性表达提高突变体的组合及表达 |
| 5.3.5 K647 位点在CGTase家族中影响酶活的规律 |
| 5.3.6 提高CGTase可溶性表达的原因的初步探究 |
| 5.3.7 CGTase及其突变体在3 L发酵罐中的高密度发酵 |
| 5.3.8 突变体的组合及其在3L发酵罐中的高密度发酵 |
| 5.3.9 组合突变体制备AA-2G |
| 5.3.10 转化产物AA-2G的鉴定 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:论文中所用CGTases以及构建的突变体 |
| 附录2:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）Heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的发掘、研究及其大肠杆菌表面展示表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝素 |
| 1.1.1 硫酸乙酰肝素和肝素的结构特性 |
| 1.1.2 肝素的生理活性及药用价值 |
| 1.1.3 肝素的体外合成 |
| 1.2 肝素骨架合酶 |
| 1.2.1 糖基转移酶 |
| 1.2.2 微生物来源的heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶 |
| 1.3 大肠杆菌表面展示系统 |
| 1.4 基于表面展示的定向进化平台策略 |
| 1.5 本课题研究的内容与意义 |
| 1.5.1 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的发现和研究 |
| 1.5.2 Heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶在大肠杆菌中的表面展示 |
| 1.5.3 研究的意义 |
| 第二章 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的发现 |
| 2.1 课题设计 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 GaKfiA菌株的构建及蛋白纯化 |
| 2.3.2 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶GaKfiA的活性分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 GaKfiA蛋白可溶性表达及分子量的测定 |
| 2.4.2 GaKfiA表现出heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶活性 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的研究及关键氨基酸位点的确定 |
| 3.1 课题设计 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的基本酶学性质及动力学研究 |
| 3.3.2 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的供体底物特异性的研究 |
| 3.3.3 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的生物信息学分析及关键氨基酸位点的确定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 新型heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的基本酶学性质表征 |
| 3.4.2 GaKfiA比EcKfiA展现出更严格的底物特异性和弱催化活性 |
| 3.4.3 GaKfiA(N56D)比野生型GaKfiA展现出更强的催化活性 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶EcKfiA在大肠杆菌中的表面展示 |
| 4.1 课题设计 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 INP-EcKfiA菌株的构建与蛋白表达分析 |
| 4.3.2 免疫荧光法检测细胞表面蛋白展示 |
| 4.3.3 蛋白表面展示的活性分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 INP-EcKfiA可溶性蛋白表达确定 |
| 4.4.2 免疫荧光法确证细胞表面蛋白展示 |
| 4.4.3 蛋白表面展示的活性及产物验证 |
| 4.5 小结 |
| 总结与展望 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 附录 |
| 1. GaKfiA的基因序列 |
| 2. GaKfiA的氨基酸序列 |
| 3. GaKflA(N56D)的基因序列 |
| 4. GaKfiA(N56D)的氨基酸序列 |
| 5. INP-EcKfiA的基因序列 |
| 6. INP-EcKfiA的氨基酸序列 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间的学术成果 |
| 参考文献 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）人胚胎肾细胞HEK293F表达重组胶原蛋白Ⅳ-α1（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 胶原蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 Ⅳ-C的蛋白结构 |
| 1.1.2 Ⅳ-C的生物合成 |
| 1.1.3 Ⅳ-C的生物学功能 |
| 1.1.4 重组胶原蛋白表达的国内外研究进展 |
| 1.1.5 重组胶原蛋白的机遇和壁垒 |
| 1.2 HEK293细胞系表达系统简介 |
| 1.2.1 细胞系介绍 |
| 1.2.2 HEK293表达系统研究进展 |
| 1.2.3 HEK293细胞的乳酸代谢 |
| 1.3 研究内容和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、目的基因及细胞系 |
| 2.1.2 主要设备和耗材 |
| 2.1.3 主要试剂及培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组表达载体pCDNA3.1-Ⅳ-α1构建 |
| 2.2.2 HEK293F细胞电穿孔转染条件的优化方法 |
| 2.2.3 电穿孔转染效率的检测方法 |
| 2.2.4 重组胶原蛋白Ⅳ-α1瞬时表达和验证方法 |
| 2.2.5 G418最低致死浓度的确定方法 |
| 2.2.6 Minipool筛选方法 |
| 2.2.7 单克隆细胞株筛选方法 |
| 2.2.8 生化代谢物浓度测定方法 |
| 2.2.9 氨基酸代谢分析方法 |
| 2.2.10 亲和层析纯化重组蛋白Ⅳ-α1方法 |
| 2.2.11 iCIEF技术测定重组胶原蛋白Ⅳ-α1电荷异质性方法 |
| 2.2.12 SEC MALS测定重组胶原蛋白Ⅳ-α1分子量方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 重组表达载体pCDNA3.1-Ⅳ-α1构建 |
| 3.1.1 氨基酸序列分析 |
| 3.1.2 密码子优化 |
| 3.1.3 获取重组质粒 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 重组Ⅳ-α1蛋白在HEK293F中的瞬时表达 |
| 3.2.1 重组胶原蛋白Ⅳ-α1瞬时表达与验证 |
| 3.2.2 HEK293F细胞电穿孔转染条件的优化结果 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 重组蛋白Ⅳ-α1稳定表达细胞株的筛选 |
| 3.3.1 G418最低致死浓度的确定 |
| 3.3.2 重组胶原蛋白Ⅳ-α1 mini pool细胞株筛选 |
| 3.3.3 C09细胞株在7L生物反应器中的工艺放大 |
| 3.3.4 重组胶原蛋白白Ⅳ-α1单克隆细胞株筛选 |
| 3.3.5 细胞株SCC07流加培养过程中的氨基酸代谢分析 |
| 3.3.6 小结 |
| 3.4 铜离子对HEK293F细胞乳酸代谢的影响 |
| 3.4.1 铜离子浓度对生长影响 |
| 3.4.2 铜离子浓度对乳酸代谢影响 |
| 3.4.3 铜离子作用下的谷氨酰胺代谢分析 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 重组胶原蛋白Ⅳ-α1的纯化和理化性质分析 |
| 3.5.1 重组胶原蛋白Ⅳ-α1的纯化 |
| 3.5.2 重组Ⅳ-α1蛋白的电荷异质性分析 |
| 3.5.3 重组Ⅳ-α1蛋白的分子量分析 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（10）刺参（Stichopus japonicas）胶原蛋白及自溶相关蛋白酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 自溶 |
| 1.2 水产动物自溶 |
| 1.3 海参自溶 |
| 1.4 胶原蛋白 |
| 1.5 与海参自溶相关蛋白酶研究 |
| 1.5.1 金属蛋白酶 |
| 1.5.2 丝氨酸蛋白酶 |
| 1.6 本课题研究的目的与内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 刺参胶原蛋白的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 刺参体壁的扫描电镜观察 |
| 2.3.2 刺参胶原(SjPSC)的制备 |
| 2.3.3 SjPSC的氨基酸组成分析 |
| 2.3.4 SjPSC扫描电镜分析 |
| 2.3.5 SjPSC的 Zeta电位分析 |
| 2.3.6 SjPSC的紫外可见分光光谱分析 |
| 2.3.7 SjPSC的傅立叶红外光谱分析 |
| 2.3.8 SjPSC的圆二色谱(CD)分析 |
| 2.3.9 不同动物I型胶原蛋白的热稳定性分析 |
| 2.3.10 抗SjPSC多克隆抗体的纯化 |
| 2.3.11 刺参胶原蛋白α1 链(SjCOLα)基因的克隆 |
| 2.3.12 SjCOLα生物信息学分析 |
| 2.3.13 胶原蛋白α_1链基因在刺参不同组织内表达水平分析 |
| 2.3.14 刺参胶原蛋白的质谱鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 刺参SjPSC的制备及生化特性分析 |
| 2.4.2 刺参SjCOLα基因的克隆及结构特征分析 |
| 2.4.3 刺参SjPSC的热稳定性分析 |
| 第3章 刺参基质金属蛋白酶-2的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 MMP-2基因的克隆 |
| 3.3.2 MMP-2的生物信息学分析 |
| 3.3.3 MMP-2催化区的表达与纯化 |
| 3.3.4 rMMP-2的CD光谱分析 |
| 3.3.5 抗rMMP-2多克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 蛋白酶抑制剂和金属离子对rMMP-2酶活力的影响 |
| 3.3.7 pH和温度对rMMP-2酶活力的影响 |
| 3.3.8 MMP-2对刺参自溶的影响 |
| 3.3.9 rMMP-2应用于制备生物活性胶原肽 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 刺参MMP-2基因的克隆 |
| 3.4.2 刺参MMP-2蛋白结构特点分析 |
| 3.4.3 刺参rMMP-2的制备及活性分析 |
| 3.4.4 刺参MMP-2在自溶过程中的作用分析 |
| 第4章 刺参丝氨酸蛋白酶(SP)的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 SP基因的克隆 |
| 4.3.2 SP在刺参不同组织的表达分析 |
| 4.3.3 SP的表达与纯化 |
| 4.3.4 rSP的酶学性质 |
| 4.3.5 rSP对刺参自溶的影响 |
| 4.3.6 rSP降解刺参胶原蛋白过程的研究 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 刺参SP的制备 |
| 4.4.2 刺参rSP的酶活性分析 |
| 4.4.3 刺参SP降解胶原蛋白酶位点分析 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的相关成果 |
四、胶原Ⅳα_1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究[D]. 边若菲. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [2]Lactobacillus fermentum 4,6-α-葡萄糖基转移酶的克隆表达、酶学性质及应用研究[D]. 盛露菲. 江南大学, 2021(01)
- [3]遗传操作引入非天然氨基酸形成硫醚键辅助胶原交联[D]. 侯亚茹. 江南大学, 2021(01)
- [4]中国明对虾低温胁迫的转录组分析及耐低温相关基因验证[D]. 王晶. 山东大学, 2021(11)
- [5]病变胶原蛋白的靶向成像[D]. 蔡向东. 兰州大学, 2021(09)
- [6]代谢工程改造枯草芽孢杆菌产乳酰-N-新四糖[D]. 董晓敏. 江南大学, 2020
- [7]Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造及制备AA-2G的研究[D]. 陶秀梅. 江南大学, 2020
- [8]Heparosan-α-1,4-GlcNAc糖基转移酶的发掘、研究及其大肠杆菌表面展示表达[D]. 王田田. 山东大学, 2020(02)
- [9]人胚胎肾细胞HEK293F表达重组胶原蛋白Ⅳ-α1[D]. 曾斐鸿. 天津科技大学, 2020(08)
- [10]刺参（Stichopus japonicas）胶原蛋白及自溶相关蛋白酶的研究[D]. 颜龙杰. 集美大学, 2019(08)