一、巨噬细胞在支气管哮喘气道重塑中的作用（论文文献综述）
司东旭[1]（2021）在《肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究》文中指出目的基于前期支气管哮喘慢性持续期（Chronic duration of bronchial asthma,CDBA）中医干预方案研究成果,温润方组（Wenrunformulagroup,WRFG）良好控制率75.44%,明显优于常规辨证组（Routine syndrome differentiation group,RSDG）良好控制率 48.33%。本研究进一步通过分子生物学研究,证明“肺脾为核心脏腑整体辨证”的中医干预思路充分反映了中医治疗CDBA的优势与特色。构建基于“肺脾为核心脏腑整体辨证”CDBA免疫调控的生物学依据。方法本研究工作主要依托课题——支气管哮喘慢性持续期中医干预方案,分别在山东中医药大学附属医院、安徽中医药大学第一附属医院、北京中医药大学东直门医院、中国中医科学院西苑医院等四个研究中心,开展同时期、多中心、随机、对照、三盲的临床实用性随机对照优效设计研究。应用“肺脾为核心脏腑整体辨证”观指导思想下形成的“温润辛金培本”原理系列方药（简称温润方）为中医干预方案。共纳入符合研究要求病例128例,将入组病例随机分为WRFG和RSDG。为进一步观察两组治疗前血清免疫球蛋白、白介素谱系分布特点,以及治疗后血清免疫球蛋白、白介素谱系变化趋势,对符合要求的入组患者进行了二次筛选。同时,招募健康人群作为健康对照组（Healthy group,HG）,并收集受试者血清标本。采用ELISA竞争检测方法进行血清标本检测,开展“肺脾为核心脏腑整体辨证”治疗CDBA调节血清免疫球蛋白及血清白介素水平的免疫调控研究。结果1病例信息分析本研究根据现有各组血清病例数,结合纳入排除标准,确定纳入WRFG24例,RSDG 14例、HG 14例。WRFG与RSDG两组患者治疗前中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,只有腰膝酸软1（1,2）（WRFG）、0（0,1）（RSDG）,具有统计学差异。其他单项中医症状体征及中医症状体征总积分均无统计学差异;WRFG与RSDG两组患者治疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,均无统计学差异;WRFG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,喘息、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征均有下降趋势,但无统计学差异;RSDG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,气短、乏力、口干、畏寒肢冷、咳嗽、咳嗽性质、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征多有下降趋势,但无统计学差异;WRFG与RSDG中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分差值比较中,WRFG在喘息、口苦、口干、心悸、纳呆、腹胀、口渴喜饮、大便不调、夜尿频、头晕、腰膝酸软、总分等方面较RSDG症状积分降低,但均无统计学差异;WRFG与RSDG疗前疗后肺功能比较,两组患者在FEV1%FVC、PEF%等方面无统计学差异。2血清免疫球蛋白2.1治疗前组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG低,具有统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。2.2治疗后组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG无统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG高,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。3血清促炎白介素3.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25、IL-36y 水平较RSDG、HG 低,具有统计学差异。WRFG 血清 IL-3、IL-4、IL-6、IL-9、IL-33 水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-7、IL-8、IL-9、IL-13、IL-20、IL-25、IL-33、IL-36γ 水平较HG无统计学差异。RSDG血清IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6水平较HG低,具有统计学差异。3.2治疗后组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-33、IL-36γ 水平较 RSDG 无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。WRFG血清IL-2、IL-3、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25水平较RSDG、HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-33 水平较 HG 无统计学差异。RSDG 血清 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-25、IL-36γ 水平较 HG 低,具有统计学差异。4血清抗炎白介素4.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-10、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-35 水平较 RSDG、HG 低,具有统计学差异;WRFG血清IL-29水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异;血清IL-12、IL-37水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。4.2治疗后组间比较WRFG血清IL-10、IL-12、IL-21水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异;WRFG血清IL-27、IL-29、IL-35、IL-37水平较RSDG、HG无统计学差异;WRFG血清IL-28A水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。结论1 WRFG组在改善哮喘患者喘息、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、总分等全身症状体征方面具有明显的优势。体现了WRFG“肺脾为核心脏腑整体辨证”,整体诊治CDBA的优势与特色。2 WRFG治疗后血清免疫球蛋白、血清促炎和抗炎白介素水平升高并接近健康人水平,可能与温润方减轻了哮喘患者气道慢性炎症这一基础病理损害,使哮喘患者气道炎症局部对较高的血清促炎白介素水平耐受性增强,提高了气道对损伤因子的免疫防御及修复能力有关。3 CDBA具有多种免疫细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症病理变化基础,炎症、免疫参与了疾病宏观表现的微观病理变化。反之,不同的微观炎症免疫调控失衡状态影响着宏观中医哮喘的病机演变。CDBA存在着“肺脾为核心多脏虚”的关键病机共性规律。“肺脾为核心脏腑整体辨证”是在全面客观认识CDBA脏腑关系与病机演变规律基础上对中医整体观念、脏腑辨证的继承、发展、应用,强调以“肺脾为核心”的整体观揭示哮喘发病机制。
张赟[2]（2020）在《诱导痰液IL-25水平在儿童支气管哮喘发病中的临床意义研究》文中认为研究背景:在儿童时期,支气管哮喘（Bronchial asthma）是一种最常见的慢性呼吸道炎症疾病,支气管哮喘全球发病率逐年升高,在发达国家和发展中国家,儿童和成人哮喘发病患者总人数已上升到3亿以上,尤其是儿童哮喘,发病人数占35%以上,并且我国是支气管哮喘病死率最高的国家之一,造成了严重的医疗负担和社会负担。虽然近些年来《全球哮喘倡议指南》（GINA指南）得到很大的推广及应用,但是我国儿童哮喘控制情况仍然不尽如人意,哮喘儿童每年哮喘急性发作人数占全部患者人数的比率达66%,因此探寻支气管哮喘的发病机制是我们的重要任务。免疫学界认为支气管哮喘的发生与Th1/Th2平衡的破坏有重要关系,当变应原或其他因素进入哮喘患者体内后,过敏原可通过抗原呈递细胞激活气道黏膜上的T细胞,因此活化和促进Th2型气道炎症反应,产生IL-4、IL-10和IL-13等多种活性细胞因子,从而激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及肺泡巨噬细胞等多种肺部炎症细胞,造成炎症细胞在气道中浸润和聚集。这些炎症细胞还能相互作用并且分泌出多种活性细胞炎症介质,从而成了一个相互作用的复杂免疫网络,从而导致气道平滑肌收缩,黏液分泌增加,血管通透性增加,炎症细胞浸润,产生气道高反应性及气道重塑等支气管哮喘病理生理特征。由于哮喘对儿童的严重不良影响,因此,获取有效的炎症评估指标及优质的抗哮喘药物一直是迫切需要解决的问题。目前已有许多研究证实,在支气管哮喘发病中,有多种类型的炎症细胞和细胞因子发挥了重要的作用。作为白介素17（Interleukin-17,IL-17）家族中的新成员,白细胞介素-25（Interleukin-25,IL-25）是一种免疫促炎性细胞因子,目前被公认在支气管哮喘的免疫功能方面发挥了十分重要的作用。IL-25在不同类型的肺细胞中表达增加,不仅包括肺结构细胞,如气道内皮细胞和上皮细胞,还包括嗜酸性粒细胞、T细胞和肥大细胞。当暴露于过敏原后,支气管粘膜下层的这些细胞会增加,并且分泌IL-25或对IL-25产生迅速的免疫反应。IL-25能活化Th2型细胞产生一系列免疫反应,可以产生Th2型细胞因子如IL-4、IL-10、IL-15等,也可以产生嗜酸性粒细胞趋化因子,从而导致血清特异性IgE升高和嗜酸性粒细胞的浸润。在活体模型中证实肺组织发生了明显的病理变化,IL-25能够引起气道炎症和气道重塑以及增强过敏性炎症反应。而通过阻断IL-25,气道高反应性和肺组织轻微的嗜酸性粒细胞浸润以及杯状细胞增生也得到了显着的改善。因此,IL-25在哮喘的发病中发挥了重要作用,受到研究者们的广泛的关注。诱导痰作为一种相对安全、无创的方法,可以通过分析痰液细胞组成和可溶性炎症介质来评价气道炎症。并且通过诱导痰细胞分析评价痰嗜酸粒细胞增多的百分比,能够直接评估气道炎症反应,是一种客观监测哮喘的方法。有研究者对哮喘儿童进行了痰细胞测定,发现不同的细胞组分可以介导不同炎症细胞,如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,产生的气道炎症,其中嗜中性粒细胞气道炎症占主导地位。最近的研究也得出结论,诱导痰的分析可以识别与肺功能参数、哮喘控制和体重指数（BMI）相关的不同“高细胞因子”模式。目前罕见对支气管哮喘患儿痰中IL-25（Sputum interleukin-25,SpIL-25）的研究报道,并且IL-25在儿童支气管哮喘气道炎症中的作用机制及对治疗的反应的机制尚不明确,我们通过对IL-25在支气管哮喘儿童痰液中的表达变化及作用机制研究,将为支气管哮喘的诊断及治疗提供新的临床思路及理论依据。研究目的:1.探讨哮喘儿童诱导痰液中IL-25浓度水平变化及其与血液中IL-25表达水平的相关性。2.探讨哮喘患儿诱导痰液IL-25表达水平和呼出气一氧化氮水平、肺功能、诱导痰细胞计数百分比等临床数据的相关性。3.在蛋白及基因水平探讨哮喘患儿痰液中IL-25表达水平与临床指标及抗哮喘治疗效果的相关性,探索IL-25是否可作为一种炎症介质评估治疗效果。研究方法:1.研究对象及分组:选择2013年6月至2016年12月于山东大学齐鲁儿童医院确诊为支气管哮喘的儿童62例,他们为为轻-中度哮喘患者,男29例,女33例,年龄6～18岁。所有患者诊断均符合《全球哮喘倡议指南》诊断标准。选取18例（女8例,男10例）年龄匹配的非哮喘健康儿童作为对照组,纳入研究儿童要求能够独立完成肺功能,并且所有受试者的FEV1>预测值的75%。哮喘儿童根据其抗哮喘药物的使用分为A组:未接受抗哮喘药物治疗的未控制的哮喘儿童;B组:应用抗哮喘药物治疗控制哮喘儿童。2.完善临床指标的测试及标本收集,包括采用德国耶格-8800肺功能仪测定儿童基线肺活量,进行乙酰胆碱激发试验及诱导痰试验;并且测定并收集研究人群呼出气一氧化氮（Fractional exhaled nitric oxide,FENO）水平、血清总免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE）、全血C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、外周血嗜酸性粒细胞计数等数据。3.采用ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）方法检测血清及诱导痰液上清液IL-25水平表达变化。4.采用免疫印迹法（Western blot）检测诱导痰液中IL-25蛋白表达。5.采用qRT-PCR法检测研究对象血液及诱导痰液IL-25基因表达水平。研究结果:1.支气管哮喘儿童痰液IL-25水平与临床指标的相关性检测1.1血清及痰液中IL-25水平变化通过ELASE方法检测IL-25水平发现,A组诱导痰液中IL-25水平为（47.16±13.50 pg/ml）显着升高（P<0.001）,明显高于其他两组（B组39.14±9.03 pg/ml,对照组36.76±6.48 pg/ml）,A组和B组诱导痰IL-25浓度水平和血清中IL-25水平显着相关（A组r=0.669,P<0.01;B组r=0.576,P<0.05）。1.2诱导痰中细胞计数通过对诱导痰液细胞计数发现,A组哮喘儿童的诱导痰嗜中性粒细胞计数百分比下降（P<0.001）,而嗜酸性粒细胞的计数百分比显着增加（P<0.001）。A组患者诱导痰液嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数百分比与诱导痰液IL-25水平呈正相关（分别为r=0.886,P<0.01;r=0.655,P<0.01）。1.3肺功能检测结果通过对入选儿童肺功能测定发现,在A组中,SpIL-25水平与FEV1（pred）（r=0.956,P<0.01）和PC20（mg/ml）（r=0.549,P<0.05）具有显着相关性。1.4 FENO检测结果通过对入选儿童FENO检测发现,A组哮喘患者的FENO水平明显升高（P<0.001）。A组血清SpIL-25水平与FENO水平具有相关性（r=-0.77,P<0.01）。我们发现哮喘儿童SpIL-25水平与血液IL-25水平（r=0.669,P<0.01）、FENO（r=-0.483,P<0.05）和嗜酸性粒细胞（r=0.405,P<0.05）均具有相关性。1.5肺功能、诱导痰液细胞计数与诱导痰液IL-25水平相关性分析通过统计分析发现哮喘儿童的FEV1/FVC%预测值、FEF25-75%的预测、诱导痰巨噬细胞（%）CRP与诱导痰液IL-25浓度水平无相关性。2.0支气管哮喘儿童诱导痰液IL-25蛋白及基因的表达2.1诱导痰液IL-25蛋白表达通过Western blot方法检测发现,各研究组诱导痰中IL-25蛋白表达水平不同。通过对比蛋白表达的比值,支气管哮喘儿童IL-25蛋白的表达水平明显增加,A组表达水平最高,表达量最多。与B组和健康对照组相比,A组诱导痰中IL-25蛋白水平的比值显着升高（P<0.001）。2.2诱导痰液IL-25mRNA表达2.2.1实时荧光定量qRT-PCR结果显示3组儿童血液及诱导痰液IL-25mRNA的相对表达量的总体均数具有显着统计学差异（P均<0.001）。A组中诱导痰液和血液IL-25的相对表达量均高于B组和健康对照组（分别P<0.05;P<0.001）。2.2.2诱导痰液和血液中IL-25mRNA表达水平相关性分析显示A组和B组支气管哮喘患儿IL-25mRNA表达呈线性相关、表达水平存在显着差异性。两组患儿诱导痰液和血液中IL-25mRNA的表达呈线性相关性（r=0.379,F=68.3,P=0.009）。A组患者诱导痰液和血液IL-25mRNA的相对表达量明显高于B组（P<0.05）和健康对照组（P<0.001）。B组患者和健康对照组相比无显着统计学差异（P=0.168）。2.2.3哮喘患儿LI-25mRNA的表达水平与病情严重度和抗哮喘治疗分组相关性分析结果哮喘患儿血液和痰液LI-25mRNA的表达水平与哮喘患儿疾病严重程度具有显着差异性（分别P=0.04和P=0.042）;经过抗哮喘治疗,哮喘患儿血液和痰液LI-25mRNA的表达水平均显着下降（分别P=0.021和P=0.026）,提示IL-25可以作为评估哮喘疾病严重程度和抗哮喘治疗效果的一种炎症介质。2.2.4哮喘息儿痰液LI-25mRNA的表达水平与血液CRP、FENO、FEV1/FVC（%）及诱导痰液嗜酸性粒细胞计数（%）相关性分析显示统计分析发现,支气管哮喘患儿痰液LI-25mRNA的表达与血液CRP水平相关性（r=0.361,P=0.007）;哮喘患儿痰液LI-25mRNA的表达水平与哮喘患儿呼出气NO水平具有线性相关（r=0.26,P=0.04）;哮喘患儿FEV1/FVC（%）和痰液LI-25mRNA的表达呈负相关性（r=-0.344,P=0.01）,痰液IL-25mRNA在支气管哮喘患儿中的表达与诱导痰液嗜酸性粒细胞计数（%）具有显着相关性（r=0.404,P=0.03）,提示IL-25可以作为一种炎症介质用来评估哮喘儿童气道炎症。结论:1.支气管哮喘儿童的诱导痰液和血液IL-25浓度升高,同时IL-25的表达在蛋白及基因水平明显升高。2.哮喘儿童痰液IL-25浓度水平和血液IL-25浓度水平、FENO、诱导痰嗜酸性粒细胞计数具有线性相关性。3.哮喘儿童诱导痰液LI-25mRNA的表达水平与血液CRP、FENO、FEV1/FVC（%）及诱导痰液嗜酸性粒细胞计数（%）、病情严重程度和抗哮喘治疗有明显相关性。4.诱导痰中IL-25水平在抗哮喘治疗后在浓度水平下降,同时在蛋白及基因水平也明显下降,提示IL-25表达水平能够作为评估药物疗效和哮喘控制状态的重要生物标志物。
徐建锋[3]（2020）在《自噬和Ang（1-7）在OVA诱导的哮喘气道重塑中的机制研究》文中进行了进一步梳理支气管哮喘是发生于上呼吸道的一种常见的慢性炎症性疾病,在全球大约有3亿多哮喘患者,我国也有将近3千万的患者,而且发病人数在发展中国家呈持续上涨趋势。以呼吸急促甚至困难、咳嗽或伴有咳痰、胸闷和胸痛等主要临床表现。支气管哮喘以气道炎症、气道高反应性为主要病理变化,而长期的气道慢性炎症反应与机体的自我修复二者间反复的斗争与平衡,必然会导致气道壁增厚、气道组织结构改变而最终发生难逆性气道重塑。目前对于难逆性气道重塑尚无特效办法,仍以缓解患者呼吸困难、胸闷等临床症状为主。因此阐明气道重塑的分子机制,探究能够逆转气道重塑的新的分子靶点已成为支气管哮喘研究领域新的热点之一,对于重症支气管哮喘患者的治疗具有重要意义。细胞自噬是机体细胞通过分解代谢途径消化分解衰老死亡的胞质内容物、细胞器等的一种生理过程,在细胞的生长、分化中发挥重要作用。自噬发生时,一些相关蛋白表达异常。其中LC3、Beclinl和P62被认为是自噬发生的生物标志物。目前越来越多的研究证实细胞自噬与多种疾病例如肿瘤、代谢性疾病等的发生、发展密切相关。但其在哮喘气道重塑中的作用报道较少。同时STAT3-PKR是调节细胞生长、介导细胞存活和分化的重要信号通路之一,但关于STAT3-PKR信号通路在哮喘气道重塑中的研究尚未见到。因此深入探讨细胞自噬在支气管哮喘中扮演的角色和分子机制以及探讨是否可以通过STAT3-PKR信号通路中的重要靶蛋白减轻或逆转气道重塑具有重要理论意义。肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）是机体内重要的体液调节系统之一,是一个大家族,由血管紧张素原通过水解、酶解等作用生成多种血管紧张素家族成员。已证实在心血管、呼吸系统等存在着局部独立的RAS系统,调节局部的病理和生理学进程。血管紧张素（1-7）（Ang（1-7））是RAS大家族中的重要一员,已被证实在调节血管张力、心肌细胞增殖和体液调节等发面发挥重要作用。也有证据显示Ang（1-7）在脂多糖（LPS）和氧化应激诱导的肺损伤和肺纤维化可发挥保护效应。但尚未有研究报道揭示Ang（1-7）是否对卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的气道重塑具有逆转效应。基于此,我们认为探讨Ang（1-7）在气道重塑中的角色,可为发生了气道重塑的重症哮喘患者的治疗提供新的分子治疗靶点。同时JNK信号通路是MAPK信号通路的一个重要分支,在细胞增殖、凋亡和应激等多种生物学行为中均发挥重要调控作用。因此我们也探讨了 Ang（1-7）是否通过JNK信号通路发挥效应。因此在本研究中我们构建了经典的OVA-哮喘气道重塑模型,以细胞自噬和血管紧张素（1-7）作为切入点,分别研究了此二者在OVA诱导的气道重塑模型中,对气道炎症、纤维化与气道重塑的影响,在深入探讨了其发生机制,以期为普通哮喘患者的治疗和发生了气道重塑的重症哮喘患者的预防、治疗提供新的分子靶点、新的干预方向。第一部分 细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制目的建立经典的OVA诱导的哮喘气道重塑小鼠模型,并给与相应特异性抑制剂,研究细胞自噬与哮喘气道重塑间的关系,并深入探讨STAT3和PKR信号分子在其发生过程中的分子机制。方法在OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型中,检测了气道高反应性,通过组织染色,Western blot、IHC检测气道重塑的指标α-SMA和CollI的表达,确定发生了气道重塑。并利用WB、IHC和ELISA方法检测自噬相关标志物Beclinl、LC3和p62的表达,探讨在此模型小鼠中自噬的发生,进一步利用特异抑制剂WP1066（STAT3抑制剂）和PKRI（PKR抑制剂）干预后,深入探讨了 STAT3和PKR信号分子在OVA诱导的哮喘小鼠气道重塑中的作用。结果1.小鼠经OVA干预处理后,出现明显的气促、呼吸困难等症状,气道组织经HE、Masson和天狼星红染色后,发现模型组小鼠出现了明显的平滑肌层增厚、胶原纤维沉积、气道壁增厚和炎性反应等病理变化,同时经Western blot检测,α-SMA和CollI蛋白的表达量也明显增多,这些数据均说明支气管哮喘气道重塑小鼠模型成功制备;2.经说estern blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclin 1,LC3和P62的表达,结果显示模型组中Beclinl和LC3的表达量明显降低,而P62的表达量明显升高,说明在发生了气道重塑的支气管哮喘小鼠气道组织中细胞自噬现象被抑制;3.经WP1066抑制剂干预后,Western blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclinl,LC3和P62的表达,结果显示模型组中Beclinl和LC3的表达量明显升高,而P62的表达量明显降低;同时,HE、Masson和天狼星红染色后,也发现WP1066干预后,小鼠气道组织的气道重塑现象明显减轻,说明WP1066可通过抑制STAT3信号分子,激活细胞自噬,从而减轻或逆转OVA诱导的气道重塑效应;4.经PKRI干预后,Western blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclinl,LC3和P62的表达,结果显示其表达水平与模型组相似;同时,HE、Masson和天狼星红染色后,也发现PKRI干预后,小鼠气道组织的气道重塑现象与模型组相似,说明PKRI可通过抑制细胞自噬激动剂PKR的表达,抑制细胞自噬,诱导气道重塑的发生;5.Western blot检测p-STAT3和p-PKR的活性水平,结果显示模型组中p-STAT3和p-PKR的活性水平升高,而WP1066抑制剂干预后,p-STAT3的活性明显降低,同时p-PKR的活性增强;PKRI干预后,p-PKR的活性明显降低,而p-STAT3的活性无明显变化,说明细胞自噬通过影响p-STAT3和p-PKR的活性水平,介导细胞自噬效应,在气道重塑中发挥重要作用。结论OVA诱导小鼠气道发生了明显的气道重塑病理变化,同时细胞自噬被抑制,而且此抑制效应与STAT3-PKR信号通路有关。第二部分 血管紧张素（1-7）在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制目的研究Ang（1-7）在经典OVA哮喘气道重塑模型小鼠对气道炎性反应和气道重塑中的作用并揭示发挥效应的信号通路。方法建立OVA哮喘气道重塑小鼠模型,并给与Ang（1-7）和特异性抑制剂A779后,收集肺泡灌洗液、血清,气道组织,分离嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞,采用ELISA、组织HE、Masson和Giemsa染色以及Western blot等研究方法确定了 Ang（1-7）干预后对哮喘小鼠气道炎性和气道重塑的影响,并检测了炎性细胞数量和相关促炎因子的表达,并深入探讨了 JNK信号通路在其中的作用。结果1.50只不同处理因素干预的BALB/c小鼠,经Giemsa染色后,发现在模型组小鼠肺泡灌洗液中,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数目明显增多,Ang（1-7）干预后炎性细胞数目明显减少,而A779抑制剂可逆转Ang（1-7）的保护效应;ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的炎性因子水平,也呈现出同样的变化,同时气道反应性检测结果显示,模型组小鼠气道反应性提高,Ang（1-7）干预后气道反应性明显降低,均说明Ang（1-7）可减轻OVA诱导的小鼠气道炎性反应;2.不同处理因素干预的BALB/c小鼠,气道组织染色结果显示,模型组小鼠发生了明显的平滑肌层增厚,气道重塑病理变化,而Ang（1-7）干预后,可明显减轻此病理变化,A779抑制剂可逆转Ang（l-7）的这一效应;平滑肌增殖的生物标志物α-SMA和CollI的表达量,经Western blot检测后,也呈现出与染色结果一致的变化。说明Ang（1-7）可减轻OVA-诱导的小鼠气道重塑病理变化;3.Western blot检测结果显示,模型组中OVA通过提高p-JNK活性水平增强α-SMA和CollI的表达水平,而Ang（l-7）可降低p-JNK活性水平,下调α-SMA和CollI的表达量,而A779抑制剂可抑制Ang（1-7）的这一效应。说明Ang（1-7）通过提高p-JNK活性,影响OVA-介导的哮喘小鼠气道重塑效应;4.JNK抑制剂SP600125干预后,Western blot检测了上皮细胞中α-SMA和CollI的表达水平,ELISA检测了促炎因子IL-4、IL-5和IL-13的含量。结果显示SP600125干预后,p-JNK活性被抑制,α-SMA和CollI表达量下调,IL-4、IL-5和IL-13的含量也下调。说明Ang（1-7）通过影响JNK信号通路发挥减轻或逆转OVA诱导的哮喘小鼠炎性反应和气道重塑效应。结论OVA诱导小鼠气道发生明显的炎症反应和气道重塑,Ang（1-7）可通过提高p-JNK蛋白活性,降低促炎因子IL-4、IL-5和IL-13的含量,下调α-SMA和CollI蛋白的表达量,减轻或逆转OVA诱导的炎症反应和气道重塑效应。
洪天一[4]（2020）在《蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制》文中研究表明研究目的支气管哮喘是儿科常见的呼吸系统疾病,严重危害儿童的身体健康。且病情顽固难愈,病程迁延反复,如果未及时治疗,可伴随终身[1]。研究表明,气道慢性炎症是气道重塑的发生基础,而重塑则是气道炎症缓慢发展的必然结果,气道持续性的炎症反应以及损伤和修复,最终导致组织增生和气道狭窄[2-3]。核转录因子Kappa B（NF-κB）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）分别是炎症和缺氧反应中的关键转录因子,受上游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的调控,从而激活其下游的血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、转化生长因子β1（TGF-β1）等基因表达,在气道炎症反应[4-8]和气道重塑演进过程中[9-11]发挥重要作用。蝎黄解痉治哮颗粒为导师冯晓纯教授基于中医理论与前人总结经验的自拟方,全方由麻黄、全蝎、杏仁、白果、苦参、甘草等组成。以《摄生众妙方》中定喘汤为基础,加减化裁而来,加入祛风解痉的虫类药全蝎为理论基础,具有宣肺解痉、止咳平喘的功效。本课题文以NF-κB和HIF-1αα作为切入点,探讨蝎黄解痉治哮颗粒对MAPKs信号通路调节NF-κB和HIF-1αα的作用,阐述其缓解支气管哮喘气道炎症和气道重塑的机制,为今后中医药防治哮喘病的基础研究提供必要的理论与实验依据。研究方法实验一:建立急性哮喘小鼠模型,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）雾化激发时观察小鼠一般状态及行为学;（2）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及细胞因子;（3）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（4）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38MAPK、p-JNK 和 Akt、p-NF-κBp65 蛋白表达,及其下游通路的 VEGF、MMP-9、TGF-β1蛋白表达。体外实验观察指标:（1）检测药物对16HBE（人支气管上皮细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-KB p65表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。实验二:建立哮喘气道重塑模型小鼠,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及炎症细胞因子的变化;（2）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（3）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38、p-JNK、Akt和HIF-1α蛋白表达,及其下游通路的VEGF、MMP-9、TGF-p1蛋白表达,以及α-SMA蛋白表达;（4）免疫荧光法检测哮喘模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达;（5）免疫蛋白印记法（Western Blot,WB）检测模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达水平。体外实验观察指标:（1）检测药物对ASMC（气道平滑肌细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导RASMC细胞p-NF-κB p65蛋白表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。研究结果实验—结果（1）OVA致敏小鼠出现哮喘发作表现。（2）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1(β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-αα、IL-6、IL-1β水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠肺气道上皮维化程度加深,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（4）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERκ1/2、p-JNK、p-p38 MAPK、AKT、p-NF-KB p65、VEGF、MMP-9和TGF-β1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制上述蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二结果（1）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α IL-6、IL-1β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1p水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,附着于上皮管腔内,部分地方形成粘液栓。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组可见上皮细胞紊乱、脱落,气道壁增厚,气管腔狭窄,部分小血管形成和大量胶原纤维沉积,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（3）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK、AKT、HIF-1α、VEGF、MMP-9和TGF-p1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制这些蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）免疫荧光法检测LPS诱导RASMCs中p-NF-KB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的RASMCs中p-NF-κBp65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）分别通过免疫组化法、免疫荧光法和WB法检测模型小鼠肺组织中αα-SMA蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组α-SMA蛋白表达明显增加,与模型组相比较,高剂量蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制α-SMA蛋白表达。研究结论（1）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠BALF中炎症细胞和相关细胞因子的表达,减轻了模型小鼠气道内炎症反应。（2）蝎黄解痉治哮颗粒可显着减少急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠气道及血管周围炎症细胞浸润,减少气道杯状细胞增生及黏液分泌,减少胶原细胞沉积降低气道上皮下纤维化程度。（3）由急性哮喘模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、NF-<B通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（4）由哮喘气道重塑模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、HIF-1α通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（5）蝎黄解痉治哮颗粒能抑制哮喘气道重塑模型小鼠肺组织内α-SMA的表达,进而减轻哮喘模型小鼠的气道高反应和减缓气道重塑。（6）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制LPS诱导的16HBE细胞和RASMCs中p-NF-κB p65蛋白表达。
陈莹莹[5]（2020）在《Sema4D在RSV诱发哮喘大鼠气道炎症和气道重塑中的作用及咳喘宁的干预机制》文中研究说明目的:研究Sema4D及其受体CD72和Plexin-B1的表达在RSV诱发哮喘大鼠体内的表达,观察Sema4D对Th1/Th2、气道上皮作用及PI3K/Akt信号通路的影响,阐明Sema4D在病毒诱发哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的作用,探究咳喘宁通过调节S ema4D,改善哮喘气道炎症和气道重塑的作用机理,为中医药防治哮喘提供新的作用靶点和可能途径。方法:（1）构建RSV复合OVA模型,将大鼠随机分为正常组、模型组、咳喘宁低、中、高剂量组、Sema4D抗体组,予以相应药物干预。HE染色观察各组大鼠肺组织病理变化;Masson染色观察各组大鼠肺组织胶原沉积状况;ELISA检测IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的含量;免疫组化、We s t ern Blot法及PCR分别检测各组大鼠肺组织Sema4D、CD72、Plexin-B1蛋白及mRNA的表达。（2）分离大鼠气道上皮细胞,通过干预 Sema4D观察对细胞的影响及咳喘宁的调节作用。CCK8检测细胞的增殖情况;Transwe ll及划痕实验检测细胞迁移情况;Western Blot 检测细胞内 Sema4D、CD72、Plexin-B1的表达;分别采用免疫荧光法及PCR检测细胞内CD72、Plexin-B1蛋白及mRNA的表达。（3）分离哮喘大鼠气道上皮细胞,观察Sema4D及P I 3K/Akt信号通路对细胞的影响及咳喘宁的干预作用。通过CCK8观察细胞增殖情况;Transwe ll及细胞划痕实验观察细胞迁移情况。结果:（1）体内实验结果显示模型组大鼠肺组织中Sema4D、Plexin-B1 的表达明显 高于正 常组,血清中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 含量较正常组明显增高,而IFN-γ的含量及CD72的表达低于正常组;Sema4D抗体组及咳喘宁各剂量组干预后大鼠肺组织中 Sema4D、Plexin-B1的表达及血清中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α含量有不同程度下降,其中以咳喘宁高剂量组及Sema4D抗体组降低最为明显,更接近正常组,但两组间差异不大;（2）体外实验结果显示,模型组气道上皮细胞中Sema4D、Plexin-B1含量高于正常组,CD72表达降低,经过咳喘宁含药血浆干预后Sema4D、Plexin-B1表达下降,CD72表达增加,且细胞的增殖迁移数量较模型组减少;加入Sema4D后,细胞的增殖、迁移率较模型组明显升高,予 Sema4D抗体干预后细胞增殖、迁移数量明显减少,Plexin-B1的表达均较Sema4D组低,CD72表达增加,S Ⅱ、SⅢ组与抗 Sema4D组作用结果差异不大,但均以咳喘宁高剂量组干预的结果最为稳定;（3）体外实验结果显示,PI3K组细胞的增殖迁移率明显升高,予抑制剂干预后细胞增殖迁移率下降,PⅢ组与抗PI3K组比较差异不大;联合激活组细胞的增殖及迁移数量明显高于 Sema4D组,而抑制激活组与S ema4D组、抗P I 3K组与联合抑制组比较差别不大。结论:Sema4D与其受体CD72、Plexin-B1相互作用,调节PI3K/Akt通路,参与气道炎症及气道重塑的发生,在哮喘发病中起到正向调节作用;咳喘宁可以降低Sema4D的表达抑制PI3K/Akt通路,从而对气道炎症及气道重塑产生影响,达到治疗作用。
孙婧怡[6]（2020）在《HMGB1/RAGE信号调控Th17/IL-17及其在支气管上皮-间质转化中的作用研究》文中研究指明目的:支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见的异质性慢性气道炎症性疾病,其发病机制至今不清楚。随着目前全球支气管哮喘患者的不断增加,研究者们对哮喘发病机制的研究也越来越深入。众所周知,目前哮喘发病机制的研究方向主要与气道免疫炎症反应、气道高反应性及气道重塑有关。其中气道重塑增加了哮喘的严重程度,这些结构变化包括由于细胞脱落,杯状细胞增生,纤毛细胞破坏和气道上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）而引起的上皮完整性丧失。已知,气道重塑是重症哮喘显示出类固醇抵抗的原因之一,其中EMT起着重要作用。高迁移率族蛋白1（High Mobility Group Box 1,HMGB1）是一种广泛存在且高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,也是一种促炎介质。晚期糖基化终产物受体（Receptor for advanced glycationend products,RAGE）是涉及多种慢性炎症状态的多配体模式识别受体,它也是HMGB1的重要作用受体,介导HMGB1参与各种免疫炎症反应。目前HMGB1/RAGE信号通路已被证实参与诸多慢性气道疾病的发病过程,其中与哮喘患者气道炎症的发病机制密切相关,但在哮喘气道EMT中的作用尚未见研究报道。大量研究发现Th17细胞可加重哮喘患者的气道炎症、气道高反应性和气道重塑的过程,IL-17是Th17细胞的特征性效应细胞因子,深入了解Th17/IL-17信号在气道重塑及激素抵抗型哮喘中的作用对研究此类哮喘的防治至关重要。有研究指出HMGB1可能参与调节Th2和Th17的极化,并且HMGB1与Th17细胞的分化调节和分泌功能密切相关。但Th17/IL-17信号是否参与HMGB1/RAGE信号调控过程及涉及气道EMT之间的关系尚未有研究报道。因此,本实验首次研究HMGB1/RAGE信号调控Th17/IL-17信号及其在支气管上皮-间质转化中的作用。方法:通过获取野生型C57小鼠来源的CD4+T淋巴细胞和经过转染处理沉默RAGE的CD4+T细胞分别进行分组实验干预,体外观察HMGB1/RAGE信号调控Th17/IL-17的分化及其功能表达。再通过利用野生型小鼠来源的支气管上皮细胞建立正常的EMT细胞模型和经过转染处理沉默RAGE（sh-RAGE）的EMT细胞模型,分别进行干预分组,观察HMGB1/RAGE信号与支气管EMT间的关系。进一步将两种细胞按实验分组与Th17细胞共培养72h,以及与IL-17细胞因子刺激培养72h,体外观察Th17/IL-17信号在支气管EMT中的调节作用。结果:体外实验发现,HMGB1/RAGE信号可以促进Th17细胞的分化成熟并促进IL-17细胞的分泌,且具有浓度依赖性（p<0.05）。在小鼠支气管上皮细胞的EMT模型干预实验中,HMGB1/RAGE信号可以促进支气管EMT的发生发展;且与Th17共培养或者加入IL-17因子可以协同增强HMGB1/RAGE信号调控促进支气管EMT的过程（p<0.05）。当沉默RAGE时,会影响HMGB1的信号转导进而减弱对支气管EMT的调控程度（p<0.05）。结论:在体外,HMGB1/RAGE信号可通过促进Th17细胞的分化以和提高IL-17的分泌水平,协同增强支气管上皮细胞间质转化过程。结合我们既往的前期动物实验结果,推测这可能是HMGB1信号参与哮喘气道重塑的机制之一。
刘文[7]（2020）在《CTGF通过诱导FSTL1表达影响哮喘气道重塑机制的研究》文中研究说明研究背景支气管哮喘（bronchial asthma）简称哮喘,是一种常见的慢性呼吸系统疾病,而气道高反应性、气道炎症及气道重塑是其三个重要的特征。目前针对气道炎症及气道高反应性的治疗方法可以有效地预防和缓解大多数的哮喘患者的临床症状,而一些经历持续不缓解的临床症状及肺功能进行性下降的哮喘被称为不可逆或难治性哮喘,对于这类患者目前尚缺少有效的治疗措施。气道重塑是哮喘的主要特征之一,这种重塑过程是严重哮喘的一个关键特征,被认为在难治性或持续性哮喘的发生发展中起到关键的作用。因此针对哮喘气道重塑机制的研究及针对气道重塑的各种组成部分的生物制剂的开发对于哮喘,尤其是难治性哮喘尤为必要。目前的动物模型、体外研究和一些临床研究已经提出了关于气道重塑中涉及的细胞和分子途径,这些途径的研究对于针对气道重塑的各类生物制剂的开发起到关键的作用,进而限制哮喘患者的气道重塑的发生,向哮喘的治愈迈了更近一步。结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）是富含半胱氨酸的分泌肽。CTGF在OVA诱导的哮喘小鼠的肺组织中表达显着升高,同时与MMP-9、TIMP-1及平滑肌层的厚度呈正向相关,上述发现提示在哮喘气道重塑的发病机制中CTGF可能参与其中。进一步的研究发现在评估持续性气道阻塞程度时,血浆CTGF可能是稳定性哮喘的潜在生物标志物,CTGF可能与哮喘气道重塑有关。卵泡抑素样蛋白1（Follistatin-Like 1,Fstl1）属于卵泡抑素蛋白家族,它是一种细胞外基质的糖蛋白,属于分泌型蛋白,对于血管平滑肌细胞的增殖和迁移起到抑制作用,能够改善内皮细胞的功能,促进血管的再形成,在胚胎发育、器官形成、肿瘤、炎症反应中起到重要作用,同时对于心肌也能够起到保护作用。在哮喘气道重塑的发生发展中气道平滑肌细胞的异常增殖与迁移也起到重要的作用,它可以导致气道高反应性的发生,而研究已经证实在人气道平滑肌细胞的增殖与迁移过程中Fstl1起到重要的促进作用。在患有严重哮喘的患者的肺中,Fstl1被巨噬细胞高度表达,而敲除Fstl1能够抑制平滑肌细胞的迁移,提示在支气管哮喘的气道重塑的治疗研究中Fstl1可能代表了一个新的靶点。断开的相互作用蛋白 2 同源物 A（Disconnected（disco）-interacting protein 2 homolog A,DIP2A）是一种细胞质蛋白,DIP2A与FSTL1之间的直接物理相互作用已经被免疫共沉淀测定所证实,DIP2A作为FSTL1的受体介导FSTL1的下游信号通路。转化生长因子-β（Transforming growth factor beta,TGF-β）可以影响多种细胞的生长和分化,参与细胞的凋亡、免疫调节反应,并在上述过程中起到重要的作用。研究发现TGF-β的表达量在哮喘患者的气道组织中显着增加。TGF-β的许多作用由CTGF介导,CTGF是与TGF-β有关的关键的促纤维化因子之一。TGF-β是主要的组织纤维化的中心介质,而Fstl1则是在肺组织纤维化过程中重要的纤维前糖类蛋白,主要通过TGF-β信号通路促进纤维化。在肺成纤维细胞中TGF-β能诱导Fstl1生成,在小鼠肺纤维化过程中TGF-β上调Fstl1的表达。TGF-β的许多作用由CTGF介导,之前的研究已经明确FSTL1、CTGF均可以促进气道重塑,但是其具体作用机制尚不清楚。本研究以CTGF及FSTL1为切入点,旨在阐明其导致哮喘气道重塑的具体机制,为早期防治哮喘病人固定性气流受限提供临床治疗思路。研究目的探究CTGF是否通过影响FSTL1/DIP2A信号通路促进哮喘气道重塑的发生。研究方法1.明确CTGF及FSTL1在OVA诱导的小鼠过敏性气道疾病模型中起到重塑的作用。1.1采用6-8周雌性BALB/C小鼠,给予OVA诱导小鼠过敏性气道疾病模型,主要采用腹腔注射致敏和滴鼻吸入局部激发的方式。1.2造模成功后对各组小鼠进行气道反应性测定,给予不同浓度的乙酰甲胆碱雾化吸入测定并记录吸入后的气道阻力。1.3肺功能检测后处死并收集哮喘模型组及对照组小鼠的肺泡灌洗液、血液及肺组织标本。1.4对各组小鼠的肺泡灌洗液进行细胞的分类及计数。1.5测定各组小鼠外周血中IgE的浓度水平。1.6采用HE染色法分析气道重塑的特征性表现,包括气道上皮细胞的脱落、平滑肌束的增加以及基底膜增厚等。1.7采用Masson染色法分析小鼠气道中胶原纤维含量的表达。1.8应用免疫组织化学染色法测定各组CTGF、FSTL1的表达情况,同时测定起到重塑作用的相关标志物a平滑肌动蛋白（a-smooth muscle actin,a-SMA）、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。1.9应用Western blot方法测定CTGF、FSTL1及其受体DIP2A以及重塑相关蛋白的表达。1.10应用实时定量聚合酶链反应qRT-PCR方法检测CTGF、FSTL1及其受体DIP2A以及重塑相关标志物mRNA的表达。2.细胞水平观察CTGF对FSTL1/DIP2A信号通路的影响。2.1体外培养人肺成纤维细胞,给予FSTL1重组蛋白刺激后,检测DIP2A、a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。2.2体外培养人肺成纤维细胞,给予CTGF重组蛋白刺激后,检测FSTL1、DIP2A、a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。2.3体外培养人肺成纤维细胞,转染FSTL1 siRNA后给予CTGF重组蛋白处理,检测FSTL1、DIP2A、a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。2.4体外培养人肺成纤维细胞,转染DIP2A siRNA后给予CTGF重组蛋白刺激后,检测FSTL1、DIP2A、a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。2.5体外培养人肺成纤维细胞,转染DIP2A siRNA后给予FSTL1重组蛋白刺激后,检测CTGF、a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。3.体内干预CTGF的表达对于哮喘小鼠FSTL1和气道重塑的影响。3.1采用6-8周雌性BALB/C小鼠,随机分为WT组、WT+OVA组、WT+OVA+Dex组、WT+OVA+CTGF组,WT+OVA组采用第一部分所描述的方法进行OVA哮喘小鼠模型制备,WT+OVA+Dex组在WT+OVA组模型制备的基础上腹腔注射地塞米松,WT+OVA+CTGF组在WT+OVA组模型制备的基础上滴鼻CTGF重组蛋白。3.2造模成功后对各组小鼠进行气道反应性的测定,测定并记录不同浓度下乙酰甲胆碱雾化吸入后的气道阻力。3.3肺功能检测结束后处死并收集各组小鼠的肺组织标本。3.4采用HE染色法观察各组小鼠的气道重塑的特征,包括上皮细胞的脱落、平滑肌束的增加及基底膜增厚等。3.5应用免疫组织化学法测定各组小鼠FSTL1的表达,同时测定起到重塑相关标志物a-SMA、纤连蛋白及Ⅰ型胶原的表达。3.6应用Western blot方法测定各组小鼠的FSTL1以及重塑相关标志物蛋白的表达。3.7应用实时定量聚合酶链反应qRT-PCR法检测各组小鼠的FSTL1以及重塑相关标志物mRNA的含量。结果1.哮喘小鼠模型的气道重塑表现明显,且CTGF、FSTL1含量增高。1.1 OVA诱导的哮喘小鼠模型组较对照组气道反应性增高。1.2 OVA诱导的哮喘小鼠模型组较对照组小鼠的肺泡灌洗液沉渣中总细胞数增多、中性粒细胞数增多及嗜酸性粒细胞数增多。1.3 OVA诱导的哮喘小鼠模型组较对照组小鼠血浆中IgE水平明显升高。1.4 HE染色显示哮喘小鼠模型组表现为上皮细胞的脱落、平滑肌束的增加以及基底膜增厚等气道重塑的表现。1.5 Masson染色显示哮喘小鼠模型组气道中胶原纤维含量明显增加。1.6免疫组织化学染色表明哮喘小鼠模型组气道中CTGF、FSTL1含量增加,且重塑相关标志物的含量也增加。1.7 Western blot显示哮喘小鼠模型组肺组织中CTGF、FSTL1及其受体DIP2A高表达,同时伴随重塑相关标志物的高表达。1.8 qRT-PCR显示哮喘小鼠模型组肺组织中CTGF、FSTL1及其受体DIP2A的mRNA高表达,同时伴随重塑相关标志物的高表达。2.CTGF通过FSTL1/DIP2A信号通路促进气道重塑。2.1 Western blot显示FSTL1重组蛋白刺激人肺成纤维细胞后其受体DIP2A蛋白高表达,同时伴随重塑相关标志物的高表达。与对照组相比,FSTL1重组蛋白刺激组FSTL1的受体DIP2A蛋白表达增高,同时重塑相关标志物的表达也增高（p<0.05）,具有统计学差异。2.2 Western blot显示CTGF重组蛋白刺激人肺成纤维细胞后FSTL1及其受体DIP2A蛋白高表达,同时伴随重塑相关标志物的高表达。与对照组相比,CTGF重组蛋白刺激组FSTL1及其受体DIP2A蛋白表达增高,同时重塑相关标志物的表达也增高（p<0.05）,具有统计学差异。2.3人肺成纤维细胞转染FSTL1 siRNA后给予CTGF重组蛋白处理,Western blot显示CTGF重组蛋白刺激阴性对照组人肺成纤维细胞后FSTL1、DIP2A及重塑相关标志物的表达较未经CTGF刺激的阴性对照组明显增高,且具有统计学差异（p<0.05）。CTGF重组蛋白刺激转染FSTL1 siRNA的人肺成纤维细胞后FSTL1、DIP2A及重塑相关标志物的表达较CTGF重组蛋白刺激阴性对照组显着减低,且有统计学差异（p<0.05）。CTGF重组蛋白刺激转染FSTL1 siRNA的人肺成纤维细胞后FSTL1、DIP2A及重塑相关标志物的表达较未经CTGF重组蛋白刺激转染FSTL1 siRNA的人肺成纤维细胞组表达无明显差异。（p>0.05）。提示予以CTGF重组蛋白刺激肺成纤维细胞后FSTL1、受体DIP2A、重塑标记物的表达均升高,阻断FSTL1后,FSTL1、受体DIP2A、重塑标记物的受到影响,未见升高。2.4人肺成纤维细胞转染DIP2A siRNA后给予CTGF重组蛋白处理,Western blot显示CTGF重组蛋白刺激阴性对照组人肺成纤维细胞后FSTL1、DIP2A及重塑相关标志物的表达较未经CTGF刺激的阴性对照组明显增高,且具有统计学差异（p<0.05）。CTGF重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞后DIP2A及重塑相关标志物的表达较CTGF重组蛋白刺激阴性对照组明显减低,且具有统计学差异（p<0.05）,而FSTL1的表达基本不变,（p>0.05）。CTGF重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞后DIP2A及重塑相关标志物的表达较未经CTGF重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞组表达无明显差异,（p>0.05）,而FSTL1的表达明显升高,（p<0.05）。2.5人肺成纤维细胞转染DIP2A siRNA后给予FSTL1重组蛋白处理,Western blot显示FSTL1重组蛋白刺激阴性对照组人肺成纤维细胞后重塑相关标志物的表达较未经FSTL1刺激的阴性对照组明显增高,且具有统计学差异（p<0.05）,而CTGF的表达基本不变,（p>0.05）。FSTL1重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞后重塑相关标志物的表达较FSTL1重组蛋白刺激阴性对照组明显减低,且具有统计学差异（p<0.05）,而CTGF的表达基本不变,（p>0.05）。FSTL1重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞后重塑相关标志物的表达较未经FSTL1重组蛋白刺激转染DIP2A siRNA的人肺成纤维细胞组表达无明显差异（p>0.05）,而CTGF的表达基本不变,（p>0.05）。3.体内干预CTGF的表达后哮喘小鼠FSTL1和气道重塑受到影响。3.1给予乙酰甲胆碱雾化吸入后,WT+OVA组较WT组的气道阻力增加,WT+OVA+Dex组较WT+OVA组气道阻力减低,WT+OVA+CTGF组较WT+OVA组气道阻力增加。3.2 HE染色显示WT+OVA组小鼠模型组表现为上皮细胞脱落、平滑肌束增加以及基底膜增厚等气道重塑表现。WT+OVA+Dex组较WT+OVA组小鼠气道炎症及重塑减轻。WT+OVA+CTGF组较WT+OVA组小鼠气道炎症及重塑加重。3.3免疫组化显示WT+OVA组较WT组的FSTL1、重塑相关标志物增加,WT+OVA+Dex组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达减低,WT+OVA+CTGF组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达增加。3.4 Western blot显示WT+OVA组较WT组的FSTL1、重塑相关标志物表达增加,WT+OVA+Dex组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达减低,WT+OVA+CTGF组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达增加。3.5 qRT-PCR显示WT+OVA组较WT组的FSTL1、重塑相关标志物表达增加,WT+OVA+Dex组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达减低,WT+OVA+CTGF组较WT+OVA组的FSTL1、重塑相关标志物表达增加。结论CTGF通过影响FSTL1/DIP2A信号通路促进哮喘气道重塑的发生。
杨召川[8]（2020）在《miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究》文中提出支气管哮喘是常见的呼吸道慢性疾病之一,其发病率在全球范围内呈增加的趋势,已经成为危害人类健康的公共健康问题。气道重塑是哮喘患者肺功能损伤的病理基础,是哮喘症状反复发作的重要原因,也是临床亟需解决的治疗难题。虽然当前全球哮喘防治创议（Global intiative for asthma,GIN A）方案的有效执行,在临床上获得了一定疗效,该方案中的主要药物糖皮质激素、长效β2受体激动剂、白三烯拮抗剂等在减轻气道炎症和缓解哮喘症状方面有效,但对气道重塑的效果微弱,难以在本质上遏制哮喘的发展演变。因此,需要从基因、蛋白、细胞等多层次入手,深入探讨哮喘气道重塑的病理改变机制,探寻控制气道纤维化的关键靶位和调控机制,为开发改善气道结构或逆转气道重塑的药物奠定基础。上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指在一定条件下（如TGF-β1等）上皮细胞失去上皮表型特征转变为成纤维细胞样间质表型的过程,细胞骨架发生改变,运动能力增强,获得间质细胞特征。在EMT转化过程中上皮细胞标志性蛋白如E-钙粘素等表达下降,间质细胞标志性蛋白如N-钙粘素、波形蛋白和α-SMA等表达上调。目前研究表明,EMT间充质转化分为3种类型:1型,主要与胚胎的发育和形成、原肠形成和神经嵴发育等有关;2型,主要与组织创伤后愈合、再生修复等有关;3型,主要与胃肠道等恶性肿瘤细胞的侵袭、转移等有关。目前研究发现EMT可由多种信号通路调控,其中TGF-β信号通路是主要的介导调控通路。人体内多种细胞均可表达TGF-β受体,TGF-β受体有3型,Ⅰ和Ⅱ型受体为跨膜结构,起信号转导作用;Ⅲ型受体不参与信号转导。Ⅰ和Ⅱ型受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,能诱导特定信号转导的级联反应。首先TGF-β与Ⅱ型受体结合激活Ⅱ型受体胞浆区的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,促使Ⅰ型受体胞浆区GS结构域磷酸化使Ⅰ型受体活化,从而启动细胞内信号转导。课题组前期通过构建哮喘气道重塑小鼠模型发现哮喘小鼠肺组织TGF-β1、Smad3表达均增加,推测TGF-β1/Smad信号通路与哮喘EMT间充质转化相关,可能是研究哮喘气道重塑的重要方向。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是一类短小的非编码单链RNAs,由18-25个核苷酸组成,在生物进化过程具有高度保守性和组织特异性,是基因表达的重要调节因子。miRNAs存在几乎所有的真核生物中,通过与靶基因3’-Untranslated Region（UTR）结合,诱导特定的mRNA降解或抑制翻译,从而调控特定基因的转录和表达。miRNAs可参与多种生物学过程,比如细胞的增殖、分化和应激反应等。基因表达与miRNAs关系复杂,一个miRNA可以调控多个基因,单个基因也可通过多个miRNAs调控,miRNAs与靶基因在多种疾病中形成网络化的调控模式。近年来,miRNAs在肿瘤、免疫学和炎症性疾病方面取得了诸多研究成果,但在哮喘中的作用研究尚处于初始阶段。有研究发现miR-378在支气管哮喘患儿血液和肺组织表达较健康儿童明显增加,体外实验表明miR-378可能通过Ras、MAPK或Ca2+信号途径促进了平滑肌细胞的增殖,增加了其抗凋亡能力,促进了哮喘气道重塑。另外一项研究表明miR-323-3p可能通过下调TGF-β信号通路抑制T细胞产生IL-22,阻断了哮喘病的发生发展。Cheng D等研究发现miR-448通过抑制EMT表型转化来降低非小细胞肺癌的转移和侵袭。有研究发现下调miR-448-5p表达上调NF-kB信号通路活性,导致了 EMT及肿瘤的发生发展。我们课题组前期发现哮喘组小鼠和经TGF-β1干预的人支气管上皮细胞中miR-448-5p表达下降,推测miR-448-5p可能与哮喘气道重塑和纤维化相关。为了研究miR-448-5p发挥作用的分子机制,我们通过生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p的结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。同源盒基因Six1基因定位在人染色体14q23,编码由283个氨基酸组成的蛋白质。Six1存在于多种细胞中,在大脑、肾脏、眼睛等多种组织器官分化发育过程中起着至关重要的作用。目前研究表明Six1作为促癌基因具有增强肿瘤细胞侵袭转移的能力,己经成为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等肿瘤学研究的热点。研究发现生理情况下Six1可以激活下游基因细胞周期蛋白Cyclin A1和Cyclin D1等,保证细胞周期的顺利进行。Six1的过度表达则扰乱了正常生理现象,增加了细胞周期和增殖,促进了组织器官纤维化和过度增殖的发生。目前研究发现在不同肿瘤组织中的Six1的作用靶点不同,在乳腺恶性肿瘤中细胞周期蛋白Cyclin A1是其下游作用靶点,高表达的Six1上调了 Cyclin A1表达,促使细胞增殖、细胞存活、血管生长和DNA修复增加。在横纹肌恶性肿瘤中,高表达的Six1可激活细胞周期蛋白Cyclin A1、细胞周期蛋白Cyclin D1等促进肿瘤侵袭转移。尽管Six1在疾病进程中的作用初露端倪,但其在哮喘中的具体作用及其调控机制却罕见文献报道。我们前期通过动物实验发现哮喘小鼠肺组织Six1表达明显升高,沉默Six1可通过下调NF-kB信号通路有效抑制哮喘模型小鼠气道炎症和气道重塑,表明Six1与哮喘气道重塑密切相关。本研究将通过构建哮喘小鼠气道重塑模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,揭示miR-448-5p在哮喘气道重塑的作用和功能,阐明miR-448-5p通过调控靶基因Six1抑制人支气管上皮细胞EMT间充质转化和哮喘气道重塑;明确miR-448-5p对TGF-β/Smad信号通路的调节作用和分子机制,有望为今后更有效的防治哮喘气道重塑提供新的分子靶点和理论依据。第一部分TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化模型的构建目的EMT间充质转化是哮喘气道重塑和纤维化的重要机制,本部分研究拟用TGF-β1作用人支气管上皮细胞构建EMT间充质转化模型,为后续研究提供工具。方法1.不同浓度TGF-β1作用于人支气管上皮细胞16HBE。2.倒置显微镜下观察TGF-β1刺激后人支气管上皮细胞形态的变化。3.Western blot检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和气道纤维化相关蛋白表达情况。结果1.倒置显微镜下观察到人支气管上皮细胞经TGF-β1（10ng/ml）干预后细胞丧失原本的鹅卵石状不规则形态,转变为长梭形成纤维细胞样形态。2.人支气管上皮细胞经不同浓度TGF-β1干预后上皮细胞标志物E-钙粘素表达量较对照组均减少（P<0.05）,间质细胞标志蛋白α-SMA和波形蛋白表达量均增加（P<0.05）,差异具有统计学意义。3.人支气管上皮细胞经TGF-β1（lng/ml、10ng/ml）干预后纤维粘连蛋白、胶原蛋Ⅳ表达量较对照组明显增加（P<0.05）,差异均有统计学意义;4.TGF-β1干预人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型中,在TGF-βl干预浓度为10ng/ml时,EMT表型标志物和纤维化相关蛋白改变较为明显。结论筛选发现TGF-β1（10ng/ml）干预人支气管上皮细胞后形态转变为成纤维细胞样长梭形,表型标志物变化较为明显,成功构建EMT间充质转化模型用于后续研究。第二部分miR-448-5p对TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化的影响目的miR-448-5p被认为是与EMT转化相关的miRNA。本研究将分析miR-448-5p在哮喘气道重塑模型小鼠肺组织和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型中的表达情况;通过转染miR-448-5p mimic和miR-448-5p inhibitor探讨其对TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化的作用及其可能的分子机制。方法1.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型;用RT-PCR技术检测miR-448-5p在哮喘小鼠肺组织和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞中的表达。2.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR技术检测细胞中EMT相关标志蛋白的表达情况。3.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR技术检测纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA的表达情况。4.将miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,Western blot检测细胞中Smad3的表达,分析miR-448-5p发挥作用的可能机制。结果1.本实验成功构建哮喘小鼠气道重塑模型和TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,RT-PCR检测发现哮喘小鼠肺组织和EMT间充质转化模型中miR-448-5p表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.上调miR-448-5p可增加TGF-β1作用的人支气管上皮细胞E-钙粘素表达,同时波形蛋白表达显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。下调miR-448-5p表达可明显减少TGF-β1作用的人支气管上皮细胞E-钙粘素表达,同时波形蛋白表达明显上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.上调miR-448-5p组可明显减少TGF-β1诱导的纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。下调miR-448-5p组可明显增加TGF-β1诱导的纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ mRNA表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.上调miR-448-5p组细胞磷酸化Smad3表达较单纯TGF-β1处理组表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。下调miR-448-5p组细胞磷酸化Smad3较单纯TGF-β1处理组表达明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论miR-448-5p能够抑制TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化,TGF-β/Smad3信号通路是其可能的作用途径。第三部分miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究目的我们通过生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。本部分研究将揭示miR-448-5p与Six1的靶向调控关系及Six1对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用及相关的分子机制。方法1.生物信息学软件Target Scan 6.2预测miR-448-5p可能的靶基因。Westem blot方法检测转染miR-448-5p mimic、miR-448-5p inhibitor后人支气管上皮细胞后Sixl表达情况。2.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间质转化模型,免疫组化和Western blot检测哮喘小鼠肺组织和人支气管上皮细胞中Sixl的表达情况。3.将Sixl干扰质粒转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,Western blot检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和纤维粘连蛋白的表达情况。4.将Six1高表达质粒和miR-448-5p mimic共转染入人支气管上皮细胞,给予TGF-β1干预,RT-PCR检测人支气管上皮细胞EMT间充质转化标志蛋白和纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅳ表达情况。5.沉默人支气管上皮细胞Six1的表达,给予TGF-β1干预,Western blot检测了人支气管上皮细胞Smad3的表达。结果1.生物信息学软件Target Scan 6.2预测结果显示Six1 3’-UTR具有与miR-448-5p结合位点,推测Six1可能是miR-448-5p的靶基因。双荧光素酶结果发现Six1 3’-UTR野生型载体共转染miR-448-5p mimic后,与对照组比较荧光素酶的活性显着降低,而突变型载体未见明显变化。Western blot检测发现转染miR-448-5p mimic后人支气管上皮细胞Six1表达情况较单纯TGF-β1诱导组明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,而转染miR-448-5p inhibitor后人支气管上皮细胞Six1表达明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.构建哮喘气道重塑小鼠模型和TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT间充质转化模型,免疫组化和Western blot方法检测证实了哮喘组小鼠肺组织Six1表达较对照组显着增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。人支气管上皮细胞经TGF-β1干预后Six1表达较对照组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Western blot检测发现沉默Six1表达后E-钙粘素表达较单纯用TGF-β1刺激组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,波形蛋白表达显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;沉默Six1表达后纤维粘连蛋白较仅用TGF-β1刺激组明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.RT-PCR发现转染Six1高表达质粒和miR-448-5pmimic组细胞E-钙粘素mRNA表达较仅转染miR-448-5p mimic组明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,波形蛋白mRNA表达明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;转染Six1高表达质粒和miR-448-5p mimic组细胞纤维粘连蛋白、胶原蛋白ⅣmRNA表达较仅转染miR-448-5p mimic组显着增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.将Six1干扰质粒转染入人支气管上皮细胞,结果发现沉默Six1组人支气管上皮细胞经过TGF-β 1作用后磷酸化Smad3表达较仅TGF-β 1干预组细胞明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论miR-448-5p可能通过靶向调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化,为深入探讨miR-448-5p的作用模式提供了理论依据。
王瑞茵[9]（2020）在《青蒿琥酯对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞的作用及机制》文中研究指明研究目的:哮喘是以气道慢性炎症为特征的异质性疾病,相关的病理机制十分复杂。随着对哮喘病理生理机制的认识的提高,人们认识到了几种临床内型,取决于气道炎症的类型、严重程度和对治疗的反应。最主要且认识比较清楚的内型是嗜酸性哮喘,约占总哮喘人口的50%至60%。嗜酸性粒细胞（EOS）在疾病的病理生理学中起着重要的效应器作用,而不仅仅是气道中可能存在的许多细胞之一,释放一系列相关介质破坏上皮细胞,诱导支气管收缩,生成粘液和增加血管的通透性。大多数的嗜酸性哮喘患者可以通过中高剂量的吸入皮质类固醇和β2受体激动剂进行控制,但是5%至10%的严重疾病需要口服皮质类固醇来控制嗜酸性气道炎症,甚至需要单克隆抗体生物制剂或者支气管热成形术等其他方式治疗。然而皮质类固醇的副作用、生物制剂的不确定性和时效性以及支气管热成形术的局限性促使了其他治疗的发展。除了 EOS产生增多外,EOS的延迟凋亡也是哮喘炎症持续的一个原因,糖皮质激素在哮喘方面不可替代的有效性除了广泛的抗炎作用外,也参与促进EOS的凋亡,而细胞凋亡是一种机体消除细胞最理想的程序性死亡方式,也是很多药物努力的方向。青蒿琥酯是一种半合成的青蒿素类衍生物,具有较好的水溶性,是抗疟疾治疗的主要治疗药物。现有研究发现青蒿琥酯除治疗疟疾外,还具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种作用,尤其是青蒿琥酯可以降低肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的EOS数量,在气道炎症、气道高反应性和气道重塑等方面起到一定的缓解作用。但是青蒿琥酯降低EOS的机制尚未阐明。本研究通过青蒿琥酯在哮喘小鼠EOS的作用及其机制进行研究,为青蒿琥酯对哮喘小鼠EOS的作用提供基础机制方面的依据。研究方法:本研究使用无特定病原体级BALB/c雌性小鼠40只,随机分为对照组、哮喘组、青蒿琥酯组和Z-VAD组。采用卵清蛋白联合佐剂氢氧化铝致敏和雾化激发的方法复制哮喘模型,并给予青蒿琥酯和小分子抑制剂进行干预。通过支气管插管有创通气方法给予不同浓度的乙酰甲胆碱检测小鼠的气道反应性,包括气道阻力和肺顺应性。气管插管和心脏采血方式获取小鼠的BALF和血液,通过进行流式细胞术检测细胞凋亡,同时检测各组小鼠BALF中的细胞总数和细胞分类计数,并对BALF上清和血清中的炎症因子IL-5和趋化因子Eotaxin进行检测。小鼠肺组织石蜡切片后用于HE染色和免疫组化染色,观察各组小鼠肺组织病理变化和细胞凋亡情况,Western检测肺组织中的Fas、Bcl-2和Caspase3的蛋白表达,PCR检测肺组织中的Fas、Bcl-2和Caspase3的基因表达。研究结果:（1）体重结果:与对照组比较,哮喘组和青蒿琥酯组的小鼠体重激发前、激发后以及体重增加均无明显差异（p<0.05）。（2）肺功能检测结果:与对照组比较,哮喘组小鼠气道阻力明显增加,肺顺应性显着下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。与哮喘组比较,青蒿琥酯组小鼠气道阻力明显下降,肺顺应性改善,差异具有统计学意义（p<0.05）。对青蒿琥酯组比较,Z-VAD组小鼠的气道阻力增加,肺顺应性下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。（3）小鼠BALF细胞计数和分类计数结果:与对照组比较,其他三组小鼠BALF中细胞总数升高,EOS 比例升高。与哮喘组比较,青蒿琥酯组的细胞总数下降且EOS 比例下降,差异具有统计学意义（p<0.05）,与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组的细胞总数增加且EOS 比例增加,差异有统计学意义（p<0.05）。（4）小鼠肺组织HE染色结果:与对照组比较,哮喘组小鼠肺组织出现明显的炎症细胞浸润,EOS明显增多,黏液分泌增加且组织炎症评分相应较高,与哮喘组比较,青蒿琥酯组小鼠肺组织炎症减轻,EOS减少,黏液分泌减少,组织炎症评分下降（p<0.05）;与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组小鼠肺组织炎症细胞增多,EOS增多,黏液分泌增加且组织炎症评分升高（p<0.05）。（5）小鼠BALF和血清中炎症因子结果:与对照组比较,哮喘组小鼠血清和BALF中IL-5和Eotaxin水平明显升高（p<0.05）;给予青蒿琥酯后,血清和BALF中IL-5和Eotaxin水平下降（p<0.05）;与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组血清和BALF中IL-5和Eotaxin水平增加（p<0.05）。（6）细胞凋亡结果:小鼠BALF进行流式细胞术后发现,与对照组比较,哮喘组BALF中EOS的比例增加,凋亡率下降（p<0.05）;与哮喘组比较,青蒿琥酯组BALF中EOS的比例下降,凋亡率增加,差异具有统计学意义（p<0.05）;与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组的EOS的比例增加,凋亡率下降（p<0.05）。肺组织行TUNEL染色后发现,与对照组比较,哮喘组肺组织EOS的凋亡率下降（p<0.05）;与哮喘组比较,青蒿琥酯组肺组织中EOS的凋亡率增加（p<0.05）;与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组的EOS的凋亡率下降（p<0.05）。另外,与对照组比较,哮喘组Fas、Bcl-2和Caspase3的蛋白和基因表达水平增加,这可能与哮喘组炎症细胞明显增加,相应地细胞凋亡总数增加有关;与哮喘组比较,青蒿琥酯组的Fas和Caspase3的蛋白和基因表达水平增加,Bcl-2的蛋白和基因表达水平下降;与青蒿琥酯组比较,Z-VAD组小鼠肺组织的Fas和Caspase3的蛋白和基因表达水平下降,Bcl-2的蛋白和基因表达水平增加。研究结论:（1）青蒿琥酯能够减少哮喘小鼠肺组织中的炎症细胞数量,尤其是EOS的数量最为明显,并且减轻气道上皮细胞的粘液产生和改善了气道高反应性。青蒿琥酯降低EOS可能参与了 EOS的成熟、趋化和凋亡等过程,通过降低IL-5和Eotaxin细胞因子影响EOS的成熟和趋化,通过细胞凋亡的外在（Fas）和内在（Bcl-2）途径诱导Caspase依赖性EOS凋亡,并且给予Caspase酶抑制剂后炎症状态恢复。（2）青蒿琥酯的效力相对较低,但作用的范围较为广泛,对小鼠体重也没有影响,不仅减少细胞因子和诱导凋亡,还对肺组织和气道的功能性作用也有作用。
王重阳[10]（2020）在《虎杖苷通过抑制P2X7R-NLRP3介导的自噬缓解哮喘气道炎症以及气道重塑》文中提出研究背景:支气管哮喘（bronchial asthma,简称哮喘）是一种极其复杂且由多种细胞及细胞成分例如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和这些细胞所分泌的细胞因子等所构成的慢性气道炎症性疾病。它主要以气道慢性炎症性改变、气道高反应及重症气道重塑为特征。哮喘气道炎症发生的主要原因与Th1/Th2、Th17/Treg分化不平衡密切相关,而当哮喘气道炎症的治愈不及时,随病程的延长可逐步形成气道重塑。气道重塑的病理学变化表现为上皮损伤、杯状细胞增生、黏膜化生、粘液分泌增加、胶原纤维沉积、基底膜增厚、气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖及周围新生血管增加,与哮喘气道炎症不同的是仅有发生气道重塑时有平滑肌增生以及基底膜增厚等改变。其中ASMCs增殖在气道重塑的过程中起到至关重要的作用。MMP-9可认为是哮喘持续气道重塑的标志物之一,随着哮喘气道重塑的加重MMP-9的释放也逐渐增加。新生血管的增加是哮喘气道重塑的一个重要病理特征,血管内皮细胞生长因子（VEGF）是血小板衍生生长因子（PDGF）家族成员之一,它是一种具有多种生物学功能的血管调节因子,因此VEGF在哮喘气道重塑的发病中同样扮演着十分重要的角色。据报道,自噬与哮喘的进展或许有一定的相关性,自噬（autophagy）,是仅发生在真核细胞上由溶酶体介导且高度保守的细胞自我消化、自我溶解的过程。自噬体的形成主要是由一系列自噬相关（Atg）基因和蛋白执行的,在这些Atg蛋白中,Beclin-1和LC3（微管相关蛋白1轻链3）是最着名的自噬相关蛋白。AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate activated protein kinase）是一种异三聚体的常规丝氨酸/苏氨酸激酶,它能够通过调节细胞内代谢从而维持细胞内能量的稳态,同时AMPK也是启动自噬机制的关键作用酶。肝激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）是AMP活化激酶的关键上游激活剂。有报道指出AMPK参与自噬的调节中可能依赖P2X7R的介导,P2X7R是一种配体门控离子通道受体,广泛表达于机体的不同组织器官当中,高浓度细胞外ATP可以激活P2X7R导致许多细胞活化反应。目前,哮喘的治疗除抗炎、平喘外依然主要以激素为主,然而激素副作用较高,故大力发展我国传统中药或许将成为未来哮喘治愈手段的必然趋势,本研究选用虎杖苷（Polydatin,PD）作为研究药物,虎杖苷是植物虎杖中提取的主要有效成分,具有清除氧自由基、抗炎、抗纤维化、抗休克、调血脂等多种生物学活性。研究目的:从体内和体外实验共同来阐明虎杖苷通过P2X7R-NLRP3介导的自噬对哮喘气道炎症和气道重塑的影响及其作用机制,为哮喘与自噬的关系提供新的研究方向,为临床哮喘的治疗提供新的作用靶点。材料与方法:1.气道炎症:（1）体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、卵清蛋白（ovalbumin,OVA）致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道炎症模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用乙酰胆碱（acetylcholine chloride,Ach）呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色及Masson染色;4)采用ELISA方法检测小鼠BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)Western Blot检测小鼠肺组织中 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1 的表达;6)Caspase-1活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性;7)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。（2）体外实验:复苏人气道上皮BEAS-2B细胞,分别使用 Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK 预处理 BEAS-2B 细胞,再使用BzATP刺激BEAS-2B细胞。观察指标:1)MTT法检测BEAS-2B细胞活力;2)Western Blot 检测 BEAS-2B 细胞中 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β的表达;3)AO 染料对 BEAS-2B 细胞进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证。5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELISA方法检测BEAS-2B细胞中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测BEAS-2B细胞中P2X7R的表达情况。2.气道重塑:（1）体内实验:48只BALB/C小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、OVA致敏组、BzATP处理组、低剂量虎杖苷组、高剂量虎杖苷组以及阳性对照组。除正常组外其余组小鼠建立哮喘气道重塑模型,各药物组分别给予相应的干预手段。观察指标:1)利用Ach呼吸激发实验检测小鼠气道反应性;2)BALF中总细胞以及各炎症细胞数量统计;3)小鼠肺组织进行HE、PAS及 Masson 染色;4)采用 ELISA 方法检测小鼠 BALF 中 IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β水平;5)免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9 水平;6)Western Blot 检测小鼠肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1 的表达;7)Caspase-1 活性检测试剂盒检测小鼠肺组织中Caspase-1活性8)组织免疫荧光检测小鼠肺组织IL-1β表达水平。（2）体外实验:复苏大鼠气道平滑肌细胞RASMCs,分别使用Apyrase、3-MA、A438079、Z-YVAD-FMK 预处理 RASMCs,再使用 BzATP 刺激RASMCs。观察指标:1)MTT法检测RASMCs活力;2)Western Blot检测RASMCs 中 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Pro-IL-1 β、mature-IL-1β的表达;3)AO染料对RASMCs进行染色;4)SiRNA沉默P2X7R并采用RT-PCR进行验证;5)Caspase-1活性检测试剂盒和ELIS A方法检测RASMCs中Caspase-1活性和IL-1β表达水平;6)细胞免疫荧光检测RASMCs中P2X7R的表达水平。结果1.第一部分:（1）与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显着升高（p<0.05）,虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低（p<0.05）;（2）与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均增加（p<0.05）,虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量均明显降低（p<0.05）;（3）BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;（4）与 OVA 致敏组相比,BzATP 处理组 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显着升高（p<0.05）,低、高剂量的虎杖苷治疗增高了 IFN-γ水平,降低了 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平（p<0.05）;（5）与 OVA致敏组相比,BzATP 处理组肺组织中 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1 表达显着增强,LKB1 和 AMPKα的磷酸化降低（p<0.05）,虎杖苷治疗组中 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1 表达显着降低,LKB1 和 AMPKα的磷酸化升高（p<0.05）;（6）与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了 Caspase-1活性（p<0.05）并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了 Caspase-1活性（p<0.05）并增加了肺组织中IL-1β的表达;（7）低、高剂量虎杖苷降低了 BzATP诱导的BEAS-2B细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了 LKB1和AMPKα的磷酸化（p<0.05）,高剂量虎杖苷效果更为显着（p>0.01）,AO染色中虎杖苷抑制了 BzATP诱导BEAS-2B细胞自噬空泡的形成;（8）在BzATP诱导的BEAS-2B细胞中,3-MA和低剂量虎杖苷降低了 P2X7R水平（p<0.05）,Apyrase、A438079、高剂量虎杖苷显着降低了 P2X7R水平（p<0.01）,A438079和低剂量虎杖苷降低了 NLRP3 和 Caspase-1 水平（p<0.05）,Apyrase、3-MA和高剂量虎杖苷显着降低了 NLRP3和Caspase-1水平（p<0.01）,3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了 ASC水平（p<0.05）,Apyrase和高剂量虎杖苷显着降低了 ASC水平（p<0.01）,Z-YVAD-FMK降低了 P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平（p<0.05）,虎杖苷降低了 Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平（p<0.05）。（9）在BEAS-2B细胞中,SiRNAP2X7R显着降低了 P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了 AMPKα的磷酸化（p<0.01）。第二部分:（1）与OVA致敏组相比,BzATP处理组小鼠的气道阻力显着升高（p<0.05）,虎杖苷低、高治疗组小鼠的气道阻力则明显降低（p<0.05）;（2）与OVA致敏组相比,BzATP组的BALF中总炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均增加（p<0.05）,虎杖苷的低、高剂量组较模型组的炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞数量、中性粒细胞数量和淋巴细胞的数量均明显降低（p<0.05）;（3）BzATP会加重OVA吸入小鼠气道内炎症细胞的浸润、破坏肺内组织结构、促进杯状细胞增生、粘液分泌及纤维化,而虎杖苷可减轻OVA吸入小鼠的炎症细胞浸润、杯状细胞增生及纤维化程度;（4）与OVA致敏组相比,BzATP处理组BALF中IFN-γ水平显着降低,IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β的水平显着升高（p<0.05）,低、高剂量的虎杖苷治疗增高了 IFN-γ水平,降低了 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-22、IL-1β表达水平（p<0.05）;（5）与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1表达显着增强,LKB1和AMPKα的磷酸化降低（p<0.05）,虎杖苷治疗组中α-SMA、PCNA、VEGF、MMP-9、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR、P2X7R、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1 表达显着降低,LKB1 和 AMPKα的磷酸化升高（P<0.05）;（6）与OVA致敏组相比,BzATP处理组肺组织明显增加了 Caspase-1活性（p<0.05）并降低了肺组织中IL-1β的表达,虎杖苷治疗组明显降低了 Caspase-1活性（p<0.05）并增加了肺组织中IL-1β的表达;（7）低、高剂量虎杖苷降低了 BzATP诱导的RASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-mTOR水平,同时增加了 LKB1和AMPKα的磷酸化（p<0.05）,高剂量虎杖苷效果更为显着（p>0.01）,AO染色中虎杖苷抑制了 BzATP诱导RASMCs自噬空泡的形成;（8）在 BzATP 诱导的 RASMCs 中,3-MA降低了 P2X7R 水平（p<0.05）,Apyrase、A438079、低、高剂量虎杖苷显着降低了 P2X7R水平（p<0.01）,3-MA、A438079和低剂量虎杖苷降低了 NLRP3、ASC和Caspase-1水平（p<0.05）,Apyrase和高剂量虎杖苷显着降低了 NLRP3、ASC和Caspase-1水平（p<0.01）,Z-YVAD-FMK 降低了 P2X7R、Caspase-1、Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平（p<0.05）,虎杖苷降低了 Pro-IL-1β、mature-IL-1β水平（p<0.05）。（9）在RASMCs中,SiRNAP2X7R显着降低了 P2X7R的表达,经BzATP处理后,SiRNAP2X7R增加了 AMPKα的磷酸化（p<0.01）。结论1.ATP/P2X7R的激活促进Th2、Th17分化,增加炎性细胞浸润,促进杯状细胞增生、胶原沉积和纤维化,加重哮喘气道炎症和气道重塑;2.虎杖苷通过激活LKB1/AMPK/mTOR信号通路减轻哮喘气道炎症和气道重塑,3.ATP/P2X7能够激活NLRP3炎症小体,促进IL-1β的释放,加速哮喘气道炎症和气道重塑的发展;4.AMPK可能是P2X7的下游信号;5.虎杖苷通过抑制ATP/P2X7R-NLRP3信号轴介导的自噬缓解哮喘气道炎症和气道重塑;
二、巨噬细胞在支气管哮喘气道重塑中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、巨噬细胞在支气管哮喘气道重塑中的作用（论文提纲范文）
（1）肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的免疫调控特征 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的相互关系 |
| 3 免疫调控对支气管哮喘慢性持续期预后转归的影响 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床需求 |
| 5 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床局限与未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的中医观 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期中医临床特征与免疫炎症的相关性 |
| 3 支气管哮喘慢性持续期中医病机演变与免疫调控的相互关系 |
| 4 中医干预对支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的作用 |
| 5 中医通过免疫调控影响支气管哮喘慢性持续期预后转归 |
| 6 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控的优势与特色 |
| 7 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控面临的问题与发展趋势 |
| 参考文献 |
| 第二部分 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”理论研究 |
| 1 “脏腑整体辨证”观 |
| 1.1 整体观念 |
| 1.2 脏腑辨证 |
| 1.3 “脏腑整体辨证”的含义 |
| 2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”观 |
| 2.1 支气管哮喘慢性持续期关键病机的共性规律特征 |
| 2.2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”的含义 |
| 3 “温润辛金培本”原理方药的临床应用 |
| 3.1 “温润辛金培本”治则理论基础 |
| 3.2 “温润辛金培本”原理方药系列疗法 |
| 3.3 温润辛金培本原理内服方药 |
| 3.4 温润方 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”与西医免疫调控的异同 |
| 4.1 免疫调控失衡的认识思路不同 |
| 4.2 免疫调控的方法有别 |
| 4.3 免疫调控的目的一致 |
| 5 “肺脾为核心脏腑整体辨证”继承与发展了中医解决支气管哮喘慢性持续期问题的优势与特色 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 研究一 基于RCT的肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期患者临床信息分析及血清标本收集 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节免疫球蛋白水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节促炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节抗炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 特色与创新 |
| 3 问题与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 附件1 支气管哮喘慢性持续期实用性随机对照研究方案 |
| 附件2 试验过程的标准作业程序质量控制(即SOP管理) |
| 附件3 各中心血清采集及哮喘控制情况 |
（2）诱导痰液IL-25水平在儿童支气管哮喘发病中的临床意义研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 儿童支气管哮喘痰液IL-25水平与临床指标的相关性研究 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 支气管哮喘儿童诱导痰液IL-25蛋白及基因的表达 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞因子IL-25与支气管哮喘 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文论文一 |
| 附英文论文二 |
（3）自噬和Ang（1-7）在OVA诱导的哮喘气道重塑中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 研究背景 |
| 前言 |
| 第一部分 细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制研究 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 第二部分 血管紧张素(1-7)在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ(待发表） |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 支气管哮喘的中西医研究概况 |
| 1 病名与症状的研究 |
| 2 病因病机 |
| 3 古今医家论治支气管哮喘 |
| 4 支气管哮喘发病机制的中医研究 |
| 5 现代医学对于支气管哮喘的研究 |
| 6 小结 |
| 文献综述二 哮喘模型动物的选择与建立 |
| 1 实验动物的选择 |
| 2 小鼠哮喘模型的致敏剂与剂量 |
| 3 不同病理改变的哮喘模型小鼠 |
| 4 特殊种类哮喘的鼠类模型 |
| 5 细胞模型 |
| 6 小结 |
| 实验研究 |
| 第一章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs/NF-κB通路改善急性哮喘气道炎症 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs和AKT/HIF-1α通路改善哮喘气道重塑 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间科研成果 |
| 个人简历 |
（5）Sema4D在RSV诱发哮喘大鼠气道炎症和气道重塑中的作用及咳喘宁的干预机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 Sema4D对哮喘免疫炎症的影响及咳喘宁的干预作用 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器、设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 哮喘大鼠模型的建立 |
| 2.2 气道反应性测定 |
| 2.3 实验分组及给药 |
| 2.4 标本留取 |
| 2.5 指标检测及方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 两组大鼠气道反应性结果 |
| 4.2 各组大鼠肺组织病理学改变比较 |
| 4.3 各组大鼠气道下胶原沉积情况 |
| 4.4 各组大鼠肺组织Sema4D的表达 |
| 4.5 各组大鼠肺组织CD72的表达 |
| 4.6 各组大鼠肺组织Plexin-B1的表达 |
| 4.7 各组大鼠相关炎症因子检测 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 Sema4D对模型大鼠气道上皮增殖与迁移的调节及咳喘宁的干预作用 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器、设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 含药血浆的制备 |
| 2.2 大鼠气道上皮细胞培养、纯化与鉴定 |
| 2.3 细胞分组及处理 |
| 2.4 检测指标及方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 细胞鉴定结果 |
| 4.2 咳喘宁对哮喘大鼠气道上皮细胞增殖与迁移的影响及干预作用 |
| 4.3 Sema4D对模型组大鼠气道上皮细胞增殖与迁移的影响及咳喘宁的干预作用 |
| 5 讨论 |
| 第三部分 Sema4D对 PI3K/Akt信号通路的调节及咳喘宁的干预作用 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器、设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠气道上皮细胞培养、纯化与鉴定 |
| 2.2 细胞分组及处理 |
| 2.3 检测指标及方法 |
| 3 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 咳喘宁通过PI3K/Akt通路 对哮喘的影响及干预作用 |
| 4.2 Sema4D通过PI3K/Akt通路对哮喘的影响及干预作用 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 课题资助 |
| 攻读学位期间参与的科研项目及发表论文 |
| 参考文献 |
| 综述 Sema4D在RSV诱发哮喘中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）HMGB1/RAGE信号调控Th17/IL-17及其在支气管上皮-间质转化中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法及试剂 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HMGB1/RAGE参与调控Th17细胞的分化成熟和IL-17的分泌水平 |
| 2.2 HMGB1/RAGE信号促进小鼠来源的支气管上皮细胞发生 EMT |
| 2.3 Th17/IL-17协同 HMGB1/RAGE信号调控支气管上皮细胞EMT |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HMGB1/RAGE信号在支气管哮喘发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（7）CTGF通过诱导FSTL1表达影响哮喘气道重塑机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 明确CTGF及FSTL1在哮喘小鼠气道重塑中的作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 细胞水平观察CTGF对FSTL1/DIP2A信号通路的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 体内干预CTGF的表达对于哮喘小鼠FSTL1和气道重塑的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 结果附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| English article |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化模型的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-448-5p对TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化和气道纤维化的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文目录 |
| 致谢 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）青蒿琥酯对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 支气管哮喘的中医研究进展 |
| 1. 病名 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 内治法 |
| 4. 外治法 |
| 5. 体质疗法 |
| 6. 支气管哮喘的中药现代理论研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 嗜酸性粒细胞在支气管哮喘中的研究进展 |
| 1. 嗜酸性粒细胞的来源 |
| 2. 嗜酸性粒细胞谱系祖细胞的形成 |
| 3. 嗜酸性粒细胞的成熟 |
| 4. 嗜酸性粒细胞的募集 |
| 5. 嗜酸性粒细胞的激活 |
| 6. 嗜酸性粒细胞的凋亡 |
| 7. 嗜酸性粒细胞在哮喘中的作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 1. 支气管哮喘的现状 |
| 2. 支气管哮喘与嗜酸性粒细胞凋亡 |
| 3. 支气管哮喘的中医发展 |
| 4. 青蒿琥酯对支气管哮喘的作用 |
| 5. 假说提出和研究目的 |
| 参考文献 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）虎杖苷通过抑制P2X7R-NLRP3介导的自噬缓解哮喘气道炎症以及气道重塑（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 虎杖苷对哮喘气道炎症的影响 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第二部分 虎杖苷对哮喘气道重塑的影响 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 论文示意图 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 综述 自噬在哮喘气道炎症和气道重塑中的研究进展 |
| 参考文献 |
四、巨噬细胞在支气管哮喘气道重塑中的作用（论文参考文献）
- [1]肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究[D]. 司东旭. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]诱导痰液IL-25水平在儿童支气管哮喘发病中的临床意义研究[D]. 张赟. 山东大学, 2020(04)
- [3]自噬和Ang（1-7）在OVA诱导的哮喘气道重塑中的机制研究[D]. 徐建锋. 山东大学, 2020(09)
- [4]蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制[D]. 洪天一. 长春中医药大学, 2020(01)
- [5]Sema4D在RSV诱发哮喘大鼠气道炎症和气道重塑中的作用及咳喘宁的干预机制[D]. 陈莹莹. 湖南中医药大学, 2020(02)
- [6]HMGB1/RAGE信号调控Th17/IL-17及其在支气管上皮-间质转化中的作用研究[D]. 孙婧怡. 桂林医学院, 2020(03)
- [7]CTGF通过诱导FSTL1表达影响哮喘气道重塑机制的研究[D]. 刘文. 山东大学, 2020(08)
- [8]miR-448-5p通过调控Six1抑制TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT间充质转化的研究[D]. 杨召川. 山东大学, 2020(08)
- [9]青蒿琥酯对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞的作用及机制[D]. 王瑞茵. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]虎杖苷通过抑制P2X7R-NLRP3介导的自噬缓解哮喘气道炎症以及气道重塑[D]. 王重阳. 延边大学, 2020(05)