姜黄油对动脉损伤大鼠血管成形术后再狭窄的抑制作用

一、莪术油对动脉损伤大鼠血管成形术后再狭窄的抑制作用（论文文献综述）

花儿（T.ATARTSE TSEG）^[1]（2021）在《豁痰解毒通络饮对大鼠PTCA术后AS模型的干预作用及其调控自噬通路的研究》文中研究表明目的:本研究通过大鼠颈总动脉球囊损伤术模型模拟临床中PTCA术后AS形成的再狭窄,观察豁痰解毒通络饮对该模型的干预作用,并讨论豁痰解毒通络饮是否通过自噬信号通路抑制PTCA术后动脉粥样硬化的形成。方法:5周龄雄性（SPF）级SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只,分别:为假手术组、模型组、中药组和西药组。大鼠适应性喂养3天后,建立颈总动脉球囊损伤术后AS模型;中药组大鼠予以豁痰解毒通络饮灌胃治疗,西药组则予以阿托伐他汀灌胃治疗,其余各组均予以等体积蒸馏水灌胃,并于术后4周取材。1.采用HE染色法检测损伤侧血管组织病理学改变情况;2.采用免疫组织化学法（IHC）检测各组大鼠颈总动脉中Beclin-1的表达情况;3.q PCR检测各组大鼠颈总动脉组织中自噬标志性分子Beclin-1、ULK1、Atg12的m RNA表达水平。3.蛋白免疫印记法（western-blot）检测各组大鼠颈总动脉中ULK1、Atg12、Atg5的表达情况。结果:1.HE染色结果显示:相比较于假手术组,模型组颈动脉内膜显着增生,管腔狭窄较为明显;与模型组相比较,中药组和西药组内膜增生情况均明显降低,管腔狭窄情况得以缓解。2.IHC检测结果显示:假手术组中几乎无粽黄色阳性表达颗粒,Beclin-1表达呈阴性;相比之下,模型组的内膜有较明显的增厚,并且新生内膜中含有大量的棕黄色Beclin-1阳性表达颗粒;与模型组相比,中药组和西药组Beclin-1的阳性表达则明显减弱。3.q PCR检测结果显示:相比于假手术组,模型组大鼠颈动脉组织中ULK1、Beclin-1、Atg12的m RNA表达水平均显着升高（P<0.01）;而与模型组相比较,中药组和西药组大鼠颈动脉中ULK1、Beclin-1、Atg12的m RNA表达水平均明显降低（P<0.01）。4.western-blot检测结果显示:与假手术组相比,模型组大鼠颈动脉组织中ULK1、Atg12、Atg5的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;相比之下,中药组和西药组ULK1、Atg12、Atg5的蛋白表达水平则显着降低（P<0.01）。结论:1.通过实验成功建立了大鼠PTCA术后AS模型,研究发现其成模率高,病变情况相对恒定,因此可用于模仿人类PTCA术后再狭窄的相关实验研究;2.豁痰解毒通络饮可明显抑制颈动脉球囊损伤后内膜的增生,改善大鼠颈动脉粥样硬化的形成;3.在大鼠PTCA术后AS模型中自噬信号通路过度表达,而豁痰解毒通络饮能够有效的抑制自噬通路过度激活,这为今后中医药治疗PTCA术后AS提供了新的治疗策略和分子生物学依据。

陈乙菲^[2]（2020）在《基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究》文中提出目的:基于CaN/NFAT信号通路,探讨血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响,探讨血府逐瘀汤对大鼠颈动脉损伤模型病理变化的影响、该信号通路标志因子和炎症因子的相关影响,明确血府逐瘀汤治疗血管内膜损伤可能的作用机制,丰富血府逐瘀汤的治疗范围和药理机制。方法:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响用BEGM培养基培养人脐静脉内皮细胞。实验用药为血府逐瘀汤冻干粉用无血清培养基BEGM配制成100mg/ml含药培养基,在涡旋仪上充分混匀后,用0.22μm滤膜除菌过滤后,高压灭菌分装保存,4℃冷藏备用。MTS实验检测不同浓度血府逐瘀汤对HUVECs细胞增殖的影响,分为正常对照组（加等体积不含药培养基）、含药培养基组（浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml、50μg/ml）,培养24h和48h,分别检测OD值。细胞划痕实验检测血府逐瘀汤对HUVECs细胞迁移和修复的影响,分为对照组（无血清培养基）,血府逐瘀汤12.5μg/ml组、血府逐瘀汤25μg/ml组、血府逐瘀汤50μg/ml组。将6孔板封好,放入37℃,5%CO2培养箱,分别于0h、24h、48h镜下拍照（×10）。Real-time PCR检测HUVECs细胞物理损伤后24h和48hCaN/NFAT标志因子的表达量。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:健康SD大鼠72只,分为6组,假手术组、模型组、他克莫司组、血府逐瘀汤高剂量组、血府逐瘀汤中剂量组、血府逐瘀汤低剂量组。假手术组只结扎颈外动脉,不做球囊扩张损伤,其余各组大鼠行球囊损伤术对大鼠颈动脉造成损伤,给药28天后取材。大鼠颈动脉做HE染色看各组病理形态变化情况,采各组大鼠血清用ELISA法检测血清MCP-1。实验二:取大鼠颈动脉组织,用免疫组化方法检测CaN含量,用Real-time PCR检测各组大鼠颈动脉中CaN、NFATc2、NFATc3、IL-2、TNF-α、COX2、S100A4 mRNA和蛋白表达水平。结果:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响MTS细胞增殖实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞增殖的作用,到48h时血府逐瘀汤50μg/ml组表现出抑制细胞增殖的作用。细胞划痕实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞迁移和修复的作用,48h血府逐瘀汤50μg/ml组体现抑制细胞迁移的作用。Real-time PCR结果显示:血府逐瘀汤给药24h,12.5μg/ml、25μg/ml血府逐瘀汤组可显着上调CaN、NFATc1、NFATc2、NFATc3 mRNA的表达量（*P<0.05,#P<0.01）;到给药48h时CaN/NFAT信号通路标志因子有表达量下调的趋势,但无统计学差异。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:颈动脉HE染色结果示:与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组有极少量血管新生内膜,极薄,有少量炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱,弹力纤维板不平整比模型组要有明显改善减轻。血清MCP-1结果示:与假手术组相比各组大鼠血清MCP-1含量具有极显着差异(**P<0.01)。他克莫司组与中剂量中药组血清含量比较未见明显差异（P>0.05）,高剂量中药组与他克莫司组比较含量降低,有极显着差异(&&P<0.01)。实验二:免疫组化检测大鼠颈总动脉组织切片CaN的表达结果示:假手术组很少见棕黄色颗粒,模型组有内膜明显增厚,CaN表达呈阳性,可见数个棕黄色颗粒;他克莫司组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组棕黄色颗粒与模型组比较明显减少,提示药物干预后大鼠颈总动脉组织中CaN表达下降。血府逐瘀汤对大鼠颈总动脉组织中CaN/NFAT信号通路标志因子的影响:与假手术组相比,模型组CaN/NFAT信号通路标志因子CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调标志因子的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。血府逐瘀汤对球囊损伤后的大鼠颈总动脉中炎症因子的影响:与假手术组相比,模型组炎症因子IL-2、TNF-α、COX2的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调三者的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。结论:1.血府逐瘀汤对HUVECs细胞的增殖和迁移在一定浓度剂量有促进作用,而随着浓度的升高有抑制作用,且这种抑制作用会随药物作用时间延长而体现出来。2.血府逐瘀汤对HUVECs损伤后CaN/NFAT信号通路标志因子在初期有促进作用,随药物作用时间延长会体现抑制趋势。3.血府逐瘀汤能有效改善球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的病变情况,为研究再狭窄提供基础。4.血府逐瘀汤可以降低大鼠颈总动脉组织中IL-2、TNF-α、COX2含量,能降低血清中MCP-1的含量,具拮抗炎症的作用。5.血府逐瘀汤能抑制大鼠颈总动脉组织中CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达量,提示血府逐瘀汤可通过CaN/NFAT信号通路抑制内膜过度增生,发挥防治再狭窄的作用。

路芳芳^[3]（2020）在《阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究》文中研究说明第一部分小鼠血管内膜增生模型的的构建目的:构建小鼠血管内膜增生模型,探讨其引起内膜增生和管腔狭窄的相关机制。方法:根据文献报道的方法[1],使用硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生,对照侧实行假手术,分离股动脉后不进行套管。手术后进行体重连续监测,取血管进行组织形态分析前用小动物超声仪检测小鼠双侧股动脉内血流的变化,作为再狭窄形成的辅助诊断指标。通过对实验处股动脉切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE staining）来判断血管内新生内膜的面积和管腔狭窄的程度,分别对内膜面积,中膜面积,内膜与中膜的比例（I/M）用ImageJ软件处理后进行定量。结果:经测定,与假手术侧相比,小鼠股动脉手术侧的血流速度[（126.2334±21.43199）vs（70.97854±4.646153）,P=0.002]显着加快,差异有统计学意义,即手术侧管腔的横截面积小于对照侧。取小鼠股动脉切片后进行HE染色,可见血管内膜显着增生和管壁增厚及管腔狭窄。内膜中可见大量的血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）增生,血管周可见炎性细胞浸润。血管狭窄参数的定量结果显示,手术侧的内膜面积[（2563.67±398.31）vs（7974.67±1491.69）,P=0.004],中膜面积[（6939.67±570.507）vs（12227.67±1487.02）,P=0.005],I/M 比值[（0.37±0.04）vs.（0.66±0.13）,P=0.019]都明显高于对照侧（图3D）,差异有统计学意义。结论:成功构建了简单实用的通过血管外膜损伤诱导小鼠股动脉内膜增生的模型。第二部分体外评价阿苯达唑对平滑肌细胞生物学功能的影响目的:利用体外实验评价阿苯达唑（Albendazole,ABZ）对VSMCs生物学功能的影响并简要探讨其作用机制。方法:体外各实验均用与实验组等体积的DMSO作为对照,且DMSO在培养基中的浓度≤0.2%。MTT法检测ABZ对VSMCs和内皮细胞（endothelial cell,ECs）增殖的影响,3-D细胞迁移实验和Annexin V-PI染色分别评估ABZ对VSMCs迁移和凋亡的影响。细胞划痕实验用来评估ABZ对ECs迁移的影响。在VSMCs体外迁移的过程中,使用特异性鬼笔环肽荧光染料标记丝状肌动蛋白（F-actin）,用来反映ABZ对细胞骨架结构变化的影响。免疫印迹法（Western blotting）检测肌球蛋白磷酸酶1（MYPT1）和肌球蛋白轻链2（MLC）磷酸化水平的变化。结果:MTT实验检测结果显示,与对照组相比,ABZ以0.5μM[（0.60±0.03）vs（0.50±0.04）,P<0.001]1μM[（0.60±0.03）vs（0.33±0.03）,P<0.001]浓度作用 48h后,均能显着抑制VSMCs的增殖,最小起效浓度为0.5μM。细胞迁移实验结果显示,与对照组相比,ABZ 以 0.5μM[（118.55±3.39）vs（81.00±4.00）,P<0.001]和1μM[（118.55±3.39）vs 78.875±3.01),P<0.001]浓度作用 48h 时后对 VSMCs 迁移具有抑制作用,穿过胶原贴附到Transwell小室膜外侧的细胞数显着减少。流式细胞术检测结果表明,ABZ作用48h后,0.5μM浓度对细胞凋亡没有显着影响[（18.29±2.79）vs（20.02±2.23）,P=0.420],但在 1.0μM时可以促进细胞凋亡[（18.29±2.79）vs（25.13+1.35）,P=0.002]。本实验室之前的实验研究表明,ABZ将VSMCs的细胞周期阻滞在G2/M期。使用MTT细胞增殖试剂盒对ECs的检测结果表明,与对照组相比,ABZ处理48h,0.5μM[（0.34±0.11）vs.（0.42±0.09）,P=0.146]和 1μM[（0.34±0.11）vs.（0.40±0.10）,P=0.427]浓度对ECs的增殖作用均未见显着的抑制作用。细胞划痕实验用来体外模拟ABZ对ECs损伤愈合的影响,ImageJ软件分别对Oh和24h划痕愈合的面积进行定量。愈合面积用Oh划痕面积与24h划痕面积之差表示。相较于对照,ECs 经过 0.5μM[（85423.89±29521.03）vs（18211.33±4985.28）,P<0.01]和 1μM[（85423.89±29521.03）vs（21810.00±17750.62）,P<0.001]ABZ 处理 24h 后,创面愈合面积都具有明显差异。Western blot检测结果显示,与对照相比,0.5μM[（0.64±0.12）vs（0.37±0.12）,P=0.04]和1.0μM[（0.64±0.12）vs（0.24±0.07）,P=0.007]ABZ 分别作用24h后,MYPT1磷酸化水平显着降低。MLC磷酸化水平在0.5μM[（0.89±0.06）vs（0.56±0.13）,P=0.01]和 1μM[（0.89±0.06）vs（0.34±0.08）,P<0.001]ABZ 处理后也显着降低。结论:ABZ能够在体外抑制VSMCs增殖和迁移,对细胞凋亡影响较小,并且不会影响ECs的增殖作用。ABZ对VSMCs迁移的影响与细胞骨架中F-actin的拆解有关,能够显着抑制F-actin的拆解,其机制可能与ABZ对MLC和MYPT1磷酸化水平的调节有关。第三部分阿苯达唑对小鼠股动脉内膜增生和管壁重塑的影响目的:利用小鼠血管内膜增生模型评价ABZ在体内对小鼠股动脉损伤后再狭窄形成的影响,探讨ABZ成为血管再狭窄潜在预防药物的可能。方法:取10周龄野生型雄性C57BL/6小鼠,硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生模型,对侧实行假手术。术后将小鼠随机分为实验组和对照组,两组小鼠同时用高脂饲料喂养。期间实验组将ABZ以1.5 mg/天的剂量进行灌胃,对照组以同体积的芝麻油灌胃。4周后用小动物超声仪评价血管内膜增生的严重程度。HE染色后观察血管组织的形态学变化,ImageJ软件处理后对内膜面积,中膜面积及内膜与中膜的比例（I/M）进行定量。通过免疫组织化学染色评价平滑肌细胞表型转换分子（α-SMA）,内皮细胞标记（CD31）,巨噬细胞标记（Mac-3）,以及平滑肌细胞核增殖抗原（PCNA）表达的变化。结果:与对照组相比,实验组小鼠双侧股动脉内血流速度的差值[（40.37±2.88）vs（25.08±7.37）,P=0.008]减低,差异有统计学意义,即ABZ作用后股动脉血管腔的横截面积大于对照侧,狭窄程度得到改善。HE染色结果表明,相较于对照组小鼠,ABZ 能够显着抑制内膜[（5605.79±1246.96）vs（2988.66±365.58）,P=0.017]增生及I/M的比例[（1.12±0.20）vs（0.76±0.15）,P=0.005],对中膜的面积并无显着效应[（4114.46±970.57）vs（3913.79±528.51）,P=0.661]。免疫组化染色结果显示,α-SMA阳性细胞显着减少[（0.35±0.02）vs（0.21±0.04）,P=0.008]。CD31染色结果表明,ABZ不会影响再内皮化。PCNA染色结果显示ABZ处理后,PCNA阳性细胞数明显减少[（0.32±0.03）vs（0.20±0.04）,P=0.007]。与对照组相比,巨噬细胞阳性数也减少[（0.08±0.02）vs（0.04±0.01）,P=0.03]。结论:ABZ通过作用于VSMCs和炎症细胞,有效的改善了动脉内膜增生和血管壁重塑,对术后血管再狭窄的形成具有较好的预防作用。

夏晓东^[4]（2020）在《温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响》文中研究表明目的:1.使用温控射频消融球囊对兔正常动脉血管进行纵向线性消融,探讨不同温度射频对兔正常动脉的损伤情况,观察温控射频球囊及单纯球囊对正常血管内膜损伤,增生及纤维组织增生情况,并测量动脉管腔面积,探索射频消融动脉血管合适温度。2.使用温控射频球囊对兔动脉粥样硬化血管进行纵向线性消融,探讨温控射频消融球囊对动脉粥样硬化斑块的影响,并了解其对动脉粥样硬化斑块血管管腔面积影响,测量炎性因子,凋亡因子及TGF-β通路,探索温控射频球囊线性消融动脉粥样硬化血管后血管组织学变化,并探索温控射频球囊消融动脉粥样硬化血管后,促炎细胞因子,抑炎细胞因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2炎症通路变化情况,为临床治疗动脉粥样硬化提供新思路。方法:1.将正常健康家兔分为4组,即单纯球囊扩张对照组,45℃温控射频球囊扩张组,50℃温控射频球囊扩张组,55℃温控射频球囊扩张组。温控射频球囊在扩张后1h,3d,7d留取兔动脉标本,甲醛固定,并进行HE,Masson染色,观察血管增生,胶原纤维变化情况并测量血管腔面积。2.动脉硬化建模:球囊拉伤兔腹主动脉内膜,并联合高脂饮食喂养,建立动脉粥样硬化模型,并在12w时随机处死2只大兔以检验动脉粥样硬化造模是否成功。3.将造模成功的大兔随机分为2组,即使用55℃射频消融扩张及单纯球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,在1小时,7天,14天以及28天留取动脉标本,行HE及MASSON染色,进行病理组织学切片观察,了解温控射频球囊及单纯球囊扩张对动脉粥样硬化血管影响。并应用免疫组化,western blot及荧光定量PCR等方法,检测组织中促炎因子,抑炎因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2通路蛋白水平及组织中m RNA水平的变化。结果:1.与单纯球囊扩张组及对照组比较,应用45℃,50℃,55℃线性消融正常兔动脉血管时,血管管腔面积各统计组之间无统计学差异。2.使用55℃射频扩张粥样硬化血管,在相同时间点,温控射频球囊组血管管腔面积大于单纯球囊扩张组,而随时间延长温控射频消融球囊组及单纯球囊扩张组两组组内血管管腔面积变化不大。温控射频球囊组各组之间管壁厚度无统计学差异。3.组织水平上,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控射频球囊扩张组IL-1β,IL-17,Bax,IFN-γ,TGF-β,Smad-2以及Caspase3表达明显高于单纯球囊扩张组。温控射频消融球囊扩张组表达IL-10及Bcl-2少于单纯球囊扩张组。4.转录水平与蛋白水平,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控球囊扩张组兔子动脉血管中Bcl-2的整体表达量要明显低于单纯球囊扩张组。但是,温控射频球囊扩张组兔子动脉血管中Bax,TGF-β,Smad-2以及Caspase3的整体表达量要明显高于单纯球囊扩张组。结论:1.使用温控射频消融球囊消融兔正常血管时,45℃,50℃,55℃均可对正常血管造成损伤,但与单纯扩张组比较,血管管腔面积变化不大。虽然随温度升高,血管壁损伤范围也相应扩大,但即使是使用55℃对正常血管进行30s消融,仍然是安全的。2.使用55℃射频消融球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,可使动脉粥样硬化血管管腔面积增大,可能与球囊挤压斑块,射频能量对血管造成线性损伤,血管顺应性增加,在动脉血压的作用下,扩张动脉粥样硬化血管。3.射频消融动脉粥样硬化血管时,消融部位动脉粥样硬化斑块可发生纤维化,可有助于动脉粥样硬化斑块稳定。4.射频消融可使消融部位促炎症细胞因子表达增加,抑炎细胞因子表达减少,凋亡受到抑制,同时TGF-β/smad2通路被激活。这也提示,虽然射频消融能增加血管面积,但同时炎症通路也被激活,如应用于临床,应同时应用抑制炎症反应药物。维持射频消融球囊扩张远期效果。

张润军^[5]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中研究表明研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。

巩正藩^[6]（2019）在《线粒体转位蛋白TSPO在高糖诱导的血管再狭窄中的作用及其机制研究》文中研究表明研究背景:糖尿病患者在行外科血管重塑术或经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）后,相比于非糖尿病患者其血管更易发生再狭窄。当血管损伤后,内膜新生在血管再狭窄过程中扮演着重要的角色,但其具体的发生机制目前还没有被阐明。血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖和迁移目前被普遍认为是血管受损后内膜新生的关键病理基础。高血糖和其他常见的因素如肥胖和高血脂等能够通过增加血管损伤后的氧化应激反应,以此来促进血管内膜的异常性增生。因此,治疗糖尿病患者PCI术后的心血管并发症,寻找一个靶向抑制内膜新生和血管重塑的新型分子是一种可行的方案。线粒体转位蛋白（TSPO）是一种广泛存在于细胞中分子量为18 kDa的蛋白,其最初被定性为外周性苯二氮卓类受体（PBR）。TSPO主要位于线粒体外膜上,已经被证实参与了很多重要的细胞程序,如增殖、凋亡、类固醇的合成、免疫调节、基因表达和线粒体生理过程。TSPO与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的相互作用将活性氧（ROS）的产生与抗氧化反应的诱导联系起来,并维持了细胞内氧化还原反应的稳态。研究证实TSPO基于线粒体外膜途径,能够调控神经元细胞中细胞内Ca2+和活性氧的转运而发挥神经毒性作用。并且TSPO被认为是一种多功能的分子,可以为具有高亲和力的和成型配体提供位点而发挥生理作用。大量研究已经证实,TSPO配体能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖,比如黑色素瘤、结肠癌、食管癌、胸腺癌、星形胶质细胞瘤和乳腺癌。研究证实,经典的TSPO配体Ro5-4864对糖尿病神经病变有保护作用,并且一些高亲和性配体能够调控TSPO的功能,从而进一步调控葡萄糖的稳态和细胞内能量的产生。但是,TSPO配体在冠脉再狭窄和Ⅱ型糖尿病引起的心血管并发症中的作用并未被阐述。基于以上观点,我们提出假设:TSPO是糖尿病患者血管成形术后内膜新生过程中关键的靶点。在我们的研究中,我们探讨了TSPO配体PK 11195和Ro5-4864对VSMC的增殖和迁移的影响,并且还调查研究了PK 11195能否作为一种潜在的化合物去抑制糖尿病患者血管成形术后的内膜新生过程。研究目的:1.观察并描述TSPO在高糖诱导的VSMC增殖和迁移过程中的作用。2.观察TSPO配体对高糖诱导的VSMC增殖和迁移的影响。3.探讨TSPO配体抑制高糖诱导的VSMC增殖和迁移作用的潜在机制。4.在体实验中研究TSPO配体对高血糖引起的内膜新生过程的影响。研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导高血糖大鼠模型。25 mM浓度的高糖刺激A10细胞不同的时间,或者用不同浓度的葡萄糖刺激A10细胞24小时。用免疫荧光染色、免疫印迹（WB）和定量聚合酶链式反应（QT-PCR）的方法检测TSPO的表达。2.用TSPO的小干扰RNA（siRNA）或其配体（PK 11195和Ro5-4864）抑制细胞内TSPO的功能。然后用细胞计数和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）的方法检测A10细胞的增殖情况,用划痕实验和侵袭小室实验检测A10细胞的迁移。3.25mM浓度的高糖刺激A10细胞,并用cGMP、PKG抑制剂观察cGMP和PKG在PK 11195抑制A10细胞增殖和迁移中的作用。A10细胞的增殖用MTT法检测,用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定cGMP的活性。4.Ⅱ型糖尿病大鼠行球囊损伤术诱导颈动脉内膜增生,同时每周两次经腹腔注射PK 11195（3 mg/千克）,连续注射两周后麻醉处死大鼠,收集损伤的颈动脉和对侧颈动脉。苏木素-伊红染色（HE）和免疫荧光染色观察评估PK 11195对动脉内膜新生的作用。研究结果:1.免疫印迹和免疫荧光结果均显示TSPO在高血糖大鼠动脉中的表达相比于对照组明显升高。用高糖刺激A10细胞,免疫印迹结果显示TSPO的表达也明显升高,并且呈浓度和时间依赖性。2.MTT法、划痕实验和侵袭小室实验检测结果均提示:用siRNA或TSPO配体PK 11195或Ro5-4864干扰A10细胞内TSPO的功能后,其高糖诱导的细胞增殖和迁移均被明显抑制,并且呈明显的剂量依赖性。3.对于PK 11195抑制高糖诱导的A10细胞增殖和迁移的潜在机制研究中,用MTT法检测A10细胞增殖情况,发现PK 11195的抑制作用能够被cGMP的阻断剂ODQ所阻断,而非被cAMP的阻断剂cAMP-Rp所抵消。因此,我们检测了cGMP下游的信号分子PKG对此抑制作用的影响,我们发现PK 11195的抑制作用也能够被PKG的阻断剂KT5823所阻断。同时,我们用ELISA的方法检测了cGMP的活性,结果发现高糖能够减少cGMP的产生,而PK 11195可以逆转高糖引起的cGMP活性的降低,而PK 11195的这种作用又能够被ODQ所阻断。以上结果证明,PK 11195通过cGMP/PKG信号通路调解高糖诱导的A10细胞增殖和迁移过程。4.Ⅱ型糖尿病大鼠行颈动脉球囊损伤术,观察PK 11195对内膜新生的影响。HE染色结果发现PK 11195能够明显减轻受损颈动脉的内膜新生,免疫荧光染色结果发现PK 11195能够抑制VSMC中核增殖抗原（PCNA）的表达,以上结果提示这种抑制作用主要是因为PK 11195抑制了VSMC的增殖和迁移。结论:我们的研究结果揭示了TSPO在Ⅱ型糖尿病大鼠颈动脉损伤模型内膜新生过程中的重要作用,并且还发现TSPO配体PK 11195能够通过cGMP/PKG信号通路抑制VSMC的增殖和迁移,从而发挥抑制高糖介导的内膜新生的作用。意义:我们的研究表明通过抑制TSPO的功能,能够抑制高血糖引起的VSMC的增殖和迁移,减轻糖尿病患者血管成形术后引起的动脉粥样硬化和再狭窄。TSPO有可能成为糖尿病患者血管成形术后引起动脉重塑的潜在治疗靶点。

崔源源^[7]（2018）在《莪术愈创木烷型倍半萜化合物干预介入后再狭窄的机制研究》文中指出药物洗脱支架（Drug-Eluting Stent,DES）引起的血管内皮修复延迟,是导致支架血栓、支架再狭窄等主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events,MACE）的一个重要病理环节。因此,单纯抑制血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMC）增殖,不仅未能根本解决介入后血管再狭窄的问题,而且有增加支架血栓的风险。如何抑制VSMC增殖,又能促进血管内皮修复,是目前介入研究领域的一个难点。支架置入过程,常伴随内皮层瓦解,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）瀑布式产生,且永久性金属支架结构也不断刺激血管组织,诱发长期氧化应激反应。因此,本论文首先评价抗氧化剂对冠心病介入患者MACE的有效性。经Meta分析证明,在介入后常规治疗基础上,给予抗氧化剂（普罗布考）干预,可降低冠心病介入患者MACE发生率,这与抗氧化剂降低再次血运重建,改善血脂水平相关。也为本论文选取实验模型提供了参考依据。现代药理研究发现,莪术主要成分具有抗氧化应激、抗炎症反应、减缓动脉粥样硬化发生发展的作用。莪术愈创木烷型倍半萜化合物（ZGS）是中药莪术中的重要活性成分。课题组前期研究发现,在小型猪血管损伤模型中,ZGS支架可促进支架梁包埋,减轻内膜增生。但是,具体的作用机制尚未清楚。因此,本论文围绕ZGS对损伤血管的修复作用,进行如下研究:（1）莪术愈创木烷型倍半萜化合物对氧化应诱导内皮细胞损伤的研究;（2）莪术愈创木烷型倍半萜化合物对血管平滑肌细胞表型转化、增殖迁移的研究;（3）莪术愈创木烷型倍半萜化合物对球囊损伤血管的修复作用。研究一抗氧化剂对冠心病介入后患者主要不良心血管事件的Meta分析目的:评价抗氧剂对改善冠心病介入后患者主要不良心血管事件（MACE）的有效性。方法:检索 PubMed,EMBASE,ScienceDirect and the cochrane central register of clinical trial,中文学术期刊全文数据库（CNKI）和万方数据库（WFDP）等电子数据库进行检索。中英文检索词包括“抗氧化剂”或“普罗布考”或“维他命C”或“维他命E”或“N-乙酰半胱氨酸”和“血管成形术”或“支架”和“随机”。采用Cochrane协作网提供的RevMan5.3软件进行Meta分析。结果:在纳入的349篇文献中,有7篇文献对冠心病介入后患者发生MACE事件进行了报告,其中抗氧化剂（普罗布考,n=352）组,发生MACE事件72例,发生率为20.5%;对照组（n=354）发生MACE事件111例,发生率为31.4%。与对照组比较,普罗布考组明显降低MAEC发生率（RR:0.65,95%CI,0.51 to 0.84,comparisonP = 0.0008）。经亚组分析,与对照组比较,普罗布考组有52例患者发生再次血运重建,发生率为14.8%,显着低于对照组（86例,发生率为24.3%,95%CI,0.44to 0.83,P = 0.002）。两组再次心肌梗死和全因死亡率无显着差异（P= 0.34,P= 0.49）。此外,与对照组比较,普罗布考组显着降低介入后患者总胆固醇和低密度脂蛋白水平（SMD,-0.68,95%CI,-0.87 to-0.49;P<0.00001;SMD,-0.28,95%CI,-0.46 to-0.11;P = 0.001）。结论:与冠心病介入后常规治疗比较,抗氧化剂普罗布考联合常规治疗可明显降低MACE发生率,该作用与普罗布考降低再次血运重建,改善总胆固醇和低密度脂蛋白水平相关。研究二莪术愈创木烷型倍半萜化合物对氧化应激诱导内皮细胞损伤的研究目的:观察ZGS对氧化应激（过氧化氢,H2O2）诱导内皮细胞损伤的作用。方法:给予不同浓度的H2O2刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,干预不同的时间（0、12、24h）,利用MTT法和划痕实验观察HUVECs活性和迁移,建立氧化应激损伤模型。模型建立后,给予ZGS（5、10、20和40ug/ml）干预24 h,观察ZGS对H2O2诱导HUVECs损伤的作用。利用transwell实验和划痕实验观察HUVECs迁移力;采用Western blot、RT-PCR、小干扰RNA技术和细胞免疫荧光技术观察ZGS调节内皮细胞修复的相关机制（Cav-l、eNOS、SDF-lα、MAPKs 和 Nrf2）。结果:（1）与空白组比较,H2O2浓度为500ug/ml,干预24 h,显着降低HUVECs迁移和活性（均P<0.01）。给予ZGS（5、10、20和40ug/mL）作用24 h,ZGS剂量依赖性地逆转H2O2损伤的HUVECs迁移。（2）与空白组比较,H2O2上调Cav-1蛋白表达,下调eNOS蛋白和磷酸化（Ser1177）表达。给予ZGS处理24 h,ZGS浓度依赖性地下调H2O2诱导的Cav-1表达,增加eNOS磷酸化（Ser1177）水平（P>0.05）。给予 eNOS 抑制剂 L-NAME,与 ZGS+H2O2组比较,ZGS+H2O2+L-NAME 下调 eNOS 磷酸化（Ser1177）水平（P<0.01）和细胞迁移力（P<0.01）。分别沉默eNOS和Cav-1蛋白表达,ZGS未能调节H2O2诱导的eNOS磷酸化（P>0.05）和Cav-1水平（P>0.05）。（3）与H2O2组比较,ZGS作用24h浓度依赖性地上调H2O2诱导的SDF-1α和P-38表达,但尚未改善P-JNK和P-Erk1/2表达。沉默Cav-1后,ZGS未改善H2O2诱导的SDF-1α和P-P38表达（均P>0.05）。（4）与H2O2组比较,ZGS干预24 h,可促进H2O2诱导的Nrf2核转移。结论:ZGS改善氧化应激诱导的内皮细胞损伤,促进内皮细胞迁移和抗氧化应激能力,其机制与调节Cav-1/P38/eNOS信号通路和Nrf2核转移相关。研究三莪术愈创木烷型倍半萜化合物对血管平滑肌细胞表型转化、增殖迁移的研究目的:观察ZGS对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人冠脉平滑肌细胞（HCSMCs）表型转化、增殖迁移的作用。方法:利用TNF-α诱导HCSMCs从收缩型向合成型转化。给予ZGS（5、10、20和40ug/mL）干预24h,观察ZGS对TNF-α诱导的HCSMCs表型转化、增殖迁移的作用。利用划痕实验和trαnswell小室实验评价HCSMCs迁移力;采用流式细胞术观察细胞周期;采用Western blot和小干扰RNA沉默技术观察ZGS调节HCSMCs表型转化、增殖迁移的相关机制。结果:（1）TNF-α（50 ng/ml）刺激 HCSMCs 24 h,HCSMCs 增殖水平显着增加（P<0.01）,且细胞形态变为“扁平状”,建立HCSMCs表型转化模型。（2）与TNF-α组比较,给予ZGS干预24 h,HCSMCs维持在“谷峰状”,ZGS+TNF-α 浓度依赖性地（5、10、20 和 40 ug/ml）抑制HCSMCs增殖于G0/G1期,同时,抑制HCSMCs迁移。（3）与TNF-α组比较,TNF-α+ZGS浓度依赖性地上调SMH-HMC和calponin表达,下调S100A4蛋白表达,SM-α-actin未见改变。（4）与TNF-α组比较,ZGS干预24 h,浓度依赖性地下调TNF-α诱导的Cx43蛋白水平,上调Cx40和Cx37蛋白水平。（5）与TNF-α比较,ZGS浓度依赖性地上调TNF-α诱导的P-Cav-1表达,下调P-Stat3和CyclinD1水平。结论:ZGS可上调TNF-α诱导的收缩蛋白表达,下调合成蛋白表达,抑制HCSMCs从收缩型向合成型转化,并可阻滞HCSMCs增殖迁移,其机制与调节连接蛋白（Cx43、Cx40、和 Cx37）和 Cav-1/Stat3/CyclinD1 信号通路相关。研究四莪术愈创木烷型倍半萜化合物对大鼠球囊损伤血管的修复作用目的:采用球囊损伤大鼠腹主动脉血管模型,观察ZGS对损伤血管的修复作用。方法:建立球囊损伤SD大鼠腹主动脉模型,实验分为5组:假手术组（Sham组、10 只）、模型组（Model 组,10 只）、ZGS20 组（20mg/kg/d,10 只）、ZGS40 组（40mg/kg/d,10 只）和 Cav-1 抑制剂组（MβCD,10 只）。HE 染色观察各组球囊损伤血管壁内膜增生情况;免疫组化观察各组平滑肌表型相关标记蛋白表达;免疫荧光观察各组Cav-1/Cxs（Cx43、Cx40和Cx37）表达。结果:（1）利用HE染色观察各组血管形态,与Sham组比较,模型组管腔内膜增厚（P<0.01）,提示模型建立成功。与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组内膜增生减少（P<0.05和P<0.01）;给予Cav-1抑制剂MβCD,逆转ZGS对内膜增生的抑制作用（均P<0.05）。（2）与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组中膜层SMH-HMC表达增加（均P<0.01）,内膜层S100A4表达减少（均P<0.01）;与ZGS20组或ZGS40组比较,ZGS+MβCD组SMH-HMC表达显着减少（均P<0.01）,内膜层S100A4表达显着增加（均P<0.01）。（3）与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组内膜层P-Stat3表达减少（均P<0.01）;与ZGS20或ZGS40组比较,ZGS+MβCD组内膜层P-Stat3表达显着增加（均P<0.01）。（4）与Sham组比较,模型组中膜层P-Cav-1表达降低,Cx43表达增加,Cx40、Cx37表达减少;给予ZGS逆转球囊损伤诱导的P-Cav-1/Cxs表达。（5）与模型组比较,ZGS20和ZGS40组内皮细胞标记物CD34表达增加（均P<0.01）。结论:ZGS可维持球囊损伤血管的平滑肌细胞呈收缩表型,促进内皮修复,减少内膜增生,其机制与调节Cxs（Cx40、Cx37和Cx43）和Cav-1/Stat3信号通路有关。

郭文鼐^[8]（2018）在《益气活血解毒化结法对PTA后再狭窄大鼠血管内膜增生及Ca2+/CaM-CaN-NFATc的影响》文中进行了进一步梳理目的通过观察益气活血解毒化结法指导下的防窄化瘀汤对经皮血管成形术（percutaneous transluminal angioplasty,PTA）后再狭窄（restenosis,RS）大鼠模型血管内膜增生、四种血清炎症因子:金属基质蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9,MMP-9）、白介素-1（interleukin-1,IL-1）、白介素-8（interleukin-8,IL-8）、高敏 C 反应蛋白（high-sensitivity c-reactive protein,hs-CRP）水平的影响及钙调神经磷酸酶（Ca2+/CaM-CaN-NFATc）信号通路相关因子mRNA及蛋白表达的影响,探讨益气活血解毒化结法防治支架术后再狭窄的分子生物学机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、防窄化瘀汤组及普伐他汀组4个组,建立球囊损伤大鼠颈动脉术后再狭窄的动物模型,经组间多重比较,采血观察防窄化瘀汤对PTA术后再狭窄大鼠血清炎症因子hs-CRP、IL-1、IL-8、MMP-9水平的影响。观察血管段经切片、染色后显微镜观察内膜增生情况,计算各组内膜增生程度。观察PCR法及westernblot法观察防窄化瘀汤对PTA术后再狭窄血管组织中Ca2+/CaM-CaN-NFATc信号通路活化T细胞核因子-1（Activated Tnuclear factor-1,NFATC1）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase excited-3,GSK-3β）信号分子mRNA及蛋白表达的影响。通过统计学分析,组间两两比较,认为P<0.05认为差异有统计学意义。结果1血清炎症因子（MMP-9、IL-1、IL-8、hs-CRP）的结果①本实验模型组大鼠血清MMP-9含量显着增加,中药组含量明显低于模型组（24.36±8.15vs40.13±15.37,*P<0.05）,西药组含量低于模型组（23.95± 12.15vs40.13± 15.37*P<0.05）,模型组含量与假手术组相比显着升高（40.13±15.37vs23.80±8.53,*P<0.05）,但中药组、西药组含量较假手术组有所增加,其余组间对比无统计学意义。②四组大鼠血清IL-1含量相比,模型组（42.2± 17.21）>假手术组（33.79± 13.92）>西药组（33.04± 13.33）>中药组（26.40±10.55）。中药组的IL-1与模型组相比显着降低,*P<0.05,其余各组比较均未见统计学差异。③假手术组大鼠血清IL-8含量在四组中最高（30.74± 12.19）,经球囊损伤颈动脉的三组相比,模型组含量高于西药组（30.43±8.35vs29.87±12.15）,而中药组含量最低（23.01 ±8.46）。四组之间经两两比较,均未见统计学差异。④假手术组大鼠血清hs-CRP含量（0.2（0.20-0.32））在四组中最低,球囊损伤的三组相比,模型组（1.10（1.10-1.20））含量高于西药组（1.00±0.15）,而中药组含量最低（0.99±0.15）。组间对比可见,模型组含量高于假手术组（*P<0.05）;西药组含量高于假手术组（*P<0.05）;中药组含量高于假手术组（*P<0.05）。其余组间比较未见统计学差异。2 PCR检测结果①本研究用PCR法检测出的NFATC1的mRNA表达量用2-AΔCt表示:与假手术组相比,另外三组血管组织中NFATC1的mRNA表达量均显着增加,中药组NFATC1的mRNA表达量最高。NFATC1的mRNA表达量经四组之间两两比较,中药组高于假手术组（P<0.05）,其余组间比较无统计学差异。②PCR法检测四组GSK-3β的mRNA的表达量:假手术组2.16± 1.46,模型组13.67± 17.82,中药组36.64± 12.79,西药组9.78±10.62,假手术组最低,中药组表达量明显增高,即:中药组>模型组>西药组>假手术组。组间对比,中药组表达量均高于其余三组,且有统计学意义。3 westernblot检测结果Westernblot法检测四组的GSK-3 β在血管壁中的蛋白表达水平,假手术组表达量最高（1.54±0.38）,中药组次之（1.18±0.24）,西药组最低（0.98±0.21）,模型组（1.02±0.17）稍高于西药组。通过四组之间进行多重比较,西药组蛋白表达量明显低于假手术组（*P<0.05）;模型组蛋白表达量低于假手术组（*P<0.05）;其余组间比较未见统计学差异。4病理切片观察内膜增生结果本实验通过目的血管段切片及染色后对各组的内膜厚度/中膜厚度（I/M）均值进行比较,以I/M代表内膜增生情况,模型组内膜增生显着增加,模型组、中药组、西药组I/M显着高于假手术组（P<0.05）,而中药组I/M显着低于球囊损伤组（P<0.05）,中药组I/M显着低于西药组（P<0.05）结论通过本实验可看出,益气活血解毒化结法指导下的防窄化瘀汤能够通过影响钙调神经磷酸内信号通路上信号分子的表达,减少内膜增生程度及发展进程,减少炎症因子hs-CRP、IL-1、IL-8、MMP-9含量,减少炎症反应,从而防治PTA术后再狭窄。因此临床上可以应用益气活血解毒化结法指导下的防窄化瘀汤进行PCI术后患者再狭窄的预防和治疗,为中西医结合治疗本病提供了一种新的思路。

崔源源,刘剑刚,赵福海,史大卓^[9]（2015）在《莪术主要化学成分预防支架后再狭窄药理作用的研究进展》文中研究说明中药莪术主要含挥发油、姜黄素等有效成分,具有抗血小板聚集、降血脂、抗氧化及抗炎等药理作用。近年来,研究表明莪术某些提取物和化学成分通过增强血管血红素氧合酶-1活性,缓解心肌细胞线粒体损伤以保护血管内皮;抑制核因子-κB（NF-κB）、靶基因白介素-受体相关激酶-1（IRAK-1）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF-6）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）减少炎症浸润;且通过影向细胞磷酸酶氧化以抑制生长因子诱导的平滑肌细胞增殖及迁移等多重药理作用。因此,利用莪术对血管内皮细胞和平滑肌细胞的不同药理作用,应用于药物涂层支架,对预防支架后再狭窄和血栓形成可能具有潜在作用。该文就中药莪术提取物及主要化学成分,对预防支加内再狭窄的药理作用及机制研究作一综述。

董庆磊,尹铁英,王贵学^[10]（2013）在《β-榄香烯在抗动脉粥样硬化及再狭窄方面的潜在应用》文中提出β-榄香烯是一种公认的广谱、高效抗肿瘤药物。近年来的研究表明,β-榄香烯具有潜在的抗动脉粥样硬化和抗经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄作用。本文就β-榄香烯在抑制血管生成、抑制血栓形成、改善血液流变学功能、抗氧化损伤、抗炎症反应,以及抑制经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄等几个方面的研究进行综述。

二、莪术油对动脉损伤大鼠血管成形术后再狭窄的抑制作用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、莪术油对动脉损伤大鼠血管成形术后再狭窄的抑制作用（论文提纲范文）

（1）豁痰解毒通络饮对大鼠PTCA术后AS模型的干预作用及其调控自噬通路的研究（论文提纲范文）

（2）基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究（论文提纲范文）

（3）阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究（论文提纲范文）

（4）温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响（论文提纲范文）

（5）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）

（6）线粒体转位蛋白TSPO在高糖诱导的血管再狭窄中的作用及其机制研究（论文提纲范文）

（7）莪术愈创木烷型倍半萜化合物干预介入后再狭窄的机制研究（论文提纲范文）

（8）益气活血解毒化结法对PTA后再狭窄大鼠血管内膜增生及Ca2+/CaM-CaN-NFATc的影响（论文提纲范文）

四、莪术油对动脉损伤大鼠血管成形术后再狭窄的抑制作用（论文参考文献）

• [1]豁痰解毒通络饮对大鼠PTCA术后AS模型的干预作用及其调控自噬通路的研究[D]. 花儿（T.ATARTSE TSEG）. 长春中医药大学, 2021(01)
• [2]基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究[D]. 陈乙菲. 长春中医药大学, 2020(08)
• [3]阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究[D]. 路芳芳. 苏州大学, 2020(02)
• [4]温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响[D]. 夏晓东. 天津医科大学, 2020(06)
• [5]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [6]线粒体转位蛋白TSPO在高糖诱导的血管再狭窄中的作用及其机制研究[D]. 巩正藩. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [7]莪术愈创木烷型倍半萜化合物干预介入后再狭窄的机制研究[D]. 崔源源. 中国中医科学院, 2018(01)
• [8]益气活血解毒化结法对PTA后再狭窄大鼠血管内膜增生及Ca2+/CaM-CaN-NFATc的影响[D]. 郭文鼐. 北京中医药大学, 2018(08)
• [9]莪术主要化学成分预防支架后再狭窄药理作用的研究进展[J]. 崔源源,刘剑刚,赵福海,史大卓. 中国中药杂志, 2015(07)
• [10]β-榄香烯在抗动脉粥样硬化及再狭窄方面的潜在应用[J]. 董庆磊,尹铁英,王贵学. 生物医学工程学杂志, 2013(03)

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