一、Molecular signal transduction in vascular cell apoptosis（论文文献综述）
赵佳福[1]（2020）在《MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究》文中研究表明前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是全球第二大最常见的男性癌症。几乎所有晚期PCa患者在接受内分泌治疗后都会发展成去势抵抗性前列腺癌。尽管雄激素受体是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castrate-resistant prostate cancer,mCRPC）的有效方法,但2018年美国依然有29430人死于PCa。近年来对14-3-3蛋白家族的研究发现,该家族成员14-3-3ε在前列腺癌的发生发展中发挥了重要作用,可能成为前列腺癌诊断治疗的分子靶点。同样,大量研究也证实miRNAs在前列腺癌的发生发展中同样发挥了重要作用,在前列腺癌的分子诊断和靶向治疗方面同样具有广阔的应用前景,然而miRNAs调控14-3-3ε在前列腺癌发生发展中的具体分子机制尚不清楚。本研究采用UALCAN-TCGA在线数据库结合qRT-PCR、CCK-8、细胞划痕、Transwell、双荧光素酶系统、流式细胞术等试验手段,从细胞水平和分子水平,阐明miRNAs调控14-3-3影响前列腺癌细胞增殖凋亡的分子机制。相关研究可为前列腺癌的分子诊断和靶向抗癌药物研发提供新思路。主要研究结果如下:1.14-3-3ε在PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响UALCAN-TCGA数据库分析结果表明,14-3-3蛋白不同亚型在PCa组织和癌旁组织具有不同的表达模式,其中14-3-3ε/YWHAE、14-3-3γ/YWHAG和14-3-3τ/YWHAQ在PCa组织中表达上调,14-3-3η/YWHAH、14-3-3β/YWHAB和14-3-3ζ/YWHAZ在PCa组织中表达下调;在前列腺癌不同细胞系中的研究发现,14-3-3ε在PC3、22Rv1、LNCaP中具有同PCa组织中相同的表达模式。CCK-8细胞增殖试验、细胞划痕试验和Transwell试验结果表明,干扰14-3-3ε的表达,严重影响了22Rv1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力（P<0.01）。以上结果暗示14-3-3ε在PCa中可能扮演原癌基因的角色。2.调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证TargetScan、miRSystem、miRanda和PicTar等在线软件预测发现,miR-155-5p、miR-31-5p、miR-29b-3p、miR-29a-3p及miR-29c-3p是调控14-3-3?得分最高的5条miRNAs;综合qRT-PCR试验、双荧光素酶试验和CCK-8试验结果发现,在22Rv1细胞中miR-31-5p与14-3-3?具有逆向表达关系,是调控14-3-3?表达效率最高的miRNA。通过构建野生型和突变型荧光素酶载体,我们发现:14-3-3?3’UTR中“UCUUGCC”7个碱基位点是miR-31-5p调控14-3-3?表达的特异性功能靶点,该位点的缺失,严重影响了miR-31-5p对14-3-3?基因的调控能力。3.miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响CCK-8试验、细胞划痕试验、Transwell试验结果发现:mi R-31-5p过表达,严重影响了22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞试验发现:miR-31-5p的上调直接导致22Rv1细胞停滞在G1期,间接抑制了22Rv1细胞增殖;细胞凋亡试验结果发现:miR-31-5p的上调促进了22Rv1细胞的早期凋亡和细胞坏死。补偿试验结果发现,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时也部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞周期的抑制和对22Rv1细胞的促凋亡能力。4.miR-31-5p调控14-3-3?对PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响对miR-31-5p调控14-3-3?影响22Rv1增殖凋亡的信号通路研究发现,miR-31-5p的上调,显着下调了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值,上调了Bad、Bax/Bcl-2的表达水平,激活了caspase-9和caspase-3等与细胞凋亡相关的级联反应;然而,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了这一现象。以上结果暗示miR-31-5p靶向调控14-3-3?抑制22Rv1细胞增殖和促进细胞凋亡是通过调节PI3K/AKT/Bcl-2信号通路实现的。综上所述,本文明确了14-3-3?蛋白在前列腺癌组织和细胞中显着升高,发现miR-31-5p是靶向调控14-3-3?基因表达的最佳miRNAs,解析了miR-31-5p靶向调控14-3-3?与22Rv1细胞增殖凋亡的关联性,阐明了miR-31-5p靶向调控14-3-3?影响22Rv1细胞增殖凋亡的分子机制。为miR-31-5p和14-3-3ε联合应用于CRPC精准治疗提供了新的理论依据。
梁苏东[2]（2020）在《异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究指明目的:肾缺血再灌注损伤（renal ischemia reperfusion injury,RIRI）为临床中常见的问题之一,它存在于临床中的多种病理生理过程。肾缺血再灌注损伤的病理生理学很复杂,炎症反应、氧化应激、细胞凋亡被认为在其中扮演了重要的角色。异槲皮素（isoquercetin,IQ）天然存在于多种植物中,既往研究已经发现IQ能通过抗炎症反应、抗氧化应激、抗凋亡的作用减轻脑部缺血再灌注损伤。但IQ在肾缺血再灌注损伤中的作用未见报道。本研究探究了 IQ对小鼠肾缺血再灌注损伤有无保护作用,并对相关作用机制进行初步的研究。方法:30只雄性野生型C57BL/6小鼠（10周龄,体重22-24g）按随机数字表法随机分为三组,每组10只,分别为:假手术组（Sham组）,肾缺血再灌注损伤组（RIRI组）和肾缺血再灌注损伤（RIRI）+IQ预处理组。肾缺血再灌注损伤组（RIRI组）:小鼠右侧肾脏切除术后阻断左肾蒂血管使左侧肾脏缺血30分钟,后开放左肾蒂血管夹,再灌注24小时。肾缺血再灌注损伤（RIRI）+IQ预处理组:小鼠术前连续3天,每天按20 mg/kg IQ的量以腹腔注射方式给药,后行缺血再灌注。（1）检测IQ预处理对血尿素氮、血肌酐的影响,HE染色观察肾脏组织学的变化;（2）通过对肾组织髓过氧化物酶（MPO）活性、IL-6、TNF-α的检测,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗炎症反应方面的作用。Western blot和免疫组化法检测肾脏组织中NF-κB表达水平,探讨可能的炎症反应机制。（3）通过对肾组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的检测,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗氧化应激反应方面的作用。（4）通过检测肾脏组织 caspase-3、caspase-8、caspase-9 的活性以及 Bcl-2、Bax蛋白的表达量,评估IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤抗凋亡方面的作用。结果:（1）与RIRI组相比,IQ预处理能显着降低小鼠肾缺血再灌注损伤后的血尿素氮、血肌酐水平,降低肾脏组织学组织损伤评分,具有一定的肾脏保护功能。（2）炎症方面的影响:与RIRI组相比,IQ预处理能显着降低肾脏组织MPO的活性,降低炎性因子IL-6、TNF-α的水平以及肾脏组织中NF-κB表达水平。（3）氧化应激方面的影响:与RIRI组相比,IQ预处理能显着升高抗氧化物质SOD、GSH、CAT的活性,降低脂质过氧化终产物MDA的水平。（4）凋亡途径的影响:与RIRI组相比,IQ预处理显着降低肾脏组织caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性,升高Bcl-2的表达量,降低Bax的表达量,上调Bcl-2/Bax。结论:（1）IQ对小鼠肾缺血再灌注损伤具有显着保护作用。（2）IQ能通过抗炎症反应的作用减轻小鼠肾缺血再灌注损伤,其可能是通过下调NF-κB通路来介导的。（3）IQ能通过抗氧化的作用对小鼠肾缺血再灌注损伤起到保护作用。（4）IQ能通过抗凋亡的作用减轻小鼠肾缺血再灌注损伤,其可能是通过调节Bcl-2家族和caspase家族成员来实现的。
夏晓东[3]（2020）在《温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响》文中进行了进一步梳理目的:1.使用温控射频消融球囊对兔正常动脉血管进行纵向线性消融,探讨不同温度射频对兔正常动脉的损伤情况,观察温控射频球囊及单纯球囊对正常血管内膜损伤,增生及纤维组织增生情况,并测量动脉管腔面积,探索射频消融动脉血管合适温度。2.使用温控射频球囊对兔动脉粥样硬化血管进行纵向线性消融,探讨温控射频消融球囊对动脉粥样硬化斑块的影响,并了解其对动脉粥样硬化斑块血管管腔面积影响,测量炎性因子,凋亡因子及TGF-β通路,探索温控射频球囊线性消融动脉粥样硬化血管后血管组织学变化,并探索温控射频球囊消融动脉粥样硬化血管后,促炎细胞因子,抑炎细胞因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2炎症通路变化情况,为临床治疗动脉粥样硬化提供新思路。方法:1.将正常健康家兔分为4组,即单纯球囊扩张对照组,45℃温控射频球囊扩张组,50℃温控射频球囊扩张组,55℃温控射频球囊扩张组。温控射频球囊在扩张后1h,3d,7d留取兔动脉标本,甲醛固定,并进行HE,Masson染色,观察血管增生,胶原纤维变化情况并测量血管腔面积。2.动脉硬化建模:球囊拉伤兔腹主动脉内膜,并联合高脂饮食喂养,建立动脉粥样硬化模型,并在12w时随机处死2只大兔以检验动脉粥样硬化造模是否成功。3.将造模成功的大兔随机分为2组,即使用55℃射频消融扩张及单纯球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,在1小时,7天,14天以及28天留取动脉标本,行HE及MASSON染色,进行病理组织学切片观察,了解温控射频球囊及单纯球囊扩张对动脉粥样硬化血管影响。并应用免疫组化,western blot及荧光定量PCR等方法,检测组织中促炎因子,抑炎因子,凋亡因子及TGF-β/Smad-2通路蛋白水平及组织中m RNA水平的变化。结果:1.与单纯球囊扩张组及对照组比较,应用45℃,50℃,55℃线性消融正常兔动脉血管时,血管管腔面积各统计组之间无统计学差异。2.使用55℃射频扩张粥样硬化血管,在相同时间点,温控射频球囊组血管管腔面积大于单纯球囊扩张组,而随时间延长温控射频消融球囊组及单纯球囊扩张组两组组内血管管腔面积变化不大。温控射频球囊组各组之间管壁厚度无统计学差异。3.组织水平上,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控射频球囊扩张组IL-1β,IL-17,Bax,IFN-γ,TGF-β,Smad-2以及Caspase3表达明显高于单纯球囊扩张组。温控射频消融球囊扩张组表达IL-10及Bcl-2少于单纯球囊扩张组。4.转录水平与蛋白水平,在1小时,7天,14天,28天的时间点,温控球囊扩张组兔子动脉血管中Bcl-2的整体表达量要明显低于单纯球囊扩张组。但是,温控射频球囊扩张组兔子动脉血管中Bax,TGF-β,Smad-2以及Caspase3的整体表达量要明显高于单纯球囊扩张组。结论:1.使用温控射频消融球囊消融兔正常血管时,45℃,50℃,55℃均可对正常血管造成损伤,但与单纯扩张组比较,血管管腔面积变化不大。虽然随温度升高,血管壁损伤范围也相应扩大,但即使是使用55℃对正常血管进行30s消融,仍然是安全的。2.使用55℃射频消融球囊扩张兔动脉粥样硬化血管,可使动脉粥样硬化血管管腔面积增大,可能与球囊挤压斑块,射频能量对血管造成线性损伤,血管顺应性增加,在动脉血压的作用下,扩张动脉粥样硬化血管。3.射频消融动脉粥样硬化血管时,消融部位动脉粥样硬化斑块可发生纤维化,可有助于动脉粥样硬化斑块稳定。4.射频消融可使消融部位促炎症细胞因子表达增加,抑炎细胞因子表达减少,凋亡受到抑制,同时TGF-β/smad2通路被激活。这也提示,虽然射频消融能增加血管面积,但同时炎症通路也被激活,如应用于临床,应同时应用抑制炎症反应药物。维持射频消融球囊扩张远期效果。
王振杰[4]（2020）在《尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ诱导人舌鳞癌细胞凋亡中PERK/eIF2α蛋白表达意义的研究》文中研究指明目的:探讨尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I（anti-tumor component-I from agkistrodon acutus venom,AAVC-I）诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中,蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase,PERK）/真核生物翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α）分子蛋白的检测,分析内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路发生的机制。方法:本实验选择体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞作为研究对象,以对数生长期细胞进行实验,选择ERS诱导剂二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol,DTT）作为阳性对照药物。1、运用MTT法检测不同浓度的DTT（1.0、2.0、4.0、8.0mM）和AAVC-I（2.0、4.0、8.0、16.0、24.0μg/ml）处理Tca8113细胞24h后的细胞增殖抑制率,并根据细胞增殖抑制率的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值筛选出阳性对照药物DTT的实验浓度,以及可能引起Tca8113细胞发生ERS最佳的AAVC-I实验浓度范围。2、根据筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞,24h后细胞苏木素伊红（haematoxylin&eosin,HE）染色倒置显微镜下观察细胞形态变化。3、采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后的凋亡情况,并进一步运用流式细胞术检测细胞凋亡率。4、筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后出现凋亡时,蛋白质印迹（western blot,WB）检测ERS标志性分子蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）,PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路中的磷酸化PERK（phosphorylated-PERK）、磷酸化eIF2α（phosphorylated-eIF2α）分子蛋白以及下游的活化转录因子4（activating transcription factor 4,ATF4）、增强子结合蛋白同源蛋白（enhance-binding protein-homologous protein,CHOP）分子蛋白和细胞凋亡相关的B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）分子蛋白的表达水平。结果:1、不同浓度的DTT（1.0、2.0、4.0、8.0mM）和AAVC-I（2.0、4.0、8.0、16.0、24.0μg/ml）处理人舌鳞癌Tca8113细胞24h后,MTT法检测结果显示,随着DTT和AAVC-I浓度的增加细胞增殖抑制率逐渐升高（P<0.01）,同时成功筛选出引起Tca8113细胞发生ERS的DTT阳性对照实验浓度组（4.0mM）和最佳的AAVC-I实验浓度范围（4.0、8.0、16.0μg/ml）。2、4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后,细胞HE染色倒置显微镜下观察发现,正常对照组细胞贴壁生长,细胞呈梭形或多边形,胞质密度分布均匀,AAVC-I实验浓度组细胞随着AAVC-I实验浓度的增加细胞逐渐皱缩变小,贴壁细胞逐渐减少,细胞间隙增大,胞质胞核浓缩,细胞破裂,特别是4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组细胞形态变化最为明显。3、4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后,Annexin V-FITC/PI双荧光试剂对细胞进行荧光染色观察凋亡细胞以及流式细胞仪分析细胞凋亡率结果发现,与正常对照组相互比较,DTT阳性对照实验浓度组和各AAVC-I实验浓度组细胞在荧光显微镜下观察到被荧光标记的凋亡细胞,AAVC-I实验浓度组细胞随着AAVC-I实验浓度的增加,凋亡细胞逐渐增多,细胞凋亡率逐渐升高（P<0.01）。4、WB法检测了4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后的ERS标志性分子蛋白GRP78,PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路中的p-PERK、p-eIF2α分子蛋白,下游的ATF4和CHOP分子蛋白以及细胞凋亡相关分子蛋白Bax、Bcl-2的表达水平,结果显示,DTT阳性对照实验浓度组和各AAVC-I实验浓度组分子蛋白表达水平与正常对照组相互比较差异具有统计学差异（P<0.05）,且随着AAVC-I实验浓度的增加GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Bax分子蛋白表达水平逐渐升高,而Bcl-2分子蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）。结论:1、DTT和AAVC-I具有抑制人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的作用,成功筛选出浓度为4.0mM的DTT和4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml的AAVC-I作为引起人舌鳞癌Tca8113细胞发生ERS的最佳实验浓度组。2、以4.0mM的DTT浓度为实验阳性对照组,各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组可引起人舌鳞癌Tca8113细胞发生ERS。3、AAVC-I可诱导人舌鳞癌Tca8113细胞发生凋亡。4、ERS PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路在AAVC-I诱导人舌鳞癌Tca8113细胞发生凋亡时起着促进作用。
井光壮[5]（2020）在《β-hCG介导的VEGF-MEK/ERK信号通路在早期绒毛血管生成和滋养细胞凋亡中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:通过检测血清β-hCG、VEGF含量以及绒毛组织中VEGF-MEK/ERK信号通路和滋养细胞凋亡相关因子的表达水平,探讨稽留流产的发病机制。方法:（1）收集稽留流产和同孕周、同年龄组因意外妊娠行人工流产术正常早孕妇女血清和绒毛组织标本各12例,所有受试者均无职业病有害因素暴露史。（2）采用放射免疫分析方法检测两组血清β-hCG含量。（3）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测两组血清VEGF含量。（4）制备绒毛组织HE切片,光镜下观察绒毛组织病理学改变。（5）采用免疫组织化学技术CD34定位检测绒毛组织血管生成情况,并计算微血管密度（MVD）。（6）qRT-PCR检测绒毛组织VEGF-MEK/ERK信号通路相关基因VEGF、VEGFR2、RAS、MEK1/2、ERK1/2mRNA表达水平以及凋亡基因Bcl-2、Bax、Cyt c、Casepase 3 mRNA表达水平。（7）采用Wes全自动蛋白分析技术检测绒毛组织VEGF-MEK/ERK信号通路相关蛋白VEGF、VEGFR2、RAS、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cyt c、Casepase 3表达水平。结果:（1）血清β-hCG、VEGF含量:稽留流产组血清β-hCG、VEGF水平均低于正常早孕组（P<0.05）。（2）绒毛组织病理改变:镜下可见稽留流产组绒毛组织滋养层明显变薄,细胞数量减少,细胞结构紊乱,部分滋养层细胞缺失。（3）绒毛组织血管生成情况:稽留流产组绒毛间质内血管小,管腔狭窄,数量明显减少。微血管计数结果显示:稽留流产组绒毛组织中微血管密度低于正常早孕组（P<0.05）。（4）绒毛组织VEGF-MEK/ERK信号通路相关因子表达情况:稽留流产组绒毛组织中VEGF、VEGFR2、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达水平均低于正常早孕组（P<0.05）;稽留流产组绒毛组织中VEGF、RAS、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平及p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值均低于正常早孕组（P<0.05）。（5）绒毛组织滋养细胞凋亡相关因子表达情况:稽留流产组绒毛组织中Bcl-2 mRNA表达水平低于正常早孕组（P<0.05）;稽留流产组绒毛组织中Bax、Cyt c和Caspase 3 mRNA表达水平均高于正常早孕组（P<0.05）;稽留流产组绒毛组织中Bcl-2蛋白表达水平低于正常早孕组（P<0.05）;稽留流产组绒毛组织中Bax/Bcl-2比值、Cyt c和Caspase 3蛋白表达水平均高于正常早孕组（P<0.05）。（6）绒毛组织VEGF、ERK1/2蛋白表达水平与绒毛组织微血管密度（MVD）的相关性分析:在稽留流产组中,ERK1/2蛋白表达水平与绒毛组织微血管密度（MVD）成正相关（r=0.909,P<0.05）。结论:孕早期孕妇体内β-hCG生成不足,可能使VEGF-MEK/ERK信号通路的表达下调,继而减少绒毛血管生成和激活线粒体凋亡通路,最终导致孕早期绒毛血管生成障碍和滋养细胞功能异常,可能是稽留流产发生的重要机制。
朱丽娟[6]（2020）在《基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制》文中指出目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球最常见的癌症之一,其在癌症中发病率和死亡率均位于前列,严重威胁着全人类的生命健康。目前对于结直肠癌的治疗以外科手术切除为主,辅助放、化疗等综合治疗措施,但随之产生的抗免疫、骨髓抑制、脏器受损、肿瘤细胞耐药等副作用,严重制约了放化疗的效果。天然药物具有复杂的成分、多重的作用靶点,对于肿瘤发展的多个环节会产生影响,同时其毒性较低,不容易产生肿瘤耐药,已成为结直肠癌辅助治疗方案重要的组成部分。蛇葡萄素（Ampelopsin,AMP）是从植物蛇葡萄根皮及叶中提取出的一种小分子黄酮类化合物,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用,而且能够诱导肿瘤细胞凋亡。近年研究发现自噬在肿瘤的治疗中也是非常重要的靶点,其与凋亡之间的关系对肿瘤的进程及治疗具有重要的影响,但是,蛇葡萄素对肿瘤细胞自噬和凋亡的调控尚不明确。因此,本研究以多种人结直肠癌细胞系作为研究对象,一方面基于色谱—质谱联用的代谢组学技术平台对蛇葡萄素干预人结直肠癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织代谢谱进行分析,筛选出与其抑制结直肠癌生长相关的差异性代谢物,并对其代谢通路进行分析,有助于从代谢层面上阐述蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机理。另一方面从细胞水平、组织水平及分子水平,探讨蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的调节以及相关的分子机制,为结直肠癌的治疗提供新的线索和途径,为蛇葡萄素抗肿瘤作用的进一步研究和开发利用提供理论参考。方法:（1）用不同浓度的AMP（6.25、12.5、25、50和100μg/ml）分别作用于人结直肠癌HCT-116、SW480、SW620、LOVO、Colo 205、LS174T细胞48、72及96 h,MTT法检测不同浓度的AMP对这些细胞增殖抑制率的影响。用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,克隆形成实验观察AMP对细胞克隆形成率的影响。用50μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞24 h,细胞创伤愈合实验观察AMP对细胞迁移能力的影响。（2）利用人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察AMP体内抗结直肠癌活性,组织切片HE染色观察AMP对动物主要脏器是否有毒性作用。（3）用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术,研究人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤块组织样本,初步筛选与AMP抑制结直肠癌生长有关的差异代谢物,并通过KEGG通路富集分析其相关代谢通路。（4）用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,流式细胞分析仪观察AMP对细胞周期和凋亡的影响,倒置显微镜下观察细胞形态。吖啶橙（Acridine orange,AO）染色后,荧光显微镜下观察AMP对细胞中发出红色荧光的酸性自噬囊泡的影响。并用电镜观察AMP对人结肠癌HCT-116细胞自噬的影响。免疫印迹法（Western-blotting）分析25、50、100μg/ml的AMP对细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白BCl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响。（5）分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和自噬促进剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,MTT法检测自噬抑制剂和促进剂与AMP合用后对细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,荧光显微镜下观察自噬抑制剂和自噬促进剂与AMP合用后细胞中酸性自噬囊泡的红色荧光比例。Western-blotting分析细胞中抗凋亡蛋白BCl-2和促凋亡蛋白Bax的比率,以及Cleaved-Caspase-3的表达,同时分析细胞中自噬标志物LC3、自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达的变化。（6）Western-blotting分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中PI3K,p-mTOR、Total-mTOR,p-Akt,Total-Akt及p-P70S6K、Total-P70S6K蛋白表达的影响。结果:（1）体外抗肿瘤实验表明,AMP对受试的六种结直肠癌细胞均有显着的抑制作用,且具有浓度依赖性。在48、72、96 h作用点,AMP对人结肠癌HCT-116、SW480及Colo 205细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,对人结肠癌SW620、Lovo及LS174T细胞而言,作用72 h时,增殖抑制作用最强,此后,随时间延长抑制作用逐渐降低。克隆形成实验和细胞创伤愈合实验表明,AMP能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成能力,抑制细胞迁移。（2）体内抗肿瘤实验表明,200 mg/kg的AMP能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤的生长,具有良好的体内抗结直肠癌活性。对动物的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏指数均无明显影响,组织切片HE染色结果显示,动物重要脏器组织无明显异常。（3）基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术平台,对人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤组织代谢谱进行了检测,筛选差异性代谢产物,涉及三羧酸循环、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氨基酰tRNA的生物合成等通路。（4）流式细胞仪分析结果显示,AMP能够将人结肠癌HCT-116、SW480细胞阻滞于G1期,干扰细胞的有丝分裂,使细胞生长停滞。同时,细胞凋亡率明显增加。AO染色后,荧光显微镜下可见细胞内红色荧光比例明显增加,电镜下可见细胞胞浆中出现了双层或者单层膜包绕着线粒体等细胞器的自噬小体和自噬溶酶体。Western-blotting分析结果显示,AMP作用后,细胞和瘤块组织中BCl-2/Bax比率下调,Caspase-3剪切活性片段Cleaved-Caspase-3的表达上调,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1及Atg5蛋白的表达均显着增加。（5）AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞增殖加快,与自噬促进剂RAPA合用后,细胞增殖减慢。细胞AO染色后荧光显微镜下可见,AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡的比例减少,而与自噬诱导剂RAPA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡比例显着增加。Western-blotting分析显示,3-MA与AMP合用,可以使自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及Atg5的表达降低,而RAPA与AMP合用后,这些蛋白的表达均明显增加。流式细胞术Annexin-PI双染结果显示,3-MA单独应用时,细胞凋亡率没有太大的变化,当其与AMP合用后,凋亡率明显低于AMP处理组。RAPA与AMP合用后,细胞凋亡率明显增加,高于AMP处理组。Western-blotting分析结果显示,3-MA与AMP合用后,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例没有显着变化,但Cleaved-Caspase-3的表达显着低于AMP处理组,RAPA与AMP合用后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例明显降低,Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。（6）25、50、100μg/ml AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞以及HCT-116细胞移植瘤裸鼠模型后,细胞及瘤块组织中的PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K的表达均呈降低的趋势。结论:（1）AMP具有显着的体外抗结直肠癌活性,能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成及迁移能力。（2）AMP具有显着的体内抗结直肠癌活性,且对动物的主要脏器无明显毒性。（3）AMP主要影响结直肠癌组织异常的能量代谢,特别是氨基酸代谢。（4）AMP能够形成结肠癌细胞G1期阻滞,诱导细胞凋亡和自噬。（5）自噬能够促进AMP诱导的细胞凋亡作用,与凋亡合作,共同促进细胞死亡。（6）AMP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。
韩佳[7]（2020）在《旱莲苷A在肺癌中的抗肿瘤效应及其分子机制研究》文中研究表明实验目的:Ecliptasaponin A（ES）,旱莲苷A是一种天然产物,在多种肿瘤中已被报道具有抗癌效果,但在肺癌中的作用效应仍未知,本文对旱莲苷A在体内外的抗非小细胞肺癌的效果进行系统评价,并探索其抗肿瘤的分子机制。方法与结果:第一部分旱莲苷A在体内外抗肺癌作用评价采用MTT比色法、集落克隆试验测定旱莲苷A对非小细胞肺癌H460和H1975细胞增殖能力的影响,并通过流式细胞术检测细胞周期的变化及凋亡发生情况。Hoechst 33342染色用于明确旱莲苷A作用后肺癌细胞发生凋亡形态变化。免疫荧光检测旱莲苷A对肺癌细胞自噬发生的影响。采用划痕实验、Transwell迁移、Transwell侵袭试验验证旱莲苷A对肺癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用免疫印迹实验（Western Blot）在非小细胞肺癌细胞中,对上述周期、凋亡、自噬、迁移和侵袭相关蛋白的表达水平进行测定,进一步验证旱莲苷A在体内抗肺癌作用方面的效果。应用移植瘤模型,设立对照组、ES低剂量组和高剂量组,验证旱莲苷A在体内的抗肿瘤效果。结果显示,非小细胞肺癌细胞的存活率随着旱莲苷A药物浓度的增加而逐渐降低,并呈时间依赖。同时,旱莲苷A使非小细胞肺癌细胞出现G0/G1期阻滞。旱莲苷A能诱导肺癌细胞H460和H1975发生凋亡和自噬,且呈剂量依赖。同时亦证实旱莲苷A对肺癌细胞的迁移和侵袭有抑制作用。周期相关蛋白Cyclin D1,CDK6,P21,凋亡相关蛋白cleaved caspase 8,cleaved caspase 9,cleaved caspase 3及Bax和Bcl-2,自噬相关蛋白LC3a/b、beclin-1及p62,迁移和侵袭相关蛋白E-cadherin,N-cadherin和Vimentin等蛋白亦发生相应改变。在选用的人肺癌H460裸小鼠皮下移植瘤模型中,发现50mg/Kg旱莲苷A,每三天给1次药,能显着抑制移植瘤的生长,且小鼠并未出现明显的体重降低。第二部分旱莲苷A的抗肿瘤作用机制研究第一节旱莲苷A诱导肺癌细胞凋亡和自噬的相互作用及其相关机制通过流式细胞检测术发现,旱莲苷A诱导肺癌细胞发生凋亡,且这种凋亡能被Caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）逆转。通过流式细胞检测术和免疫印迹实验发现,自噬抑制剂3-MA和CQ能阻断自噬发生,进而减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。进一步探讨发现旱莲苷A通过激活ASK1/JNK通路促进非小细胞肺癌细胞的凋亡,ASK1抑制剂GS-4997和JNK抑制剂SP600125能逆转旱莲苷A引起的凋亡,且SP600125也能抑制旱莲苷A引起的自噬。第二节内质网应激在旱莲苷A抗肿瘤效应中的分子机制研究通过免疫印迹实验发现旱莲苷A作用于H460和H1975细胞后引起内质网应激,Bip、IRE1α、XBP1s及c-Myc等蛋白水平表达增高。流式细胞检测术显示内质网抑制剂4-PBA能减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。一方面,通过流式细胞检测术发现IRE1α的激酶抑制剂kira6能逆转旱莲苷A引起的凋亡,免疫印迹实验发现kira6能降低旱莲苷A作用后增高的磷酸化的IRE1α、ASK1和JNK的表达水平,阐明了内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路在旱莲苷A促进肺癌细胞凋亡中的作用。另一方面,通过流式细胞检测术发现IRE1α的核酸内切酶抑制剂STF-083010促进旱莲苷A引起的凋亡,c-Myc抑制剂10058-F4亦能促进旱莲苷A引起的凋亡;免疫印迹实验发现STF-083010能降低XBP1s和c-Myc蛋白的表达水平,使cleaved caspase3的表达水平增高,阐明了IRE1α/XBP1/c-Myc通路在旱莲苷A促进肺癌细胞生存中的作用。第三节旱莲苷A通过抑制PKCα/STAT3的表达,从而促进肺癌细胞凋亡免疫印迹实验发现旱莲苷A能抑制非小细胞肺癌细胞H460和H1975内PKCα和STAT3的表达。通过流式细胞术和免疫印迹实验,使用PKCα的抑制剂Sotrastaurin能促进莲苷A引起的肺癌细胞凋亡;通过质粒转染持续表达PKCα可减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡,此外,抑制PKCα能降低STAT3的表达。使用IL-6促进STAT3的表达可减弱旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡;使用S3I-201抑制STAT3的作用可促进旱莲苷A引起的肺癌细胞凋亡。结论:一、本文通过探讨旱莲苷A在体内外的抗肺癌效应,发现旱莲苷A具有显着的体外抗肺癌作用,能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期,能促进肺癌细胞发生凋亡和自噬,能抑制肺癌细胞的迁移和侵袭,裸鼠皮下移植瘤模型中提示其在体内显着抑制移植瘤的生长。二、研究旱莲苷A诱导凋亡发生的分子机制,发现:1.旱莲苷A诱导肺癌细胞的凋亡和自噬,且自噬又能促进肺癌细胞的凋亡。旱莲苷A通过调节ASK1/JNK通路促进肺癌细胞的凋亡;JNK通路又能促进肺癌细胞的自噬。2.内质网应激在旱莲苷A抗肿瘤效应中发挥着“双刃剑”的作用。旱莲苷A通过增强IRE1α的激酶活性,激活IRE1α/ASK1/JNK通路,促进肺癌细胞的凋亡;旱莲苷A通过增强IRE1α的核酸内切酶作用,激活IRE1α/XBP1/c-Myc通路,促进肺癌细胞的生存。3.进一步研究还发现,旱莲苷A能通过抑制PKCα/STAT3通路,促进肺癌细胞的凋亡。
李倩[8]（2019）在《高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究》文中提出研究背景糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是目前糖尿病最常见的微血管并发症之一,视网膜内皮细胞（Retinal endothelial cells,RECs）在视网膜中发挥许多重要功能,是构成血-视网膜屏障的重要组成部分。在DR早期,RECs功能障碍,促进了DR的进展。研究发现,RECs的炎性凋亡改变在疾病发生发展过程中扮演了重要角色。细胞在免疫炎性反应的刺激下,会发生包括形态学改变在内的一系列变化,引起白细胞介素IL-1,IL-6,IL-8及TNF等炎性因子的表达,通过激活相应的信号传导通路来发挥生物学效应,随着疾病严重程度加重,视网膜内皮细胞炎性反应加重,最终出现细胞凋亡现象。其中p53信号传导通路和NF-κB信号传导通路是诱发细胞凋亡和炎症反应的两条最重要的途径。P53是机体中重要的抑癌基因之一,其可以导致细胞周期停滞、诱导凋亡,在抑制机体多种肿瘤的发生和组织损伤中发挥着重要的作用。P53的蛋白产物可以通过与细胞凋亡相关的靶基因P21、MDM2、Bax相互作用而发挥出潜在的功能,p53能诱导促凋亡基因如Bax、PUMA的表达,亦可以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,直接或间接地导致线粒体膜的去极化,参与细胞凋亡过程。p53亦可以转移到线粒体,导致线粒体膜的去极化,释放促凋亡因子,诱导细胞凋亡的发生。P53基因在DNA修复、阻滞细胞周期、抑制血管生成以及促进细胞非程序性凋亡过程中均扮演了重要的角色。我们的前期实验结果证实,高糖培养的视网膜内皮细胞中促凋亡蛋白Bax及Cl-caspase-3表达升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达出现下降趋势,随着葡萄糖浓度的进一步升高,细胞凋亡趋势增加,此变化是否受p53诱导调控?我们将通过进一步实验加以证实。目前诸多研究已经证实p53与糖尿病及其并发症的发生与发展具有重要的关联性,在这一过程中,P53是否与一些信号通路之间协同发挥作用还是单独起到作用需进一步研究加以证实。NF-κB是一种多向功能调节的转录因子,其主要功能是调控多种基因的表达,包括炎性反应基因、病毒相关基因和原癌基因等的转录表达。NF-κB能被多种因子所激活,引起炎性因子表达的普遍升高,诸如IL-8、IL-6及TNF-α等。我们的前期实验已经证实,高糖诱导的视网膜内皮细胞中IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达随葡萄糖浓度的升高而增加,是否意味着通过激活NF-κB而发挥转录调控作用,尚有待于进一步加以证实。p53是否和NF-κB信号通路在控制相关疾病炎性和细胞凋亡过程中具有协同作用引起了相关学者的兴趣。有研究结果表明,两者在诸多癌症细胞的发生发展过程中表现出相互拮抗,但是在糖尿病相关疾病的研究中表现出协同作用。目前在糖尿病性视网膜病变细胞凋亡机制的研究中二者关系如何未见类似的报道。基于此,本研究采用高浓度葡萄糖作为致炎性因子,模拟视网膜病变的发生与发展过程,对RECs进行形态学观察、凋亡率检测,并检测细胞内炎性因子和凋亡相关蛋白的表达,确定细胞炎性效应及细胞凋亡的基础,在第二部分旨在探讨视网膜内皮细胞凋亡发生机制,了解p53信号传导通路与细胞经典回路NF-κB在其过程中的作用,以期发现二者之间的关系。目的探究高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应,研究p53和NF-κB细胞通路蛋白在人视网膜内皮细胞凋亡中的表达机制和相互关系。材料与方法第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应将培养对数生长期人视网膜内皮细胞分为三组:实验组为高糖浓度组（HG,30mmol/L）,另设正常对照组（Control,5.5mmol/L）、以及以甘露醇（Mannitol）作为高渗对照组（Mannitol,24.4mmol/L）。部分实验根据研究内容不同,设置不同浓度葡萄糖组（15mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L）。于6孔板内加入上述不同成分培养基培养后进行检测。具体检测内容如下:HE染色检测各组细胞形态学变化;透射电镜检测各组细胞细胞器变化;LDH法检测细胞膜损伤;DNA倍体法检测细胞周期;流式细胞仪检测各组细胞凋亡;Western-blot法检测细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Cl-caspase-3浓度表达;ELISA法检测白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子TNF-α浓度表达。进行统计学分析。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制实验细胞同第一部分,对细胞进行如下分组:1、高糖浓度组（HG,30mmol/L）:细胞在30mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;2、高糖+p53抑制剂组（HG+pifithrin-α）:细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在30 mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;3、正常对照组（Control,5.5mmol/L）:细胞在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时;4、p53抑制剂对照组（pifithrin-α）:细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时。具体检测项目如下:透射电镜检查细胞形态学变化;Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3蛋白浓度;Western-blot法检测p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB蛋白浓度;免疫荧光法检测P53和NF-κB p65蛋白在视网膜内皮细胞的免疫荧光共定位及表达阳性率;q-PCR法检测p53、p65蛋白的mRNA转录水平。进行统计学分析。结果第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应1、HE染色分析:培养细胞至48小时可以在光学显微镜下见到显着形态学差异,正常对照组细胞呈现正常生长状态,细胞形状均一,有丝分裂活跃,数量较多,细胞间融合较好。随着高浓度葡萄糖溶液培养时间延长,可以观察到视网膜血管内皮细胞整体密度较低,细胞周围出现空隙,细胞内逐渐出现大量空泡和颗粒,细胞形态学发生显着的改变。2、透射电镜分析:在高糖环境中培养12小时后的RECs细胞,细胞膜出现明显凸起现象,细胞内线粒体及高尔基体肿大,线粒体体积增大,视网膜内皮细胞周围可以明显的观察到脂质沉淀,细胞内出现了脂质沉淀累积和明显的空泡现象,同时伴随着大量的初级溶酶体、次级溶酶体甚至是吞噬体出现。3、LDH检测:高糖培养后细胞LDH漏出率显着增加,提示细胞膜损伤,上述改变呈现出浓度依赖性和时间依赖性。4、DNA倍体法检测细胞周期:当高浓度葡萄糖溶液充分作用后,细胞周期的阻滞效应明显,主要停留在G2期,并可见DNA片段形成显着增多,大量凋亡小体形成。5、流式细胞术检测细胞凋亡:高糖诱导视网膜内皮细胞凋亡效应显着,正常细胞比例显着降低,细胞死亡以凋亡为主,凋亡细胞比例显着增多。6、Western-blot检测:高糖溶液培养的RECs,细胞内促凋亡蛋白Bax及caspase-3蛋白的表达显着上升,抑凋亡蛋白Bcl-2下降,结果有显着差异。7、ELISA检测结果:随着葡萄糖浓度的提升,白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达均有不同程度的提升,且差异具有统计学意义。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制1、透射电镜:高糖培养下的视网膜内皮细胞出现明显的凋亡形态学变化,表现为线粒体中的空泡化,染色质浓缩和内质网的脱颗粒,而在高糖+抑制剂组上述变化显着减轻;2、Western-blot检测凋亡相关蛋白表达:应用pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,促凋亡蛋白Bax、Cl-caspase-3表达减少,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达升高;3、Western-blot检测p53和NF-κB通路蛋白:在高糖培养下的RECs细胞,p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB表达量均有不同程度升高,pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,p53表达量显着降低,p-p53/p53比值显着升高,且NF-κB通路蛋白p65、IκB表达量显着降低,p-p65/p65和p-IκB/IκB比值显着降低。4、免疫荧光检测p53和NF-κB p65蛋白表达共定位:高糖组,p53、p65荧光信号呈现强阳性,较正常对照组显着增强,抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53、p65荧光信号显着降低,以p53蛋白荧光信号降低明显,在细胞核及细胞质内仍可观察到p65荧光信号。5、q-PCR检测p53、p65 mRNA转录水平:高糖组p53、p65的mRNA表达显着升高;抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53和p65的mRNA表达水平明显降低。结论高浓度葡萄糖可以对视网膜内皮细胞造成实质性损伤,早期即导致其形态学改变;高浓度葡萄糖可激活视网膜内皮细胞凋亡通路和炎症反应通路,导致视网膜内皮细胞凋亡率上升、炎症因子表达增加。P53信号通路参与高糖培养的视网膜内皮细胞的凋亡过程;高糖环境促进p53蛋白以及NF-κB通路活性,使细胞发生炎性反应及细胞凋亡产生;p53抑制剂可抑制p53信号通路和NF-κB信号通路转导,二者在高糖诱导的视网膜内皮细胞炎性凋亡过程中可能起到一定协同作用。
刘红佶[9]（2019）在《基于NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路研究RGCs凋亡机制及补肾活血法的干预效应与作用机制》文中提出背景和目的:青光眼不可逆的视神经损害对人类视觉质量构成极大的威胁,深入了解青光眼视神经损害发生发展机制及开发视神经保护药物的形式刻不容缓。研究发现由高眼压（high intraocular pressure,HIOP）导致的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）进行性凋亡是青光眼视神经损害的根本原因。另外,抑凋亡和促凋亡信号因子的相对表达对RGCs凋亡具有重要调控作用,而NGF/ASK1/FoxO1通路与NGF/AKT/CREB通路与细胞凋亡密切相关,因此NGF/ASK1/FoxO1通路与NGF/AKT/CREB通路可能参与RGCs凋亡相关机制。既往青光眼视神经保护以活血通络为主,滋养肝肾较少,滋养肝肾、活血通络同用者罕见,系统研究更少。补精益视片为中医眼科名家陈达夫教授经验方,具有滋养肝肾、活血通络的作用,作为补肾活血法代表方,我们前期临床及动物实验均已明确其对青光眼具有较好的视神经保护作用,其具体作用机制尚需进一步探索。本研究首先通过体外高压诱导、成功构建RGCs凋亡模型,观察不同压力梯度对RGCs凋亡的影响,从NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路的角度研究其机制,然后建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,探讨补肾活血法（补精益视片）对以上通路的干预效应和机制。旨在传承并发掘名老中医经验,从而为青光眼视神经保护创新新思路、提供新方法。实验一:基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制目的:HIOP是诱导RGCs凋亡的重要因素,然而,其潜在的机制尚未清楚。对离体状态下RGCs的病理学特征进行研究,可以避免细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用和机体内环境的复杂性而导致的体内研究局限性,离体状态下RGCs凋亡模型（体外加压培养RGCs）是研究青光眼RGCs凋亡发生机制的理想模型。本部分实验基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制。方法:采取开放式压力控制培养系统建立体外加压RGCs凋亡模型。将原代培养的SD大鼠RGCs分别暴露于0 mmHg、20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg5个压力梯度24 h,采用倒置显微镜观察RGCs的形态学变化、CCK-8和Annexin V-FITC/PI流式细胞术分别检测RGCs的活性和凋亡率、Western blot及qRT-PCR分别检测NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB的蛋白表达和mRNA水平。结果:（1）成功建立体外加压培养RGCs的凋亡模型:40 mmHg组、60 mmHg组、80 mmHg组RGCs的活性明显低于0 mmHg组与20 mmHg组（均P<0.01）,其凋亡率明显高于0 mmHg与20 mmHg（均P<0.01）,20 mmHg组与0 mmHg组RGCs活性及凋亡率均无明显差异（P>0.05）;另外,在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg中,RGCs细胞活性随压力的增高而逐渐下降（P<0.05）,凋亡率则随着压力的增高而逐渐升高（P<0.05）。（2）不同压力梯度对RGCs的形态学变化的影响:0 mmHg组和20 mmHg组有极少量细胞出现细胞萎缩改变;40 mmHg组较多细胞萎缩或破坏;60 mmHg组大部分细胞神经突缩短,部分细胞解体或死亡;80 mmHg组细胞均出现严重的结构损害,已不可分辨其基本形态结构。（3）不同压力梯度对NGF通路相关蛋白NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB表达的影响:与0 mmHg组相比,20 mmHg组NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,而40 mmHg组、60 mmHg组和80 mmHg组的NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB蛋白表达水平与0 mmHg组、20 mmHg组相比,则有明显差异（P<0.01）,且NGF、AKT和CREB的蛋白表达水平随着压力的升高而逐渐下降（P<0.05）,而ASK1、FoxO1蛋白表达水平则随压力的升高而逐渐增加（P<0.05）。（4）不同压力梯度对NGF通路相关蛋白NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB mRNA表达的影响:与0 mmHg组相比,20 mmHg组NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB mRNA表达水平均无明显变化（P>0.05）;而40 mmHg组、60 mmHg组和80 mmHg组的NGF、AKT、ASK1、FoxO1、CREB mRNA与0 mmHg组、20 mmHg组相比,则有明显差异（P<0.01）,且NGF、AKT和CREB的mRNA表达水平随着压力的升高而逐渐下降（P<0.01）,而ASK1及FoxO1 mRNA表达水平则随着压力的升高而逐渐增加（P<0.05）。（5）NGF/ASK1/FoxO1通路和NGF/AKT/CREB通路的比较:20mmHg组NGF/ASK1/FoxO1通路ASK1、FoxO1蛋白及mRNA表达与NGF/AKT/CREB通路CREB蛋白及mRNA表达比较无明显差别（P>0.05）。而40mHg组、60mmHg组、80 mmHg组NGF/AKT/CREB通路CREB蛋白及mRNA表达变化量明显高于NGF/ASK1/FoxO1ASK1与FoxO1蛋白及mRNA表达变化量（均P<0.01）。表明在NGF相关通路中,NGF/AKT/CREB可能在压力引起RGCs凋亡中作用可能更重要。结论:（1）采取开放式压力控制系统可成功制作体外加压培养RGCs凋亡模型。（2）40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg的压力均可诱导体外培养RGCs发生凋亡形态学改变,降低RGCs细胞活性,增加RGCs的凋亡率,20 mmHg却与0mmHg类似,未能引起相应改变。（3）调控NGF/ASK1/FoxO1和NGF/AKT/CREB通路可能均是压力导致RGCs凋亡的分子生物学机制。（4）NGF/AKT/CREB通路在RGCs凋亡中的作用可能更为明显。实验二:基于NGF/AKT/CREB通路研究补肾活血法（补精益视片）对大鼠慢性HIOP模型视网膜损伤及RGCs凋亡的影响及机制目的:我们前期临床及动物实验均已发现补肾活血法（补精益视片）对青光眼具有较好的视神经保护作用,且实验一“基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制”研究中发现NGF/AKT/CREB通路在RGCs凋亡中可能发挥着更为重要的作用。为进一步探索补肾活血法（补精益视片）保护视神经机制是否有NGF/AKT/CREB信号转导通路参与,故建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,研究补肾活血法（补精益视片）对大鼠慢性HIOP模型视网膜损伤及RGCs凋亡的影响及机制。方法:采用烙闭上巩膜静脉法建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,60只大鼠随机分为正常组20只,给药组20只,模型组20只。监测大鼠眼压,分别于造模后3天及造模后2月行相关检测:高倍显微镜下观察视网膜形态结构,测量视网膜厚度及RGCs数量,采用Tunel法检测大鼠RGCs凋亡率,免疫组化检测大鼠RGCs的NGF/AKT/CREB通路NGF、AKT、CREB蛋白表达。结果:（1）成功建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型:造模后3天,模型组IOP较造模前显着升高（均为P<0.01）,造模后2月模型组IOP较造模前模型组IOP及造模后2月空白组IOP均有显着差异（P<0.01）;（2）Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型视网膜形态、RGCs凋亡率及数量、视网膜厚度检测:造模后3天,模型组与给药组视网膜结构出现明显破坏,间质水肿,RGCs数量较空白组减少（P<0.05）,凋亡率增加（P<0.05）,视网膜水肿增厚（P<0.05）,部分RGCs形态不规则、染色变淡有空泡、且RGCs排列紊乱,内、外核层排列疏松。造模后2月,模型组视网膜较空白组明显变薄（P<0.05）,内外核层排列明显疏松,模型组RGCs数量较空白组明显较少（P<0.05）,凋亡率较空白组RGCs明显增加（P<0.05）,RGCs排列不规则,且已多呈空泡样。另外,与造模后3天模型组比较,造模后2月模型组RGCs凋亡率增加（P<0.05）,RGCs数量变少（P<0.05）。（3）补肾血法（补精益视片）对Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型眼压、视网膜形态、RGCs数量、RGCs凋亡率及视网膜厚度的影响:虽然造模后3天,给药组眼压、视网膜形态、RGCs数量、RGCs凋亡率及视网膜厚度较模型组均无明显差异（P>0.05）。造模后2月,给药组IOP较模型组IOP及造模后3天给药组IOP均有所降低（P<0.05）。造模后2月,给药组视网膜较模型组视网膜增厚（P<0.05）,RGCs凋亡率降低（P<0.05）,RGCs数量增多（P<0.05）,RGCs形态大致正常,排列规则,内外核层排列稍紊乱。与造模后3天给药组比较,造模后2月给药组凋亡率降低（P<0.05）。（4）补肾活血法（补精益视片）对Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs NGF/AKT/CREB通路NGF、AKT、CREB表达的影响:造模后3天,模型组NGF、AKT及CREB表达均较空白组明显减少（P<0.05）,模型组及给药组NGF、AKT及CREB表达无明显差异;而造模后2月模型组较造模后3天模型组NGF、AKT、CREB表达量降低（P<0.05）,造模后2月给药组NGF、AKT及CREB表达则较模型组明显增多（P<0.05）,且造模后2月给药组较造模后3天给药组NGF、AKT及CREB表达量增多（P<0.05）。结论:（1）采用烙闭大鼠上巩膜静脉方法建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型可获得稳定、持久的HIOP;并可模拟青光眼HIOP造成的渐进性视网膜病理损害:视网膜形态结构渐进性损害,视网膜厚度渐进性变薄,RGCs凋亡率逐渐增加及RGCs数量逐渐减少。（2）补肾活血法（补精益视片）可抑制Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs凋亡、防止RGCs数量减少,改善视网膜病理形态结构及防止视网膜厚度变薄,且有助于轻度降低IOP,从而发挥保护视神经作用。（3）补肾活血法（补精益视片）可促进Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs NGF/AKT/CREB信号转导通路中生存基因NGF、AKT、CREB蛋白表达,且随着用药时间延长,NGF、AKT、CREB蛋白表达有增高趋势,这可能在补肾活血法（补精益视片）保护青光眼视神经的机制中起重要作用。
姜丹丹[10]（2019）在《MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响》文中认为研究背景:乳腺癌对于我国女性来说是很大的威胁,每年新生和死亡人数分别占世界的12.2%和9.6%。随着医学科学的发展,乳腺癌的诊治已经有了比较大的进步,获得了很高的治愈率和生存率。但是乳腺癌患者仍然有高复发率和转移率。乳腺癌的内科治疗包括化疗、内分泌治疗和靶向治疗。近几年来,乳腺癌靶向治疗已成为临床研究的热点话题,其临床应用明显提高了乳腺癌的诊疗效果。已经针对不同的乳腺癌亚型开发了越来越多的靶向疗法。这些药物的临床应用改善了乳腺癌的治疗效果,并不断改变乳腺癌的临床实践过程。如何克服癌症的耐药性,开发出能够超越传统靶向药物疗效的新药,是未来的重要研究方向。MYC是一个强大的原癌基因,原发于Burkitt淋巴瘤t（8;14）（q24;q32）染色体中发现。MYC是螺旋亮氨酸拉链家族成员,和它的其他家族成员N-MYC、L-MY C一样,都是转录因子。MYC是以核定位序列,螺旋-环-螺旋二聚区域,DNA结合区域和转录调节区域为基础发挥其功能作用。正常细胞中,MYC原癌基因在转录水平、转录后水平、细胞周期检验点和染色体有丝分裂中严格受多种调控机制和信号转导通路等调控。这些严格调控机制使细胞不能发生癌变,而目前为止MYC是最频繁失调控的致癌基因之一。在50%的人类癌症中,MYC家族致癌基因存在调节失控,这往往与患者不良预后和生存不利有关。MYC几乎在致癌过程的每个方面都发挥着重要作用,协调增殖、凋亡、分化和代谢。尽管抑制MYC是治疗多种癌症的有效方法,但由于其蛋白结构不可药物化,直接靶向MYC已经是一个挑战。因此,为了达到理想的抗肿瘤效果,人们广泛探索MYC阻断的替代方案,包括MYC/Max复合物阻断、MYC转录和/或翻译抑制、MYC失稳以及与MYC过表达相关的合成致病性。MYC调控异常引起的细胞凋亡是一种重要的调节机制,在预防致瘤细胞增殖中起着非常重要的作用。致癌基因MYC诱导的细胞凋亡是通过p53依赖和非p53依赖途径发生的,其机制尚不清楚。p53基因在约50%的人类恶性肿瘤中存在突变,p53抑制肿瘤活性的丧失与细胞周期阻滞和细胞凋亡密切有关。有报道提出,p53缺失引起的DN A修复过程的缺失与在p53缺失小鼠中观察到的高癌症易感性相关。MYC在乳腺癌组织中的扩增率大约30%。大量基础研究数据表明,原癌基因MYC的扩增在乳腺癌发病机制中具有重要作用,但其扩增频率和在人类研究中的预后相关性并不一致。有研究显示,MYC扩增与已知预后因素的关系（肿瘤分级、淋巴结转移、激素受体阴性）有显着的相关性;扩增与复发和死亡风险显着相关。由此可见,MYC失调可导致乳腺癌的发生和进展,并与不良预后相关。因此,靶向MYC调控通路可为乳腺癌治疗提供一种有前途的策略。我们研究的目的就是希望了解MYC与乳腺癌临床病理特征,预后的相关性并初步探讨其在p53缺失的乳腺癌细胞中的作用机制。研究目的:1、检测乳腺癌组织中MYC的表达,分析其与临床病理因素,复发转移的关系,探讨MYC与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移的关系;2、观察野生型MYC和突变型MYC（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其原因;3、借助体外RNAi沉默基因技术探讨MYC基因通过调节上游基因p14,p21从而调控非p53依赖性凋亡的重要因子Bim的机制。材料和方法:1、检测MYC过表达和乳腺癌临床病理特征及复发转移的关系（1）选取并收集2013年6月至2014年1月青岛大学附属医院收治的100位浸润性乳腺癌患者癌组织及癌旁组织样本。（2）免疫组化检测分析组织标本中MYC的表达。（3）收集整理临床病理数据资料,将MYC的表达情况与临床病理因素进行相关性分析;分析MYC与乳腺癌5年DFS的关系。2、观察MYC野生型及突变型（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（1）分别应用携带MYC野生型及突变型（T58A）慢病毒载体介导转染p53缺失的HCC1937乳腺癌细胞。（2）采用菌落形成法和MTT法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖的影响。（3）流式细胞仪测凋亡法和TUNEL法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞凋亡的影响。3、分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用（1）通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测MYC、Bim mRNA和蛋白水平的表达,分析MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖和凋亡调控的作用机制。（2）RT-PCR和Western blot检测MYC和Bim信号通路中p14、p21的mRNA和蛋白的表达水平。（3）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p21的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p21的表达水平。（4）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p21后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。（5）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p14的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p14的表达水平。（6）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p14后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。结果:1、免疫组化结果显示MYC在乳腺癌组织中的阳性率为36%（36/100）;在癌旁正常组织中,阳性率为12%（12/100）;MYC在癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织,二者比较有统计学意义（p<0.05）。2、MYC阳性表达与乳腺癌的年龄不相关,在小于等于50岁的患者中,阳性率为37.2%（16/43）,在大于50岁的患者中,阳性率为35.1%（20/57）,二者差别无统计学意义（p=0.827）。3、MYC阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径相关,在小于等于2cm的患者中,阳性率为25%（12/48）,而在大于2cm的患者中,阳性率为46%（24/52）,MYC在肿瘤直接大于2cm的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.028）。4、MYC阳性表达与乳腺癌的TNM分期相关,在分期为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为26.8%（15/56）,而分期为Ⅲ的患者中,阳性率为47.7%（21/44）;MYC在分期越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.030）。5、MYC阳性表达与乳腺癌的细胞学分级相关,在分级为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为27.6%（16/58）,而分级为Ⅲ的患者中,阳性率为47.6%（20/42）,MYC在分级越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.039）。6、MYC阳性表达与乳腺癌的ER状态相关,在ER阳性的患者中,阳性率为25%（15/60）,而ER阴性的患者中,阳性率为52.5%（21/40）,MYC在ER阴性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.005）。7、MYC阳性表达与乳腺癌的HER状态相关,在HER2阳性的患者中,阳性率为48.6%（18/37）,而HER2阴性的患者中,阳性率为28.6%（18/63）,MYC在HER2阳性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.043）。8、MYC阳性表达与乳腺癌的淋巴结状态无关,在淋巴结阳性的患者中,阳性率为43.1%（25/58）,而淋巴结阴性的患者中,阳性率为26.1%（11/42）,二者差别无统计学意义（p=0.082）。9、MYC阳性表达与乳腺癌的术后复发转移相关,在5年内复发的患者中,阳性率为60%（12/20）,而5年内未复发的患者中,阳性率为29.2%（24/80）;MYC阳性患者具有更高的复发风险,二者差别有统计学意义（p=0.012）。10、MYC阳性表达与乳腺癌的p53表达无关,在p53表达阳性的患者中,阳性率为39.6%（21/53）,而p53表达阴性的患者中,阳性率为31.9%（15/47）,二者差别无统计学意义（p=0.642）。11、MYC野生型及突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞。两者较对照组均能诱导细胞增殖（p<0.01）;野生型同时能够诱导细胞凋亡（p<0.01）,而突变型不能诱导凋亡（p>0.05）。12、RT-PCR和Western blot结果显示,MYC野生型转染组细胞Bim表达水平升高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）转染组细胞Bim与对照组表达无明显差异（p>0.05）。13、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21表达水平下降（p<0.01）,Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p21后,Bim表达水平较沉默前更高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p21后,Bim表达水平与单纯沉默p21无明显差异（p>0.05）。14、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14表达水平升高（p<0.01）,同时Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p14后,Bim表达水平较沉默前降低（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p14后,Bim表达水平与单纯什么p14无明显差异（p>0.05）。结论:1、MYC在乳腺癌组织中的高表达与肿瘤直径、细胞学分级、病理分期、激素受体状态、HER2状态有关;且MYC阳性患者5年内复发转移风险增高,表明MYC阳性表达与乳腺癌预后相关。2、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC可以促进细胞增殖和凋亡,而MYC发生突变后,仅能促进细胞增殖,却不能促进凋亡。3、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC通过MYC/p21/Bim及MYC/p14/Bim这两种信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥调控作用;MYC突变后,不能调控p21、p14,进一步不能调控Bim参与细胞凋亡的调控。
二、Molecular signal transduction in vascular cell apoptosis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Molecular signal transduction in vascular cell apoptosis（论文提纲范文）
（1）MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1.前列腺癌(Prostate Cancer,PCa) |
| 1.1 PCa的发病率和死亡率 |
| 1.2 PCa发病的遗传因素 |
| 1.3 PCa发生发展的分子机制 |
| 2.miRNAs与PCa |
| 2.1 MicroRNA与表观遗传 |
| 2.2 miRNA的表观遗传调控和PCa的关系 |
| 2.3 PCa中具有癌基因作用的miRNAs |
| 2.4 PCa中具有抑癌基因作用的miRNAs |
| 2.5 miRNAs在PCa诊断、治疗中的应用 |
| 3.14-3-3蛋白 |
| 3.1 14-3-3蛋白的结构与分子功能 |
| 3.2 14-3-3蛋白的细胞生物学功能 |
| 3.3 14-3-3蛋白与肿瘤 |
| 4.14-3-3蛋白与PCa |
| 4.1 通过自身表观遗传学修饰在PCa中发挥作用 |
| 4.2 通过影响与PCa发生相关的关键蛋白的细胞定位发挥作用 |
| 4.3 通过提高或降低自身表达水平发挥作用 |
| 5.本研究目的意义 |
| 6.研究技术路线 |
| 第一章 14-3-3ε在 PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 14-3-3ε基因荧光定量PCR引物的设计和合成 |
| 3.2 14-3-3ε基因siRNA的设计及合成 |
| 3.3 细胞培养和细胞转染 |
| 3.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 3.5 细胞蛋白提取及Western blotting检测 |
| 3.6 CCK-8试验检测细胞的增殖能力 |
| 3.7 Transwell试验检测细胞的侵袭能力 |
| 3.8 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 3.9 数据分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 14 -3-3ε基因在PCa组织和细胞中呈明显上调趋势 |
| 4.2 siRNA-4对14-3-3ε基因具有较强的干扰效率 |
| 4.3 干扰14-3-3ε基因对PCa细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第二章 调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miRNAs筛选及序列合成 |
| 3.2 引物设计及序列信息 |
| 3.3 细胞转染及qRT-PCR试验 |
| 3.4 双荧光素酶试验筛选调控14-3-3ε表达的最佳miRNAs |
| 3.5 CCK-8试验检测5条miRNA对22Rv1细胞的增殖能力 |
| 3.6 miR-31-5p与14-3-3ε相互作用位点的鉴定 |
| 3.7 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 生物在线软件筛选调控14-3-3ε基因的microRNAs |
| 4.2 五条候选microRNAs在 PCa细胞中的表达 |
| 4.3 五条miRNAs在 PCa各细胞系中转染效率检测 |
| 4.4 五条miRNAs对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.5 靶向调控14-3-3ε基因的miRNAs的筛选及鉴定 |
| 4.6 miR-31-5p与14-3-3ε/3’UTR具有直接相互作用 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 质粒和菌株 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 miR-31-5p不同miRNA浓度的细胞转染 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.5 CCK-8检测细胞增殖试验 |
| 3.6 Transwell试验 |
| 3.7 细胞划痕试验 |
| 3.8 细胞周期试验 |
| 3.9 细胞凋亡试验 |
| 3.10 统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p转染24h后转染效率检测 |
| 4.2 miR-31-5p不同转染浓度对14-3-3ε表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 4.4 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞增殖能力的影响 |
| 4.5 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞侵袭能力的影响 |
| 4.6 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞迁移能力的影响 |
| 4.7 共转染miR-31-5p与对22Rv1细胞周期的影响 |
| 4.8 共转染miR-31-5p与14-3-3ε对22Rv1细胞凋亡的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/Akt/Bcl-2 信号通路的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 细胞系及质粒载体 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 细胞转染 |
| 3.2 Western blot检测细胞转染效率 |
| 3.3 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 miR-31-5p调控14-3-3ε对 PI3K/AKT/m TOR信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2 miR-31-5p调控14-3-3ε对 BCL-2 信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.3 miR-31-5p调控14-3-3ε影响22Rv1细胞增殖和凋亡的分子机制 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ:在读博士期间取得的科研成果 |
| 附录Ⅱ:论文涉及的试剂配方 |
（2）异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立及IQ预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的肾功能及其相应肾脏组织学的保护作用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 第一部分小结 |
| 第二部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗炎症反应的作用及其机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗氧化应激的作用及其机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四部分 IQ预处理在肾缺血再灌注损伤中抗凋亡的作用及其机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肾缺血再灌注损伤的病理生理过程及治疗的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 英文缩略词及其中英文对照表 |
| 致谢 |
（3）温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1. 对象和方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.1.1 实验动物与饲料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 射频温控球囊消融对家兔正常血管的影响 |
| 1.2.2 射频温控球囊消融动脉粥样硬化血管情况 |
| 1.2.3 样本采集 |
| 1.2.4 测量指标 |
| 1.2.5 HE染色 |
| 1.2.6 Masson染色 |
| 1.2.7 Realtime PCR方法 |
| 1.2.8 western blot方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 射频温控球囊消融对家兔正常血管的影响 |
| 2.1.1 温控球囊对血管影响 |
| 2.1.2 比较温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔主动脉作用 |
| 2.1.3 温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔主动脉纤维化情况 |
| 2.2 射频温控球囊对家兔动脉粥样硬化血管的影响 |
| 2.2.1 组织病理学改变 |
| 2.2.2 比较温控射频球囊组与单纯球囊扩增组对兔粥状动脉硬化主动脉作用 |
| 2.2.3 免疫组化结果 |
| 2.3 射频温控球囊对家兔动脉血管的细胞因子转录水平的影响 |
| 2.4 射频温控球囊对家兔动脉血管的细胞因子蛋白水平的影响 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 PCI与动脉粥样硬化 |
| 3.2 射频消融(RFA) |
| 3.3 温控球囊血管成形术(RFPB) |
| 3.4 温控射频球囊成形术的安全性 |
| 3.5 温控射频球囊对血管壁成分以及血管内径的影响 |
| 3.5.1 温控射频球囊对血管内斑块内成分的影响 |
| 3.5.2 温控射频球囊对血管扩张维持的影响 |
| 3.5.3 凋亡和内膜增生 |
| 3.6 细胞因子在动脉粥样硬化发展中的作用 |
| 3.7 温控射频球囊对凋亡通路影响 |
| 3.8 研究不足之处 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 动脉粥样硬化与炎症因子及炎症通路 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ诱导人舌鳞癌细胞凋亡中PERK/eIF2α蛋白表达意义的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究材料(资料、内容)与方法 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 细胞培养体系 |
| 1.2 实验研究材料 |
| 1.2.1 实验主要相关试剂 |
| 1.2.2 实验主要相关仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 实验主要相关溶液的配制 |
| 2.1.1 细胞培养液的配制 |
| 2.1.2 细胞冻存液的配制 |
| 2.1.3 药品DTT溶液的配制 |
| 2.1.4 药品AAVC-Ⅰ溶液的配制 |
| 2.2 体外培养Tca8113细胞 |
| 2.2.1 Tca8113细胞的体外复苏 |
| 2.2.2 Tca8113细胞的换液培养 |
| 2.2.3 Tca8113细胞的传代培养 |
| 2.2.4 Tca8113细胞的冻存处理 |
| 2.3 MTT检测DTT和 AAVC-Ⅰ对 Tca8113 细胞增殖影响 |
| 2.3.1 MTT检测DTT浓度组对Tca8113 细胞增殖作用 |
| 2.3.2 MTT检测AAVC-Ⅰ浓度组对Tca8113 细胞增殖作用 |
| 2.4 HE染色观察DTT和 AAVC-Ⅰ对 Tca8113 细胞形态影响 |
| 2.5 Tca8113 细胞荧光染色观察DTT与 AAVC-Ⅰ对细胞凋亡影响 |
| 2.6 WB检测Tca8113细胞相关分子蛋白表达水平 |
| 2.6.1 提取Tca8113细胞总蛋白 |
| 2.6.2 BCA测定细胞总蛋白浓度 |
| 2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.7 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（5）β-hCG介导的VEGF-MEK/ERK信号通路在早期绒毛血管生成和滋养细胞凋亡中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 稽留流产概述 |
| 1.2 绒毛血管生成在胚胎发育中的作用 |
| 1.3 β-hCG在孕早期绒毛血管生成中的作用 |
| 1.4 VEGF/VEGFR2 信号通路与血管生成 |
| 1.5 MEK/ERK信号通路 |
| 1.6 滋养细胞凋亡与hCG、VEGF-MEK/ERK信号通路 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 基本情况比较 |
| 3.2 血清中β-hCG和 VEGF的水平 |
| 3.3 绒毛组织病理改变比较 |
| 3.4 两组绒毛组织中微血管形成情况 |
| 3.4.1 CD34表达及血管形态 |
| 3.4.2 微血管密度(MVD)计数情况 |
| 3.5 绒毛组织中VEGF/VEGFR2 信号通路相关因子表达 |
| 3.5.1 VEGF/VEGFR2 信号通路相关基因mRNA表达 |
| 3.5.2 VEGF/VEGFR2 信号通路相关蛋白表达 |
| 3.6 绒毛组织中MEK/ERK信号通路相关因子表达 |
| 3.6.1 MEK/ERK信号通路相关基因mRNA表达 |
| 3.6.2 MEK/ERK信号通路相关蛋白表达 |
| 3.7 绒毛组织VEGF和 ERK1/2 蛋白表达水平与微血管密度的相关性分析 |
| 3.8 绒毛组织中细胞凋亡相关因子表达 |
| 3.8.1 绒毛组织中细胞凋亡相关基因mRNA表达 |
| 3.8.2 绒毛组织中细胞凋亡相关蛋白表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 β-hCG异常与稽留流产 |
| 4.2 绒毛组织结构病理改变分析 |
| 4.3 绒毛血管生成异常与稽留流产 |
| 4.4 VEGF/VRGFR2 信号通路异常与稽留流产 |
| 4.5 MEK/ERK信号通路异常与稽留流产 |
| 4.6 滋养细胞凋亡与稽留流产 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 不足之处 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 结直肠癌的病因及治疗进展 |
| 1.2 天然药物治疗结直肠癌的研究进展 |
| 1.3 蛇葡萄素的研究进展 |
| 1.4 代谢组学在结直肠癌研究中的应用 |
| 1.5 凋亡和自噬在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 蛇葡萄素体外抗结直肠癌作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 2.2.3 增殖抑制实验 |
| 2.2.4 细胞克隆实验 |
| 2.2.5 细胞创伤愈合实验 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MTT法检测不同浓度AMP对人结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞克隆的影响 |
| 2.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 蛇葡萄素抗人结直肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤药效实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 3.2.2 分组及给药方法 |
| 3.2.3 检测指标 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物体重的影响 |
| 3.3.2 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物瘤体积的影响 |
| 3.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物瘤重及抑瘤率的影响 |
| 3.3.4 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物脏器系数的影响 |
| 3.3.5 人结肠癌HCT-116细胞移植瘤模型动物主要脏器组织切片HE染色结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于代谢组学研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 样品前处理 |
| 4.2.2 LC-MS/MS分析 |
| 4.2.3 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 样本代谢质谱TIC图 |
| 4.3.2 偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.3 正交偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.4 单变量统计分析结果 |
| 4.3.5 显着性差异代谢物 |
| 4.3.6 层次聚类分析结果 |
| 4.3.7 相关系数矩阵热图 |
| 4.3.8 KEGG通路富集分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 受试药配制 |
| 5.2.3 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 5.2.4 动物分组及给药方法 |
| 5.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 |
| 5.2.6 流式细胞仪分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞凋亡的影响 |
| 5.2.7 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.2.8 AO染色观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞自噬的影响 |
| 5.2.9 透射电镜观察HCT-116细胞自噬 |
| 5.2.10 Western-blotting观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达的影响 |
| 5.2.11 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 AMP对人结肠癌细胞周期的影响 |
| 5.3.2 AMP对人结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.3 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.3.4 荧光显微镜和透射电镜观察细胞自噬情况 |
| 5.3.5 细胞及瘤块组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.3.6 细胞及瘤块组织中自噬相关蛋白的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 自噬在蛇葡萄素诱导人结肠癌细胞凋亡中的作用以及相关分子机制研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 6.2.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 6.2.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 6.2.5 AO染色观察AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.2.6 Western-blotting观察自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡和自噬蛋白表达的影响 |
| 6.2.7 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞增殖的影响 |
| 6.3.2 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡的影响 |
| 6.3.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.3.5 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.6 AMP对 PI3K/Akt/mTOR信号转导途径的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）旱莲苷A在肺癌中的抗肿瘤效应及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 1 第一部分 旱莲苷A在体内外抗肺癌作用评价 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 2 第二部分旱莲苷A的抗肺癌分子机制研究 |
| 2.1 第一节旱莲苷A诱导肺癌细胞发生凋亡和自噬的相互关系及其作用机制 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 2.2 第二节内质网应激在旱莲苷A抗肿瘤效应中的分子机制研究 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 第三节旱莲苷A通过PKCα/STAT3 通路调控肺癌细胞凋亡 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 3 结论 |
| 综述 IRE1信号通路在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 糖尿病早期视网膜血管改变 |
| 1.1.1 发病机制及分子生物学改变 |
| 1.1.2 细胞因子对血管损伤的调节 |
| 1.1.3 血管活性物质对血管损伤影响 |
| 1.2 糖尿病性视网膜病变与炎症 |
| 1.2.1 高血糖诱导视网膜微血管病变机制 |
| 1.2.2 炎症因子破坏视网膜细胞的机制 |
| 1.2.3 糖尿病性视网膜病变相关炎症因子的分类 |
| 1.3 糖尿病性视网膜病变与细胞凋亡 |
| 1.3.1 细胞凋亡的机制 |
| 1.3.2 细胞凋亡的基本形式 |
| 1.3.3 NF-κB 在细胞凋亡中的作用 |
| 1.3.4 抑癌基因p53 与凋亡的关系 |
| 1.3.5 P53 通路和NF-κB 信号转导通路的联系 |
| 1.4 本研究的目的、内容和意义 |
| 第2章 高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡效应 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂及设备 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.3 实验过程 |
| 2.3.1 研究方法 |
| 2.3.2 溶液配制 |
| 2.3.3 细胞原代培养与分离 |
| 2.3.4 HE染色光镜标本制作 |
| 2.3.5 透射电子显微镜样品制备 |
| 2.3.6 LDH检测 |
| 2.3.7 DNA倍体法检测细胞周期 |
| 2.3.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.9 Western-blot检测分析 |
| 2.3.10 ELISA检测分析 |
| 2.3.11 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 HE染色结果 |
| 2.4.2 透射电镜结果 |
| 2.4.3 LDH检测结果 |
| 2.4.4 DNA倍体法检测细胞周期结果 |
| 2.4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 2.4.6 Western-blot检测结果 |
| 2.4.7 ELISA检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 实验试剂及仪器 |
| 3.3 实验过程 |
| 3.3.1 透射电镜检查 |
| 3.3.2 Western blot检测凋亡蛋白 |
| 3.3.3 Western blot检测p53和NF-κB 通路蛋白 |
| 3.3.4 P53和NF-κB 在视网膜内皮细胞的免疫荧光共定位 |
| 3.3.5 q-PCR反应 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 透射电镜结果 |
| 3.4.2 Western-blot检测Bax、Bcl-2、cl-caspase-3 的表达变化 |
| 3.4.3 Western-blot检测p53/p-p53、p65/p-p65、IκB/p-IκB 结果 |
| 3.4.4 荧光免疫共定位检测p53与NF-κB p65 蛋白在细胞内的表达及定位 |
| 3.4.5 q-PCR检测RECs细胞内p53和p65的mRNA转录水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 抑制p53 蛋白表达对高糖培养RECs细胞形态学的影响 |
| 3.5.2 抑制p53 蛋白对凋亡通路蛋白的影响 |
| 3.5.3 RECs细胞内p53 信号通路蛋白的表达变化 |
| 3.5.4 NF-κB 信号通路蛋白及其抑制蛋白的表达变化 |
| 3.5.5 RECs细胞炎性凋亡机制分析 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）基于NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路研究RGCs凋亡机制及补肾活血法的干预效应与作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 一、前言 |
| 二、实验内容 |
| 1.实验一 基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要器材与试剂 |
| 1.1.2 实验对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 纯化SD乳鼠RGCs的原代培养 |
| 1.2.2 建立RGCs加压培养模型 |
| 1.2.3 RGCs免疫组化鉴定及纯度检测 |
| 1.2.4 Cell Counting Kit-8 检测加压后RGCs活性 |
| 1.2.5 Annexin V/PI flow cytometry检测加压后RGCs的凋亡率 |
| 1.2.6 Western blot检测加压后RGCsNGF、AKT、ASK1、FoxO1、CREB蛋白表达 |
| 1.2.7 qRT-PCR检测加压后RGCs NGF、AKT、ASK1、FoxO1、CREB mRNA表达 |
| 1.3 统计学方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1RGCs的鉴定及纯度检测 |
| 1.4.2 不同压力梯度对RGCs的形态学变化的影响 |
| 1.4.3 不同压力梯度对RGCs活性的影响 |
| 1.4.4 不同压力梯度对RGCs凋亡率的影响 |
| 1.4.5 不同压力梯度对RGCsNGF、AKT、ASK1、FoxO1与CREB表达的影响 |
| 1.4.6 不同压力梯度对RGCsNGF、AKT、ASK1、FoxO1与CREB mRNA表达的影响 |
| 1.4.7 ASK1、FoxO1与CREB在 20mmHg、40mmHg、60mmHg和 80mmHg中表达变化量的比较 |
| 1.4.8 ASK1、FoxO1与CREB在 20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg和 80 mmHg中mRNA表达变化量的比较 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 体外加压培养RGCs凋亡模型的建立及不同压力梯度的选择依据 |
| 1.5.2 NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路相关指标选择依据 |
| 1.5.3 基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路分析不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响 |
| 1.6 结论 |
| 2.实验二 补肾活血中药(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜及RGCs凋亡相关NGF/AKT/CREB信号通路的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验器材与试剂 |
| 2.1.2 实验对象 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分组方法 |
| 2.2.2 造模方法 |
| 2.2.3 给药方法 |
| 2.2.3 取材及固定 |
| 2.2.4 眼压测定 |
| 2.2.5 视网膜形态结构观察 |
| 2.2.6 计算RGCs细胞数量 |
| 2.2.7 测量视网膜厚度 |
| 2.2.8 TUNEL法检测RGCs凋亡率 |
| 2.2.9 免疫组化法检测RGCsNGF、AKT、CREB蛋白表达水平 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型眼压的影响 |
| 2.4.2 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜结构影响 |
| 2.4.3 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型RGCs数量影响 |
| 2.4.4 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜厚度影响 |
| 2.4.5 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型RGCs凋亡率的影响 |
| 2.4.6 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型RGCsNGF表达的影响 |
| 2.4.7 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型RGCs AKT表达的影响 |
| 2.4.8 补肾活血法(补精益视片)对高眼压模型大鼠RGCs CREB表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 高眼压动物模型选择依据 |
| 2.5.2 补肾活血法立法依据及方药选择依据 |
| 2.5.3 NGF/AKT/CREB通路选择依据 |
| 2.5.4 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型眼压的影响 |
| 2.5.5 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜结构、RGCs数量及视网膜厚度的影响 |
| 2.5.6 补肾活血法(补精益视片)对大鼠高眼压模型RGCs凋亡率的影响 |
| 2.5.7 补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型RGCsNGF/AKT/CREB通路的影响 |
| 2.6 结论 |
| 三、创新点 |
| 四、问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间学术论文及科研成果 |
（10）MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MYC在乳腺癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 组织样本的收集 |
| 2.2 石蜡标本的制备 |
| 2.3 组织切片的苏木精-伊红染色(HE染色) |
| 2.4 免疫组织化学技术(IHC)检测组织中MYC表达水平 |
| 2.5 随访 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC蛋白在乳腺癌组织、癌旁正常组织中的表达 |
| 3.2 MYC阳性表达与乳腺癌临床病理特征的关系 |
| 3.3 MYC阳性表达与乳腺癌预后的关系 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 MYC对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养方法 |
| 2.2 慢病毒转染及效率测定 |
| 2.3 RT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.4 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.5 克隆形成实验检测细胞增殖 |
| 2.6 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.7 TUNEL法分析细胞凋亡 |
| 2.8 流式细胞仪法检测细胞凋亡 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC野生型与突变型(T58A)转染后转染效率测定 |
| 3.2 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞增殖的影响 |
| 3.3 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞凋亡的影响 |
| 3.4 MYC野生型与突变型(T58A)转染后各相关凋亡蛋白表达 |
| 3.5 MYC野生型与突变型(T58A)转染后Bim的表达 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 慢病毒转染 |
| 2.2 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 转染后p21和Bim的表达 |
| 3.2 干扰p21后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3 转染后p14和Bim的表达 |
| 3.4 干扰p14后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、Molecular signal transduction in vascular cell apoptosis（论文参考文献）
- [1]MicroRNA-31-5p调控14-3-3ε影响前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制研究[D]. 赵佳福. 贵州大学, 2020
- [2]异槲皮素预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 梁苏东. 苏州大学, 2020(06)
- [3]温控射频消融血管成形术对动脉粥样硬化的影响[D]. 夏晓东. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]尖吻蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ诱导人舌鳞癌细胞凋亡中PERK/eIF2α蛋白表达意义的研究[D]. 王振杰. 皖南医学院, 2020(01)
- [5]β-hCG介导的VEGF-MEK/ERK信号通路在早期绒毛血管生成和滋养细胞凋亡中的作用研究[D]. 井光壮. 兰州大学, 2020(12)
- [6]基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制[D]. 朱丽娟. 兰州大学, 2020(01)
- [7]旱莲苷A在肺癌中的抗肿瘤效应及其分子机制研究[D]. 韩佳. 浙江大学, 2020(01)
- [8]高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究[D]. 李倩. 吉林大学, 2019(02)
- [9]基于NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路研究RGCs凋亡机制及补肾活血法的干预效应与作用机制[D]. 刘红佶. 成都中医药大学, 2019(04)
- [10]MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响[D]. 姜丹丹. 青岛大学, 2019(07)