一、三类抗蝮蛇毒血清的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较研究（论文文献综述）
李佳欣[1]（2021）在《青环海蛇蛇毒组分的多组学分析及抗体制备》文中进行了进一步梳理
王博[2]（2021）在《我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选》文中提出第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科,全球共70余种,我国分布有17种,优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物,其主要组分为神经毒素和多种酶类,致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同,海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青环海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的组成,比较分析两者差异情况,本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象,首先构建了海蛇毒腺转录组数据库;其次利用液相色谱-质谱联用技术,通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析;在组学基础之上,我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下:1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序,成功构建了高质量的毒腺转录组数据库,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中进行了功能注释,在NR数据库中,两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注释中,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes,主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中;对简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点检测,平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点,其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高,均超过了50%。通过与Uni Prot动物毒素库（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比对,在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。2.通过液相色谱-质谱联用技术,获得Hcu V和Hcy V蛋白组分的原始肽段,匹配检索Uni Prot动物毒素数据库,在Hcu V和Hcy V中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类,鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类,但也有少数见于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通过毒素蛋白组比较分析发现,不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具体的蛋白组成也有一定差异。Hcu V和Hcy V中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分别为54%和38%,在Hcy V中分别为69%和22%,与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半数致死量(LD50)分别为0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很强的致死性;两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性,但无明显的促凝与抗凝活性,这些活性检测结果与组学分析结果相一致。本部分通过对Hcu V和Hcy V进行多组学分析,并结合蛇毒生物学活性检测,揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性,也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系,为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价海蛇毒主要组分为神经毒素,能阻断神经突触传递,从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强,可诱发严重的呼吸衰竭,死亡率高,目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清,但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清,对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示,不同海域、不同种类的海蛇,其毒素组成存在一定差异,因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清,本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原,经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤,制备了高效价的抗毒血清;并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价,明确了抗毒血清的有效用量和使用时机,为今后临床应用提供了参考。主要结果如下:1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化,使毒素抗原获得最大的免疫原性,免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清;经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后,抗海蛇毒血清中抗体F（ab’）2蛋白纯度达到91.6%,杂质大量减少,同时具备较好的毒素中和能力。2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）体外抗毒实验结果显示,Hcu AV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能够对抗1.2 mg平颏海蛇毒或0.9 mg青环海蛇毒,使半数实验动物存活,提示Hcu AV能交叉中和多种海蛇毒,并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。3.Hcu AV体内抗毒实验结果显示,海蛇咬伤中毒后注射Hcu AV能显着提高实验动物的存活率,但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果,预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时,Hcu AV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。本部分以平颏海蛇毒为抗原,制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清,能显着地降低中毒死亡率,保护机体脏器免受损伤,为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成,是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外,也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质,具有多样的药理学效应如:镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象,分离其毒腺组织,利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子,经过多轮淘选,筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆,通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等,最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽,并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下:1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库,文库库容达到2.2×109,随机测序验证外源插入片段准确无误;c-Myc标签检测结果表明,外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。2.以LPS为靶标分子,经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程,获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明,该多肽富含碱性氨基酸,理论分子量为2523.15,理论等电点为10.76,在中性溶液中携带正电荷;该多肽的二级结构主要为α-螺旋,氨基与羧基端呈现出双亲性结构,能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽,纯度超过95%,质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符,证明合成的多肽无误,可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定,结果表明,该多肽与LPS具有较强的结合能力,结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明,该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果,因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,简称Hc-ENP。4.体外实验结果表明,Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L浓度下,能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示,Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活,从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应,包括:炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等,进而发挥抗炎活性。5.体内实验结果表明,Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应,包括:靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选,从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP,其在体内外均有明确的LPS拮抗效果,本研究为进一步开发利用海蛇基因资源,探索其开发应用价值提供了新的途径。
李进红[3]（2019）在《磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用》文中进行了进一步梳理磷脂有很好的乳化、分散作用,并能促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤。但残留于植物油脂中,它会使油脂变得不稳定,促使酸败加剧,颜色加深,增加过滤和操作的难度,造成设备结焦、增加脱色脱酸负担等问题。酶法脱胶具有减少水的使用量,提高产油率,绿色无毒害等优点。将磷脂酶固定在合适的载体上,不仅能增加酶的稳定性,还可以实现磷脂酶的回收再利用。本文选择将磷脂酶C固定到大孔树脂上,磷脂酶A1固定到磁性Fe3O4纳米粒子上;并将固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶C进行单一及联合油脂脱胶应用。通过考察脱胶油含磷量和得油率对不同脱胶工艺进行比较分析获得研究结果如下。（1）以固定化磷脂酶的酶活力和蛋白吸附率为考察指标,从001×10、001×7、D345等几种大孔树脂中筛选出弱碱性阴离子交换树脂D345为较优固定化载体。经单因素实验和正交实验,得到固定化磷脂酶C的最适制备条件为:加酶量6.0 mL pH 5.5,时间6.0 h,戊二醛浓度1.0%,温度30℃。制备的固定化酶酶活力可达1832U/g,酶蛋白吸附率为78.7%;固定化磷脂酶C较适反应温度50℃,pH 6.5,热稳定性和pH稳定性均在一定程度上提高,在4℃冰箱中保存40 d剩余67.0%的酶活力。（2）将Fe3O4纳米粒子与TEOS（硅酸四乙酯）反应制备Fe3O4-SiO2磁性载体,然后再将载体与3-APTES（3-氨基丙基三乙氧基硅烷）反应制备氨基化Fe3O4-SiO2,最后用戊二醛将Fe3O4-SiO2磁性复合载体进行交联,最终制备得到改性Fe3O4-SiO2载体,以酶活回收率和蛋白固载率为考察指标,获得最佳固定化的条件为:加酶量8.0mL/50mg载体、温度30℃,pH 6.0,时间8.0 h,戊二醛浓度8.0%,此条件下制得磁性固定化PLA1酶的酶活回收率达到63.3%,蛋白固载率为68.0%。（3）通过扫描电子显微镜分析,可以观察到Fe3O4磁性纳米粒子基本形貌为球状,具有良好的分散性,团聚较少,其平均粒径在15 nm左右。Fe3O4-SiO2磁性复合载体的粒径较为均一,表面平滑,呈球状,各载体间分散性良好,载体的平均粒径为200 nm左右。通过透射电子显微镜分析,可以看出Fe3O4纳米颗粒的固定化载体呈核壳形,中间黑色的实心为Fe3O4纳米颗粒,载体周围呈现出均匀的灰色薄层为SiO2层。通过傅立叶红外光谱分析,表明磷脂酶成功的固定到了磁性载体上,通过X射线衍射,可以看出固定化载体材料中反尖晶石型晶体结构为磁性Fe3O4的晶面。（4）以含磷量为指标,优化固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1的较适油脂脱胶条件,对于固定化磷脂酶C较适脱胶条件为:酶添加量1.2 g/kg、时间4.0 h、温度55℃、pH 6.5。对于固定化磷脂酶A1较适脱胶条件为:酶添加量0.6 g/kg,时间2.0 h、温度60℃、pH 5.5。研究表明,对不同来源和不同含磷量的毛油,固定化磷脂酶A1脱胶均能有效降低毛油中的含磷量,固定化磷脂酶C能提高中性油的得油率,但脱胶油中含磷量尚未达到物理精炼要求（<10 mg/kg）;而采用固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1联合脱胶,可以充分发挥两者的优势,在有效降低脱胶中含磷量的同时,还能提高产油率,提高经济效益。
郭积芳[4]（2015）在《中介蝮蛇毒中Intobin1和Intobin2基因Kex2位点突变体在毕赤酵母中的表达及生物活性研究》文中研究说明蛇毒类凝血酶（Snake venom thrombin-like enzyme,SVTLEs）,属于胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶,主要存在于蝰科蝮亚科蛇的蛇毒中。它在体外能够直接作用于纤维蛋白原,催化纤维蛋白原分子的特定部位Arg-Gly肽键的裂解,释放血纤肽,从而导致纤维蛋白的单体首尾聚合形成凝块;但在体内不激活凝血因子,由它水解生成的纤维蛋白凝块不产生侧链交联,很容易被天然网状内皮系统或正常的纤溶作用所清除,表现降纤、抗凝的效果。临床上,蛇毒类凝血酶已成为防治血栓栓塞性疾病的有效药物,但是由于蛇毒资源有限、分离纯化成本高,难以保证产量,因此利用基因工程手段获得重组蛇毒类凝血酶是满足需求的有效途径。巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种成熟的真核表达系统,已经成功表达了多种蛋白,许多蛇毒类凝血酶也已经在毕赤酵母中得到了表达,但是关于中介蝮蛇毒类凝血酶在毕赤酵母中表达的报道却很少。因此,本研究以来自中介蝮毒腺cDNA文库的两个类凝血酶基因为材料,将密码子优化,并突变掉2个Kex2位点,然后采用毕赤酵母GS115菌株进行基因工程表达,对其活性进行分析,有望为该酶的进一步研究奠定基础。本研究的内容:1.对本实验室前期建立的中介蝮毒腺cDNA文库中的两个类凝血酶基因序列进行初步的生物信息学分析。并根据分析结果将其命名为Intobin1和Intobin2。2.根据毕赤酵母密码子偏爱性对Intobin1和Intobin2基因进行密码子优化;为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的目的蛋白的降解,将Intobin1和Intobin2基因编码的氨基酸中的Arg突变为Lys;同时在Intobin1和Intobin2序列的C末端引入6个His标签,方便后期目的蛋白的纯化。将优化后的Intobin1和Intobin2基因序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司全序列合成,并将优化后的突变型（Mutant）基因 Intobin1 命名为 mIntobin1,突变型（Mutant）基因 Intobin2命名为 mIntobin2。3.将突变型基因mIntobin1和mIntobin2克隆于分泌型表达载体pPIC9K,构建重组载体 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2。4.将线性化的重组载体pPIC9K/mIntobin1和pPIC9K/mIntobin2电转入毕赤酵母GS115菌株中,并通过不同浓度的抗生素G418和MD平板筛选阳性克隆;利用试剂盒法提取重组后的 GS115/pPIC9K/mIntobin1 和 GS115/pPIC9K/mlntobin2 的基因组,并用PCR法验证其表型;鉴定正确的阳性克隆进行初步诱导表达,诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。5.采用单因素实验方法,从诱导时间、甲醇浓度、温度、pH值、抗氧化剂五个方面对诱导表达菌株进行发酵条件优化。以最优的发酵条件进行大规模诱导表达,并采用Ni-NTA纯化柱对目的蛋白进行纯化。6.采用Bradford法计算优化后诱导上清的总蛋白浓度以及纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的浓度,并采用Gel-Pro软件分析纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的纯度。7.对纯化后的重组蛋白mIntobin1和mIntobin2进行生物学活性测定。利用BApNA测定mIntobin1和mIntobin2的酰胺水解活性;利用纤维蛋白平板法测定其纤溶活性;采用SDS-PAGE法测定其纤维蛋白原水解活性。实验结果:1.对Intobin1和Intobin2基因序列进行生物信息学分析。结果表明Intobin1基因包含一个长度为789 bp的开放阅读框,编码262个氨基酸,信号肽为1～18位氨基酸（MVLIKVLANLLILQLSYA）;成熟肽分子量为26.9kDa,理论等电点为6.76;活性位点为His67、Asp112、Ser208;N-糖基化位点为105位和124位;Intobin1编码的氨基酸序列与Pallabin-2（Gloydius halys,Q9YG16.1）的同源性最高（达94%）。Intobin2基因包含一个长度为783 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸,信号肽为1～18位氨基酸（MVLIRVLANLLILQLSYA）;成熟肽分子量为26.55 kDa,理论等电点为8.43;活性位点为His67、Asp112、Ser208;N-糖基化位点为123和124 位;Intobin2 编码的氨基酸序列与 Gloshedobin（Gloydius Shedaoensis P0C5B4.2）的同源性最高（达99%）。2.密码子优化结果表明,优化后的Intobin1和Intobin2基因的氨基酸序列与原基因的氨基酸序列一致,优化后Intobin1基因编码的氨基酸中有18个氨基酸的密码子进行了替换,共计72个位点,GC含量由45.61%调整到42.89%。优化后Intobin2基因编码的氨基酸中有17个氨基酸的密码子进行了替换,共计100个位点,GC含量由47.23%调整到43.71%。为防止Kex2对目的蛋白的降解,将Intobin1基因编码的氨基酸中的第138位的Arg突变为Lys,Intobin2基因编码的氨基酸中的第26、48位的Arg突变为Lys。3.优化后的基因克隆于分泌型表达载体pPIC9K,经PCR验证、测序鉴定表明重组载体 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2 已构建成功。4.利用电穿孔仪将线性化的表达载体pPIC9K/mIntobin1和pPIC9K/mIntobin2电转入毕赤酵母GS115中,获得了重组的转化子;通过不同G418浓度的YPD平板筛选,获得了高抗性转化子;MM和MD平板筛选结果表明转化子全为甲醇快速利用型（Mut+）;PCR 结果表明 pPIC9K/mIntobin1 和 pPIC9K/mIntobin2 已成功整合入GS115的基因组中;初步诱导表达的上清经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明重组蛋白mIntobin1和mIntobin2已获得表达,分子量约为35.0 kDa。5.优化 GS115/pPIC9K/mIntobin1 和 GS115/pPIC9K/mIntobin2 在毕赤酵母中的发酵条件,得到了最佳的诱导表达条件。GS115/pPIC9K/mIntobin1的最佳表达条件为:诱导时间为120 h、甲醇浓度为1%、温度为30℃、pH为6.0,添加褪黑素和抗坏血酸能提高mIntobin1蛋白在毕赤酵母中的表达;GS115/pPIC9K/mIntobin2的最佳表达条件为:诱导时间为96h、甲醇浓度为1%、温度为28℃、pH为6.0,添加抗氧化剂褪黑素和抗坏血酸可以提高mIntobin1在毕赤酵母中的表达。经Ni-NTA柱纯化,在分子量为35.0 kDa处得到了 mIntobin1和mIntobin2蛋白的单一条带。6.按优化后得到的最佳诱导条件进行诱导,结果表明优化后GS115/pPIC9K/mIntobin1 诱导的上清总蛋白含量为 265 μg/ml,GS115/pPIC9K/mInt-bin2诱导的上清总蛋白含量为225 μg/ml,与未优化时的初步表达相比,分别提高了 48.5%和47.3%。纯化后mIntobin1和mIntobin2蛋白的浓度分别为75μg/ml和60μg/ml,与未突变的Intobin1和Intobin2（纯化后）的含量相比无明显变化。Gel-Pro软件分析发现,纯化后mIntobin1的纯度达到80%,mIntobin2的纯度达到70%。7.对纯化后的mIntobin1和mIntobin2蛋白进行相关生物活性鉴定,结果表明mIntobin1和mIntobin2不具有酰胺水解活性和纤溶活性,但具有纤维蛋白原水解活性,mIntobin1从2 h起对牛纤维蛋白原的Aα和Bβ链有微弱的水解作用,将Aα和Bβ链降解成小的片段;而mIntobin2与牛纤维蛋白原保温30 min时,水解牛纤维蛋白原的Bβ链,将Bβ链降解成小的片段,并且随着保温时间的延长水解作用明显加强;但mIntobin1和mIntobin2对牛纤维蛋白原的γ链均没有水解作用。结论:本研究通过一系列实验方法,确立了有效表达mIntobin1和mIntobin2基因的体系,为mIntobin1和mIntobin2基因的深入研究奠定了一定的基础。
张翠[5]（2015）在《中介蝮蛇毒GI-PA1和Intobin2基因的毕赤酵母表达及生物活性研究》文中提出动静脉血栓、心肌梗死和脑梗死等血栓性疾病严重威胁着人类的健康,溶栓疗法被认为是治疗血栓性疾病最有效的方法。现在应用于临床的蛇毒溶栓剂主要为类凝血酶和纤溶酶。蛇毒纤溶酶原激活剂由于其半衰期长、选择性高,可专一性的将人Glu-纤溶酶原变为纤溶酶,使血栓溶解,也成为开发新型溶栓剂的一个方向。中介蝮蛇毒富含丝氨酸蛋白酶（蛇毒纤溶酶原激活剂和具有激肽释放活性的类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶）,在基础研究领域和医药领域具有重要价值。然而由于蛇毒资源有限,通过分离纯化难以量产,因此本研究以来自中介蝮毒腺cDNA文库的两个新型丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086为材料,采用毕赤酵母表达系统（GS115和SMD1168菌株）进行基因工程表达,获得表达产物,为后续研究和工业化生产中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶奠定基础。主要的研究内容如下:1.对中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086进行生物信息学分析,结果显示:SP20638基因包含一个777 bp的开放阅读框,编码258个氨基酸;该基因编码的氨基酸序列属于丝氨酸蛋白酶的PA亚型,是纤溶酶原激活剂;SP20638基因编码的蛋白1-18位氨基酸残基为信号肽,19-24位氨基酸残基为前肽（Propeptide）,25-258位氨基酸残基为成熟肽;N-糖基化位点为Asn44;形成的二硫键为 Cys31-Cys163,Cys55-Cys66,Cys98-Cys256,Cys142-Cys210,Cys174-Cys189 和 Cys200-Cys225;活性位点为 His65,Asp110 和 Ser204;成熟肽的分子量为25.4 KDa,理论等电点为5.30。SP46086基因包含一个783 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸;该基因编码的氨基酸序列属于丝氨酸蛋白酶的KN亚型,是具有激肽释放活性的类凝血酶;SP46086基因编码的蛋白1-18位氨基酸残基为信号肽,19-24位氨基酸残基为前肽（Propeptide）,25-260位氨基酸残基为成熟肽;N-糖基化位点为Asn123,Asn124;形成的二硫键为Cys31-Cys165,Cys52-Cys68,Cys100-Cys258,Cys144-Cys212,Cys176-Cys191 和 Cys202-Cys227;活性位点为His67,Asp112和Ser206;成熟肽的分子量为25.9 KDa,理论等电点为 8.44。2.对中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因SP20638和SP46086进行密码子优化,并将优化后的基因送上海生工生物工程有限公司合成。结果显示:密码子优化后的SP20638基因mRNA折叠最小自由能由△G=-237.20 kcal/mol提高到△G=-173.30 kcal/mol,共对15个氨基酸的密码子进行了替换,总计85个位点,G+C含量从52%降为39%,基因全长729 bp。密码子优化后的SP46086基因mRNA折叠最小自由能由AG=-224.20 kcal/mol提高到△G=-173.80 kcal/mol,有17个氨基酸的密码子进行了替换,共计99个位点,G+C含量从48%降为38%,基因全长735 bp。为了方便后续研究,将优化后的SP20638基因命名为GI-PA1,优化后的SP46086基因命名为Intobin2。3.用限制性内切酶SnaBI和Not I对优化后的基因和pPIC9K载体进行双酶切,连接,转入大肠杆菌Top10菌株,经PCR,双酶切和测序鉴定重组表达载体的构建情况。结果显示:重组表达载体pPIC9K/GI-PA1和pPIC9K/Intobin2构建成功。4.用限制性内切酶SacI将重组表达载体线性化,以电转化的方法（电转参数为1500 V,25 μF,200 Ω）转入毕赤酵母菌株（GI-PA1基因转入GS115菌株,Intobin2基因转入SMD1168菌株）,对阳性克隆用浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4 mg/mL的抗生素G418依次进行筛选,并对4 mg/mL的YPD平板上的克隆用MM和MD平板进行表型鉴定,最后用PCR鉴定阳性克隆。将鉴定正确的阳性克隆进行初步诱导表达和Western-blot鉴定,筛选出表达量最高的菌株作为诱导表达菌株。结果显示:线性化的pPIC9K/GI-PA1转入GS115菌株中,线性化的pPIC9K/Intobin2转入SMD1168菌株,在G418浓度为4 mg/mL的YPD平板上获得了 GS115转化子的5个高抗性转化子和SMD1168转化子的5个高抗性转化子（分别编号为1、2、3、4、5）,通过MM和MD平板以及PCR最终确定所获得的GS115和SMD1168高抗性转化子均为甲醇利用快速型表型。经过初步的发酵诱导和Western-blot鉴定,选择了表达量高的GS115转化子2号菌以及SMD1168转化子1号菌作为诱导表达菌株,并分别命名为GS115/GI-PA1和SMD1168/Intobin2。5.对诱导表达菌株进行发酵条件的单因素优化,所选择的参数为时间、pH、甲醇添加量、温度和抗氧化剂,所得数据用SPSS软件分析。结果显示:GS115/GI-PA1的最佳诱导条件为:时间96h,pH6,甲醇添加量为1.5%,温度为25 ℃,添加终浓度为10 mmol/L的抗坏血酸;SMD1168/Intobin2的最佳诱导条件为:时间96 h,pH 5,甲醇添加量为0.5%,温度为25 ℃,无需添加抗氧化剂。6.以最优的发酵条件进行大规模诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,并测定纯化蛋白的酰胺水解活性、纤溶活性、纤维蛋白原水解活性。结果显示:用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,rGI-PA1蛋白在35 KDa之下有一粗条带,rIntobin2蛋白在35 KDa处有一条较浅的条带。生物活性测定表明rGI-PA1和rIntobin2不能水解合成底物BApNA,不具有纤溶活性;rGI-PA1蛋白在2-3μg时就能降解牛纤维蛋白原的Aα链和Bβ链,在略小于Aα链的位置出现新的降解带,在略小于Bβ链的位置也出现了新的降解带,并且对Bβ链的降解能力大于Aα链,不降解牛纤维蛋白原的γ链;rIntobin2蛋白在1 μg时就开始降解牛纤维蛋白原的Aα链和Bβ链,在小于Bβ链的位置出现了新的降解带,并且对Bβ链的降解能力远远大于Aα链,不降解牛纤维蛋白原的Y链。结论:本研究成功在毕赤酵母菌株GS115和SMD1168中表达了中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶基因GI-PA1和Intobin2,获得了重组菌株GS115/GI-PA1和SMD1168/Intobin2,并证明rGI-PA1和rIntobin2重组蛋白具有纤维蛋白原水解活性。这些工作为中介蝮蛇毒丝氨酸蛋白酶的工业化生产和应用鉴定了基础,同时也对重组表达其他蛇毒蛋白酶具有一定的参考价值。
李曙[6]（2016）在《蝮蛇蛇毒蛋白C激活物的纯化鉴定及其抗心血管氧化应激损伤的作用机制》文中指出血管内皮细胞（Vein Endothelial Cell,VEC）能分泌和代谢多种血管活性物质,参与机体炎症和免疫反应,影响血管平滑肌细胞增殖及粒细胞和血小板对内皮细胞的黏附,维持机体内环境的稳态。血管内皮细胞结构和功能障碍是动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病发病的关键环节,保护VEC对防治心脑血管等疾病具有重要意义。造成血管内皮细胞损伤的因素是多方面的,其中氧化应激致内皮细胞损伤在多种因素中占有重要的地位。氧化应激诱导内外源性因素引起体内活性氧升高损伤内皮细胞的机制非常复杂,主要表现为导致细胞构成的生物分子脂质氧化损伤。近来有研究显示,氧化应激可以激活MAPK（丝裂原激活的蛋白酶）信号通路,诱导转录激活因子蛋白-1（activator protein-1,AP-1）活化,促使VEC释放细胞间黏附分子（ICAM-1）和E-选择素等粘附分子,导致白细胞自身或与VEC之间相互黏附,进而引发炎症反应损伤内皮细胞。从这些研究中得知,减轻氧化应激损伤、干预炎症反应,是保护血管内皮功能,防治心血管疾病的关键所在。蛇毒中富含酶、蛋白和多肽等具有重要药理活性的物质,是一种天然药用资源。随着蛋白组学和转录组学技术的发展,毒液中的大量成分已成功应用到心血管疾病的防治和临床实验诊断试剂。安徽南部山区毒蛇资源丰富,在过去几年内我们研究组主要以皖南产蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalina）蝮属（Agkistrodon）蛇毒为对象,从中分离、纯化一种蛋白C激活剂（Protein C Activator,PCA）组分。经初步验证,我们分离出的蛇毒PCA组分具有抑制血小板聚集功能。在心肌梗死、缺血再灌注、败血症等动物模型实验中也发现,蛇毒PCA可以有效改善氧化应激所致的脏器损伤,调节超氧化物歧化酶（SOD）活性、降低血小板活化因子（PAF）、内皮素-1（ET-1）、血管性假血友病因子（vWF）、丙二醛（MDA）含量。根据我们的上述结果结合其他课题组的研究成果,提示蛇毒PCA组分可能是保护VEC的优良生物蛋白。为了验证这一假设,本研究拟以蛇毒PCA为研究对象,建立H2O2诱导的内皮细胞损伤模型,论证蛇毒PCA抗氧化应激损伤的效应,及其对高糖诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化的干预路径,从PCA作用靶细胞和机体整体调节两个方面揭示PCA保护内皮细胞的生物学特性及其可能的分子机制,为蛇毒PCA应用于VEC保护提供理论基础。实验共分为三个部分,主要研究内容和结果如下:1、从皖南山区产蝮蛇毒粗毒中纯化制备出蛇毒血管活性肽PCA,初步鉴定其分子生物学特性:采用CelluLose DEAE-52,CM-SepHadex C-25离子交换柱及SepHadex G-75凝胶柱,以离子交换和凝胶过滤层析纯化蛇毒粗毒;通过联用酶联免疫吸附实验发色底物法和血小板聚集测试仪检测PCA的初步生物学特性;SDS-PAGE凝胶电泳检测PCA的纯度和相对分子量;质谱（LC-MS）鉴定蛋白质特性。结果显示:从皖南蝮蛇粗毒中经Cellu Lose DEAE-52阴离子交换层析分离纯化出7个层析峰,经血小板聚集实验筛选出IV峰具有显着抑制血小板聚集作用。再经CM-SepHadex C-25阳离子交换柱及SepHadex G-75凝胶柱层析得到AHV-PCA。经SDS-PAGE、LC-MS测定AHV-PCA为分子量约为31.0kDa、PI5.7、与去整合素有一定同源性的生物蛋白质。2、观察蛇毒PCA对H2O2诱导的内皮细胞损伤保护效应及可能机制:原代培养HUVEC,PCA（20,40,80μg/mL）预处理1h后,300μmol/mL H2O2诱导HUVECs损伤。AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,流式细胞术检测细胞内活性氧簇（ROS）水平,比色法检测细胞一氧化氮（NO）、白介素-1（IL-1）,Real-time PCR和western blotting检测细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及p38丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）mRNA和蛋白表达。结果显示:与模型组（300μmol/mL H2O2）相比,在三个浓度PCA（20,40,80μg/m L）预处理组的细胞存活率在43.9,64和80.6%;氧化应激水平（ROS）降至54.7,42.7和25.1%。此外,IL-1水平也降至的83.3、62.2和30.7%。NO含量增加了155.9,232.4和317.6%。凋亡率下降了59,47.7和32.7%。磷酸化p38-MAPK表达下调,而上调了eNOS表达。结果证明了PCA预处理1h后能明显减少H2O2诱导的HUVECs的凋亡,降低胞内P38-MAPK的表达及ROS、IL-1水平,上调eNOS的表达及NO水平。PCA对H2O2诱导的内皮细胞损伤具有一定的保护作用,其保护路径与PCA降低活性氧水平、下调P38-MAPK及上调eNOS的表达有关。3、明确蝮蛇蛇毒PCA成分对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠心肌纤维化抑制效应及可能的机制:高脂肪饮食喂养大鼠4周后再给予低剂量（30mg/kg）的STZ单次腹腔注射制备2型糖尿病动物模型。然后给予不同剂量的PCA处理大鼠10周。结果显示:与糖尿病对照组比较,PCA治疗各组大鼠的血糖、左心室重量指数（LVWI）,血清TGF-β1,IL-1β和胶原容积分数含量有不同程度降低,特别是在高剂量（8 mg/kg）组。实时定量PCR和Western blotting显示,PCA处理后心肌组织中MMP-2 mRNA及蛋白表达明显下降,同时保持了MMP-TIMP平衡。这些研究结果表明,皖南蝮蛇粗毒中纯化出的PCA蛋白多肽,具有明确的抗血小板聚集活性,能够在体内、外实验中发挥出抗心血管氧化应激损伤特性,潜在的功能提示其可成为治疗心血管疾病的天然药物资源。
赵宁宁[7]（2016）在《江浙短尾蝮蛇蛇毒解离素的克隆表达及活性鉴定》文中研究指明目的构建解离素（Disintegrin/DI）和人Ig G1抗体Fc段重组融合基因到p XC17.4/p CDAN3.1（+）表达载体,转染至293真核表达系统,表达并分泌解离素融合蛋白,获得重组解离素,为其生物活性测定、构效关系研究和临床应用奠定基础。方法1表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1（+）-MDF/DDF的构建1)模板合成目的基因（DI）:根据本课题组前期分离的天然江浙短尾蝮蛇蛇毒解离素测定的氨基酸序列合成其相应的c DNA序列并在此序列的3’端引入Ig G3Upper Hinge基因序列。Ig G1 Fc:根据NCBI上公布的人Ig G1 Fc基因序列合成其CH2CH3区域。2)引物设计根据两模板基因序列,设计扩增引物,另外设计一对引物,替换解离素c DNA 3’端的Ig G3 Upper Hinge为Ig G1 Hinge。3)融合基因MDF/DDF的获得PCR法扩增DI及Fc段,琼脂糖凝胶电泳回收后,Overlap PCR法将DI和Fc搭桥形成DI-Fc融合基因,从而形成两种类型的融合基因,即DI和Fc段之间为Ig G3 Upper Hinge和Ig G1 Hinge两种类型,我们将两类设计产生的融合基因分别相应称为MDF和DDF;TA克隆至T Vector p MD19（Simple）测序载体,Hind III/Eco RI双酶切和测序鉴定。4)重组表达载体的构建Hind III/Eco R I双酶切T-MDF/T-DDF获得MDF和DDF融合目的基因,克隆至相同两酶切得到的线性表达载体p XC17.4/p CDAN3.1（+）,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑取单克隆双酶切鉴定。2重组解离素的表达及纯化1)脂质体法Lipofectamine 2000预转染四个表达载体至293FT细胞。2)ELISA法测定293FT细胞培养上清中蛋白的表达量,确定最优表达载体。3)PEI法转染293FT细胞,ExpiFectamine293法转染Expi293F悬浮细胞,获得重组融合解离素,并比较两种转染方法蛋白表达量的差异。4)HiTrap MabSelect SuRe Protein A亲和层析纯化细胞培养上清得到重组解离素。3重组解离素纯度鉴定UPLC法检测纯化后得到的重组解离素的纯度及分子量。使用SEC液相色谱柱（4.6mm×150mm,1.7μm,Waters）;柱温:30℃;流动相:0.02 M PB+0.15 M Na Cl缓冲液;检测器:TUV检测器;进样量:10μl;流速:0.4m L·min-1;检测波长:280 nm的条件下,检测两融合蛋白的纯度。4重组解离素免疫原性及生物学活性测定1)还原和非还原条件下,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定重组蛋白分子量,Western blot中分别孵育抗人Ig G Fc抗体和抗蝮蛇毒血清,从两方面验证重组解离素的表达。2)ADP诱导的血小板聚集实验检测重组解离素的生物学活性。结果1表达载体的构建1)融合基因MDF/DDF DI基因片段扩增产物大小为349bp（358bp）,Fc基因扩增产物大小为644bp（661bp）;Overlap PCR将两片段搭桥后,获得MDF/DDF基因扩增产物大小分别为970bp和985bp;克隆至T载体,双酶切和测序鉴定,挑取正确克隆。2)重组表达载体构建重组载体连接成功挑取单克隆后,Hind III/Eco R I双酶有约1kb大小片段切出,从而成功构建重组表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1（+）-MDF/DDF。2重组解离素的表达、纯化及纯度鉴定1)重组解离素融合蛋白的表达各表达载体转染后细胞培养上清中均有融合蛋白表达,以p XC17.4为表达载体:MDF,DDF浓度分别为0.68mg/L,0.97mg/L;以p CDNA3.1为表达载体MDF,DDF的浓度分别为4.3 mg/L,2.3mg/L,因此初步确定用p CDAN3.1（+）-MDF/DDF表达载体批量转染293细胞,以获得重组解离素。2)重组解离素融合蛋白的纯化Hi Trap Mab Select Su Re Protein A亲和层析纯化293细胞培养上清,洗脱蛋白获得单个目标蛋白峰,PEI转染法蛋白产量约2mg/L,Expi Fectamine293F法蛋白产量约45mg/L。3)重组解离素的纯度鉴定UPLC结果显示两重组解离素的出峰时间均在大于180k Da位置,MDF中有少量小分子蛋白存在,表明纯化所得蛋白多聚体占主要部分。3重组解离素融合蛋白分子量、免疫原性及生物学活性测定1)重组解离素融合蛋白分子量和免疫原性鉴定在SDS-PAGE胶中,MDF存在理论条件下所设计的35k Da大小分子量的单体重组解离素,DDF也有少量二聚体融合蛋白,分子量约为70k Da,但MDF也有二聚体出现,且两种设计中多聚体的占绝大多数。Western Blot结果发现抗人Ig G Fc抗体和抗蝮蛇毒血清分别作为一抗孵育均有条带显出,而同型对照Ig G未有条带显出,表明纯化所得蛋白为既有能识别抗蛇毒血清的解离素和也有识别人Ig G抗体Fc段的融合蛋白。2)重组解离素融合蛋白对ADP诱导血小板聚集的影响所获得的重组解离素具有抑制ADP诱导的血小板聚集作用,其抑制效应与重组解离素的剂量成正比。从功能方面提示重组解离素具有天然解离素相似的抗血小板聚集的作用。结论应用基因重组的方法成功构建真核表达载体p XC17.4-MDF/DDF,p CDAN3.1（+）-MDF/DDF,转染293细胞成功表达并分泌出具有抑制ADP诱导的血小板聚集活性的重组解离素融合蛋白,为进一步研究解离素在抗血栓和抑制肿瘤细胞的粘附、迁移和血管生成等生物学功能奠定了基础。
李景传[8]（2015）在《重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定》文中提出神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）是神经营养因子中最早被发现的、且至今研究最为清楚的一种神经细胞生长调节因子,该因子具有营养神经元和促进突起生长等多种生物学功能。而且近年研究发现,NGF不仅局限于中枢以及周围神经系统,还在褥疮、角膜溃疡、青光眼,甚至在免疫性疾病的治疗中发挥着积极的作用。目前临床上应用最广泛的是鼠源性NGF,然而其生产方法和成品的缺点不容忽视,易引起过敏反应及诱发中和抗体反应;可能被病毒污染;工艺复杂,无法实现自动化,生产成本高,且成药价格高居不下,这引起我们的关注。另一方面,尽管研究者们尝试通过多种方法和从不同系统中利用重组药物技术生产重组人NGFβ亚基（rh-β-NGF）,但是采用原核表达系统或者与人类物种差异很大的昆虫系统,难以得到高生物学活性的重组NGF。即便采用真核表达系统,由于缺乏重组载体构建的完备性,导致生产效率相对低下。因此,我们尝试构建一种高效稳定的重组人NGF真核表达载体,通过增加一些转录及翻译调控元件、更换信号肽序列,并检测人NGF的表达水平并鉴定其生物学活性,为大规模生产NGF奠定基础。1、成功建立高效、稳定的重组人NGF的真核表达系统及纯化其表达产物首先,构建重组质粒p CMV-β-NGF-IRES-dhfr,由5部分组成,包括CMV启动子、β球蛋白基因内含子、人β-NGF基因、内部核糖体进入位点序列（IRES）和筛选标记基因（Dihydrofolate Reductase,dhfr）。然后将重组质粒转染至HEK293细胞系,用MTX筛选和有限稀释法进行克隆选择,获得高效表达rh NGF的单克隆重组细胞株。结果显示,重组细胞在形态上与普通HEK293细胞相同,生长方式、速度和凋亡率与重组前相似,两者无明显不同。随后逐步降低血清培养,最终使细胞株完全适应无血清培养基,并稳定表达rh NGF（即rh-β-NGF,本文中rh NGF均指rh-β-NGF）。利用SDS-PAGE分析表达产物,可见相对分子质量约13 k Da的条带,纯度大于50%,经质谱法测定得到其肽图谱与理论序列完全匹配,接着我们利用SP Sepharose FF强阳离子层析柱纯化rh NGF,得到rh NGF蛋白纯度>95%;最后进行重组细胞株表达效率和表达稳定性检测,结果表明重组细胞株经历60次传代后仍能稳定生长,并高效表达rh NGF,分泌效率为50-100 mg/L培养基上清,约为20-50 pg/（cell?d）。2、重组人NGF经初步鉴定发现具有多方面活性良好生物学活性的rh NGF才具临床药用价值,因此我们通过分析rh NGF对PC12细胞分化、鸡胚背根神经节细胞和小鼠鼠颈上神经节生长的影响,以及经rh NGF处理后小鼠体内一系列指标的变化,来鉴定其生物学活性。大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞（PC12细胞）系,是一类具有神经内分泌特性的细胞系,培养简单,传代方便,因而被广泛应用于神经药理和神经生理学相关领域研究[1,2],诱导PC12细胞分化是检测NGF生物学活性的经典方法。我们常规培养PC12细胞,至其生长至90%单层时,按终浓度5μg/m L加入鼠源性神经生长因子（m NGF）和rh NGF,并以PBS做阴性对照,结果发现rh NGF组较阴性对照组能生长出更多纤维状突起,说明重组细胞株所分泌的rh NGF具有诱导PC12细胞分化的生物学活性活性。鸡胚背根神经节（Dorsal Root Ganglia,DRG）细胞增殖实验是检测神经营养物质的主要方法,也是鉴定NGF生物学活性的常用实验。我们解剖出8 d龄鸡胚的DRG,放置培养皿中培养,待神经节细胞贴壁生长,换入新鲜培养液,加入PBS、m NGF、rh NGF,观察细胞生长情况。24 h各组均有细胞迁出,而48 h后rh NGF组更多细胞的迁出,并形成类神经突起,m NGF组同样也有明显改变,迁出细胞长势良好,而在PBS组中DRG细胞生长明显杂乱无序,且可见凋亡现象。这些结果表明m NGF、rh NGF有神经元营养和促神经细胞生长的作用。进一步检测rhNGF对新生小鼠皮肤Trk A表达水平,以及颈上神经节生长的影响,分析其生物学活性。通过颈部皮肤注射rh NGF,利用Western Blot法检测新生小鼠颈部皮肤Trk A表达量。结果发现,rh NGF与m NGF均能够明显升高小鼠颈部皮肤Trk A表达量,且效果相似。同时,双侧颈部皮肤Trk A表达水平均出现升高,但没有统计学差异,提示rh NGF不仅在注射部位发挥作用,也能够上调远离注射部位皮肤的Trk A,因此rhNGF能够在全身发挥作用。肥大细胞可分泌神经生长因子,后者与肥大细胞膜上NGF受体Trk A结合,通过第二信使Ca2+诱导肥大细胞自身活化并脱颗粒,释放一些炎性介质和组胺等作用于神经末梢促使后者释放神经递质[4,5]。我们通过分析经药物处理后新生鼠皮肤组织的肥大细胞形态,发现rh NGF和m NGF处理的两组,肥大细胞聚集并且脱颗粒,说明rh NGF能与肥大细胞膜上特异受体结合并发挥作用。进一步解剖分离出各组新生鼠颈上神经节（Superior Cervical Ganglia,SCG）,于显微镜下测定SCG短径a和长径b,采用1/2×a×a×b的方法计算SCG体积,进行统计学分析。结果发现,注射rh NGF组和m NGF组的SCG对比阴性对照组体积明显增大。分析双侧SCG体积,发现注射rh NGF和m NGF能够同时增加新生鼠双侧SCG体积。通过HE染色对小鼠SCG进行组织学分析,发现两NGF组SCG神经元较之PBS组呈肥大生长且数量增多。综合以上结果,我们建立的细胞株能高效稳定表达rh NGF,并且在体外和体内均具有类似于药用m NGF同样的活性。本研究为rh NGF的临床应用提供研究材料和实验数据。
张雷[9]（2014）在《尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶AaHⅣ及其结构域免疫效果评价》文中研究说明一、研究背景抗蛇毒血清是世界卫生组织推荐的治疗毒蛇咬伤的唯一特效药物。从世界范围内看，目前抗蛇毒血清仍然是通过免疫马或羊等动物来获得。然而，蛇毒是一种复杂的蛋白质、多肽混合物，其中部分具有很强抗原性的毒素，却没有或只有很弱的免疫原性；部分具有很强免疫原性的毒素，却没有或只有很弱的抗原性。毒素抗原性和免疫原性的分离，使得目前使用全蛇毒免疫制备的抗蛇毒血清中还存在没有保护性效价的免疫球蛋白，进一步加重了异源动物蛋白造成了过敏性休克、血清病等严重不良反应的发生。理想的免疫原应该是仅仅包含能够刺激动物产生有效保护性抗体的致病毒素。尖吻蝮蛇是一种广泛分布于我国南方地区的蝰科类毒蛇。其毒性强，毒液量大，受伤患者病情进展快、并发症多、预后差，往往面临截肢或死亡的威胁，是临床治疗中的一大难题。蛇毒金属蛋白酶（snake venom metalloproteinases SVMPs）目前被认为是尖吻蝮蛇等蝰科类毒蛇毒液中含量最丰富、出血活性最强的致病毒素。AaHⅣ是来源于尖吻蝮蛇毒的出血性P-Ⅲ型SVMPs，具有完整的金属蛋白酶结构域（催化结构域）、类去整合素结构域和富含半胱氨酸结构域（非催化结构域），具有明显的出血活性和抑制血小板聚集活性。二、目的和方法为了减少免疫毒素的种类、优化免疫原结构、减少不良反应发生率，我们：1)使用亲和层析和疏水层析等方法，从尖吻蝮蛇粗毒中纯化出天然出血性P-Ⅲ型SVMPsAaHⅣ，并将其作为免疫原，同佐剂一起皮下注射免疫小鼠，3轮免疫后通过间接ELISA法检测抗体效价，确定其是否具有免疫原性；同时，比较使用AaHⅣ免疫小鼠与全蛇毒免疫小鼠产生的抗血清对全蛇毒攻毒的小鼠保护性差异；2)在前部分实验的基础上，采用基因工程技术分别合成AaHⅣ催化结构域和非催化结构域cDNA，并分别重组在pET28a（+）质粒上表，通过工程菌E.coli BL21（DE3）诱导表达；表达产物经Ni2+-NTA亲和层析法进行纯化，并分别使用AaHⅣ、催化结构域片段、非催化结构域片段、PBS免疫小鼠，3轮免疫后通过间接ELLISA法检测其是否具有免疫原型；同时，比较使用AaHⅣ催化结构域片段、非催化结构域片段免疫小鼠与使用AaHⅣ免疫小鼠产生的抗血清对AaHⅣ攻毒的小鼠保护性差异。三、结果1、天然AaHⅣ蛋白纯化经过离子亲和层析和疏水层析，以及脱盐等步骤，成功从江西产尖吻蝮蛇粗毒中纯化到出血性P-Ⅲ型SVMPAaHⅣ蛋白，皮下注射昆明小鼠证明其具有出血活性，并通过BLISS法测定其LD50为10.07μg/g。2、AaHⅣ催化结构域和非催化结构域表达及纯化根据Genebank中查询到的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域mRNA序列，进行密码子最优化后，通过基因合成的方法分别获得AaHⅣ催化结构域和非催化结构域cDNA，并重组在pET28a（+）表达质粒上。经CaCl2法转入工程菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导分别表达出AaHⅣ催化结构域片段和非催化结构域片段。AaHⅣ催化结构域片段表达形式为包涵体，经8mol/L尿素溶液溶解，采用His标签纯化，脱盐后得到AaHⅣ催化结构域片段；AaHⅣ非催化结构域片段表达形式为可溶蛋白，表达产物经Ni2+-NTA亲和层析法纯化，脱盐后得到AaHⅣ非催化结构域片段。3、抗体效价分别使用同批次江西产尖吻蝮蛇毒、AaHⅣ蛋白、AaHⅣ催化结构域片段、AaHⅣ非催化结构域片段、PBS，对昆明小鼠进行腹股沟皮下免疫，首轮免疫使用完全弗氏佐剂，后两轮免疫使用不完全弗氏佐剂。3轮免疫后1周通过尾静脉采血，间接ELISA法提示尖吻蝮蛇毒免疫组、AaHⅣ免疫组、AaHⅣ催化结构域片段免疫组、AaHⅣ非催化结构域片段免疫组小鼠均能产生高效价IgG抗体。4、出血抑制实验小鼠3轮免疫后摘眼球取血，分离血清，将尖吻蝮蛇毒免疫组、AaHⅣ免疫组和PBS免疫组抗血清分别与尖吻蝮蛇毒混合（5μl：1μg），37℃孵育1小时后注射未免疫小鼠背部皮肤皮下。24小时后测量小鼠皮下出血面积（n=6）：AaHIV免疫组为（44.83±19.48）mm2，尖吻蝮蛇毒免疫组为（1.50±3.67）mm2，PBS组为（134.83±21.97）mm2。经one way-ANOVA方法进行统计学分析，AaHⅣ免疫组和尖吻蝮蛇毒免疫组皮下出血面积之间有统计学差异（P＜0.001），而AaHⅣ免疫组与PBS组之间皮下出血面积也有统计学差异（P=0.001）。小鼠3轮免疫后摘眼球取血，分离血清，将AaHⅣ免疫组、催化结构域免疫组、非催化结构域免疫组和PBS免疫组抗血清分别与新鲜纯化的AaHⅣ混合（5μl：1μg），37℃孵育1小时后注射未免疫小鼠背部皮肤皮下。24小时后测量小鼠皮下出血面积（n=6）：AaHⅣ免疫组为（2.83±4.92）mm2，催化结构域免疫组为（5.67±6.74）mm2，非催化结构域免疫组为（16.50±11.04）mm2，PBS组为（52.50±16.94）mm2。经oneway-ANOVA统计学分析，AaHⅣ免疫组、催化结构域免疫组、非催化结构域免疫组均较PBS组显着减少出血面积（P＜0.001）；AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异（P＞0.05），而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异（P＜0.05）；5、攻毒实验新鲜配置的尖吻蝮蛇毒溶液2LD50剂量采用腹腔注射的方法对尖吻蝮蛇毒组小鼠、AaHⅣ组小鼠和PBS组小鼠进行攻毒。24小时后AaHⅣ免疫组死亡3只，尖吻蝮蛇毒免疫组死亡1只，PBS组全部死亡（n=10）。Fisher’s Exact test方法统计分析提示，尖吻蝮蛇毒免疫组和AaHⅣ免疫组小鼠死亡率没有统计学差异（p=0.58）。尖吻蝮蛇毒免疫组和AaHⅣ免疫组小鼠均与PBS组之间存在统计学差异（p＜0.01）。新鲜纯化的AaHⅣ蛋白2LD50剂量采用腹腔注射的方法对AaHⅣ、AaHⅣ催化结构域片段和非催化结构域片段和PBS组小鼠进行攻毒。24小时后AaHⅣ免疫组存活9只，催化结构域片段免疫组存活8只，非催化结构域片段免疫组存活2只，PBS组存活0只（n=10）。AaHⅣ免疫组和催化结构域片段免疫组小鼠死亡率无统计学差异（P＞0.05）。催化结构域片段免疫组和非催化结构域片段免疫组之间（p＜0.05），非催化结构域片段免疫组与AaHⅣ免疫组之间（P＜0.001）均存在统计学差异。四、结论①AaHⅣ具有免疫原性和抗原性，其免疫小鼠产生的抗体能够具备对尖吻蝮蛇粗毒的中和活性，可以作为制备抗蛇毒血清的备选免疫原。②AaHⅣ催化结构域片段在P-Ⅳ型SVMPs致病机制中具有重要作用，显示出明确的免疫原性和抗原性，其抗血清能够对小鼠产生与抗AaHⅣ血清一样的中和保护性，可以作为进一步优化免疫原结构的组成部分。
郭亚[10]（2014）在《中药光敏剂激活蛇毒多肽的脑透过性及其镇痛机理研究》文中指出蛇毒神经毒素，具有很高的生物活性和良好的中枢作用，是研究神经系统中神经递质的产生及其传递过程分子机制的重要探针，但是神经毒素是中药大分子，无法透过血脑屏障，无法通过外周给药达到预期的效果。因此无创伤性改变中枢作用药物的透过性具有重要的临床价值和现实意义。广东地处华南，具丰富的蛇类资源，其蛇毒的产量高。蛇毒镇痛多肽的研究将为镇痛药物开辟新资源，促进广东中医药事业的发展。本实验以中华眼镜蛇粗毒为原料，分离纯化获得神经毒素，探讨在中药光敏剂脱镁叶绿酸a的介导下血脑屏障开放促进药物的吸收作用，以促进神经毒素进入中枢，研究其透过和分布规律，并探讨其镇痛作用机理。主要方法和结果如下：（1）采用丙酮法从中药蚕砂中提取脱镁叶绿酸a，此法操作简单，成本低，提取率高，产物纯度高。提取工艺为：通过丙酮浸提，浓缩后经乙醚转溶，再用30%盐酸使叶绿素脱镁并盐酸化而分离，调节pH至2.53.0可使脱镁叶绿酸a沉淀而出。提取率为0.66%，纯度为97.9%。（2）采用CM-Agrose离子交换色谱和Sephadex G-50、 Sephadex G-25凝胶过滤色谱对中华眼镜蛇毒进行分离纯化，收集色谱峰，冷冻干燥。通过毒性试验确定纯化产物为神经毒素（CNT），提取率为3.51%。采用SDS-PAGE法测定纯化产物的分子质量为7989Da。用醋酸扭体法和热板法考察CNT的镇痛活性，结果表明CNT具有镇痛效果，CNT和脱镁叶绿酸a光照组具有更好的镇痛效果。（3）本实验通过使君子酸兴奋毒性损伤ESCI模型为中枢痛动物模型，通过脱镁叶绿酸a与CNT络合，腹腔注射，借助于脱镁叶绿酸a的光敏作用，在弱激光照射下，研究不同脑区的ROS的变化情况。结果表明神经毒素降低了大鼠大脑各组织ROS含量，光激发脱镁叶绿酸a促进了蛇毒神经毒素对大脑的作用效果。（4）本实验通过色谱法从中华眼镜蛇毒中分离纯化得到了神经毒素，具有显着镇痛作用；通过大鼠兴奋毒性脊髓损伤（ESCI）模型实验，证实了光激发脱镁叶绿酸a促进了神经毒素的脑透过性和对大脑中枢的镇痛作用；其镇痛机制与活性氧（ROS）有关。
二、三类抗蝮蛇毒血清的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三类抗蝮蛇毒血清的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较研究（论文提纲范文）
（2）我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗平颏海蛇毒血清的制备及抗毒效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛇毒中活性组分的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 磷脂酶研究 |
| 1.1.1 磷脂酶 A_1 |
| 1.1.2 磷脂酶 A_2 |
| 1.1.3 磷脂酶C |
| 1.1.4 磷脂酶D |
| 1.2 磷脂酶的固定化 |
| 1.2.1 磷脂酶A_1的固定化 |
| 1.2.2 磷脂酶A_2的固定化 |
| 1.2.3 磷脂酶C的固定化 |
| 1.2.4 磷脂酶D的固定化 |
| 1.3 酶法脱胶 |
| 1.3.1 磷脂酶A_1脱胶的研究 |
| 1.3.2 磷脂酶A_2脱胶的研究 |
| 1.3.3 磷脂酶C脱胶的研究 |
| 1.4 研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.4 论文的技术框架线路图 |
| 第二章 大孔树脂固定化磷脂酶C的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 大孔树脂的筛选 |
| 2.2.4 载体的预处理 |
| 2.2.5 固定化酶的制备 |
| 2.2.6 载体蛋白吸附量的测定 |
| 2.2.7 固定化磷脂酶活力的测定 |
| 2.2.8 相对酶活的测定 |
| 2.2.9 磷脂酶C最优固定化条件的确定 |
| 2.2.10 固定化酶贮藏稳定性的研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化载体的选择 |
| 2.3.2 磷脂酶C最佳固定化条件的确定 |
| 2.3.3 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 2.3.4 固定化酶贮藏稳定性的研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 磁性Fe_3O_4 纳米粒子固定化磷脂酶A1的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 固定化磷脂酶A_1流程图 |
| 3.2.4 Fe_3O_4-SiO_2 磁性复合载体的制备 |
| 3.2.5 磷脂酶A_1的固定化 |
| 3.2.6 固定化载体的表征 |
| 3.2.7 固定化磷脂酶A_1酶活力的测定 |
| 3.2.8 酶活回收率和蛋白固载率的计算 |
| 3.2.9 磷脂酶A_1最优固定化条件的确定 |
| 3.2.10 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 3.2.11 操作稳定性 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 磷脂酶A1固定化单因素试验 |
| 3.3.2 响应面试验结果与分析 |
| 3.3.3 磁性固定化磷脂酶A1的表征分析 |
| 3.3.4 固定化磷脂酶的酶学特性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A_1联合脱胶的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 固定化磷脂酶A_1和固定化磷脂酶C联合脱胶工艺流程 |
| 4.2.4 固定化酶法联合脱胶 |
| 4.2.5 磷含量的标准曲线 |
| 4.2.6 固定化磷脂酶C脱胶条件的确定 |
| 4.2.7 固定化磷脂酶A_1脱胶条件的确定 |
| 4.2.8 不同脱胶工艺的对比 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 固定化磷脂酶C脱胶条件的确定 |
| 4.3.2 固定化磷脂酶A_1脱胶条件的确定 |
| 4.3.3 不同脱胶工艺的对比 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（4）中介蝮蛇毒中Intobin1和Intobin2基因Kex2位点突变体在毕赤酵母中的表达及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| AbsTract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.2 蛇毒类凝血酶概述 |
| 1.2.1 SVTLEs的结构 |
| 1.2.2 SVTLEs的理化性质 |
| 1.2.3 SVTLEs的药理学作用 |
| 1.2.4 SVTLEs的作用机制 |
| 1.2.5 SVTLEs的应用 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的基本体系 |
| 1.3.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 1.4 基因工程技术重组表达SVTLEs |
| 1.4.1 SVTLEs的原核表达 |
| 1.4.2 SVTLEs的真核表达 |
| 1.5 本文的选题依据及研究内容 |
| 第2章 基因序列的生物信息学分析及密码子优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 毕赤酵母密码子偏爱性分析 |
| 2.2.3 密码子优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 基因及氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 氨基酸序列同源性分析 |
| 2.3.3 毕赤酵母密码子偏爱性分析结果 |
| 2.3.4 密码子优化结果 |
| 第3章 真核表达载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株及载体 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的基因与引物的合成 |
| 3.2.2 目的基因mIntobin1和mIntobin2的获得 |
| 3.2.3 pPIC9K载体的获得 |
| 3.2.4 目的基因与表达载体双酶切 |
| 3.2.5 目的基因与载体连接 |
| 3.2.6 TOP10感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 重组质粒的转化 |
| 3.2.8 质粒DNA的提取 |
| 3.2.9 重组载体的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 pPIC9K载体双酶切 |
| 3.3.3 重组载体的鉴定 |
| 第4章 重组载体电转化入毕赤酵母及高抗性转化子的筛选及阳性克隆的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌种和载体 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组载体线性化 |
| 4.2.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 |
| 4.2.3 重组质粒的电转化 |
| 4.2.4 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 4.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.6 目的蛋白的初步诱导表达 |
| 4.2.7 SDS-PAGE初步检测目的蛋白 |
| 4.2.8 目的蛋白的WesteRN-blot鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组载体线性化 |
| 4.3.2 重组载体电转入GS115 |
| 4.3.3 高抗性转化子的筛选 |
| 4.3.4 高抗性转化子整型鉴定 |
| 4.3.5 高抗性转化子基因组DNA的鉴定 |
| 4.3.6 SDS-PAGE初步鉴定目的蛋白 |
| 4.3.7 WesteRN-blot鉴定 |
| 第5章 重组蛋白发酵条件优化及其纯化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 5.2.2 发酵条件的优化 |
| 5.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 5.2.4 目的蛋白的定量分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 5.3.2 发酵条件优化 |
| 5.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 5.3.4 目的蛋白的定量分析 |
| 第6章 重组蛋白的生物学活性检测 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验仪器 |
| 6.3 实验试剂 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.4.1 酰胺水解活性的测定 |
| 6.4.2 纤溶活性测定 |
| 6.4.3 纤维蛋白原水解活性测定 |
| 6.5 结果 |
| 6.5.1 酰胺水解活性的测定 |
| 6.5.2 纤溶活性测定 |
| 6.5.3 纤维蛋白原水解活性的测定 |
| 第7章 讨论 |
| 7.1 密码子优化 |
| 7.2 mIntobin1/ mIntobin2在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 7.3 发酵条件优化及纯化情况 |
| 7.4 相关活性的探讨 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（5）中介蝮蛇毒GI-PA1和Intobin2基因的毕赤酵母表达及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.2 蛇毒纤溶酶原激活剂概述 |
| 1.2.1 SV-PA的分子结构 |
| 1.2.2 SV-PA的理化性质 |
| 1.2.3 SV-PA的酶学性质 |
| 1.2.4 SV-PA的作用机制 |
| 1.3 蛇毒类凝血酶概述 |
| 1.3.1 SVTLE的分子结构 |
| 1.3.2 SVTLE的理化性质 |
| 1.3.3 SVTLE的作用机制 |
| 1.3.4 SVTLE的生物活性 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统概述 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统的组成 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统前景 |
| 1.5 蛇毒蛋白糖基化与毕赤酵母表达外源蛋白糖基化比较 |
| 1.5.1 蛋白质糖基化简介 |
| 1.5.2 蛇毒糖蛋白 |
| 1.5.3 毕赤酵母表达外源蛋白的糖基化 |
| 1.5.4 毕赤酵母糖基化改造 |
| 1.6 蛇毒纤溶酶原激活剂和类凝血酶的异源表达 |
| 1.6.1 SV-PA的异源表达 |
| 1.6.2 SVTLE的异源表达 |
| 1.7 选题依据及实验技术路线 |
| 第2章 生物信息学分析及密码子优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 密码子优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 密码子优化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 生物信息学分析 |
| 2.4.2 密码子优化 |
| 第3章 真核表达载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体和菌株 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 目的基因的获得 |
| 3.2.3 pPIC9K载体的获得 |
| 3.2.4 目的基因和pPIC9K载体的双酶切 |
| 3.2.5 目的基因和载体的连接 |
| 3.2.6 TOP10感受态的制备 |
| 3.2.7 转化 |
| 3.2.8 重组载体的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 GI-PA1和Intobin2基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 pPIC9K载体的双酶切结果 |
| 3.3.3 重组载体的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 重组载体电转化毕赤酵母及阳性转化子的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 培养基配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组载体的线性化 |
| 4.2.2 酵母感受态的制备 |
| 4.2.3 电转化毕赤酵母 |
| 4.2.4 毕赤酵母转化子的筛选 |
| 4.2.5 转化子的鉴定 |
| 4.2.6 重组蛋白的初步诱导及Western-blot鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 重组载体的线性化结果 |
| 4.3.2 毕赤酵母的电转化 |
| 4.3.3 毕赤酵母转化子的筛选 |
| 4.3.4 酵母基因组PCR |
| 4.3.5 重组蛋白的初步诱导 |
| 4.3.6 重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 重组菌的摇瓶水平发酵条件优化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 蛋白浓度的测定 |
| 5.2.2 时间优化 |
| 5.2.3 pH优化 |
| 5.2.4 甲醇添加量优化 |
| 5.2.5 温度优化 |
| 5.2.6 添加抗氧化剂 |
| 5.2.7 数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 蛋白浓度标准曲线的绘制 |
| 5.3.2 时间优化结果 |
| 5.3.3 pH优化 |
| 5.3.4 甲醇添加量 |
| 5.3.5 温度优化 |
| 5.3.6 添加抗氧化剂 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 重组蛋白的纯化及生物活性鉴定 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 目标蛋白的纯化 |
| 6.3.2 生物活性测定 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（6）蝮蛇蛇毒蛋白C激活物的纯化鉴定及其抗心血管氧化应激损伤的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写表(Abbreviations) |
| 第一章 前言 |
| 第二章 蝮蛇毒PCA的分离纯化及初步生物学特性鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验标本 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 AKTAprime蛋白质纯化系统分离纯化 |
| 2.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳 |
| 2.3 发色底物法(Chromogenic Substrate Assay) |
| 2.4 血小板聚集率的测定 |
| 结果 |
| 1.1 蝮蛇毒PCA的分离纯化 |
| 1.2 AHV-PCA经SDS-PAGE电泳结果 |
| 1.3 AHV-PCA经LC-MS鉴定结果 |
| 讨论 |
| 第三章 蝮蛇毒PCA对H_2O_2诱导的内皮细胞损伤保护效应及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 人脐静脉内皮细胞 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 人脐静脉内皮细胞体外培养 |
| 2.2 实验设计与分组 |
| 2.3 CCK-8法测定细胞增殖活力 |
| 2.4 AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡 |
| 2.5 流式检测细胞内ROS |
| 2.6 IL-1和NO水平检测 |
| 2.7 Rea-l time PCR检测P38-MAPK和eNOSmRNA的表达 |
| 2.8 蛋白免疫印迹检测P38-MAPK及eNOS蛋白表达 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 PCA对血管内皮细胞形态的影响 |
| 2 CCK-8药物敏感性实验 |
| 3 流式细胞仪检测内皮细胞凋亡 |
| 4 PCA对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞ROS水平的影响 |
| 5 PCA对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞IL-1表达的影响 |
| 6 PCA对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞p38-MAPK、eNOS表达和NO水平的影响 |
| 讨论 |
| 第四章 蝮蛇毒PCA对糖尿病大鼠心肌纤维化的抑制效应及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖尿病大鼠模型制备与分组 |
| 2.2 样品采集 |
| 2.3 心肌标本处理 |
| 2.4 病理形态学观察 |
| 2.5 酶联免疫（ELISA）法TGF-β1及IL-1β的含量 |
| 2.6 实时定量（Q-PCR）检测MMP-2和TIMP-2mRNA表达 |
| 2.7 Western blotting检测MMP-2和TIMP-2蛋白表达水平 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 各组大鼠空腹血糖（FBG）、体重、左心室重量指数的改变 |
| 2 各组大鼠TGF-β1、IL-1β含量变化 |
| 3 各组大鼠心肌形态病理学改变 |
| 4 PCA对大鼠心肌组织胶原纤维的影响 |
| 5 PCA对大鼠心肌MMP-2、TIMP-2 mRNA、蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 主要研究结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 第六章 综述 蛇毒有效成分的药理研究进展及其临床应用 |
| 1 蛇毒成分的构成 |
| 1.1 蛇毒酶 |
| 1.2 生长因子 |
| 1.3 神经毒性多肽 |
| 1.4 膜活性多肽 |
| 1.5 蛇毒去整合蛋白 |
| 2 蛇毒的临床应用研究 |
| 2.1 防治心血管疾病治疗（抗凝、止血、降压） |
| 2.2 抗炎、镇痛，免疫调节 |
| 2.3 抗肿瘤治疗 |
| 3 蛇毒的开发前景 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附：博士在读期间发表论文及获奖情况 |
（7）江浙短尾蝮蛇蛇毒解离素的克隆表达及活性鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蛇毒解离素概述及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表 |
（8）重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 神经生长因子的临床应用 |
| 2 神经生长因子的生产方法 |
| 第一部分 重组人神经生长因子真核表达系统的建立 |
| 引言 |
| 1 主要材料、试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 重组人神经生长因子的活性鉴定 |
| 引言 |
| 1 主要材料、试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶AaHⅣ及其结构域免疫效果评价（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 第二章 尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶 AaHⅣ免疫效果评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶 AaHⅣ催化结构域、非催化结构域免疫效果评价 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）中药光敏剂激活蛇毒多肽的脑透过性及其镇痛机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛇毒神经毒素的分离、性质及其作用机制 |
| 1.1.1 蛇毒神经毒素的发现 |
| 1.1.2 蛇毒神经毒素的分离纯化 |
| 1.1.3 神经毒素的分类和结构特点 |
| 1.1.4 神经毒素对突触的作用 |
| 1.1.5 神经毒素镇痛特点 |
| 1.1.6 神经毒素镇痛机制 |
| 1.2 血脑屏障（BBB） |
| 1.3 光敏剂的种类、性质及其作用机制 |
| 1.3.1 光动力疗法 |
| 1.3.2 光敏剂的发展 |
| 1.3.3 光敏剂的作用机制 |
| 1.3.4 光敏剂单线态氧的测定 |
| 1.4 本论文研究的目的意义，创新点及其主要内容 |
| 1.4.1 本论文研究的目的意义 |
| 1.4.2 本实验的创新之处 |
| 1.4.3 本实验研究的主要内容 |
| 第二章 脱镁叶绿酸 a 的制备和光谱特性 |
| 2.1 主要的原料和试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 脱镁叶绿酸 a 的制备原理 |
| 2.4 脱镁叶绿酸 a 的制备 |
| 2.5 脱镁叶绿酸 a 的含量及光谱测定 |
| 2.5.1 含量测定 |
| 2.5.2 紫外和荧光光谱测定 |
| 2.6 结果与分析 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 中华眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化及其理化性质的测定 |
| 3.1 药品，试剂及主要溶液配制 |
| 3.2 主要实验仪器 |
| 3.3 中华眼睛蛇蛇毒神经毒素的分离纯化 |
| 3.3.1 CM-Agrose 阳离子交换层析 |
| 3.3.2 Sephadex G-50 凝胶过滤层析法 |
| 3.3.3 Sephadex G-25 凝胶过滤层析法 |
| 3.4 理化性质的测定 |
| 3.4.1 毒性试验 |
| 3.4.2 分子量的测定 |
| 3.4.3 蛋白含量测定 |
| 3.4.4 紫外光谱扫描 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 脱镁叶绿酸 a 光动力条件研究 |
| 4.1 药品和主要试剂 |
| 4.2 实验仪器 |
| 4.3 测定方法和原理 |
| 4.4 脱镁叶绿酸 a 最佳浓度的确定 |
| 4.5 脱镁叶绿酸 a 最佳光照时间的确定 |
| 4.6 结果与讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 光动力对蛇毒神经毒素的镇痛活性影响 |
| 5.1 动物、药品和试剂 |
| 5.2 小鼠 LD_(50)的测定 |
| 5.3 小鼠热板法镇痛实验 |
| 5.4 小鼠醋酸扭体法镇痛实验 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 脱镁叶绿酸 a 介导神经毒素镇痛机制研究 |
| 6.1 药品试剂和动物 |
| 6.2 主要实验仪器 |
| 6.3 实验准备 |
| 6.4 兴奋毒性脊髓损伤(ESCI)模型的建立 |
| 6.5 ROS 的测定 |
| 6.6 结果与分析 |
| 6.7 镇痛机理的提出 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、三类抗蝮蛇毒血清的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较研究（论文参考文献）
- [1]青环海蛇蛇毒组分的多组学分析及抗体制备[D]. 李佳欣. 南京师范大学, 2021
- [2]我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选[D]. 王博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用[D]. 李进红. 合肥工业大学, 2019(01)
- [4]中介蝮蛇毒中Intobin1和Intobin2基因Kex2位点突变体在毕赤酵母中的表达及生物活性研究[D]. 郭积芳. 陕西师范大学, 2015(04)
- [5]中介蝮蛇毒GI-PA1和Intobin2基因的毕赤酵母表达及生物活性研究[D]. 张翠. 陕西师范大学, 2015(04)
- [6]蝮蛇蛇毒蛋白C激活物的纯化鉴定及其抗心血管氧化应激损伤的作用机制[D]. 李曙. 安徽师范大学, 2016(06)
- [7]江浙短尾蝮蛇蛇毒解离素的克隆表达及活性鉴定[D]. 赵宁宁. 福建医科大学, 2016(07)
- [8]重组人神经生长因子的真核表达及初步活性鉴定[D]. 李景传. 第四军医大学, 2015(02)
- [9]尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶AaHⅣ及其结构域免疫效果评价[D]. 张雷. 第三军医大学, 2014(02)
- [10]中药光敏剂激活蛇毒多肽的脑透过性及其镇痛机理研究[D]. 郭亚. 华南理工大学, 2014(02)