一、高浓度葡萄糖对兔十二指肠自律性的影响（论文文献综述）
ChineseHeartFailureAssociationofChineseMedicalDoctorAssociation;NationalExpertCommitteeonCardiovascularDiseasesandProfessionalCommitteeonHeartFailure;EditorialBoardofChineseJournarofHeartFailureandCardiomyopathy[1]（2020）在《中国心力衰竭患者离子管理专家共识》文中认为心力衰竭（心衰）的发生发展是一个复杂的病理生理过程,血清离子平衡紊乱在这个过程中发挥着重要的作用,与心衰的预后密切相关。维持心衰患者血清离子平衡是心衰管理中的重要部分。本共识结合国内外最新研究结果以及我国实践经验,从血清钾离子紊乱（低钾血症、高钾血症）、血清钠离子紊乱（低钠血症、高钠血症）、血清镁离子紊乱（低镁血症、高镁血症）以及铁离子紊乱（铁缺乏、铁超载）的管理等几个方面进行介绍,旨在指导和规范我国心衰患者的血清离子平衡管理,从而改善心衰患者预后。
刘旭[2]（2019）在《仲景消渴证治思想及白虎加人参汤改善MKR转基因小鼠2型糖尿病的作用研究》文中研究表明目的:梳理仲景的消渴证治思想以及探究白虎加人参汤对2型糖尿病小鼠的作用研究,从传统医学论治消渴病及现代实验研究白虎加人参汤对改善2型糖尿病小鼠空腹血糖值与氧化应激反应等角度,总结仲景的消渴证治思想与揭示白虎加人参汤治疗2型糖尿病的疗效机理。方法:文献部分,采用文献研究法,梳理及总结归纳仲景消渴证治思想,搜集整理古代医家对仲景所创立白虎加人参汤的论述与应用,以及对白虎加人汤的现代药理研究。实验部分,选取4周龄MKR小鼠60只,雌雄各半,随机分成6组:MKR空白对照组、MKR模型组、白虎加人参汤低剂量组、白虎加人参汤中剂量组、白虎加人参汤高剂量组、二甲双胍组,同时设10只4周龄C57BL小鼠为正常对照组。除正常对照组外,给予高脂高糖饲料喂养1月后给予STZ腹腔注射造模。以空腹血糖值≥11.1mmol/L为成模标准。给药28天后,以心脏采血处死小鼠留取血样,并手术取出小鼠胰腺组织,以电化学法检测小鼠空腹血糖;光镜和透射电镜分别观察胰腺组织;以ELISA法测定氧化应激标志物ROS、SOD、MDA的含量。结果:与正常组比,MKR空白对照组、MKR模型组胰岛细胞病变明显,胰腺组织明显具有炎性浸润,FBG、ROS、MDA均明显升高（P<0.01）,SOD明显下降（P<0.01）;经白虎加人参汤治疗后,与模型组比较,胰岛细胞病变得到改善,胰腺组织炎性浸润得到缓解;中药三个剂量组与西药组FBG明显下降（P<0.01）;中药中、高剂量组与西药组ROS含量下降（P<0.05）,SOD含量上调（P<0.05）,MDA含量下调（P<0.05）.结论:1.仲景从“虚”与“热”论治消渴病的证治思想为后世医家治疗消渴病辨证分型奠定了理论基础提供了指导方向。2.治疗肺胃热盛气阴两伤消渴病之白虎加人参汤具有显着降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用。3.白虎加人参汤具有提高糖尿病小鼠SOD活性,降低ROS、MDA含量,缓解氧化应激反应的作用,具有明显抗氧化能力。4.白虎加人参汤对于糖尿病小鼠具有改善受损的胰岛细胞功能,保护胰腺组织,缓解炎症反应的作用。
张婷婷[3]（2017）在《新疆黑果小檗根部成分分析及体外抑菌活性初步研究》文中研究说明目的:对新疆黑果小檗根部化学成分进行初步定性定量分析。在此基础上,对根皮5%硫酸提取物进行分离纯化、结构解析及含量测定,并研究根部化学成分的体外抑菌活性。方法:1.化学成分初步研究:（1）采用植物未知化学成分系统预试验方法,对黑果小檗根皮和根木质部不同溶剂提取物进行化学成分初步定性研究。（2）对比研究紫外分光光度法和酸性染料比色测定总生物碱含量的区别,并对根皮和根木质部中总生物碱含量进行初步测定。（3）用响应面法考察并优化根皮总生物碱的提取工艺。2.用5%硫酸冷浸提取黑果小檗根皮,滤液通过阳离子交换树脂、硅胶柱层析等分离纯化方法,结合NMR、ESI-MS等分析方法,解析单体化合物的结构,并采用HPLC法对其进行含量测定。3.采用牛津杯法、倍比稀释法及OD值测定法,初步研究根皮5%硫酸提取物及其95%乙醇部位、70%乙醇部位、水部位、单体化合物和根木质部的上述部位对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的体外抑菌活性。结果:1.（1）黑果小檗根皮和根木质部中都含有氨基酸、蛋白质、生物碱、糖及苷类、有机酸、皂苷类、黄酮类、酚类和鞣质、三萜、内酯类等多种物质。（2）紫外分光光度法测得样品总生物碱含量（平均值2.94%）均高于酸性染料比色法测得总生物碱含量（平均值1.42%）。采用紫外分光光度法测得根皮和根木质部中总生物碱含量为:（根皮/根木质部）酸提物（4.52%/3.96%）>95%乙醇提取物（2.89%/2.88%）>水提取物（1.74%/2.28%）>丙酮提取物（0.83%/1.10%）>乙酸乙酯提取物（0.28%/0.13%）>石油醚提取物（0.07%/0.08%）。（3）根皮总生物碱的最优提取条件为乙醇体积分数50%,料液比1︰51（g︰mL）,提取次数3次,提取温度80℃,提取时间2h。2.从本植物根皮中首次分离得到反式阿魏酸,在5%硫酸提取物中含量为0.59%。3.（1）根皮5%硫酸提取物及其95%乙醇部位、根木质部5%硫酸提取物及其95%乙醇部位对四种致病菌有抑制作用（阳性结果）,其余样品均显示阴性结果。（2）根皮5%硫酸提取物对四种致病菌的MIC均为2.02mg·mL-1,其95%乙醇部位对大肠杆菌的MIC为2.13mg·mL-1,对粪肠球菌的MIC为4.25mg·mL-1,对铜绿假单胞菌的MIC为8.50mg·mL-1,对金黄色葡萄球菌的MIC为1.06mg·mL-1;根木质部5%硫酸提取物对四种致病菌的MIC均为1.90mg·mL-1,其95%乙醇部位对大肠杆菌和粪肠球菌的MIC均为5.05mg·mL-1,对铜绿假单胞菌的MIC为20.19mg·mL-1,对金黄色葡萄球菌的MIC为2.53mg·mL-1。（3）根皮5%硫酸提取物的水部位(20.68-10.34mg·mL-1)、根木质部5%硫酸提取物的95%乙醇部位(2.53-10.10mg·mL-1)及水部位(0.97-7.73mg·mL-1)对乳酸杆菌的生长有促进作用,其余样品均显示抑制作用;根木质部5%硫酸提取物70%乙醇部位(40.06mg·mL-1)、根皮5%硫酸提取物70%乙醇部位(2.91-11.63mg·mL-1)以及水部位(20.68mg·mL-1)对双歧杆菌的生长有促进作用,其余样品均显示抑制作用。结论:1.（1）根皮和根木质部中化学成分种类基本相同。其中生物碱含量较高,若以生物碱作为有效成分时,初步推断根木质部有作为用药部位的可能性。（2）采用响应面法优化的根皮总生物碱提取工艺,通过三次验证试验,总生物碱提取率为4.01%,RSD=1.12%,理论值与实际值的误差为0.98%,说明优化的工艺稳定可行,可为黑果小檗根皮总生物碱后续研究提供实验基础。2.黑果小檗根皮5%硫酸提取物中含有反式阿魏酸,含量为0.59%。3.根皮和根木质部5%硫酸提取物及其不同溶剂部位对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌有不同程度的抑菌作用,对双歧杆菌和乳酸杆菌有一定的促增生作用。初步推断,若用于治疗由菌群紊乱引起的肠道疾病时,黑果小檗根木质部也可用于入药。
史美云[4]（2015）在《齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷临床前药代动力学研究》文中研究指明齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷（calenduloside E,CE）是从龙牙楤木中提取的具有降糖、避孕、抗心律失常等多种药理活性的五环三萜类皂苷,为齐墩果酸（oleanolic acid,OA）的葡萄糖醛酸结合物。CE因毒性低、药理作用广而受到广泛关注。本文建立了选择性好、灵敏度高的能同时测定生物样品中CE及其活性代谢产物OA的液相色谱-质谱联用技术（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS）,并根据CFDA指导原则进行方法学确证,采用该方法对CE的临床前药代动力学进行了研究。主要包括大鼠和犬口服给予CE后,测定血浆中的药物浓度,考察血药浓度随时间的变化规律;考察CE及其活性代谢产物OA在大鼠体内的组织分布和排泄特征;应用液相色谱串联高分辨飞行时间质谱（LC-TOFMS/MS）初步鉴定大鼠体内的代谢产物;使用特异性底物探针法考察CE对大鼠CYP450酶的抑制、诱导作用;基于Caco-2和MDCK-MDR1细胞模型,阐述CE给药后在大鼠肠道的吸收转运机制。一、CE在大鼠和比格犬体内的药物动力学研究CE经灌胃/口服低、中、高三剂量（大鼠为3.75,7.5和15 mg/kg;比格犬1.05,2.1和4.2 mg/kg）给药后,发现其在大鼠和比格犬体内的药动学过程均符合二室模型。除犬的MRT和Vd/F有差异外,大鼠和犬体内Tmax,t1/2,CL/F,MRT和Vd/F均不随给药剂量的增加而变化,AUC0-t,AUC0-∞和Cmax胃均与给药剂量呈线性相关,表明CE在给药剂量范围内有线性药动学特征趋势。以AUC0-t计算,在中剂量下,大鼠灌胃给药后的绝对生物利用度为0.067%,比格犬口服给药后绝对生物利用度为0.59%,比大鼠有所提高。比格犬多次给药后,给药第1天和第6天的Tmax、t1/2无显着性差异,AUC0-t、AUC0-∞的蓄积因子为:2.45和2.41,Cmax的蓄积因子为2.09,犬多次服药后在体内表现出轻度蓄积。大鼠口服给药后血浆中大部分采血点未检测到苷元OA,可能由于大鼠体内CE向OA转化率低,且CE生物利用度低,吸收少,血浆中的OA低于定量下限而检测不到。犬分别口服给予CE低、中、高三个剂量后,血浆中均可检测到少量的OA。口服给药之后,从OA的Tmx可以看出由于其脂溶性更强,CE向OA的生物转化和OA的吸收都是很迅速的。OA的药-时曲线呈双峰现象,可能由于OA的肝肠循环所致。静脉给药之后,仅3.5%的CE向OA转化,这表明在肝脏中极少的CE转化为OA。因此,口服给药后生成的OA是胃肠道和肝脏共同作用的结果。二、CE在大鼠体内的组织分布研究通过比较CE在大鼠体内各组织分布的特点,对CE在大鼠体内的靶向性及各组织的蓄积情况进行评价。给药0.5h～2h后,各组织中CE浓度基本达到峰值。CE在胃壁,小肠壁浓度较高,与胃肠道给药途径相关。给药12 h后,各组织中CE含量均有明显下降趋势,不足峰值的10%,说明CE在体内组织不易产生蓄积。OA在各组织中的分布趋势与CE在组织内的分布趋势基本吻合。用平衡透析法测定大鼠血浆中CE血浆蛋白率,30、100、300 ng/mL的CE平衡24 h后,血浆蛋白结合率均接近于100%,表明CE血浆蛋白结合率很高,在体内主要以与血浆蛋白结合的形式存在,提示在合并用药时应注意药物-药物相互作用。三、CE在大鼠体内的代谢与排泄研究用LC-TOF MS/MS法对CE给药后大鼠排泄物中代谢产物进行了鉴定,结果表明:CE可被肠道微生物水解生成苷元OA;OA的C3-OH和C28-COOH都可发生葡萄糖醛酸结合反应,C3-OH与葡萄糖醛酸结合生成原形CE,C28-COOH与葡萄糖醛酸结合生成CE的同分异构体齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷,两个位点都发生与葡萄糖醛酸结合齐墩果酸-3,28-0-葡萄糖醛酸苷;此外,C12和C13间的双键可发生还原;C12和C13间的双键也可发生氧化,生成环氧化合物。通过测定大鼠排泄物中CE和OA的含量,并对CE的同分异构体齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷进行相对定量。大鼠给药72 h后,CE和OA的排泄量基本上达到坪值;CE和OA及CE同分异构体累计排泄量占给药剂量百分比为28.90%。尿液排泄量较低（仅0.04%）,说明肾排泄不是CE的主要排泄途径,主要以苷元的形式从粪便排出体外。四、CE对大鼠CYP450酶的影响基于特异性底物探针法评价CE对大鼠肝微粒体五种主要CYP450酶亚型（CYP 1A2、CYP 2D6、CYP 3A4、CYP 2C9 和 CYP 2C19）的作用。CE 给药后,大鼠体内肝微粒体的蛋白含量以及CYP450酶含量均没有明显的增加或减少,说明CE对大鼠肝微粒体五种细胞色素P450酶亚型既无诱导作用,也无抑制作用。五、CE在大鼠肠道吸收机制研究通过考察CE在大鼠肠道内容物中的稳定性发现CE在肠道可部分水解为苷元OA;将苷元在含有UDPGA的大鼠肠S9、肝S9或肠液中进行孵化,测定CE及齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷的生成量,发现苷元在大鼠肠壁中能发生广泛的葡萄糖醛酸结合反应,进而分别生成CE和齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷,同时发现更易生成后者,体内选择性还需进一步研究。CE的跨膜转运实验表明CE在Caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数与OA接近,且跨膜前有2/5的CE转化为OA,但由跨膜吸收后的OA转化生成的齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷含量却很少。因此,可推测CE在肠道中部分以原形吸收,部分通过水解为苷元后吸收,吸收后的成分中主要以CE的形式存在。此外MDCK-MDR1细胞模型的实验初步推测CE不是P-gp的底物。
路雯[5]（2013）在《硫化氢对大鼠十二指肠运动的影响及其机制》文中进行了进一步梳理第一部分硫化氢通过激活TRPV1通道和KATP通道调节十二指肠运动目的：自然界内的硫化氢（Hydrogen sulfide, H2S）是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体,但在哺乳动物体内可能是一种气体信号分子。在细胞内H2S主要以L-半胱氨酸（L-cysteine）作为底物,通过两种磷酸毗哆醛依赖的酶产生,分别是胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase, CBS）和胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase, CSE）。H2S可以在哺乳动物多个器官或组织合成并发挥生理调节作用。有研究报道H2S可以调节胃肠道运动,但是结果不尽一致并且机制尚未明确。我们的研究发现CBS和CSE表达在十二指肠的肌间神经丛神经元中,但是H2S对十二指肠的运动发挥着何种作用及其内在机制尚不清楚。本研究的目的是探究H2S对大鼠十二指肠的运动的影响及其内在机制。方法：十二指肠离体肌条张力记录将大鼠颈部脱臼予以牺牲,快速取出长约2cm的一段十二指肠,小心去除肠系膜及结缔组织,沿与十二指肠纵轴平行的方向剪开肠段,粘膜面向上展开并固定在盛有氧饱和Krebs溶液的硅胶盘中。在解剖镜下用显微器械小心撕去粘膜层和粘膜下层,沿平行纵轴方向制备十二指肠肌条（10mm×4mm）。用多通道生理记录仪记录十二指肠纵形肌肌条的张力。肌条在盛有5ml Krebs溶液的浴槽中孵育20分钟左右,待其自发收缩稳定后开始实验。平滑肌细胞分离与长度测量将上述实验中制备的十二指肠肌条剪成2mm×2mm小块并转移到1ml含有1.7-1.9mg Ⅱ型胶原酶、500-700μ g木瓜蛋白酶、1mg二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）、0.5mg胰蛋白酶抑制剂和1mg小牛血清白蛋白的无钙PSS溶液中消化20-30分钟。消化完毕后用Kraft-Bruhe溶液（KB溶液）冲洗数次,然后用尖端口径约2mm并抛光过的玻璃吸管轻轻吹打数次以制备单个平滑肌细胞的细胞悬液,分散的细胞保存在KB溶液中并置于4℃备用。在倒置显微镜下观察平滑肌细胞的形态并测量加药前后细胞的长度。免疫荧光双重和三重标记采用免疫荧光双重标记或三重标记技术对KATP通道、CBS和CSE进行定位。上述实验中制备的去掉粘膜层和粘膜下层的十二指肠标本,再在解剖镜下小心撕去环形肌层,剩余部分为纵行肌-肌间神经丛标本（longitudinal muscle myenteric plexus, LMMP）。将LMMP标本用4%的多聚甲醛溶液室温固定30分钟,磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）洗3次后用3%的H202溶液室温孵育15分钟以封闭内源性过氧化物酶活性,PBS洗3次后用0.1%的Triton X-100孵育标本20分钟以增加细胞膜通透性,然后用10%的驴血清封闭1小时以去除非特异性染色。随后分别加入相应的一抗混合液在4℃孵育12-16小时。PBS洗3次后加入相应的荧光二抗混合液室温孵育2小时,75%甘油封片后在荧光共聚焦显微镜下观察并拍照。统计分析使用Chart5数据分析系统对所记录的肌条张力曲线下面积进行积分,积分的单位为g.s。加入NaHS、L-cysteine或SAM （S-adenosyl-L-methionine）前3分钟内的平均积分（总积分值除以时间）作为基础值,加药后不同时间段的平均积分为效应值。基础值与效应值的比值R作为标准化的运动积分,反应肌条运动的变化。加药前R值标准化为1。因为Carbachol主要引起消化道肌条基础张力增加,观察H2S对Carbachol诱发肌条收缩的影响时,统计指标采用肌条的基础张力,即肌条张力曲线的最低值。加入NaHS之前3分钟的平均基础张力值作为基础值,加入NaHS之后各时间点的基础张力作为效应值。效应值与基础值的差值即为肌条基础张力的变化值。加药前的变化值均标准化为0g。在分析平滑肌细胞长度的变化时,以加入NaHS之前的细胞长度（μm）作为基础值,加药后的细胞长度减去加药前的细胞长度即为细胞长度的变化值。数据用均数±标准误（mean±SEM）表示,用one-way ANOVA后Dunnett’s检验来分析多个实验组和一个对照组数据之间的差异,t test用于分析两组数据之间的差异,以P<0.05做为显着性差异界值,n代表每组中动物数或平滑肌细胞的数量。结果：1、NaHS对十二指肠纵形肌肌条自发收缩活动的影响浴槽内加入H2S的供体NaHS （0.5mM,1mM和2mM）之后,肌条呈现先兴奋后抑制的双相反应。在加入NaHS之后,肌条收缩活动立即明显增强,在1-2分钟内兴奋作用达到最高,5分钟之内恢复正常。加入NaHS （lmM）第一分钟内运动积分的R值由对照组1.01±0.03（n=6）增加到4.8±0.5（n=10,P<0.05）。短暂兴奋作用后肌条的运动出现持续时间较长的抑制,在15-30分钟左右R值达到最低点,45分钟左右时收缩活性部分恢复。浴槽中加入1mMNaHS15分钟之后,运动积分的R值由对照组0.8±0.04（n=6）下降到0.2±0.05（n=10, P<0.05）。NaHS对肌条的抑制作用呈现浓度依赖性,在第15分钟,0.5-2mM的NaHS对肌条运动具有明显的抑制作用,且随着NaHS浓度增高抑制作用增强,但当NaHS的浓度低到0.1mM时对肌条的运动没有影响。2, NaHS对Carbachol诱发的十二指肠纵行肌肌条收缩的影响Carbachol （2μM）引起肌条收缩张力迅速增高,持续时间超过20分钟。我们在加入Carbachol10分钟后再加入不同浓度的NaHS （0.05mM,0.1mM,0.2mM,0.5mM和1mM）,发现NaHS迅速逆转Carbachol诱发的基础张力增加,且呈现浓度依赖性。加入不同浓度NaHS （0.2mM,0.5mM和1mM）5分钟之后,肌条收缩的基础张力分别降低了0.8±0.2g、0.9±0.2g和1.3±0.2g,均显着高于对照组（仅加Carbachol组）基础张力的改变（0.03±0.0l g,n=6）（P<0.05）。3. TRPV1通道和NK1受体在NaHS引起的短暂性兴奋中的作用TRPV1通道的拮抗剂Capsazepine （10μM）和NK1受体（P物质的受体）拮抗剂L703606（10μM）预孵育肌条都可以显着减弱NaHS （1mM）引起的肌条兴奋反应,阻断剂预孵育之后再加入NaHS,第1分钟Capsazepine+NaHS组和L703606+NaHS组的运动积分R值分别为1.7±0.2（n=10）和1.2±0.1（n=8）,均显着低于DMSO+NaHS组（4.8±0.5,n=11）（P<0.05）,而KATP通道拮抗剂格列苯脲（Glibenclamide, Glib,10μM）和电压敏感钠通道的拮抗剂河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX,10μM）都对NaHS （1mM）引起的肌条兴奋反应没有影响。4、KATP通道在NaHS引起的长时程抑制中的作用KATP通道拮抗剂Glib（10μM）预孵育肌条可以明显减弱NaHS （1mM）所引起的肌条收缩的长时间抑制作用。在NaHS加入后的第15分钟,运动积分的R值由对照组0.3±0.05（n=11）增加到Glib+NaHS组的0.8±0.1（n=8,P<0.05）。而Capsazepine、L703606和TTX对NaHS （1mM）引起的肌条收缩的长时间抑制作用没有影响。5、蛋白硫氢化在NaHS引起的双相反应中的作用巯基烷化剂NEM能够保护蛋白质分子中游离巯基使其不被硫氢化。肌条在含NEM（0.1mM）的Krebs液中孵育15分钟后再加入NaHS （1mM）, NaHS所引起的短暂性兴奋作用明显减弱。NEM（0.1mM）孵育后加入NaHS1分钟后的运动积分R值降低到1.6±0.3（n=9）,而对照组为4.6±0.4（n=13）,相比有明显差异（P<0.05）。除此之外,NaHS所引起的长时间的抑制作用也被NEM部分逆转。NEM+NaHS组加入NaHS后15分钟的运动积分R值为0.5±0.1（n=9）,显着高于NS+NaHS组的R值（0.2±0.05,n=13）（P<0.05）。6、KATP通道在十二指肠平滑肌细胞中的表达免疫荧光双重标记的方法显示,在分离培养的平滑肌细胞和LMMP标本上,SM22（平滑肌细胞的标记物）和Kir6.2（KATP通道的亚基）共表达在相同细胞上,这说明KATP通道表达在十二指肠平滑肌细胞上。7、NaHS对单个平滑肌细胞的直接舒张作用NaHS （0.5mM和1mM）可以引起急性分离的单个十二指肠平滑肌细胞的长度显着增加,这一作用持续5分钟以上,该作用呈现一定的浓度依赖性。加入NaHS（1mM）5分钟后,平滑肌细胞的长度增加了3±0.5μm（n=18）,明显高于对照组细胞长度的改变（0.1±0.2μm）（P<0.05）.NaHS（1mM）引起的平滑肌细胞的舒张作用可被KATP通道拮抗剂Glib（10μM）和巯基烷化剂NEM（0.1mM）所阻断。Glib预处理使加入NaHS（1mM）后第5分钟时细胞长度的改变由2.8±0.4μm（DMSO+NaHS组,n=13）减小到一0.2±0.3μ m（Glib+NaHS组,n=18,P<0.001）；NEM预处理使NaHS（1mM）引起的细胞长度的改变由2.9±0.5μm（PSS+NaHS组,n=18）减小到0.1±0.4u m（NEM+NaHS组,n=12,P<0.001）8、CBS和CSE在十二指肠肌间神经丛的表达免疫荧光三重标记和免疫荧光双重标记的结果显示,CBS和CSE表达在十二指肌间神经丛内NeuN阳性的神经元上,而平滑肌细胞上没有表达。另外,CBS和CSE这两种酶同时表达在神经元的胞体中。9、内源性H2S对二指肠肌条收缩的影响及其机制加入CBS和CSE的底物L-cysteine（0.5mM和1mM）后,可以使十二指肠肌条收缩显着增强,这一增强作用在加药后2分钟左右达到最大,15分钟之内恢复正常。在浴槽中加入L-cysteine（1mM）2分钟之后,肌条运动积分的R值增加到1.9±0.1（n=9）,与对照组（0.9±0.05,n=6）相比有明显差异（P<0.05）。PAG（CSE的抑制剂,0.5mM）和AOAA（CBS的抑制剂,0.05mM）孵育肌条可以显着减弱L-cysteine引起的兴奋作用。加入L-cysteine2分钟后,PAG和AOAA预处理组肌条的运动积分R值为1.3±0.1（n=7）,与对照组（1.9±0.1,n=8）相比显着降低（P=0.009）.TRPVl通道的拮抗剂Capsazepine或NK1受体的拮抗剂L703606预孵育都可以显着减弱L-cysteine（1mM）引起的肌条兴奋反应。浴槽中加入Capsazepine或L703606孵育15分钟后再加L-cysteine,第2分钟的运动积分R值分别为1.4±0.07（Capsazepine+L-cysteine组,n=13）和1±0.1（L703606+L-cysteine组,n=6）,显着低于DMSO孵育后再加L-cysteine的R值（1.9±0.1,n=7）（P<0.05）。与L-cysteine相似的是,CBS的激动剂SAM（1mM）也使十二指肠肌条收缩显着增强,这一作用同样可被Capsazepine和L703606阻断。和NaHS引起的双相反应不同,L-cysteine和SAM对肌条收缩都没有抑制作用。结论：内源性和外源性H2S对十二指肠肌条的自发收缩都有短暂兴奋作用,这一作用是通过激活传入感觉神经末梢上的TRPV1通道从而导致P物质释放增多引起的。除此之外,外源性H2S还发挥长时间的抑制作用,这是作用是通过直接开放平滑肌细胞上的KATP通道介导的。H2S对TRPV1通道和KATP通道的调节可能都是通过蛋白硫氢化这一机制介导的。H2S可能激活了感觉传入神经末梢的传出样作用。第二部分硫化氢对十二指肠肌间神经丛S神经元电生理学特性的影响及其机制目的：消化道除受中枢神经系统调控外,其自身还有一套完整的自主神经系统,能够完成基本的反射活动,称作肠神经系统（enteric nervous system, ENS）,内有感觉神经元、中间神经元和运动神经元,它们形成复杂的神经网络,调节消化道的感觉、运动、分泌和血流。根据其电生理学特征,肠神经丛内的神经元可以分为AH神经元和S神经元。AH神经元主要是肠道内源性感觉神经元,S型神经元主要为运动和中间神经元。内源性H2S可以在十二指肠肌间神经丛神经元合成,但是H2S对ENS中的神经元有何调节作用尚未见报道。本实验的目的是探讨H2S对肌间神经丛内S神经元电生理特性的影响及其机制。方法：肌间神经丛神经元分离与培养将LMMP标本（制备方法同第一部分）置于含10mg/ml木瓜蛋白酶的37℃Krebs溶液中消化50分钟,然后将组织剪碎,置于含1mg/ml Ⅱ型胶原酶的37℃DMEM培养基进行第二次消化,消化时间为55分钟。玻璃吸管轻轻吹打组织块数次,得到细胞悬液。将细胞悬液在1500r/min转速离心6分钟,弃去上清液,用1ml含10%胎牛血清的DMEM重新悬浮细胞并滴片,细胞贴壁后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。37℃培养箱培养16-24小时后进行全细胞膜片钳记录。全细胞膜片钳记录用阻抗为5-7MΩ的玻璃微电极与细胞膜形成GΩ以上的高阻封接,然后再给予细胞一个突然的负压吸引打破封接处的细胞膜,进行全细胞电信号记录。记录细胞膜电位时膜片钳放大器处于电流钳状态,不给予任何电流刺激,即I=)。观察电压变化激发膜电流时,放大器处于电压钳状态。细胞膜的电信号通过Axon膜片钳放大器和A/D转换器记录入计算机,使用Clampexl0.2软件进行信号采集和分析。AH和S神经元鉴别首先确定所记录神经细胞的阈电位,然后连续给予细胞三次时程为50ms的阈上电流刺激,连续激发三次动作电位。若在三个动作电位之后出现一段幅度为2-15mV,时程为3-20s的后超级化,则该细胞为AH神经元,若无后超级化则该细胞为S神经元。免疫荧光双重标记实验步骤同第一部分。数据统计与分析在观察膜电位改变时,以加NaHS前的膜电位作为基础值,以加药后膜电位超级化的最低值作为效应值,效应值减去基础值即为膜电位的改变。在观察外向电流改变实验部分,将钳制电位从-80mV直接升至+50mV会激发出一个短暂的内向离子流和持续的外向离子流,以加NaHS前膜电位钳制在+50mV时的外向电流的大小做为基础值,加NaHS后1分钟相同位置的电流大小减去基础值即为外向电流的改变。数据分析方法同第一部分。结果：1.NaHS对肌间神经丛S神经元膜电位的影响对细胞施加NaHS（0.1mM,0.5mM和1mM）约10秒钟后,细胞膜电位发生明显超级化反应,且呈现浓度依赖性。在加药后1分钟左右,膜电位达到最低点,超级化的幅度分别为3.9±0.7mV（n=9:NaHS0.1mM）,7.6±1.3mV（n=15:NaHS0.5mM）和13.8±1.8mV（n=13:NaHS0.1mM）,和对照组（0.2±0.3mV,n=7）相比均有显着性差异（P<0.05）.NaHS引起的超级化反应经细胞外液冲洗可恢复至静息电位水平。低浓度的NaHS（0.01mM）不影响S神经元的膜电位。2.NaHS对S神经元外向离子流的影响在电压钳模式下,设置一个100ms的step,将钳制电位从-80mV升至+50mV,细胞首先出现一个短暂的内向电流,然后再出现快速失活的外向电流和持续平稳的外向电流。我们观察的指标为持续平稳期的外向电流大小。NaHS（1mM）作用1分钟后,从-80mV到+50mV的电压变化诱发的外向电流显着增加。加药后1分钟时NaHS组外向电流的增大幅度为619.2±47.9pA（n=17）,显着高于对照组外向电流的改变（45.7±37.6pA,n=8,P<0.001）.3.KATP通道在NaHS引起肌间神经丛S神经元外向电流增大中的作用用KATP通道阻断剂Glib预孵育细胞10分钟后,从-80mV到+50mV的电压变化诱发的外向电流在加入NaHS后不再增加。用Glib预处理后,NaHS使S神经元外向离子流增加的幅度由673.8±51.8pA（DMS0+NaHS组,n=13）降至73.7±46.1pA（Glib+NaHS组,n=8,P<0.001）。4.KATP通道在肌间神经丛神经元上的定位不管是在分离培养的肌间神经丛细胞上还是肌间神经丛标本上,所有的NeuN阳性细胞都表达Kir6.2,说明KATP通道在肌间神经丛神经元上表达。5.蛋白硫氢化机制在NaHS引起肌间神经丛S神经元外向电流增大中的作用用巯基保护剂NEM（0.1mM）孵育细胞10分钟后,NaHS不再引起外向电流增加。用NEM预处理后,NaHS使S神经元外向离子流增加的幅度由619.2±47.9pA（vehicle+NaHS组,n=17）降至137.7±63.3pA（NEM+NaHS组,n=7,P<0.001）。结论：外源性H2S使大鼠十二指肠肌间神经丛S神经元细胞膜电位超级化,这一作用可能是通过硫氢化S神经元上KATP通道介导的。
张敬升[6]（2013）在《效阈浓度下复方四种单体及其配伍的细胞生物效应》文中指出方剂现代研究一直是中医药研究领域的重点和难点。复方作用于人体的生物效应模式是中药复方机制研究的关键问题之一,利用中医方剂的配伍优势及其多成分、多靶点、多途径调节的特点,探索中药复方特有的效应模式,对于揭示中医方剂的理论内涵有重要的意义。本课题基于葛根黄芩黄连汤临床用于2型糖尿病治疗的经验背景,选择分别来自于该方中4味中药所涉及的四种化学成分及其配伍作为该方成分配伍的表征,以体外3T3-L1脂肪细胞IR模型为工具,在观察各单体成分不同浓度对该模型细胞糖消耗或摄取影响的基础上,进一步考察其效阈下的低或极低浓度单体配伍的抗IR效应,以探讨中药复方多成分低浓度下的生物效应模式。论文分文献综述和实验研究两部分。文献综述部分主要总结了方剂现代实验研究、葛根黄芩黄连汤及其方内药味所含主要单体的实验研究和药理研究及其临床运用、IR细胞模型的研究进展。实验研究部分首先建立稳定的细胞系,确定四种中药单体的安全有效浓度,继之复制3T3-L1细胞IR模型,探查各单体低浓度条件下作用于模型细胞的浓度-效应,最后进行四种单体阈浓度的配方及阈下浓度各单体交互配伍的研究。研究一：3T3-L1前脂肪细胞的分化诱导及四种中药单体对细胞活力的影响3T3-L1前脂肪细胞的分化诱导方法：从-80℃冰箱中取出含有前脂肪细胞的冻存管,迅速放37℃水浴锅内复温融化,复苏。将3T3-L1前脂肪细胞,用含10%小牛血清的高糖-DMEM,在37℃5%CO2条件培养,48h换培养液,传代。取对数（指数）生长期的传代细胞冻存。细胞接种于培养板,待其生长至完全融合后2D,采用诱导剂I BMX、DEX、Ins诱导分化。取不同分化时间中的3T3-L1细胞,显微镜下观察其形态变化和细胞油红0着染情况。结果：复苏后贴壁培养的3T3-L1前脂肪细胞为梭形,均匀分散分布于培养瓶底部,大小形态一致,增殖稳定快速,生长曲线呈“S”形；分化期间细胞开始由梭形逐渐向椭圆、类圆及圆形转变,胞体逐渐增大,胞浆丰富；油红0染色显示培养中3T3-L1前脂肪细胞脂滴不断增多,D9-D10,90%以上的细胞胞浆中积聚大量的脂滴,脂滴呈红色,胞核呈蓝色,大量体积较大的脂滴分布于细胞核周围,形成典型的成熟脂肪细胞形态“戒环样”结构。结果表明前脂肪细胞的诱导分化成功。四种中药单体对3T3-L1细胞活力的影响方法：将3T3-L1前脂肪细胞以1×104细胞/孔,接种于无菌96孔培养板中,200μL/孔,待细胞完全贴壁,吸弃上清液,设置空白对照组和不同浓度药物干预组（10-3～10μM）,药物干预48h后,MTT实验检测各组的OD值。结果：葛根素10-1、1.0μM浓度、黄芩素10-1～10μM、小檗碱10-2～1.0μM、甘草酸10-1～10μM浓度组的OD值均见显着升高,小檗碱10μM组的OD值显着降低。表明四种单体较低浓度区间均有增加细胞活力的作用。研究二：3T3-L1细胞IR模型建立及4种中药单体对IR模型细胞的影响3T3-L1细胞IR模型的建立方法：将分化成熟的3T3-L1细胞的96孔细胞培养板中,加入0.2%BSA的DMEM培养基培养12h后,分为正常对照组和IR模型组。正常组以含0.2%BSA的DMEM培养基培养,模型组以含0.2%BSA.10-6M INS的DMEM培养基培养,孵箱内培养24h、48h后,氧化酶法和荧光（2-NBDG）标记法测定各组细胞培养液中葡萄糖量和细胞葡萄糖摄取量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液中糖量显着性增加,细胞糖摄取量显着性降低。表明经高胰岛素诱导24h和48h的3T3-L1细胞的糖消耗或摄取降低,具有IR特征,模型复制成功。中药单体对IR模型细胞糖消耗或摄取的影响方法：96孔细胞培养板中正常对照组和IR模型组3T3-L1细胞,分别以含0.2%BSA的DMEM培养基和含0.2%BSA、10-6M Ins的DMEM培养基培养24h；模型组再分成模型对照和药物干预各组。正常组以含0.2%BSA的DMEM培养基,模型组和药物干预各组分别以含10-6M Ins的DMEM培养基和含10-6M Ins+不同浓度的中药单体的培养基,分别培养24h和48h后,氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖量或／和细胞葡萄糖摄取量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液的葡萄糖量明显增加；较之于模型组,葛根素10-3、10-2、10-1μM24h釉10-3、10-1M48h细胞外液的糖量均明显减少,黄芩素10-4～1μM24h和10-5～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加,小檗碱10-2、10-、1μ M24h和10-4～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加,甘草酸10-4～1μ M24h和10-5～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加。表明多个低浓度区间的4种单体作用IR脂肪细胞24h和48h均有显着增加其糖消耗的作用,具有抗IR活性。研究三：效阈浓度下四种单体配伍对IR模型细胞的效应观察四种单体配方对IR模型细胞糖消耗的影响方法：取以上各单体的阈浓度组合成复方,进一步稀释成含不同浓度的10-6M Ins的DMEM培养基。细胞分组及培养同研究二。于含药培养基作用24h和48h,采用氧化酶法分别测定各组细胞培养液葡萄糖量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液葡萄糖量增加；较之于模型组,四种单体配方各浓度（10-5μM～1.0μM）24h和48h细胞外液葡萄糖量显着性减少。表明四种单体阈浓度配方105μM-1.0μM均有抗IR活性。效阈浓度下4种单体不同配伍对IR模型细胞糖摄取的影响方法：取各单体阈浓度的1/10,按4因素2水平正交表组合成不同配方,稀释成含药浓度为1／40的10-6M Ins的DMEM培养基。细胞培养同研究二。于含药培养基作用24h和48h,2-NBDG荧光标记法分别测定各组细胞葡萄糖摄取量。结果：与正常组比较,模型组24h和48h细胞糖摄取量显着减少；较之于模型组,4种单体不同配伍中的多组配方24h和48h细胞糖摄取量明显增加,其48h的效应优于24h,4种单体合用配方24h和48h细胞糖摄取量均明显高于其他各组。表明极低浓度下的4种成分配方较其他拆方配伍具有更好的抗IR活性。各因素交互关系分析表明,影响24h和48h的药物效应的主要因素分别是甘草酸和黄芩素、甘草酸、葛根素,提示甘草酸和黄芩素在全方中发挥重要作用。本课题基于复杂系统理论对中药复方可能存在多成分极低浓度下的生物效应模式进行探讨,结果在细胞水平上发现效阈浓度下（微量）的多种单体配方具有明显的生物效应。本研究对于“中药复方低浓度下多成分相互作用产生效应”的推测提供实验证据。
董玲娜[7]（2013）在《（氧化）苦参碱与去甲乌药碱药代动力学特征与代谢机理》文中提出一、背景与目的有毒中药的毒性和有效性均可反映为有毒中药的药代动力学特征。从药代动力学的角度,认识有毒中药的毒性特点,并从药物代谢等影响药代动力学特征的关键环节和分子靶点认识有毒中药的安全性和有效性,可为临床合理驾驭有毒中药的毒性提供依据。基于此,本论文主要选择了山豆根有效成分及附子、细辛共同的有效成分为主要研究对象,从药代动力学和代谢关键环节上开展研究工作。山豆根是越南槐（Sophora tonkinensis）的干燥根茎,主要分布在中国的西南部,临床作为一种常用中药用于治疗黄疸,炎症,肿痛。氧化苦参碱（oxymatrine, OMT）与苦参碱（matrine, MT）是山豆根中最主要的有效成分,也是有毒成分,是研究山豆根的代表性化合物,它们具有抗炎,抗肿瘤,抗乙肝病毒的作用。山豆根提取物具有良好的药理活性,同时也具有一定的副作用与肝脏毒性。研究报道关于氧化苦参碱与苦参碱的治疗作用与潜在毒性的讨论较多。科学研究已经证实,氧化苦参碱与苦参碱均是主要的毒性生物碱,其中苦参碱主要有神经毒性的作用。而氧化苦参碱向苦参碱的转化是造成血中氧化苦参碱浓度低与苦参碱浓度高的主要原因,这种转换可以影响氧化苦参碱与苦参碱的疗效与毒性,目前这种转化的机制尚无文献报道。因此,本论文以oxymatrine与]matrine为目标化合物,研究对比了山豆根提取物与氧化苦参碱纯品药代动力学特征,及氧化苦参碱生物转化的机理。附子、细辛中的主要有效成分之一去甲乌药碱（Higenamine）,具有强心与抗炎的作用,在我国去甲乌药碱现在已经进入Ⅱ期临床研究。但其安全性评价仍然存在巨大挑战。其中可直接影响去甲乌药碱药动学特征与药效作用的代谢特征缺失。文献报道,新西兰兔静脉给药去甲乌药碱后在尿液中可检测到主要有24-33%的去甲乌药碱葡萄糖醛酸化结合物,这可能是导致其低生物利用度的原因。因此,我们重点研究了去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢。因此,本文的研究目的是（1）以氧化苦参碱与苦参碱为特征性标志物,比较了单独给药氧化苦参碱单体与单独给药山豆根提取物的药动学特征差异,为山豆根的毒性预警和临床应用提供依据；（2）我们猜测造成山豆根提取物与氧化苦参碱单品药动学差异的原因是由于氧化苦参碱在体内向苦参碱的转化,因此进一步研究氧化苦参碱向苦参碱转化的代谢特征与机理；（3）为探寻去甲乌药碱低生物利用度的原因及代谢种属差异对药动学的影响,我们基于药物代谢酶研究去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢特征与代谢机理,为临床前研究及临床安全用药提供基本的理论基础。二、方法建立灵敏的UPLC-MS/MS检测方法,检测口服给药山豆根提取物与口服,静脉给药氧化苦参碱纯品大鼠血浆中OMT与MT的浓度,运用winnolin3.3进行数据模拟处理得到药动学参数。运用重组人源化CYP亚酶与化学抑制剂在无氧条件下进行体外微粒体孵育模型及高效液相色谱技术,进行氧化苦参碱代谢机理研究。采用重组人源化UGT亚酶与不同种属的肝微粒体进行体外孵育实验,研究去甲乌药碱的UGT代谢机理。统计学处理：数据用mean±SD来表示。统计软件SPSS13.0.采用统计方法independent-samples T-test或者One-way ANOVA进行数据分析。三、结果1.山豆根提取物中苦参碱（matrine）与氧化苦参碱（oxymatrine）的含量测定建立一种灵敏,可靠的HPLC方法测定山豆根提取物中的氧化苦参碱与苦参碱的含量,为确定药动学研究中的给药剂量提供依据。受试样品山豆根提取物中氧化苦参碱的含量为0.60%,苦参碱的含量为0.40%。2.大鼠口服山豆根提取物和OMT单体的药动学特征参数及生物利用度评价建立一种灵敏,可靠,快速的UPLC-MS/MS方法来检测大鼠血浆中的氧化苦参碱与苦参碱的血药浓度。大鼠灌胃或尾静脉给药后,采用后眼眶取血的方法分别完成大鼠口服给药山豆根提取物,口服与静脉给药氧化苦参碱单体的药代动力学实验。研究发现,大鼠口服氧化苦参碱单体2mg/kg与山豆根提取物（相当于氧化苦参碱2mg/kg,苦参碱1.3mg/kg）后,表现为不同的药动学行为,Cmax,AUC0→t,以及MRT0→t均有显着性差异（t-test, p<0.05）。大鼠口服山豆根提取物与口服氧化苦参碱单体后,血中可发现大量的苦参碱,氧化苦参碱的绝对生物利用度分别为1.87%,6.79%,均较低。我们将代谢产物苦参碱计入后,计算得到大鼠口服氧化苦参碱单体后,总生物碱（MT+OMT）的生物利用度为81.14±8.83%；口服山豆根提取物后,总生物碱（MT+OMT）的生物利用度为69.36士17.37%。3.OMT与MT血浆蛋白结合率实验我们采用操作简便,干扰小,省时高效的超滤法,来研究氧化苦参碱,苦参碱在大鼠血浆中的结合率。实验测得,氧化苦参碱的血浆蛋白结合率为4.80%-8.95%,苦参碱的血浆蛋白结合率为5.10-10.55%,这与之前的药动学实验中氧化苦参碱与苦参碱的快速消除相一致（静脉给药氧化苦参碱与苦参碱的半衰期分别为181.74士31.51min,249.20士76.21min）。4.OMT在人的肝脏与肠道微粒体中代谢生成MT的速率比较分别运用人的肝脏与肠道微粒体,进行体外孵育实验研究OMT在肝脏与肠道中代谢生成MT的酶动学特征,比较OMT在肠道与肝脏中的代谢速率差异。结果表明,OMT在肝脏中的速率与清除率均大于在肠道中（Vm肝脏1.49士0.24nmol/min/mg>Vm肠道0.46±0.05nmol/min/mg,CL肝脏0.0067ml/min/mg>CL肠道0.0031ml/min/mg）。5.CYP亚酶特异性化学抑制剂对OMT代谢生成MT的影响选用一系列CYP亚酶特异性化学抑制剂来（CYP1A2抑制剂马来酸氧氟沙明,CYP2C8抑制剂槲皮素,CYP2C9抑制剂盐酸胺碘酮,CYP2C19抑制剂奥美拉唑,CYP2D6抑制剂奎尼丁,CYP3A抑制剂酮康唑,CYP2E1抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸）研究负责参与OMT代谢生成MT的CYP酶亚型。结果表明,与对照组相比,加入CYP3A,2C19组的MT生成量均减少（p<0.05,one way ANOVA）,其中CYP3A组相对于对照组减少了50%以上,说明CYP3A主要参与了其代谢过程。6.人源重组化CYP亚酶纯酶实验选用人源重组化CYP纯酶验证参与OMT代谢生成MT的CYP酶亚型。结果表明,CYP3A4组的MT生产量显着高于其他组（CYP1A2,1B1,2D6,2C19,3A5,2C8,2B6,2A6,1A1.2E1）,说明CYP3A4主要负责OMT代谢生成MT。7.去甲乌药碱（Higenamine）的UGT代谢机理研究我们运用12种重组人源化UGT亚酶与Higenamine在高、中、低三个浓度（20μM,40μM,200μM）下进行孵育,分别考察它们在不同的人UGT同工酶中的代谢速率的差异。研究表明,UGT1A6,UGT1A8, UGT1A9参与去甲乌药碱的代谢,代谢速率大小顺序为：UGT1A9>UGT1A8> UGTIA6。UGT1A8最主要存在于人的肠道中,UGT1A6最主要存在于人的肝脏中,UGT1A9则几乎只在肝脏中表达,即我们推测去甲乌药碱的代谢器官主要是在肝脏和肠道。与此同时,运用重组人源化UGT亚酶,研究去甲乌药碱在主要负责其葡萄糖醛酸化代谢UGT亚酶中的酶代动力学特征。去甲乌药碱在UGT1A9中的代谢属于非经典米氏方程中的自身激活型（Autoactivation）,在UGT1A8中的代谢属于经典的米氏方程（Michaelis-Menten equation）。清除率Vmax/Km的大小是UGT1A9（0.0055ml/min/mg）>UGT1A8（0.0005ml/min/mg）。8.UGT亚酶化学抑制剂对去甲乌药碱（Higenamine）代谢影响的研究为进一步验证参与去甲乌药碱代谢的UGT酶亚型,我们考察了UGT特异性化学抑制剂：UGT1A6特异性化学抑制剂苯基丁氮酮（phenylbutazone）, UGT1A9特异性化学抑制剂香芹酚（carvacrol）对去甲乌药碱在人的肝脏中的葡萄糖醛酸化反应的影响。结果表明,与对照组相比,加入carvacrol的UGT1A9与Human Liver Microsome （HLM）反应体系中代谢产物的生产量随着抑制剂浓度的增加而降低（p<0.05, one way ANOVA）,而加入phenylbutazone组则没有该趋势。说明UGT1A9是去甲乌药碱在肝脏代谢的最主要亚酶,UGT1A6则不是。9.比较去甲乌药碱在肝脏与肠道微粒体中的酶代动力学特征的研究运用肝脏与肠道的微粒体,进行体外孵育实验,研究Higenamine在肝脏与肠道中的酶动学特征,比较Higenamine在肠道与肝脏中的代谢速率差异。结果表明,Higenamine在肝脏中的反应速率（6.81±1.73nmol/min/mg）要大于肠道（1.26±0.30nmol/min/mg）。10.去甲乌药碱在大鼠,小鼠,豚鼠,狗,人的肝微粒体中代谢速率差异的比较及酶动学特征研究根据文献报道,去甲乌药碱在兔,狗,人的药代动力学特征差异较大,我们猜测这可能是由于它的代谢差异造成的。为验证此假说,我们运用五种不同种属（大鼠,小鼠,豚鼠,狗,人）不同性别的肝微粒体研究Higenamine的葡萄糖醛酸化代谢速率与酶动学特征的差异。结果表明,Higenamine在五种不同种属的肝微粒体中的代谢速率与酶动学特征均存在显着性差异。Higenamine在雄性与雌性大鼠,小鼠的肝微粒体中的葡萄糖醛酸化代谢反应为底物抑制型（Substration inhibition）;在雌性及雄性的豚鼠,狗,人的肝微粒体中的代谢属于自身激活型（Autoactivation）。狗与人的葡萄糖醛酸化的酶代动力学特征最为接近,提示我们在今后模拟人体代谢的研究中可选用狗为实验动物。与此同时,我们研究了性别差异对去甲乌药碱葡萄糖醛酸化代谢的影响。结果表明,除了大鼠存在显着性的性别差异及狗在中浓度和高浓度存在显着性差异外,豚鼠,小鼠,人的去甲乌药碱葡萄糖醛酸化代谢无明显性别差异。四、结论1.大鼠口服氧化苦参碱单体2mg/kg与山豆根提取物（相当于氧化苦参碱2mg/kg,苦参碱1.3mg/kg）后,在血中发现均以苦参碱存在形式为主,且表现为不同的药动学行为,Cmax,AUC0→t,以及MRT0→t均有显着性差异（t-test, p<0.05）;氧化苦参碱的绝对生物利用度分别为1.87%,6.79%,均较低,我们猜测造成这两种生物利用度差异的原因可能是山豆根中的其他成分可能影响氧化苦参碱向苦参碱的转化过程；为阐明药动学差异的原因,进一步探寻该转化机理,发现OMT发生转化的器官在肝脏,OMT发生Ⅰ相还原反应生成MT,且反应主要由CYP3A4介导,这一转化过程直接影响了山豆根主要成分的生物利用度及其药动学特征。2. UGT1A6,UGT1A8,UGT1A9参与了去甲乌药碱的葡萄糖醛酸化代谢,推测它的主要代谢器官为肝脏,并且在肝脏中主要是由UGT1A9代谢；去甲乌药碱在五种不同种属的肝微粒体中表现为不同的酶代动力学特征,这可能是导致去甲乌药碱在不同种属动物体内的药动学特征不同的原因；狗与人的葡萄糖醛酸化的酶代动力学特征最为接近,提示我们在今后模拟人体代谢的研究中可选用狗为实验动物。
丁丽琴[8]（2012）在《牡丹皮化学成分及丹皮酚大鼠体内初步药代动力学研究》文中提出牡丹皮（Moutan Cortex）又名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮、洛阳花,为毛莨科芍药属植物牡丹（Paeonia SuffruticosaAndrews）的干燥根皮。味苦,辛:性微寒;归心、肝、肾经。具有清热凉血、活血化瘀之功效;主要用于治疗热入营血,温毒发斑,吐血衄血,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,痈肿疮毒,跌扑伤痛。本论文对牡丹皮的70%乙醇提取物进行研究,利用溶剂分布萃取法和各种色谱手段从中分离得到64个化合物,并根据理化常数及光谱数据分析（[α]、UV、IR、1D-NMR、2D-NMR、MS等）鉴定了其结构,新化合物1～12解析为:paeoniflorin B（）、oxypaeoniflorin sulfonate（2）、4-O-甲基氧化芍药苷（4-O-methyloxypaeoniflorin,3）、oxypaeonidanin（4）、9-O-butyloxypaeonidanin（5）、9-O-butylpaeonidanin（6）、4-O-butyloxypaeoniflorin（7）、9-epi-oxypaeonidanin（8）、4-O-methylgalloyloxypaeoniflorin（9）、paeoniflorin A（10）、mudanoside C（11）、（E）-icosyl 3-（2,4,5-trihydroxyphenyl）acrylate（12）;已知化合物测定为:芍药苷（paeoniflorin,13）、paeonidanin（14）、4-O-甲基芍药苷（4-O-methylpaeoniflorin,15）、苯甲酿芍药苷（benzoylpaeoniflorin,16）、mudanpiosideE（17）、氧化芍药苷（oxypaeoniflorin,18）、苯甲酿氧芍药苷（benzoyloxypaeoniflorin,19）、牡丹皮苷D（mudanpiosideD,20）、牡丹皮苷C（mudanpiosideC,21）、8-0-去苯甲酰基芍药苷（8-O-debenzoylpaeoniflorin,22）、没食子酰氧芍药苷（galloyloxypaeoniflorin,23）、没食子酰芍药苷（galloylpaeoniflorin,24）、牡丹皮苷B（moudanpioside B,25）、牡丹皮苷F（moudanpioside F,26）、4-0-丁基芍药苷（4-O-butylpaeoniflorin,27）、paeoniflorigenone（28）、paeonidanin A（29）、4-O-甲基苯甲酰芍药苷（4-O-methylbenzoylpaeoniflorin,30）、丹皮酚原苷（paeonolide,31）、丹皮酚苷（paeonoside,32）、mudanosideB（33）、suffruticosideD（34）、suffruticosideA（35）、suffruticosideB（36）、3-O-β-D-glucopyranosyl-4-methoxyacetophenone（37）、丹皮酚（paeonol,38）、1-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）ethanone（39）、2,3-dihydroxy-4-methoxyacetophenone（40）、丹皮酚新苷（apiopaeonoside,41）、iriflophenone 2-O-β-D-glucopyranoside（42）、cadina-4,1 1-dien-14-oic acid（43）、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-galloylglucose,44）、1,3,4-三没食子酰葡萄糖（1,3,4-trigalloylglucose,45）、1,2,3,4-四没食子酰葡萄糖（1,2,3,4-tetragalloylglucose,46）、（-）-儿茶素（（-）-catechin,47）、齐墩果酸（oleanolicacid,48）、尿啼啶（uridine,49）、α-乙基-阿拉伯糖（α-L-arabinopyranosideethyl,50）、β-谷甾醇（3-sitosterol,51）、富马酸单乙酯（mono-ethyl fumarate,52）、富马酸二丁酿（dibutyl fumarate,53）、香草酸（vanillic acide,54）、马来酸单甲酯（mono-methyl maleate,55）、邻苯二甲酸二丁酿（phthalic acid dibutyl ester,56）、没食子酸（gallic acid,57）、没食子酸甲酯（methyl gallate,58）、没食子酸乙酯（ethyl gallate,59）、没食子酸丁酯（butyl gallate,60）、棕榈酸甲酯（methyl palmitate,61）、十五烷酸（pentadecanoic acid,62）、对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid,63）、苯甲酸（benzoic acid,64）。其中12个（化合物1-12）为新化合物,9个（化合物37,42,43,47,49,50,52,53,55）为首次从该属植物中分离得到。上述研究结果丰富了牡丹皮化学成分的结构类型,同时为进一步的生物活性研究奠定了物质基础。一氧化氮（NO）是在生物体内由L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）在一氧化氮合酶（NOS）的作用下生成的一种无机小分子自由基,是一种生物体内重要的信使分子和神经递质,参与调节机体的许多生理或病理过程,如血管舒张,非特异性宿主防御反应,局部缺血再灌损伤,慢性或急性炎症反应等。研究证实在一些类型的细胞如巨噬细胞,上皮细胞,和平滑肌细胞中通过应答一些前炎症因子如白介素-lβ（IL-1β）,肿瘤坏死因子（TNF-α）和脂多糖（LPS）等的刺激可以刺激其中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达而导致过量产生NO。论文采用Griess法考察了其中58个化合物抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7NO的释放活性,结果表明有13 个化合物（1,10,19,21,24,26,28,30,35,55,58,59,60）表现出比阳性药物更强的抑制活性。另外,11个化合物（4,22,32,33,36,37,39,43,51,53,62）表现出不同程度的抑制活性。这些化合物对NO的抑制作用初步阐明了牡丹皮发挥抗炎活性的药效物质。丹皮酚为牡丹皮中主要活性成分之一,2010版《中华人民共和国药典》（一部）规定其含量不得少于1.2%,近年来研究表明丹皮酚具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用。文献调研发现,丹皮酚生物利用度较低,仅有少数文献报道丹皮酚在大鼠体内的代谢转化情况,在人体内代谢研究报道更是少之又少,前期本课题组从受试者口服丹皮酚片后收集的尿液中分离得到5个代谢产物,resacetophenone（M1）,resacetophenone-2-O-sulfate（M2）,2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O-sulfate（M3）,2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O-glucopyranuronoside（M4）,2-hydroxyacetophenone-4-O-glucopyranuronoside（M5）,并采用UPLC/Q-TOF-MS2技术,初步分析和鉴定了丹皮酚在人尿液,大鼠尿液、血浆和胆汁中的代谢产物。本论文在其工作基础上进行补充和完善,系统分析了丹皮酚在生物体内的代谢情况;并对前期得到的代谢产物M1-M5,后期得到的M6（2,5-dihydroxy-4-methoxyacetophenone）和化学合成得到的 M10（2,4,5-trihydroxyacetophenone）进行抑制LPS激活巨噬细胞释放NO的活性和清除DPPH和·OH自由基的活性测试,活性结果表明M6,M10活性较强,丹皮酚、M1、M3、M5也有一定程度的清除.OH活性。本论文初步建立了快速、灵敏的UPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中丹皮酚及其代谢产物M1,M2,M4-M6的浓度,研究了大鼠灌胃丹皮酚的吸收动力学特征。实验结果显示,丹皮酚和代谢产物分别在50～4000 ng/mL,12.5～1000 ng/mL范围内线性关系良好,丹皮酚和各代谢产物在体内的血药浓度和排泄速率各不同,且代谢产物的血药浓度与给药剂量相关。这些结果为进一步研究丹皮酚在体内的代谢情况提供了重要信息,同时,也为临床合理用药和系统的药代动力学研究提供参考。
谢远[9]（2012）在《氨基酸对妊娠小鼠子宫自发收缩的影响研究》文中提出子宫不规律收缩是早产的最明显迹象,一般发生在妊娠早期和中后期,子宫平滑肌处于静止状态对于妊娠维持至关重要。大量研究表明,氨基酸对子宫平滑肌的收缩具有调节作用。本论文首先利用RM6240BD型多道生理信号采集系统对组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、异亮氨酸（Ile）苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）等9种常见氨基酸在1、5、10mmol-L-1浓度梯度下对非妊娠期小鼠子宫平滑肌收缩的影响进行了研究,结果表明His在该浓度梯度下对非妊娠小鼠子宫肌条收缩的平均抑制率分别为29.0%、78.0%和100.0%；Arg为3.8%、32.6%和35.1%；Cys、Gln、Ile、Phe、Met分别在-9.3%～-91.6%、-7.0%～-44.0%、-1.0%～-107.4%、-2.8%～-27.7%和9.3%～-100.1%范围；而Leu和Lys的抑制率均小于±20%,说明Arg和His对非妊娠小鼠子宫平滑肌的收缩有明显抑制作用；Cys、Gln、 Ile、Phe和Met具有促收缩作用；Leu和Lys对非妊娠小鼠子宫平滑肌的收缩作用不明显。本论文进一步研究了Arg和His在0.1、0.5、1、2、5、10mmol·L-1浓度梯度下对妊娠中后期（15.5dpc）及产前期（17.5dpc和18.5dpc）孕鼠子宫平滑肌自发收缩的影响,得到在该浓度梯度下Arg对15.5dpc、17.5dpc和18.5dpc三个时期孕鼠子宫收缩的抑制率分别为（27.6±6.3）%～（100.0±0）%、（31.3±15.6）%～（52.4±17.7）%和（32.2±14.4）%～（69.4±9.3）%；His的抑制率为（34.0±5.3）%～（100.0±0）%、（21.1±2.8）%～（100.0±0）%和（26.5±11.5）%～（100.0±0）%,Arg和His在浓度达到5mmol·L-1时可以完全抑15.5dpc孕鼠子宫平滑肌收缩,不能完全抑制18.5dpc孕鼠子宫平滑肌收缩,His在浓度达到10mmol·L-1时可以完全抑制15.5dpc、17.5dpc和18.5dpc孕鼠子宫平滑肌收缩,而Arg在浓度达到10mmol·L-1时只能对15.5dpc孕鼠子宫平滑肌收缩产生完全抑制,表明Arg对15.5dpc孕鼠子宫收缩的抑制作用具特异性,并且不同时期孕鼠子宫对同一浓度氨基酸的敏感程度不同。本文还运用LC-MS/MS法测定了15.5dpc和18.5dpc两个时期孕鼠血清中Arg和His的浓度,得到15.5dpc孕鼠血清的Arg和His含量分别为（325.69±41.79） μmol·L-1和（139.70±67.07） μmol·L-1,18.5dpc孕鼠血清中Arg和His含量分别为（182.08±6.53）μmol·L-1和（117.4±24.53） μmol·L-1,结果表明两个时期孕鼠血清中这两种氨基酸生理浓度大小差异明显,在15.5dpc孕鼠血清中含量较高,有利于抑制孕鼠子宫收缩,18.5dpc孕鼠血清中含量均较低,有利于分娩发动,说明这两种氨基酸在小鼠妊娠的维持过程中发挥着重要作用,有可能作为妊娠中后期的维持药物来预防早产,由于Arg对15.5dpc孕鼠子宫收缩的抑制作用更具特异性,可能更适于作为妊娠中后期的抗早产药物,可为开发新型氨基酸抗早产药物提供实验基础和理论依据。
莫镇涛[10]（2012）在《β-细辛醚对缺糖缺氧PC12细胞自噬的影响》文中研究说明目的：1.研究PC12细胞在缺糖缺氧（2h）再给氧过程中ATP与Beclin-1的相关性。2.研究自噬在PC12细胞缺糖缺氧（2h）再给氧过程中的的作用。3.研究β-细辛醚对缺糖缺氧再给氧PC12细胞Beclin-1、线粒体膜电位（MMP）、细胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i）、细胞成活率、细胞形态的影响。方法：1.建立缺糖缺氧再给氧PC12细胞损伤模型：将高糖DMEM完全培养液换为无糖的Earle’s平衡盐溶液,并将培养板放入1%O2、94%N2和5%CO2的培养箱培养2h,作为模拟细胞缺糖缺氧的状态,然后弃Earle’s平衡盐溶液并换回高糖DMEM完全培养液,并将培养板放入5%CO2的培养箱培养模拟再给氧状态。2.建立高效液相（HPLC）检测ATP的方法学：通过设置阴性对照组,标准品对照组,样品对照组,考察细胞提取液ATP检测的专属性；精密称取10.0mgATP并用双蒸水溶解定容至10mL。精密量取以上1.00mg/mL ATP标准液0.5mL定容至10mL,浓度即为50.0μg/mL。依次精密量取50.0μg/mL ATP标准液16、32、48、64、80μL并用双蒸水定容至10mL,浓度依次为0.080、0.160、0.240、0.320、0.400ng/mL。进样器精密吸取20μL进样。在0.080-0.400mg/mL范围内,考察ATP浓度与峰面积的线性关系；取0.080、0.240、0.400μg的低、中、高三种不同的ATP对照品溶液各一份,连续进样五次,考察精密度；取再给氧0、10、24h3个不同时点的细胞各5份,分别加入600μL PBS重悬,然后加入80μL50%的HCl04-80℃/室温反复冻融2次,分别加入0.1、0.2、0.4μg/mLATP标准溶液1mL,再用300μL,2mol/LNaOH将细胞提取液的pH值调至中性,4℃12000r/min离心15min,取上清液进行测定,考察平均回收率。将处理后的再给氧24h的细胞提取液于-80℃放置Od、3d、7d检测,考察样品储存的稳定性。3.建立流式细胞仪检测Beclin-1的方法学：包括考察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）,2%牛血清的PBS封闭液,一抗的浓度(0.002、0.004、0.006μg/μL孵育温度（25、37℃）,孵育时间（15、30、60min）,保存方法及时间（标本标记制备后立即检测和4℃放置6h、24h上机检测；或用1%多聚甲醛固定后4℃保存放置1、3、7d检测）对Beclin-1蛋白测定的影响。4.研究自噬的作用及自噬与ATP关系。体外培养PC12细胞48h,弃细胞完全培养液,PBS洗一遍后,加入Earle’s平衡盐溶液并放入1%O2、94%N2和5%CO2的培养箱中培养2h,然后弃Earle’s平衡盐溶液并换回细胞完全培养液培养0,4,10,24,,18h,HPLC检测ATP（并检测24h的正常对照组ATP）,BCA法检测蛋白含量,流式细胞仪检测Beclin-1,MTT法检测细胞活力,倒置相差显微镜下观察细胞形态。透射电子显微镜下观察正常培养PC12细胞与再给氧24h PC12细胞的自噬体数量和形态。将同一孔的再给氧0、24h的细胞分别分成两份,一份用于检测ATP含量,另一份用于检测Beclin-1表达,并做两者的相关性分析。13-细辛醚对缺糖缺氧再给氧PC12细胞自噬的影响：体外培养PC12细胞48后,分别用含β-细辛醚（20、30、45μg/mL）,尼莫地平（10μmol/L）的细胞完全培养液预给药1h后,弃药液,PBS洗1遍,分别加入含β-细辛醚（20、30、45μg/mL）、尼莫地平（10μmol/L）的Earle’s平衡盐溶液并放入1%02、94%N2和5%CO2的培养箱中培养2h,然后弃Earle’s平衡盐溶液并换回细胞完全培养液培养24小时,流式细胞仪检测Beclin-1,MMP,[Ca2+]i,MTT法检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞数量和形态,透射电子显微镜观察自噬体。6.统计分析方法：数据以均数±标准差（x±s）表示,采用独立样本t检测法检测组间的差异性和Pearson相关性分析法分析两指标之间的相关性。结果：1.在0.08-0.40mg/mL范围内,ATP浓度与峰面积有良好的线性关系（r=0.9995）；连续测定5次0.080,0.240,0.400μg/mL ATP的峰面积,RSD分别为2.8、2.1、1.8%,精密度良好；测得再给氧0、10、24h3个不同时点细胞提取液的平均回收率为95.6±2.8%,RSD为2.9%,准确度良好；-80℃冰箱储存0,3,7d,ATP浓度分别为0.331±0.010,0.312±0.012,0.303±0.008μg/mL,RSD为4.5%,储存7天内稳定性良好。2.正常细胞的Beclin-1表达很低（6.49±1.19%）,但缺糖缺氧再给氧后,Beclin-1表达显着升高（33.14±2.16%）。自噬抑制剂3-MA能够显着降低模型组Beclin-1表达（15.27±1.51%vs模型组,P<0.001）。标本标记过程中使用2%BSA/PBS与不使2%BSA/PBS测得的Beclin-1表达率分别是35.40±2.13%和43.99±7.26%,两者有统计学差异（P<0.01）一抗浓度为0.004μg/μL时,测得的Beclin-1表达率最高（35.40±2.13%）,一抗浓度为0.002、0.006时,测得的Beclin-1表达率均所下降（分别为33.54±2.27%,29.95±1.76%）；抗体孵育温度在室温（25℃）和37℃水浴时,测得的Beclin-1表达率无显着性差异（36.27±3.29%vs36.70±2.84%6,P>0.05）；孵育时间30min、60min检测结果无统计学差异（36.38±3.51%vs36.36±3.64%,P>0.05）,但孵育时间15min时,测得的Beclin-1表达率有所降低（31.67±3.76%vs36.38±3.51%,P<0.05）；标本制备后立即检测和放置于4℃保存6h检测结果无显着性差异（36.30±3.29%vs34.93±3.38%,P>0.05）,但4℃保存24h检测结果明显下降（20.81±3.99%vs36.30±3.29%,P<0.001）；标记制备后的标本固定在1%多聚甲醛中并置放于4℃可保存3天其检测结果与当天检测的结果无显着性差异（36.59±3.19%vs37.67±3.38%,P>0.05）,第7天检测结果则明显下降。（24.04±3.83%vs37.67±3.38%,P<0.001）。3.PC12细胞缺糖缺氧2h再给氧期间,细胞成活率、细胞ATP含量先降低后升高,Beclin-1表达先升高后降低,细胞形态的变化是先损伤后改善。PC12细胞缺糖缺氧2h,再给氧0、4、10h,细胞成活率持续下降（64.6±4.6%、51.8±1.6%、36.0±5.6%）,再给氧24、48h细胞成活率持续上升（56.8±3.7%、73.4±4.3%）。再给氧0、4h细胞ATP含量持续下降（3.4±0.5、3.2±0.4mg/g蛋白）,10h有所恢复（4.1±0.7mg/g蛋白）,但是仍低于缺氧前水平（4.6±0.9mg/g蛋白）,再给氧24、48h,细胞ATP含量持续升高（5.4±0.9、6.7±1.2mg/g蛋白）。再给氧24h细胞ATP含量显着低于正常对照组（5.4±0.9mg/g蛋白vs7.7±1.2mg/g蛋白,p<0.001）。再给氧0、4、10、24,48h,Beclin-1蛋白表达上调（10.5±1.4%、12.7±1.4%、16.1±1.8%、28.2±3.1%、20.0±3.2%）,再给氧48h与再给氧24h相比,Beclin-1蛋白表达下调。再给氧0、4、10h,细胞数量持续减少,并在10h时减少至最低值,突起变短,细胞变圆变小,皱缩聚集。再给氧24h,细胞数量增加,胞体变得较为饱满,轴突变长。再给氧48h,细胞数量增加,胞体变得饱满,突起相互交织形成网状。正常培养的细胞较难观察到自噬体,再给氧24h的细胞可明显观察到一些自噬体。再给氧0h,ATP与Beclin-1呈显着负相关关系（r=-0.61,P<0.05）,再给氧24h,ATP与Beclin-1没有显着相关性（r=0.24,P>0.05）。4.体外正常培养48h的PC12细胞缺糖缺氧2h,再给氧24h后,在光镜下可观察到细胞数量减少,胞体变圆,轴突变细长；在电镜下能够明显观察到一些自噬体；Beclin-1表达显着增加（28.5±2.3%,vs正常组（6.3±0.8%）,p<0.001）,OD值显着降低（0.46±0.02,vs正常组（0.79±0.04）,p<0.001）；MMP显着降低（335.2±19.3,vs正常组（542.5±26.6）,p<0.001）；[Ca2+]i显着升高（294.9±42.7,vs正常组（124.7±14.9）,p<0.001）。β-细辛醚（20,30,45μg/mL）和尼莫地平（10μmol/L）都非常显着地降低模型组细胞Beclin-1表达（19.1±2.8%、17.6±2.6%、20.5±2.8%、15.6±2.5%,vs模型组,p<0.001）和[Ca2+]i（137.8±23.5、132.4±25.5、169.7±23.9、139.0±19.0,vs模型组p<0.001）,升高模型组细胞的OD值（0.64±0.07,0.75±0.09,0.56±0.08,0.74±0.04,vs模型组,p<0.01）和MMP（422.4±27.5,478.7±21.6,414.1±25.1,483.5±28.2,vs模型组,p<0.01）,并且不同程度地增加造模细胞数量,改善细胞形态。其中β-细辛醚（30μg/mL）使模型组细胞的活力和[Ca2+]i接近于正常组水平（P>0.05）。结论：1.使用终浓度约为6%的HCLO4反复冻融细胞2次能够较好的提取细胞内ATP。HPLC能够分离细胞内的复杂成分,并且快速、准确定量分析细胞内ATP含量。2.流式细胞仪和透射电子显微镜的研究结果表明,缺糖缺氧再给氧使PC12细胞自噬表达增加。流式细胞仪能够简便、快速、准确地定量细胞Beclin-1的相对百分含量。筛选分析结果表明,优化的流式细胞仪检测Beclin-1蛋白的参数是：标记过程中使用2%牛血清的PBS封闭液；一抗浓度为0.004μg/μL;孵育温度室温（25℃）,孵育时间30min；标记制备后标本立即检测或置4℃保存6h内检测,否则要固定在1%多聚甲醛并于4℃保存,3天内检测。3.PC12细胞缺糖缺氧期间升高的自噬与能量代谢障碍有关,再给氧期间升高的自噬与[Ca2+]i、降低的MMP有关。自噬在2h缺糖缺氧再给氧期间可能起到细胞保护的作用。4.20、30、45μg/mL的p-细辛醚预给药1h,缺糖缺氧期间给药2h,能不同程度地减轻缺糖缺氧再给氧造成的细胞损伤,其中以30μg/mL的β-细辛醚效果最佳。p-细辛醚可能通过钙离子拮抗作用,改善细胞功能,从而降低自噬,提高细胞成活率。
二、高浓度葡萄糖对兔十二指肠自律性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高浓度葡萄糖对兔十二指肠自律性的影响（论文提纲范文）
（2）仲景消渴证治思想及白虎加人参汤改善MKR转基因小鼠2型糖尿病的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 仲景消渴证治思想 |
| 2 白虎加人参汤组方原理 |
| 第二章 实验部分 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
（3）新疆黑果小檗根部成分分析及体外抑菌活性初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容 |
| 1 新疆黑果小檗根化学成分初步研究 |
| 1.1 初步定性试验 |
| 1.2 黑果小檗根皮总生物碱含量测定方法对比研究 |
| 1.3 黑果小檗根皮和根木质部中总生物碱含量测定 |
| 1.4 黑果小檗根皮总生物碱提取工艺考察与优化 |
| 2 黑果小檗根皮5%硫酸提取物的分离纯化、定性定量分析 |
| 2.1 试药与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 黑果小檗根部成分体外抑菌活性研究 |
| 3.1 试药与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 指导教师评阅意见表 |
（4）齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷临床前药代动力学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 三萜类化合物概况 |
| 1.2 五环三萜类化合物的吸收及体内处置 |
| 1.3 药物吸收研究方法 |
| 1.4 齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷和齐墩果酸研究背景 |
| 1.4.1 齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷 |
| 1.4.2 齐墩果酸 |
| 1.5 研究方案及目标 |
| 第2章 药物动力学研究 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 药品与试剂 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 标准溶液配制 |
| 2.1.4 给药与样品采集方案 |
| 2.1.5 血浆样品测定 |
| 2.1.6 分析方法确证 |
| 2.1.7 未知样品测定与质量控制 |
| 2.1.8 数据处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠给药后血药浓度及药代动力学参数 |
| 2.2.2 犬给药后血药浓度及药代动力学参数 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 LC-MS/MS分析方法的建立及优化 |
| 2.3.2 大鼠体内的药代动力学 |
| 2.3.3 比格犬体内的药代动力学 |
| 第3章 组织分布试验 |
| 3.1 组织分布研究 |
| 3.1.1 药品与试剂 |
| 3.1.2 大鼠灌胃用药配制 |
| 3.1.3 给药与样品采集方案 |
| 3.1.4 组织样品测定 |
| 3.1.5 分析方法确证 |
| 3.1.6 未知样品测定 |
| 3.1.7 结果 |
| 3.2 血浆蛋白结合率 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方案 |
| 3.2.4 测定方法 |
| 3.2.5 稳定性考察 |
| 3.2.6 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 组织分布 |
| 3.3.2 血浆蛋白结合率 |
| 第4章 代谢与排泄试验 |
| 4.1 代谢产物鉴定 |
| 4.1.1 药品与试剂 |
| 4.1.2 给药与样品采集 |
| 4.1.3 生物样品的测定 |
| 4.1.4 结果 |
| 4.2 排泄试验 |
| 4.2.1 CE和OA的定量分析 |
| 4.2.2 CE同分异构体的相对定量分析 |
| 4.3 结论 |
| 4.3.1 代谢研究 |
| 4.3.2 排泄研究 |
| 第5章 CE对大鼠肝微粒体CYP450酶影响的研究 |
| 5.1 CE对大鼠肝微粒体蛋白影响 |
| 5.1.1 药品与试剂 |
| 5.1.2 仪器与设备 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.1.4 给药方案 |
| 5.1.5 肝微粒体的制备 |
| 5.1.6 肝微粒体蛋白浓度及CYP 450含量测定 |
| 5.1.7 结果 |
| 5.2 CE对大鼠主要肝微粒体酶活性的影响 |
| 5.2.1 肝微粒体的孵育体系 |
| 5.2.2 样品前处理流程 |
| 5.2.3 肝微粒体孵化样品的测定 |
| 5.2.4 结果 |
| 5.2.5 结论 |
| 第6章 CE在大鼠体内的吸收机制研究 |
| 6.1 仪器与试剂 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 大鼠肠道内容物中的代谢转化 |
| 6.2.3 大鼠肠S9、肠微粒体及肝微粒体中的葡萄糖醛酸结合 |
| 6.2.4 Caco-2细胞和MDCK-MDR1细胞单层双向跨膜转运试验 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 CE在大鼠肠道内容物中的水解 |
| 6.3.2 苷元OA在大鼠肠S9、肝S9及肠液中的葡萄糖醛酸结合 |
| 6.3.3 CE的细胞单层渗透性 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（5）硫化氢对大鼠十二指肠运动的影响及其机制（论文提纲范文）
| 目录 |
| CATALAGUE |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词和中文对照 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
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| 英文论文全文(一) |
| 英文论文全文(二) |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）效阈浓度下复方四种单体及其配伍的细胞生物效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词 |
| 第一部分 综述 |
| 综述一 方剂现代实验研究进展 |
| 1 方剂功效与机理研究 |
| 2 方剂的配伍研究 |
| 3 方剂效用物质基础研究 |
| 4 方剂与病证关系的研究 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 葛根黄芩黄连汤的研究进展 |
| 1 葛根黄芩黄连汤的现代实验研究 |
| 2 葛根黄芩黄连汤的现代临床应用 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 胰岛素抵抗细胞模型的研究进展 |
| 1 胰岛素抵抗(IR)的概述 |
| 2 IR的体外细胞模型研究 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 效阈浓度下复方四种单体及其配伍的细胞生物效应 |
| 前言 |
| 1 方剂现代研究概述 |
| 2 方剂作用原理的探索 |
| 3 方剂效应物质基础的探索 |
| 4 对方剂效应的认识 |
| 5 思考及问题提出 |
| 6 对方剂效应的新认识 |
| 7 本课题研究内容及目标 |
| 参考文献 |
| 研究一 3T3-L1前脂肪细胞的分化诱导及四种中药单体对细胞活力的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 3T3-L1脂肪细胞IR模型的建立及四种中药单体对IR模型细胞糖消耗及摄取的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 效阈浓度下四种单体配伍对IR模型细胞的效应观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 简历 |
（7）（氧化）苦参碱与去甲乌药碱药代动力学特征与代谢机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 山豆根的研究进展 |
| 1.1.1 临床应用 |
| 1.1.2 毒性反应 |
| 1.1.3 山豆根活性成分药代动力学研究进展 |
| 1.2 去甲乌药碱的研究概况 |
| 1.2.1 Higenamine的药理作用 |
| 1.2.2 Higenamine的药动学研究进展 |
| 1.3 药物代谢酶 |
| 1.3.1 氧化酶 |
| 1.3.2 还原酶 |
| 1.3.3 水解酶 |
| 1.3.4 肠道中的细菌还原水解反应 |
| 1.3.5 药物转移酶 |
| 第二章 立题依据 |
| 2.1 山豆根提取物及氧化苦参碱的药代动力学研究的立题依据 |
| 2.2 去甲乌药碱的代谢机理研究的立题依据 |
| 第三章 山豆根提取物与氧化苦参碱(Oxymatrine)药代动力学研究 |
| 3.1 研究方法与技术 |
| 3.1.1 材料与仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 方法学考察 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 口服给药山豆根提取物在大鼠体内的药代动力学研究 |
| 3.2.1 口服给药山豆根提取物在大鼠体内的药代动力学研究 |
| 3.2.2 口服及静脉给药氧化苦参碱在大鼠体内的药代动力学研究 |
| 3.2.3 氧化苦参碱与苦参碱血浆蛋白结合率研究 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 氧化苦参碱代谢生成苦参碱的机理研究 |
| 4.1 研究方法与技术 |
| 4.1.1 材料与仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 去甲乌药碱的UGT代谢机理研究 |
| 5.1 研究方法与技术 |
| 5.1.1 材料与仪器 |
| 5.1.2 Higenamine的UPLC方法学考察 |
| 5.1.3 Higenamine的稳定性考察 |
| 5.1.4 Higenamine的葡萄糖醛酸化代谢体系的建立 |
| 5.1.5 LC/MS/MS及HRMS鉴定Higenamine及其UGTs代谢产物 |
| 5.1.6 Higenamine及其UGTs代谢物的浓度转换因子 |
| 5.1.7 葡萄糖醛酸化代谢速率的计算 |
| 5.1.8 酶代动力学分析 |
| 5.1.9 统计分析 |
| 5.2 研究结果 |
| 5.2.1 Higenamine葡萄糖醛酸化代谢产物的结构鉴定 |
| 5.2.2 Higenamine的UGT代谢机理及Higenamine在参与代谢的主要UGTisoform中的酶动学研究 |
| 5.2.3 UGT特异性化学抑制剂实验 |
| 5.2.4 人肝、肠微粒体对Higenamine的代谢研究 |
| 5.2.5 去甲乌药碱在大鼠,小鼠,豚鼠,狗,人的肝微粒体中代谢速率差异的比较及酶动学考察 |
| 5.2.6 同种动物不同性别的肝微粒体代谢酶对Higenamine的葡萄糖醛酸化影响 |
| 5.3 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）牡丹皮化学成分及丹皮酚大鼠体内初步药代动力学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一章 芍药属植物的研究概况 |
| 第一节 芍药属植物化学成分研究 |
| 第二节 芍药属植物的药理作用研究 |
| 第三节 立题依据 |
| 参考文献 |
| 第二章 牡丹皮的化学成分研究 |
| 第一节 化合物的结构,编号及鉴定方法 |
| 第二节 化合物的结构鉴定 |
| 参考文献 |
| 第三章 实验部分 |
| 第一节 实验仪器与材料 |
| 第二节 牡丹皮化学成分的提取分离 |
| 第三节 单萜苷酸水解、糖的衍生化及GC分析 |
| 第四章 生物活性测试 |
| 第一节 抑制大鼠巨噬细胞释放NO活性 |
| 第二节 活性实验结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 丹皮酚研究概况 |
| 第一节 丹皮酚的药理作用和急性毒性实验 |
| 第二节 丹皮酚的体内代谢和药代动力学研究 |
| 第三节 立题依据 |
| 参考文献 |
| 第六章 丹皮酚体内代谢产物、生物活性及大鼠体内初步药代动力学研究 |
| 第一节 丹皮酚体内代谢研究 |
| 第二节 丹皮酚及代谢产物生物活性测试 |
| 第三节 丹皮酚大鼠体内初步药代动力学研究 |
| 参考文献 |
| 第七章 小结与讨论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 发明专利 |
| 附图 |
| 附件 |
（9）氨基酸对妊娠小鼠子宫自发收缩的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 结构氨基酸的研究概述 |
| 1.1.1 结构氨基酸的理化性质 |
| 1.1.2 结构氨基酸的分类 |
| 1.1.3 结构氨基酸的功能 |
| 1.1.4 游离氨基酸水平与生理状态的相关性 |
| 1.1.5 氨基酸的测定方法 |
| 1.2 平滑肌概述 |
| 1.2.1 平滑肌的分布与分类 |
| 1.2.2 平滑肌与功能 |
| 1.2.3 氨基酸对平滑肌收缩的调节 |
| 1.3 本论文研究的目的、内容及意义 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 研究意义 |
| 第2章 氨基酸对小鼠子宫平滑肌收缩的影响研究 |
| 2.1 氨基酸对小鼠子宫收缩筛选实验 |
| 2.1.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.2 实验方法与结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.2 精氨酸和组氨酸对妊娠中后期及产前期小鼠子宫收缩影响实验 |
| 2.2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2.2 实验方法与结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 妊娠期小鼠血清中游离精氨酸和组氨酸的含量测定 |
| 2.3.1 实验仪器与试剂 |
| 2.3.2 实验方法与结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 妊娠期小鼠血清中氨基酸成分总离子流图 |
| 附录2 妊娠期小鼠血清中游离精氨酸和组氨酸质谱多反应监测图 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（10）β-细辛醚对缺糖缺氧PC12细胞自噬的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 石菖蒲的研究概况 |
| 一、石菖蒲的临床研究 |
| 二、化学成分研究 |
| 三、药代动力学研究 |
| 四、石菖蒲的药理学研究 |
| 五、小结 |
| 第二节 脑能量代谢的研究概况 |
| 一、脑能量代谢的特点 |
| 二、脑能量代谢的调节 |
| 三、脑能量代谢信号通路 |
| 四、脑缺血再灌注与脑能量代谢障碍 |
| 五、神经退行性变疾病与脑能量代谢障碍 |
| 六、脑能量代谢的研究方法 |
| 七、中药改善脑能量代谢 |
| 八、小结 |
| 第三节 自噬的研究概况 |
| 一、自噬的分类 |
| 二、自噬的发生过程和形态学基本特征 |
| 三、自噬的发生的分子机制 |
| 四、自噬的生理病理意义 |
| 五、自噬与细胞死亡的关系 |
| 六、缺血缺氧后自噬的调控机制 |
| 七、自噬的研究方法 |
| 八、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 缺糖缺氧再给氧对PC12细胞自噬的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二节 β-细辛醚对缺糖缺氧PC12细胞自噬的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 结语 |
| 一、研究思路 |
| 二、研究结论 |
| 三、创新性 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略语表 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
四、高浓度葡萄糖对兔十二指肠自律性的影响（论文参考文献）
- [1]中国心力衰竭患者离子管理专家共识[J]. ChineseHeartFailureAssociationofChineseMedicalDoctorAssociation;NationalExpertCommitteeonCardiovascularDiseasesandProfessionalCommitteeonHeartFailure;EditorialBoardofChineseJournarofHeartFailureandCardiomyopathy. 中华心力衰竭和心肌病杂志, 2020(01)
- [2]仲景消渴证治思想及白虎加人参汤改善MKR转基因小鼠2型糖尿病的作用研究[D]. 刘旭. 湖南中医药大学, 2019(02)
- [3]新疆黑果小檗根部成分分析及体外抑菌活性初步研究[D]. 张婷婷. 新疆医科大学, 2017(05)
- [4]齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷临床前药代动力学研究[D]. 史美云. 吉林大学, 2015(01)
- [5]硫化氢对大鼠十二指肠运动的影响及其机制[D]. 路雯. 山东大学, 2013(04)
- [6]效阈浓度下复方四种单体及其配伍的细胞生物效应[D]. 张敬升. 北京中医药大学, 2013(10)
- [7]（氧化）苦参碱与去甲乌药碱药代动力学特征与代谢机理[D]. 董玲娜. 南方医科大学, 2013(03)
- [8]牡丹皮化学成分及丹皮酚大鼠体内初步药代动力学研究[D]. 丁丽琴. 沈阳药科大学, 2012(03)
- [9]氨基酸对妊娠小鼠子宫自发收缩的影响研究[D]. 谢远. 西南交通大学, 2012(11)
- [10]β-细辛醚对缺糖缺氧PC12细胞自噬的影响[D]. 莫镇涛. 广州中医药大学, 2012(09)