一、mRNA Expression Alteration of Inward Rectifier Potassium Channels in Rats Brain with Cholinergic Impairment（论文文献综述）
刘敏[1]（2020）在《KATP通道SUR1亚单位在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究》文中研究表明帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是继阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）之后的第二大神经退行性疾病,是一种常见且复杂的神经系统退行性疾病,其主要特征是肌僵直、静止性震颤、运动迟缓和姿势反射障碍等运动症状。此外,PD患者在早期还表现出认知功能障碍、精神异常和自主神经功能障碍等一系列非运动症状。PD的主要病理特征是黑质（substantia nigra,SN）多巴胺（dopamine,DA）能神经元选择性缺失,导致纹状体（striatum,Str）神经元末梢释放DA减少,而残存DA能神经元内出现α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）异常聚集,形成路易小体（Lewy bodies,LBs）。PD的发病机制尚不明确,遗传、环境、衰老、炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和铁代谢异常等都可能参与到PD的发生发展中。最近的研究表明,SN区DA能神经元上ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels,KATP通道)的选择性激活可能参与了PD中SN区DA能神经元的损伤。KATP通道是一种内向整流钾离子通道,由四个内向整流钾通道Kir6.x（inwardly rectifying K channels,Kir）亚基（Kir6.1或Kir6.2）和四个ABC（ATP-binding cassette protein,ABC）家族成员磺酰脲受体（sulfonylurea receptor,SUR）组成。SN区DA能神经元主要表达SUR1/Kir6.2、SUR2B/Kir6.2和SUR1/SUR2B/Kir6.2三种类型的KATP通道。PD病人的尸检报告指出,SN区DA能神经元上KATP通道SUR1亚单位的m RNA水平比对照组高了约两倍。本实验室前期研究也证实,在3月龄和6月龄携带人A53T突变型α-syn转基因小鼠（简称A53Tα-syn转基因小鼠）SN区KATP通道SUR1亚单位的m RNA和蛋白的表达水平均显着上调,但Kir6.2和SUR2B的表达却没有改变。KATP通道作为一种调控能量代谢的元件,可通过感知胞内ATP/ADP比率的变化,将细胞内能量代谢和电活动相耦联。有报道指出,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）或鱼藤酮制备的PD动物模型中,通过记录离体脑片SN区DA能神经元观察到,KATP通道对代谢应激状态变化尤为敏感,KATP通道的开放能够导致细胞膜超极化。对于晚期PD病人的研究指出,SN区DA能神经元的簇状放电显着增多,这种放电模式的改变能够加速DA能神经元的变性死亡。而将KATP通道Kir6.2亚单位敲除后,成年小鼠脑内SN区DA能神经元的簇状放电明显减少。那么,在PD的发病过程中,KATP通道SUR1亚单位选择性上调是否会对SN区DA能神经元的放电模式产生影响,敲低SUR1亚单位是否会对DA能神经元起到保护作用,目前尚不清楚。为了探讨PD发病过程中KATP通道SUR1亚单位表达升高对SN区DA能神经元功能的影响,本实验采用A53Tα-syn转基因小鼠和C57BL/6小鼠为主要研究对象,应用在体细胞外电生理技术,首先观察了正常小鼠SN区KATP通道的开放对DA能神经元自发放电活动的影响。然后,在A53Tα-syn转基因小鼠上,观察SN区DA能神经元自发放电活动随月龄的变化。最后,应用脑立体定向注射技术,将携带SUR1干扰序列的慢病毒注射到A53Tα-syn转基因动物和MPTP诱导的PD动物模型的SN区,应用免疫荧光、高效液相色谱分析和western blots等技术,观察敲低SUR1对两种PD动物模型SN区DA能神经元功能的影响。实验结果如下:1.在正常小鼠黑质记录到的16个DA能神经元中,微压力注射100μmol/L KATP通道开放剂二氮嗪,可以使其中的6个神经元自发放电频率由2.39±0.74 Hz降低至0.89±0.74 Hz,加药后较加药前相比,放电频率平均降低了87.9±8.7%,差别具有统计学意义（P<0.05）。此外,我们对注射二氮嗪前后的自发放电间隔（interspike internal,ISI）的变异系数（coefficient of variation,CV）进行分析,结果显示,加药前后CV值未发生显着改变（P>0.05）。其余的10个DA能神经元,注射KATP通道开放剂二氮嗪,可以使其放电频率由2.69±1.97 Hz降低至2.17±1.77 Hz,频率变化程度小于2倍的标准差,视为不反应细胞。2.在正常小鼠黑质记录到的7个DA能神经元中,微压力注射50μmol/L NMDA受体激动剂NMDA后,自发放电频率由1.46±1.45 Hz升高至3.40±1.29 Hz,加药后较加药前相比,放电频率平均升高了65.14±3.34%,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。注射NMDA前后的ISI的CV值发生明显改变,差别具有统计学意义（P<0.05）。而给予KATP通道抑制剂格列苯脲后,再激动NMDA受体,记录到的5个DA能神经元自发放电频率由2.90±1.63 Hz升高至4.30±2.48 Hz,加药后放电频率较加药前相比平均升高了55.3±40.1%,但差别无明显变化（P>0.05）。阻断KATP通道后,再激动NMDA受体前后的ISI的CV值未发生明显改变（P>0.05）。3.通过记录3月龄及6月龄A53Tα-syn转基因小鼠SN区DA能神经元自发放电情况观察到,与同月龄WT小鼠相比,两种月龄的A53Tα-syn转基因小鼠的SN区DA能神经元自发放电频率均显着增加,差别具有统计学意义（P<0.05）。同时,我们在3月龄A53Tα-syn转基因小鼠上,观察到不规则放电增多且有少量簇状放电的发生;6月龄A53Tα-syn转基因小鼠不规则放电增多且有大量簇状放电的发生。4.将携带SUR1干扰序列的慢病毒载体立体定位注射到4月龄WT小鼠和A53Tα-syn转基因小鼠SN区60天后,观察到WT小鼠和A53Tα-syn转基因小鼠SN区SUR1蛋白水平分别减少了40.93%和34.72%,较空载慢病毒对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。注射空载慢病毒组A53Tα-syn转基因小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别降低了29.36%和19.86%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组A53Tα-syn转基因小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别增加了49.11%和23.41%,与注射空载慢病毒组A53Tα-syn转基因小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。5.在MPTP制备的PD小鼠模型中,SN区TH蛋白表达水平降低了33.17%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。SN区SUR1亚单位m RNA及蛋白表达水平分别升高了54.21%和52.76%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）;而SUR2B或Kir6.2亚单位的m RNA及蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）。6.将携带有SUR1干扰序列的慢病毒载体注射到C57BL/6小鼠SN区21天后,再连续腹腔注射MPTP 5天,注射空载慢病毒组MPTP小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别降低了56.27%和48.42%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001,P<0.01）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数分别增加了100.87%和62.95%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。同时,高效液相检测结果显示,注射空载慢病毒组MPTP小鼠Str内DA、DOPAC和HVA含量分别减少了89.41%、86.65%和73.16%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠Str内DA、DOPAC和HVA含量分别增加了360.00%、190.00%和86.32%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.05）。7.将携带有SUR1干扰序列的慢病毒载体注射到C57BL/6小鼠SN区21天后,再连续腹腔注射MPTP 5天,注射空载慢病毒组MPTP小鼠SOD1蛋白表达水平和Bcl-2/Bax蛋白比值分别减少了40.64%和58.47%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001,P<0.01）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠SN区SOD1蛋白表达水平和Bcl-2/Bax蛋白比值分别增加了38.48%和102.83%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。综上所述,KATP通道能够参与小鼠SN区DA能神经元簇状放电的发生;在PD的发病过程中,伴随SN区KATP通道SUR1亚单位表达上调,DA能神经元放电频率及簇状放电的发生均显着增加。在PD转基因小鼠和MPTP制备的PD小鼠模型上,敲低SUR1后,可以延缓SN区DA能神经元的退变进程。本研究表明,在PD发病过程中,KATP通道SUR1亚单位在SN区的选择性上调是导致DA能神经元退行性改变的原因,为针对SUR1靶点开发抗帕金森病药物提供了重要依据,进而为PD的治疗提供新的理论基础及实验依据。
李凤珍[2]（2020）在《ASIC1a、TASK-1和TASK-3在癫痫持续状态模型中的表达及作用》文中研究指明背景近年来基于动物或细胞癫痫模型上的研究均表明中枢神经系统中酸敏感离子通道1a（Acid-sensing ion channel 1a,ASICla）及弱内向整流钾通道相关的酸敏感钾离子通道 1 和 3（TWIK-related acid-sensitive K+channel land 3,TASK-1 和 TASK-3）在癫痫的发生及发展中发挥着重要的作用。部分研究认为ASICla促进了慢性癫痫的发生,而其他研究则认为ASICla有助于癫痫发作的终止。其研究结果不一致,有待进一步研究证实。TASK-1和TASK-3在癫痫持续状态（Status epilepticus,SE）中的表达及其对癫痫行为学及电生理影响尚未见报道。本研究将通过氯化锂-匹罗卡品诱发的SE模型,分析大鼠海马ASIC1a、TASK-1和TASK-3的表达,并观察其对锥体细胞电生理的影响。目的通过观察SE后不同时间点ASIC1a、TASK-1和TASK-3的表达,SE对胶质细胞和神经元的影响,以及SE后ASIC1a、TASK-1和TASK-3对锥体细胞电生理的影响,探讨ASIC1a、TASK-1和TASK-3在SE中的作用。方法1.通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱导SE模型,使用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q-PCR）技术检测Sprague Dawley（SD）大鼠对照（control）组及SE后海马0、1、2和3 h的ASIC1a、TASK-1和TASK-3 mRNA表达水平。2.通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱导SE模型,使用Western Blot技术检测SD大鼠control组及SE后海马0、1、2和3 h的ASIC1a、TASK-1和TASK-3蛋白表达水平。3.通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱导SE模型,使用免疫荧光技术检测SD大鼠control组及SE后海马1、2和3 h的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的变化。4.通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱导SE模型,SE 24 h后使用全细胞膜片钳技术记录SE control组及分别给予ASIC1a、TASK-1和TASK-3的抑制剂SD大鼠海马CA1区锥体细胞动作电位（Action potential,AP）的频率变化。结果1.SE后,与control组相比,ASIC1a的mRNA在2和3 h时间点表达明显减少;TASK-1的mRNA在1 h时间点表达明显减少;TASK-3的mRNA在3 h时间点表达明显减少。2.SE后,与control组相比,ASIC1a、TASK-1和TASK-3的蛋白在3h时间点表达均明显减少。3.SE后,与control组相比,大鼠胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）在海马CA1、CA3和齿状回（Dentate gyrus,DG）区3h时间点表达水平显着升高,而在CA2区任何时间点均无明显变化;大鼠钙离子结合适配器分子1（Ionized calcium binding adapter molecule 1,IB A-1）在海马各区3 h时间点表达水平显着升高;大鼠神经元核抗原（Neuron specific nuclear protein,NeuN）在海马各区各时间点均未见明显变化。4.SE后24 h,与SE组相比,给予ASIC1a抑制剂PcTx1后,AP的频率明显降低;分别给予TASK-1和TASK-3的抑制剂ML365和PK-THPP后,AP的频率均显着增加。结论SE后,ASIC1a、TASK-1和TASK-3表达降低,星形胶质细胞和小胶质细胞激活,而神经元无明显变化;SE后,ASIC1a、TASK-1和TASK-3提高锥体细胞的兴奋性,可能参与SE的发生。
程晓芳[3]（2019）在《Hypocretin调控内侧内嗅皮层的机制及其对学习记忆的影响》文中指出内侧内嗅皮层（Medial entorhinal cortex,MEC）在学习记忆中具有重要作用。MEC浅层神经元包括兴奋性的主要投射神经元和抑制性的中间神经元。其中,主要投射神经元可分为星状神经元和锥体神经元;中间神经元包括小清蛋白阳性（Parvalbumin,PV+）、生长抑素阳性（Somatostatin,SOM+）和5-羟色胺3A受体阳性(Serotonin receptor type 3A,5-HT3AR+)中间神经元。MEC浅层神经元所构成的网络具有一个显着特征,即主要投射神经元之间极少形成相互联系,而是与中间神经元形成大量双向投射。神经元集群活动表现为局部场电位（Local field potential,LFP）的节律性振荡。Theta（4-12Hz）和gamma（25-120 Hz）振荡是MEC浅层与海马之间进行空间信息处理和传递的重要特征。学习记忆的完成是以高水平觉醒状态为前提的,而觉醒状态的维持依赖于脑内觉醒系统。觉醒肽（Hypocretin/orexin,Hcrt/orexin）能系统是脑内最重要的促觉醒系统之一。Hcrt系统是否调控MEC神经元活动并参与MEC相关的学习记忆行为及其机制目前仍不清楚。因此,本课题首次关注了Hcrt能系统在调控MEC神经元活动及其相关的空间学习记忆中的作用和机制。我们采用膜片钳技术、免疫组化及免疫电镜技术、病毒辅助的神经束路示踪技术、光遗传学和化学遗传学技术,并在特定的空间学习记忆任务中在体操控MEC浅层的Hcrt能纤维,详细研究了促觉醒Hcrt能系统调控MEC的机制及其在MEC相关的空间学习记忆中的作用。主要结果归纳如下:1.Hcrt1通过作用于HcrtR1兴奋MEC浅层中间神经元（1）Hcrt1通过Hcrt/orexin 1型受体（Hcrt/orexin receptor type 1,HcrtR1/OX1R）增加MEC浅层中间神经元的放电频率。在电流钳模式下,我们发现灌流Hcrt1（500 nM）明显增加了PV+、5-HT3AR+和SOM+中间神经元的放电频率(PV+中间神经元:P<0.05,n=8;SOM+中间神经元:P<0.01,n=9;5-HT3AR+中间神经元:P<0.01,n=9)。而在HcrtR1阻断剂SB-334867（2μM）存在的情况下,Hcrt1增加中间神经元放电的效应消失（n=7）,这些结果提示Hcrt1通过作用于HcrtR1增加MEC浅层中间神经元放电。（2）Hcrt1增加MEC浅层中间神经元的兴奋性输入。神经元的兴奋性受到输入性突触传递的影响。我们发现谷氨酸能AMPA受体抑制剂CNQX（10μM）和NMDA受体抑制剂AP-5（50μM）可完全阻断Hcrt1对中间神经元的兴奋效应（n=9）。在电压钳模式下,Hcrt1（500 nM）显着增加了中间神经元自发性兴奋性突触后电流（Spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs）的频率（P<0.05,n=8）,而不影响其幅度（n=8）。因此,Hcrt1通过作用于HcrtR1增加中间神经元的兴奋性输入,提高其兴奋性。2.Hcrt1增强MEC浅层兴奋性-抑制性神经元联系（1）Hcrt增强MEC浅层局部兴奋性-抑制性神经元之间的兴奋性突触传递。采用double-patch膜片钳记录,Hcrt1（500 nM）显着增加了主要投射神经元发放动作电位在PV+神经元、SOM+神经元以及5-HT3AR+神经元上诱发产生的兴奋性突触后电流（Unitaryexcitatory postsynaptic currents,uEPSCs）的反应率(主要投射神经元-PV+神经元:P<0.01,n=5;主要投射神经元-SOM+中间神经元:P<0.05,n=3;主要投射神经元-5-HT3AR+中间神经元:P<0.001,n=4)。这一结果直接表明,Hcrt1增强了MEC浅层兴奋性主要投射神经元与抑制性中间神经元之间的兴奋性突触传递效率。（2）HcrtR1表达于MEC浅层中间神经元突触前的谷氨酸能纤维末梢。免疫组化和免疫电镜的实验结果发现,在MEC浅层中间神经元突触前兴奋性轴突末梢中可观察到HcrtR1的分布,提示Hcrt1可能是通过作用于中间神经元突触前谷氨酸能末梢上的HcrtR1发挥效应。3.Hcrt1增加MEC浅层主要投射神经元的抑制性输入且依赖于完整的兴奋性突触传递（1）Hcrt1诱导MEC浅层主要投射神经元膜电位超极化并产生外向电流。在电流钳模式下,不管是星状神经元还是锥体神经元,Hcrt1（500 nM）均诱导了膜电位的超极化（星状神经元:P<0.001,n=23;锥体神经元:P<0.01,n=8）。与此一致,在电压钳模式下,Hcrt1（500 nM）诱使MEC浅层主要投射神经元产生明显的外向电流（P<0.001,n=16）。（2）Hcrt1增加MEC浅层主要投射神经元上的抑制性γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）能输入。在GABAa受体阻断剂印防己毒素（Picrotoxin,PIC）（100μM）和GABAb受体阻断剂CGP-55845（2μM）存在的情况下,Hcrt1（500 nM）诱发主要投射神经元的超极化效应被完全阻断（n=8）,提示Hcrt1的这种效应依赖于GABA能突触传递。有趣的是,将脑片上兴奋性谷氨酸能AMPA受体和NMDA受体阻断后,灌流Hcrt1（500 nM）不影响自发性抑制性突触后电流（Spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs）的频率（n=7）和幅度（n=7）。我们将主要投射神经元的膜电位钳制在+10 mV,这既阻断了所记录神经元上谷氨酸受体的开放又保持了整个MEC浅层兴奋性谷氨酸突触传递的完整性。在这种记录模式下,Hcrt1（500 nM）显着增加了主要投射神经元上sIPSCs的频率（P<0.001,n=7）和幅度（P<0.05,n=7）。因此,在保持兴奋性谷氨酸能突触传递完整性的条件下,Hcrt1可显着增强MEC浅层主要投射神经元上的抑制性输入。4.内源性Hcrt调控MEC浅层神经元活动并增强gamma振荡（1）激活MEC浅层内源性Hcrt通过HcrtR1增加中间神经元放电。在Hcrt-cre小鼠的LH区注射顺行示踪的AAV-EF1α-DIO-mCherry后,可在MEC浅层观察到Hcrt能纤维的分布;在MEC浅层注射逆行传递AAVretro-EF1α-EYFP后,可在LH区检测到病毒表达阳性的Hcrt神经元。因此,LH区的Hcrt神经元向MEC浅层发出直接纤维投射。我们将携带激活型光通道蛋白的病毒AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry注射到Hcrt-cre小鼠的LH区使MEC浅层的Hcrt能纤维末梢表达光敏感的通道蛋白ChR2。光刺激（473 nm,20 Hz）激活内源性Hcrt释放后显着增加了MEC浅层PV+中间神经元放电频率（P<0.05,n=7）。HcrtR1阻断剂SB-334867可完全阻断这种光刺激增加中间神经元放电的效应（n=5）。因此,与外源性Hcrt的效应一致,内源性Hcrt通过作用于HcrtR1增强中间神经元兴奋性。（2）激活MEC浅层内源性Hcrt增加中间神经元的兴奋性输入。与离体脑片灌流Hcrt1的结果相一致,光刺激激活MEC浅层内源性Hcrt显着增加了中间神经元sEPSCs的频率（P<0.05,n=6）而不影响其幅度（n=6）。因此,内源性Hcrt可增强中间神经元的兴奋性输入,使其放电增加。（3）在体情况下激活MEC浅层内源性Hcrt增强中间神经元放电并抑制主要投射神经元放电。为了进一步阐明在体情况下内源性Hcrt对MEC浅层神经元的调控作用,我们利用多通道记录技术,观察了激活MEC浅层Hcrt能纤维对主要投射神经元和中间神经元放电的影响。结果发现,激活内源性Hcrt显着增加了中间神经元的放电频率（P<0.001,n=18）,并显着降低了主要投射神经元的放电频率（P<0.001,n=43）。（4）在体情况下激活MEC浅层内源性Hcrt增强gamma振荡。通过分析比较不同频率带的LFP,我们发现光激活MEC浅层内源性Hcrt不影响theta振荡的能量（n=27）,而显着增加了low-gamma（P<0.001,n=27）和high-gamma（P<0.01,n=27）振荡的能量。鉴于gamma振荡在MEC空间信息处理中的关键作用,我们推测,MEC浅层的内源性Hcrt很有可能通过影响神经元活动和网络振荡调控在体情况下MEC相关的空间认知功能。5.LHHcrt-MEC通路调控空间学习记忆（1）MEC浅层内源性Hcrt参与调控空间探索行为化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt损害小鼠空间探索行为。我们在小鼠LH区注射AAV-EF1α-DIO-hM4D-mCherry,并在MEC浅层注射叠氮平-N-氧化物（Clozapine N-oxide,CNO）实现化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt的释放,结果表明注射CNO显着增加了小鼠找到空间环境中正确食物位置的时间(P<0.001,nmCherry=8,nhM4D=8),且探索错误容器的次数显着高于对照组(P<0.01,nmCherry=8,nhM4D=8)。此外,抑制MEC浅层内源性Hcrt显着降低了空间探索行为中low-gamma振荡和high-gamma振荡的能量(Low-gamma:Ptrial4,8,20<0.05,Ptrial 16<0.01,nmCherry=56,nhM4D=49;High-gamma:Ptrial 12,20,24<0.05,Ptrial 16<0.01,nmCherry=56,nhM4D=49),提示Hcrt可能通过影响MEC浅层的gamma振荡调控空间探索行为。光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt增强空间探索行为。我们在小鼠LH区注射AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry,并在MEC浅层埋置光纤实现光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt的释放。在空间探索任务中,光照显着缩短小鼠在空间探索实验早期寻找食物的潜伏期(与对照组比较,Block 1:PmCherry×ChR2<0.001,nmCherry=6,nChR2=5),表明在行为学水平增强了空间探索能力。（2）MEC浅层内源性Hcrt参与调控空间工作记忆化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt损害空间工作记忆。在MEC浅层注射CNO抑制内源性Hcrt显着降低了小鼠在正常和干扰性T-迷宫任务中的正确率(正常T-迷宫:hM4D组:Psaline×CNO<0.05,nsaline=6,n CNO=6;干扰性T-迷宫:hM4D组:Psaline×CNO<0.05,nsaline=6,n CNO=6),提示空间工作记忆受损。在空间工作记忆任务的执行期光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt强化行为学表现。我们分别在T-迷宫任务的sample trial、delay period和execution trial行光刺激激活MEC浅层内源性Hcrt,观察小鼠行为学变化。结果表明,在正常T-迷宫任务中,不管是在sample trial、delay period还是execution trial光激活MEC浅层内源性Hcrt均不影响小鼠的正确率(nChR2=7,nmCherry=4)。然而,在干扰性T-迷宫任务的execution trial激活内源性Hcrt使小鼠的正确率在原有基础上进一步提高(Plight off×execution<0.05,n ChR2=7,nmCherry=4),而在sample trial或delay period进行光照则对正确率无明显影响(nChR2=7,nmCherry=4),表明LHHcrt-MEC通路在空间学习记忆任务中抵制空间干扰信息也发挥重要作用。研究结论:LH区Hcrt神经元向MEC浅层发出直接纤维投射。Hcrt通过作用于中间神经元突触前兴奋性神经末梢上的HcrtR1,促进谷氨酸释放,增强兴奋性-抑制性神经元突触传递并形成反馈抑制,发挥调控MEC浅层兴奋性-抑制性神经元环路的作用。以调节神经元环路活动为基础,Hcrt增强了MEC浅层局部gamma振荡的能量,最终参与空间学习记忆过程。我们的结果为深入理解Hcrt能系统调控MEC浅层神经元活动、网络振荡及空间学习记忆的作用和机制以及研究觉醒系统参与调控学习记忆功能脑区的工作模式提供了新的可靠证据。
聂昕时[4]（2019）在《A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对慢性间歇低氧大鼠颏舌肌中枢调控的影响》文中认为目的:阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的呼吸睡眠疾病,以反复上气道塌陷及慢性间歇低氧为主要特点。上气道的稳定开放主要依赖于上气道负压及神经肌肉调控的平衡,其中颏舌肌起着至关重要的作用。在健康人群中,颏舌肌通过舌下神经接受上游中枢神经系统的调控。这种调控作用已被证明可受到快动眼（Rapid Eye Movement,REM）期睡眠及低氧的影响。由于长期处于低氧状态,清醒时OSA患者的颏舌肌及其中枢调控常表现为代偿性的活性增加,以对抗上气道塌陷。但进入REM睡眠期后,这种代偿活性的消失将导致OSA患者的上气道较健康人群更容易塌陷,从而进一步加重病情,造成恶性循环。在睡眠期舌下神经核上的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）与去甲肾上腺素均可影响舌下神经的活性,且去甲肾上腺素可能占到了作用的90%。本实验小组曾就此进行了一系列研究,来探讨在常氧及慢性间歇低氧条件下,中枢神经系统中的5-HT与去甲肾上腺素参与颏舌肌调控的潜在机制。我们发现,中缝核上的5-羟色胺能神经元可参与介导慢性间歇低氧诱导的颏舌肌运动皮层易化。向舌下神经核中微注射α1肾上腺素能受体阻断剂可使颏舌肌的经颅磁刺激（Transcranial magnetic stimulation,TMS）反应明显下降,提示我们去甲肾上腺素可通过舌下神经核上的α1受体为颏舌肌的中枢调控提供正向的去甲肾上腺素能驱动。而慢性间歇低氧可使这种驱动效应明显加强。以上结论均提示我们,慢性间歇低氧所介导的颏舌肌中枢调控中,去甲肾上腺素起到了非常重要的作用。中缝核上的5-HT能神经元通过激动舌下神经核上的5-HT2A受体来激活舌下神经及颏舌肌。我们由此猜测,舌下神经核上的去甲肾上腺素同样来源于上游去甲肾上腺素能神经元。并且此神经元同样可以参与慢性间歇低氧大鼠颏舌肌的中枢调控。解剖证据表明,舌下神经核上分布的去甲肾上腺素能纤维末梢主要来源于位于脑干A5、LC、A7等去甲肾上腺素能细胞群,其中A7具有最大的投射倾向及比例。细胞膜上可与去甲肾上腺素结合的受体称为肾上腺素能受体,属于G蛋白耦连受体。研究表明,A7去甲肾上腺能神经元上主要表达α2肾上腺素能受体。作为一种自身受体,α2肾上腺素能受体主要分布于突触前,可负反馈调节神经元去甲肾上腺素释放。G蛋白门控的内向整流钾通道（G protein-gated inwardly rectifying postassium,GIRK）在中枢神经系统中广泛分布,通常参与调解神经递质对突触后的抑制效应,可受去甲肾上腺素等多种神经递质的调控。免疫印迹实验结果表明,A7细胞群存在GIRK通道阳性表达。由此我们可提出假设,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元可参与颏舌肌的中枢调控,可通过GIRK通道受神经元上的α2肾上腺素能受体（α2受体）调节。慢性间歇低氧已被证明可参与介导颏舌肌的中枢代偿。但去甲肾上腺素如何参与慢性间歇低氧大鼠的中枢调控,尚无明确定论。本研究课题旨在通过建立慢性间歇低氧模型大鼠来模拟临床OSA患者反复间歇低氧的特点。在低氧的不同时间点,通过观察大鼠颏舌肌肌电图（Electromyogram,EMG）、TMS反应及相关受体的变化等,来探讨慢性间隙低氧A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌中枢调控的作用及机制,进而为OSA患者的临床诊断与治疗提供新的理论依据。方法:1.在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体与GIRK通道对颏舌肌的中枢调控的影响。在本实验部分中,我们选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,随机分为常氧组（NO组,n=8）、IgG-SAP给药组（IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（SAP组,n=8）、NACL给药组（NACL组,n=8）、Clonidine给药组（CLO组,n=8）、RS-79948给药组（RS组,n=8）、ML297给药组（ML组,n=8）、Tertiapin-Q给药组（TER组,n=8）、Tertiapin-Q/Clonidine给药组（TC组,n=8）与ML297/RS-79948给药组（MR组,n=8）。参考既往文献,通过免疫组化及免疫荧光明确去甲肾上腺素能神经元在脑中的分布,利用琼脂糖凝胶模型模拟药物在脑内的扩散,通过脑立体定位仪进行A7细胞群去甲肾上腺素能神经元定位。将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP、α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948、GIRK通道激动剂ML297与GIRK通道阻断剂Tertiapin-Q分别微量注射入相应实验组大鼠的A7细胞群。另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证常氧条件下A7去甲肾上腺能神经元及α2受体与GIRK通道对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。2.慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体对颏舌肌的中枢调控的影响及可能机制探讨。在本实验部分中,我们选取SPF级健康成年Wistar雄性大鼠,建立慢性间歇低氧（Chronic Intermittent Hypoxia,CIH）模型。实验大鼠每天于8:00 AM-4:00 PM置于低氧舱共8小时,以7天为一周期,持续4个周期共28天。每次缺氧-复氧循环时间为188s,舱内氧浓度呈周期波动于10%至21%之间。慢性间歇低氧大鼠被随机分为单纯慢性间歇低氧组（CIH组,n=32）、IgG-SAP给药组（CIH+IgG组,n=8）、Anti-DBH-SAP给药组（CIH+SAP组,n=8）、Clonidine给药组（CIH+CLO组,n=8）、RS-79948给药组（CIH+RS组,n=8）、NACL给药组（CIH+NACL组,n=8）。参考既往文献,通过立体定位技术,将特异性去甲肾上腺素能神经元损伤剂Anti-DBH-SAP注射入CIH-SAP组大鼠的A7细胞群。α2受体激动剂Clonidine、α2受体阻断剂RS-79948在实验进行当天被分别注射进入CIH-CLO与CIH-RS组大鼠的A7细胞群。另有实验大鼠被分别给予同等剂量IgG-SAP或NACL作为对照组。待大鼠恢复后,在每一低氧周期结束当天,即低氧的第7、14、21、28天,应用经颅磁刺激在特定时间点测量颏舌肌的TMS与EMG结果,来验证慢性间歇低氧条件下A7细胞群去甲肾上腺能神经元及其上α2受体对大鼠颏舌肌中枢调控的影响。另有CIH组大鼠在每一低氧周期结束当天被处死,进行脑组织灌流取材及标本切片,进行冰冻切片免疫组化。比较低氧不同时间点A7细胞群去甲肾上腺素能神经元多巴胺-β-羟化酶（Dopamineβ-hydroxylase,DBH）、舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢、α1受体及α2受体蛋白的表达情况。以此来探讨慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌的中枢调控影响的可能机制。结果:1.在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体与GIRK通道对颏舌肌的中枢调控的影响1.1在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元参与了颏舌肌的中枢调控,并起正向调控作用。当损伤A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降（p<0.05）。1.2在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的α2受体参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。当激动A7细胞群α2受体时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降。反之亦然（p<0.05）。1.3在常氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的GIRK通道参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。当激动A7细胞群GIRK通道时,可导致颏舌肌EMG活性下降,TMS潜伏期变长且振幅下降。反之亦然（p<0.05）。1.4在常氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元α2受体对颏舌肌中枢调控的功能是与GIRK通道耦联的（p<0.05）。2.慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元及α2受体对颏舌肌的中枢调控的影响及可能机制探讨2.1在慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元参与了颏舌肌的中枢调控,并起正向调控作用。这种正向调控作用持续28天。当损伤A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元时,可导致颏舌肌TMS潜伏期变长且振幅下降,EMG活性下降（p<0.05）。2.2在慢性间歇低氧条件下,大鼠A7细胞群的去甲肾上腺素能神经元上的α2受体参与了颏舌肌的中枢调控,并起负向调控作用。这种负向调控作用持续28天。当激动A7细胞群α2受体时,可导致颏舌肌TMS潜伏期变长且振幅下降,EMG活性下降。反之亦然（p<0.05）。2.3慢性间歇低氧可增加A7细胞群去甲肾上腺素能神经元的DBH表达平均光密度值（p<0.05）,未影响DBH阳性细胞数目（p>0.05）。2.4慢性间歇低氧增加了去甲肾上腺素能纤维膨体末梢数目（p<0.05）,但未影响舌下神经核上去甲肾上腺素能纤维末梢DBH的表达的平均光密度值p>0.05)。2.5慢性间歇低氧可增加舌下神经核的α1A受体表达的平均光密度值（p<0.05）,但未影响阳性细胞数目（p>0.05）。2.6慢性间歇低氧可减少舌下神经核的α2A受体表达的平均光密度值（p<0.05）,但未影响阳性细胞数目（p>0.05）。结论:1.在常氧条件下,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元通过α2受体与GIRK通道参与颏舌肌的中枢调控。2.在慢性间歇低氧条件下,A7细胞群去甲肾上腺素能神经元正向参与颏舌肌的中枢调控,作用持续28天。3.慢性间歇低氧影响A7细胞群DBH、舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢、α1A受体及α2A受体的表达。
肖华[5]（2018）在《Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究》文中认为一、背景和目的目前构建心脏生物起搏细胞主要有两种策略:以基因为基础和以细胞为基础。前一种方法根据窦房结（SAN）细胞特异的离子通道和对胚胎SAN发育起关键作用的转录因子,采用单个基因或者多基因组合进行转染干预。过表达超级化激活环核苷酸门控（HCN）通道,产生对自主神经调节敏感的起搏电流（If）是以基因为基础的构建生物起搏点的策略之一,这种类型的通道产生的内向电流主要在舒张期,从而避免了对动作电位的干扰。T盒基因（Tbx）家族是心肌细胞形成和分化的主要调控因子,如Tbx3,Tbx5和Tbx18在胚胎SAN发育中起关键作用,而这些因子的上游是Tbx18,已有研究显示单用Tbx18转录因子即可将静止心肌诱导成心脏起搏样细胞并显示出该因子在构建心脏生物起搏器方面广阔的应用前景。后一种以细胞为基础构建的方法包括两个方面:直接将细胞转化为SAN样起搏细胞和将细胞作为基因的运输载体。骨髓间充质干细胞（MSCs）是心脏生物起搏器理想的干细胞来源,具有免疫豁免优势和相对电静止特性。且能够很容易通过缝隙连接与相邻的细胞进行偶联。MSCs具有直接分化为心肌细胞的能力,但这种能力非常弱。c-kit是心脏前体细胞的标记,在MSCs也有表达,犬MSCs（cMSCs）和心肌细胞一样都来自早期中胚层,不同的分化调控因子决定了其各自不同的分化方向。本实验将SAN发育过程中重要的调控因子Tbx18在c-kit+cMSCs过表达,研究是否能介导c-kit+cMSCs向SAN细胞分化,从而具有天然SAN细胞相似的表观特征。同时研究Tbx18转染的c-kit+cMSCs在与犬心房肌共培养的环境中能否与其形成偶联,从而构成功能性的合胞体。心脏的电偶联由缝隙链接介导,缝隙连接蛋白（connexin,Cx）组成的跨膜通道聚合体构成了细胞间的缝隙链接。不同的聚合体由于排列方式的不同分为同聚体同侧型、同聚体异侧型、异聚体同侧型和异聚体异侧型四类。通过允许小分子和离子沿其电化学梯度扩散,缝隙链接为电冲动的扩步提供了低电阻路径。目前在人类发现的Cx有21种,它们各自具有不同的生物物理学性质,包括电导、电压、PH、对离子和小分子（荧光染料）的选择性通透。细胞间的偶联由Cx的数量和Cx所构成通道的活性所决定,这些都受到上游转录调控因子的严格管控。目前在心脏发现有4种Cx表达:connexin43（Cx43）,Cx40,Cx45和Cx37。这些Cx在心脏不同区域表达目的是传递不同的被动电学特性,其中Cx45主要在哺乳动物SAN细胞表达,是对缝隙链接处电压变化最敏感的Cx,当其细胞质相对于周围细胞电位偏负时,Cx45通道将关闭,这将有效防止周围心肌的除极电流返流入SAN细胞,干扰正常电冲动的传导顺序。以往的在体研究仅单纯用HCN4病毒载体转染MSCs,这种构建方式得到的生物起搏频率远远低于正常SAN的起博频率,本实验采用编码Cx45的缝隙连接蛋白α7（gap junction protein-alpha 7,GJA7）基因与HCN4基因两个慢病毒载体共转染cMSCs,研究是否能进一步促使单纯HCN4病毒载体转染cMSCs向SAN样细胞分化。将HCN2过表达的MSCs注射入房室传导阻滞犬的左心室游离壁可以获得满足生理需要的起搏频率和对儿茶酚胺药物的反应性,但该起搏功能在注射后8周即开始下降,由于没有发生排斥反应和细胞凋亡现象,考虑该原因是由于细胞从注射部位迁移。因此采用生物材料将细胞包裹固定是目前的研究热点,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,其在37°℃能发生溶液-凝胶转变,具有较少的化学交联毒性。本实验选用壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,将这种可注射生物材料包裹病毒转染的cMSCs,去评价这种生物高聚物能否作为细胞的输送载体为细胞的存活和固定提供适宜的基质环境,观察细胞在温敏水凝胶内的存活增殖情况,为下一步在体动物实验研究打下基础。研究方法:1.培养 cMSCs 和分选 c-kit+cMSCs。cMSCs首先从新生犬股骨和胫骨分离和培养。一部分正常培养传代,一部分用流式活细胞分选技术从P3代cMSCs中分选出c-kit+cMSCs,并进行细胞表面抗原鉴定（CD45/CD29/CD44）。2.构建hTbx18慢病毒载体转染c-kit+cMSCs;构建hHCN4和hGJA7慢病毒载体单独或者共同转染cMSCs。2.1 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>hTBX18[NM 001080508.2]:T2A:{EYFP}作为实验组,构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>{EYFP}作为对照组。将已构建好的两组慢病毒载体分别转染c-kit+cMSCs获得Tbx18-EYFP-c-kit+c MSCs和EYFP-c-kit+cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybr ene的最适浓度。细胞转染4天后行RT-PCR实验验证hTbx18基因在Tbx18-EYFP-c-ki t+cMSCs中过表达。2.2 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>hHCN4[NM 005477.2]和 pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJC1[NM005497.3]作为实验组,构建pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-Null作为对照组。将构建好的慢病毒载体分别转染cMSCs得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和GFP-cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybrene的最适浓度。在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs首先通过2μg/mL的嘌呤霉素纯化5天,再加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJ C1进行共转染。以上步骤共构建成功:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs及其对照组EYFP-c-kit+cMSCs;HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 和 HCN4+GJA7-cMS Cs共转染组。3.进行犬SAN和犬心房肌细胞原代分离培养及体外共培养环境。犬SAN原代细胞被分离后制备成悬浮细胞,新鲜分离的细胞作为阳性对照组,6小时内用于后续实验。犬心房肌从新生犬右心房分离,采用差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）方法纯化培养细胞。原代心房肌细胞培养24小时后,以4:1的比例（80%心房肌细胞）分别与上述转染细胞混合进行共培养。4.各组细胞的功能检测。4.1 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs在转染后4天分别收集进行SAN特异型特征的检测,并于新生犬SAN细胞进行对比;Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后进行细胞膜片钳检测各组If电流生成情况,用Lucifer荧光黄染料进行细胞间缝隙连接评价,并于新生犬SAN细胞进行对比。4.1.1细胞内环磷酸腺苷[1]分析:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs细胞内 cAMP水平。4.1.2 RT-qPCR:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中Cx45,Kir2.1,PLB 和α-actinin相对mRNA表达水平。4.1.3 WB:监测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs中HCN4,Cx45,PLB,p-PLB和α-actinin的蛋白表达水平。4.1.4 免疫荧光:检测Cx45在犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中的免疫荧光显像。4.1.5共培养环境下转染细胞的电生理检测:采用全细胞膜片钳和穿孔全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案记录特征性的If电流,评价该通道的激活和失活特性,测试其对异丙肾上腺素药物刺激的反应,染料转移实验评价缝隙连接情况。4.2 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后,加入2μgmL的嘌呤霉素连续五天以清除心房肌细胞,收集各组细胞行SAN细胞特异性指标检测和细胞膜片钳检测If电流生成情况。4.2.1 RT-qPCR:检测 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs中Cx45,Cx43,Tbx3,Tbx18和编码同源异型盒蛋白Nkx-2.5的基因（Nkx2.5）相对mRNA表达水平。4.2.2细胞膜片钳检测:采用全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案对比各组记录到的特征性的If电流。5.转染细胞与温敏水凝胶共培养及功能检测。5.1浸提实验和CCK-8检测:用来评价温敏水凝胶材料的细胞毒性。以不含细胞的纯培养基为空白对照组,以培养基中含有0.64%萘酚为阳性对照组,以不含浸提液的纯培养基为阴性对照组,每组均设6个复孔。5.2 CCK-8检测转染细胞胶内增殖情况:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别于转染后72小时和温敏水凝胶共培养,cMSCs,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组,每组均设6个复孔,CCK-8试剂于1天,4天,7天检测,观察胶内细胞增殖情况。5.3 激光共聚焦检测:观察 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶材料共培养4天后凝胶内细胞形态。5.4 iCelligence实时检测:评价Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 在凝胶内实时生长情况,cMSCs,Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组。结果:1.流式活细胞分选将c-kit+细胞分选出来,分选后分析显示c-kit+细胞纯度大于90%,死细胞数小于10%,细胞表面抗原鉴定显示CD29+,CD44+,CD45-。2.pLV-hTbx18-EYFP或pLV-EYFP使用5μg/mL polybrene,以MOI=100的浓度分别转染c-kit+cMSCs 24小时得到Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs。病毒转染后48小时,转染的c-kit+cMSCs展现黄色荧光,6个不同随机视野下激光共聚焦显微镜分析pLV-hTbx18-EYFP的转染效率为94±3.5%,pLV-EYFP-cMSCs的转染效率为96±2.5%。RT-PCR显示基于人Tbx1 8设计的引物可以在Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs中检测到Tbx1 8的表达。使用6μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度转染24小时得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs,GFP-cMSCs,病毒转染后72小时,转染的cMSCs分别展现绿色,红色和绿色荧光,6个不同随机视野下荧光显微镜分析三组细胞的转染效率均大于90%,在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs中加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1 A>hGJC1,用6 μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度进行共转染,用2μg/mL嘌呤霉素纯化转染细胞5天,6个不同随机视野下荧光显微镜分析共转染细胞表达黄色荧光,转染效率大于95%。3.新鲜分离的犬原代SAN细胞以细条钩形居多,细胞出现不规则节律性搏动,新鲜分离的犬原代心房肌细胞培养24小时可见完全贴壁生长,呈长杆状。按照4（心房肌细胞）:1的比例将Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs或EYFP-c-kit+cMSCs或HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs或GFP-cMSCs或HCN4+GJA7-cMSCs与心房肌分别混合,3天后各组共培养细胞生长成单层细胞。4.Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs具有天然SAN细胞的关键特征。Tbx18-EYFP-c-kit+cMS Cs同SAN细胞一样具有高的细胞内cAMP水平（n=3）。Cx45,Kir2.1,PLB,α-actinin的相对mRNA表达水平在Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs是上调的。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和SAN细胞的HCN4,Cx45,PLB,p-PLB,α-actinin蛋白表达水平相似,与EYFP-c-kit+c MSCs明显不同。其中HCN4和Cx45的蛋白水平在Tbx18-c-kit+cMSCs分别是EYFP-c-kit+cMSCs的12倍和5.6倍。Cx45免疫荧光显像示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相似SAN细胞有Cx 45 表达,而 EYFP-c-kit+cMSCs 未见 Cx45 表达。在与犬心房肌共培养三天后,If电流的特征被记录。通过构建回归模型发现Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和 SAN的If电流趋势极其相似（I=-89.368+82.306 V-19.975 V 2+0.868 V3,F=693.056,Sig.<0.01,R2=0.983 vs.I=-110.892+102.927 V-26.637 V2+1.204 V3,F=649.977,Sig.<0.01,R2=0.982）。If电流的激活曲线显示V1/2在Tbx 18-EYFP-c-kit+cMSC s和S AN细胞之间有明显差异（-82.5±4.6,n=22 vs.-77.2±6.3 mV,n=18;P<0.05）,但是斜率因子K没有达到统计学意义上的差异（-7.7±0.4,n=22 vs.-8.1±0.2 mV,n=18;P=0.573）。相比SAN细胞,Tbx18-c-kit+cMSCs 有更正的反转电位（-18.41±1.2 mV,n=12 vs.-23.19±1.6 mV,n=10;P<0.05）。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的激活时间常数在 660±27（-120mV）～1880±103（-80mV）毫秒,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的失活时间常数在 1000±99（-70mV）～210±19（-40mV）毫秒。给予3μmol/L异丙肾上腺素,If电流的激活时间（-120 mV）减少了26±2%（n=8）。V1/2朝向去极化方向移动了大约 6.1 mV（从-84.9±5.6到-78.8±4.8 mV,n=8;P<0.05）。染料注入细胞5分钟后,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相邻的两个心房肌细胞也出现荧光显影,而EYFP-c-kit+cMSCs周围没有心房肌细胞显影。SAN细胞周围有一个细胞显影。HCN4+GJA7-cMSCs 促进 HCN4-GFP-cMSCs 或 GJA7-RFP-cMSCs 向窦房结样细胞分化。RT-qPCR显示GJA7-RFP-cMSCs相较GFP-cMSCs上调Tbx3的表达（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5的表达下降（n=8;p<0.05）,HCN4和Tbx18表达水平两组细胞没有明显差异（n=8;p>0.05）。HCN4+GJA7-cMSCs 共转染组的HCN4,Cx45,Tbx3表达水平比HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs组高（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5表达水平比单纯转染组低（n=8;p<0.05）,Tbx18表达水平在共转染组与单纯转染组之间无明显差异（n=8;p>0.05）。在与犬心房肌共培养三天后,全细胞膜片钳记录If电流的特征。GFP-cMSCs与GJA7-RFP-cMSCs均未记录到特征性的If电流HCN4+GJA7-cMSCs记录到的If 电流,其幅值增加（-1173.8±18.4 vs.-1057.9±14.6 mV,,与HCN4-GFP-cMSCs相比,n=3;p<0.05）,电流激活曲线右移,半数最大激活电压明显变正（-92.6±3.6 vs.-101.9±4.0 mV,n=3;P<0.05）,If通道的反转电位绝对值增加（-29.6±3.9 vs.-26.8±3.2 mV,n=3;p>0.05）。5.浸提实验第7天显示光密度（OD）值在12.5%,25%,50%,100%浸提液组分别为4.6247±0.099,4.5911±0.101,4.0057±0.087,4.5144±0.088,所有检测组的相对细胞增殖率均大于90%显示材料的细胞毒性在0～I级。CCK-8检测显示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.6754±0.10501,4.3294±0.20432,3.7682±0.41215,HCN4-GFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在 1 天,4天,7天分别为3.2820±0.00686,4.4947±0.23174,4.3849±0.43016,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.0181±0.31104,4.1634±0.26420,4.1348±0.36887,所有转染细胞在凝胶中存活4天达到增殖高峰,7天左右生长趋于平稳。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别与温敏水凝胶共培养4天后于激光共聚焦显微镜下观察,可见黄色、绿色、红色荧光细胞在凝胶内不同层面分布生长。iCelligence检测示不同时间点温敏水凝胶内细胞的平均细胞指数未见明显变化。结论:1.Tbx18过表达c-kit+cMSCs介导其向SAN样细胞分化。2.HCN4+GJA7共转染cMSCs通过增强If电流的幅值,利于电信号的扩步促进HCN4-GFP-cMSCs向S AN样细胞分化。3.温敏水凝胶对生物起搏细胞的存活和生长提供了适宜的环境。
孙邈[6]（2016）在《复智胶囊及大黄素对VD大鼠海马和SH-SY5Y线粒体凋亡通路与Iκ电流关系的影响》文中进行了进一步梳理近年来我们团队对复智胶囊经验方防治血管性痴呆（Vascular Dementia）进行了大量的研究工作,已知其可通过保护胆碱能系统,上调海马胆碱能系统低水平;削减缺血炎症反应对神经系统的损害;恢复脑血管循环流注,减少血小板聚集,消除氧化自由基等来预防治疗血管性痴呆。近年来研究发现钾离子通道与细胞凋亡有密切关系,尤其以延迟整流钾电流IK在凋亡中扮演重要角色,本研究将关注复智胶囊及其有效成分大黄素对线粒体凋亡通路与IK电流关系的影响。目的本研究聚焦延迟整流钾通道电流与经典的内源性线粒体凋亡通路之间的关系对细胞凋亡的影响,结合分子生物技术和基因技术,运用Western-blot、Real-time PCR和ELISA的方法检测复智胶囊对血管性痴呆大鼠海马Bcl-2、Bax及Caspase-3的影响,研究复智胶囊对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用,探索复智胶囊修复神经细胞功能的可能机制;并且以神经细胞膜的离子通道特征为出发点,通过运用全细胞膜片钳技术观察复智胶囊有效成分大黄素对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）延迟整流钾通道（IK）的作用,并探讨IK与线粒体凋亡通路的关系,望从神经元保护方面来阐明复智胶囊的拮抗凋亡机理以验证其改善血管性痴呆大鼠学习和记忆的作用;通过观察复智胶囊及大黄素对VD大鼠海马组织和SH-SY5Y细胞线粒体凋亡通路与IK电流关系的影响为复智胶囊治疗血管性痴呆提供理论及实验的可靠依据;且为进一步探讨中枢钾离子通道与血管性痴呆的关系开拓道路。方法在体实验:根据随机数字表法,将100只SD大鼠,选出正常组和假手术组各20只,剩余则使用双侧颈动脉永久结扎2-VO法,将造模成功的大鼠分为血管性痴呆VD模型组、安理申治疗组和复智胶囊治疗组,每组动物20只。各组动物连续灌药四周后进行相应的指标检测。本实验使用Morris水迷宫的方法对各组大鼠进行行为学检测,观测其学习记忆能力;采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定各组大鼠血清中的Cleaved Caspase-3表达;采用Real-time PCR的方法检测各组大鼠脑海马组织中Bcl-2和Bax的mRNA基因变化水平;采用Western blot的方法测定各组大鼠脑海马组织中Bcl-2,Bax,Caspase-3和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。离体试验:细胞常规培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,通过建立细胞生长曲线确定本实验所需细胞密度,通过MTT比色法检测复智胶囊有效成分大黄素细胞毒性实验确定本实验大黄素加药浓度,将SH-SY5Y细胞随机分为空白对照组、糖氧剥夺OGD组、糖氧剥夺OGD+大黄素（Xμmol/L）治疗组,使用全细胞膜片钳技术描记对照组、模型组和大黄素组IK的变化,绘制I-V曲线。结果我们的结果显示:（1）与正常对照组相比,VD模型组大鼠脑海马组织中凋亡抑制基因Bcl-2表达降低,而促凋亡基因Bax表达升高,Bcl-2/Bax的比值变小;通过复智胶囊或安理申的干预则可降低VD大鼠脑海马组织中的促凋亡基因Bax,并且升高凋亡抑制基因Bcl-2,通过改变Bcl-2/Bax的比值来起到对抗细胞凋亡的作用。（2）与正常对照组相比,VD模型组大鼠脑海马组织中的Caspase-3和Cleaved Caspase-3明显过表达,而通过复智胶囊或安理申的干预,可降低VD大鼠脑海马组织中的Caspase-3和Cleaved Caspase-3,以改善VD所造成的脑组织损害。（3）SH-SY5Y经过糖氧剥夺后呈现缺糖缺氧状态,细胞存活率显着下降,此现象可在加入复智胶囊有效成分大黄素后被逆转,提示复智胶囊有效成分大黄素对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤后生长和活力状态具有保护作用。（4）糖氧剥夺OGD组与空白对照相比,IK电流密度明显减弱。复智胶囊有效成分大黄素则可逆转此抑制作用,在指令电压为+50 mV时IK峰密度值分别从（4.474±0.4182）pA/pF增大至（5.947±0.7415）pA/pF（P<0.05,n=15）（5）复智胶囊有效成分大黄素可使被OGD抑制的IK电流-电压曲线（I-V）慢慢上升,并且伴随着的去极化幅度的逐步升高而越来越大。结论1、在体实验显示复智胶囊可以抑制促凋亡基因Bax的表达,下调凋亡执行者Caspase-3的表达,并且上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达,说明基于经典的线粒体凋亡通路,复智胶囊可启动抗凋亡机制,以达到对血管性痴呆的神经元保护作用。2、膜片钳的数据结果说明复智胶囊主要成分对SH-SY5Y延迟整流钾通道IK的峰值及电压电流（I-V）曲线有较为显着的激活作用,说明复智胶囊主要成分可以通过激活IK电流,减少细胞内钙离子堆积来抑制线粒体凋亡通路的启动。以上结果提示我们复智胶囊可能通过对IK电流的激活和抗凋亡机制来治疗血管性痴呆。
薄冰[7]（2012）在《力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道的影响》文中指出长期高强度运动训练可引发运动员心脏窦房结（sinoatrial node, SAN）的多种功能障碍，包括窦性心动过缓、窦性心律不齐、病态窦房结综合征等，在运动比赛中可导致猝死风险的增加。SAN起搏活动与细胞膜上多种离子通道有关，包括：HCN、L-Ca2+、T-Ca2+、IKr、IKs、IKATP等，而SAN功能障碍与其细胞膜上离子通道的改变密切相关。运动医学领域对于运动训练诱发SAN功能障碍的发生机制尤其是电生理学及分子生物学机制鲜见报道，因此，本研究即以SAN细胞膜上离子通道的电生理活动（第一部分力竭运动对大鼠SAN起搏活动相关离子通道电流的影响）和结构组成（第二部分力竭运动对大鼠SAN相关离子通道亚基mRNA和蛋白质表达的影响）为切入点，着力探讨力竭运动状态下，心脏SAN细胞起搏活动相关离子通道电生理学和基因水平的改变，揭示运动引发SAN功能障碍发生的离子通道机制，为进一步探索SAN细胞离子通道的功能调节和信号转导机制、运动性心律失常的预防措施及临床治疗等奠定理论和实验基础。第一部分力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道电流的影响研究目的：探讨两周力竭运动对大鼠SAN细胞HCN通道、L-Ca2+通道、T-Ca2+通道、快激活整流K+通道、慢激活整流K+通道、ATP敏感型K+通道If、ICa,L、ICa,T、IKr、IKs、IKATP电流的影响。实验分组：将180只健康雄性SD大鼠随机分为9组，每组20只，包括安静对照组（C组）、一次力竭组（O组）、反复力竭组（R组），各组大鼠分别于运动后即刻（0h）、4小时（4h）、12小时（12h）、24小时（24h）不同时相取材，一次力竭运动各组大鼠分别以O-0h、O-4h、O-12h、O-24h命名，反复力竭运动各组大鼠分别以R-0h、R-4h、R-12h、R-24h命名，以观察运动结束后SAN细胞膜上离子通道If、ICa,L、ICa,T、IKr、IKs、IKATP电流密度变化与时间的关系。动物模型建立：安静对照组不施加任何运动影响，反复力竭各组大鼠尾部负重为体重的3%，每天1次，每周6天游泳训练，每次运动时间控制在2小时左右，共运动2周；一次力竭运动各组大鼠正常喂养两周后，进行一次性力竭游泳运动，运动方案同反复力竭组。模型建立完成后，测量大鼠心电图及相关血液学指标以判断模型建立效果。研究方法：1.大鼠SAN细胞急性分离：采用Langendorff灌流及酶消化法急性分离大鼠SAN细胞。2.全细胞膜片钳记录SAN细胞各通道电流：应用全细胞膜片钳技术分别记录各组SAN细胞膜上If、ICa,L、ICa,T、IKr、IKs、IKATP共6个通道电流密度的变化。3.数据统计：全细胞膜片钳实验结果以通道电流密度数值表示，电流密度为电流强度与膜电容的比值（pA/pF），其中电流强度为实验所测量电流峰值，膜电容为实验中记录到的单个细胞电容值。实验结果中各通道电流密度以均数±标准差（x±S）表示，数据采用SPSS13.0软件及EXCEL软件中单因素方差分析（ANOVA），各实验组与对照组之间的显着性差异采用SNK法，P＜0.05为显着性差异，P＜0.01为非常显着性差异。研究结果：1.力竭运动对大鼠心电图和相关血液学指标的影响：心电图指标结果：反复力竭运动后，心电图显示窦性心动过缓发生率为20%；窦性心律不齐发生率为2.5%，ST-T出现明显升高，心肌缺血的发生率为5%。血液学指标：一次力竭运动及反复力竭运动后大鼠肌红蛋白、血清肌钙蛋白I和肌钙蛋白T出现不同程度升高，表明心肌出现微损伤。2.力竭运动对大鼠SAN细胞If电流的影响：与对照组-29.11±2.63pA/pF相比，一次力竭运动对于大鼠窦房结HCN通道If电流密度无明显影响，反复力竭各时相组If电流密度显着下降（P<0.01）。这一结果可能导致SAN细胞舒张期自动去极化的负性变时效应，从而引起SAN细胞起搏活动的减慢。3.力竭运动对大鼠SAN细胞ICa,L电流的影响：对照组SAN细胞ICa,L电流密度为-7.78±0.76pA/pF，一次力竭运动各时相组无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为-6.19±0.38pA/pF，较对照组及一次力竭各组显着下降（P<0.05），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为-6.26±0.06pA/pF、-6.22±0.95pA/pF和-6.33±0.68pA/pF，低于对照组及一次力竭O-0h组（P<0.05，P<0.05，P<0.05）。4.力竭运动对大鼠SAN细胞ICa,T电流的影响：与对照组ICa,T电流密度为-11.23±0.79pA/pF相比，一次力竭运动各时相组电流密度无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为-6.89±1.42pA/pF，较对照组及一次力竭各组下降，且具有显着性差异（P<0.01），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为-6.62±0.42pA/pF、-7.02±0.84pA/pF和-6.58±0.56pA/pF，与对照组及一次力竭各组相比，均具有显着性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。5.力竭运动对大鼠SAN细胞IKr电流的影响：与对照组大鼠SAN细胞IKr电流密度为1.73±0.04pA/pF相比，一次力竭运动各时相组电流密度无明显变化，反复力竭即刻组R-0h电流密度为0.93±0.05pA/pF，较对照组及一次力竭各组下降，且具有显着性差异（P<0.01），反复力竭其它时相组的电流密度均下降，分别为0.89±0.17pA/pF、0.96±0.03pA/pF和0.92±0.29pA/pF，与对照组及一次力竭各组相比，均具有显着性差异（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。6.力竭运动对大鼠SAN细胞IKATP电流的影响：与对照组1.02±0.07pA/pF相比，一次力竭运动可引起大鼠窦房结KATP通道IKATP电流密度增加，但无统计学意义；反复力竭各时相组IKATP电流密度为3.77±0.05pA/pF（P<0.01），并明显高于一次力竭O-0h组（P<0.01），但反复力竭组中随着取材时间的延长，电流密度呈下降趋势，24h内仍未达到对照组水平。研究结论：1.两周反复力竭运动可导致心脏SAN细胞If，ICa,L、ICa,T、IKr电流密度减少，IKATP电流密度增加，上述5种离子通道出现变化的综合效应可导致窦房结自律性、兴奋性及传导性等功能活动异常，致使运动员窦性心动过缓、窦性心律失常、病态窦房结综合症等结内病理变化的发生率增加。2.长期大强度反复运动训练对于心脏窦房结起搏活动的影响可进而引发异位起搏点出现，如房性心律、心房颤动、心房扑动及室性心律失常等心脏电兴奋产生异常，还可能导致房室传导阻滞、房室分离等电兴奋传导障碍。由此可见，运动训练对于窦房结起搏活动相关离子通道电生理学的影响可能是运动性心律失常的主要发生机制之一。第二部分力竭运动对大鼠窦房结离子通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响研究目的：探讨两周力竭运动对大鼠SAN细胞膜上HCN通道亚基HCN1、HCN2、HCN4，L-Ca2+通道亚基Cav1.2、Cav1.3，T-Ca2+通道亚基Cav3.1、Cav3.2，延迟整流K+通道亚基ERG、KvLQT1，ATP敏感型钾离子通道亚基Kir6.2共10个亚基mRNA和蛋白质表达的影响。实验分组及动物模型建立：同第一部分。研究方法：1.应用实时荧光定量PCR法测定各组大鼠SAN组织HCN1、HCN2、HCN4、Cav1.2、Cav1.3、Cav3.1、Cav3.2、ERG、KvLQT1、Kir6.2mRNA表达水平。2.应用Western blot法测定各组大鼠SAN组织HCN1、HCN2、HCN4、Cav1.2、Cav1.3、Cav3.1、Cav3.2、ERG、KvLQT1、Kir6.2蛋白质表达水平。3.数据统计：实验结果以均数±标准差（x±S）表示，数据采用SPSS13.0软件及EXCEL软件中单因素方差分析（ANOVA），各实验组与对照组之间的显着性差异采用SNK法，P＜0.05为显着性差异，P＜0.01为非常显着性差异。研究结果：1.力竭运动对大鼠SAN HCN通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：与对照组相比，一次力竭组中的O-0h组HCN1、HCN4mRNA相对表达量明显升高（P<0.05，P<0.01），O-4h组HCN1、HCN4明显升高（P<0.01，P<0.05）；反复力竭组R-0h与R-4h组HCN1明显下降（P<0.01，P<0.01）；反复力竭各组HCN2、HCN4mRNA表达明显下降（P<0.01）。（2）蛋白质水平：与对照组相比，反复力竭各组HCN1蛋白质表达无明显变化，HCN2、HCN4蛋白质表达明显下降（P<0.01）。2.力竭运动对大鼠SAN L-Ca2+通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：各组Cav1.2mRNA表达无明显变化；与对照组相比，O-0h、O-4h、O-12h组Cav1.3mRNA相对表达量升高（P<0.05、P<0.05、P<0.05）；反复力竭各时相组Cav1.3mRNA相对表达量下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。（2）蛋白质水平：各组Cav1.2蛋白质表达无明显变化；与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Cav1.3标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。3.力竭运动对大鼠SAN T-Ca2+通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响：（1）mRNA水平：与对照组相比，O-0h、O-4h、O-12h组Cav3.1mRNA相对表达量升高（P<0.05、P<0.05、P<0.05）；反复力竭各时相组Cav3.1mRNA相对表达量下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各组Cav3.2mRNA表达无明显变化。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Cav1.3标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各组Cav3.2蛋白质表达无明显变化。4.力竭运动对大鼠SAN IKr通道亚基mRNA及蛋白质表达的影响:（1）mRNA水平：与对照组相比，反复力竭各时相组ERG mRNA相对表达量下降（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组ERG标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。5.力竭运动对大鼠SAN IKs通道亚基mRNA及蛋白质表达无影响。6.力竭运动对大鼠SAN ATP敏感型K+通道亚基mRNA及蛋白质表达的影：（1）mRNA水平：与对照组相比，反复力竭各时相组Kir6.2mRNA相对表达量上调（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.05）。（2）蛋白质水平：与对照组及一次力竭O-0h组相比，反复力竭各时相组Kir6.2标准灰度值下降（P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。研究结论：两周反复力竭运动可引起大鼠窦房结HCN、L-Ca2+、T-Ca2+、快激活内向整流K+通道及ATP敏感型K+通道亚基mRNA及蛋白质表达的变化，长期大强度反复运动训练状态下，窦房结起搏活动相关离子通道组成亚基mRNA及蛋白质的表达与通道电流密度的变化趋势具有一致性，可见，离子通道亚基是通道电生理活动改变的主要结构因素及重要的分子学机制，因此，运动对于窦房结细胞离子通道功能状态的影响可能主要由通道亚基的改变介导。
陆文娟[8]（2012）在《蟾酥的心脏毒性评价和减毒药物筛选》文中提出近年来中药毒性问题已引起学者的广泛关注,有毒中药蟾酥是临床常用药物,为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufogargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液。具有解毒止痛、开窍醒神的功能。为咽喉类中成药（六神丸、牛黄消炎丸等）和抗肿瘤中成药（华蟾素片、西黄丸等）的主要组成药物。药理学研究表明具有抗癌、抗辐射、抗结核、强心、抗白血病等作用。但是,蟾酥有毒性,临床不慎过量使用可引起中毒,特别是引起心律失常甚至死亡。其存在心脏毒性严重制约了临床用药安全。因此,本论文开展蟾酥心脏毒性和其减毒药物筛选研究,旨在揭示其临床合理配伍应用提供实验依据。主要内容包括:1.蟾酥对心律失常、心功能的影响;2.筛选具有减低蟾酥心脏毒性的药物;3.抗心律失常药对蟾酥诱导的各类心律失常的作用,及Na+、K+、Ca2+与蟾酥诱导的心律失常的关系;4.维拉帕米与苯妥英钠对豚鼠离体心脏蟾蜍甾烯类成分摄取量的影响。主要研究结果如下:1.系统地归纳了中药蟾酥的化学成分、药理作用、临床应用方面的研究进展;并对心律失常的发病机制、抗心律失常药物的研究进展进行了综述。2.蟾酥致大鼠心律失常的动力学研究。采用动态心电图技术,给大鼠一次性灌胃蟾酥生药（250/500 mg/kg）,记录正常状态下及给药后5、15、30、45、60、120、180、300、480、720 min的心电图,对所有心电图的分析,结果表明:①蟾酥中毒大鼠发生的主要心律失常类型（室上性早搏,室上性心动过速,室性早搏,室性心动过速,室颤,室性心动过缓）②不同时间点心律失常发生率;③720分钟之内心律失常程度趋势。3.蟾酥生药（125/250 mg/kg）对豚鼠心电图和心功能的影响。通过监测蟾酥中毒豚鼠的心电图和心功能,结果显示:①蟾酥能引起豚鼠多种心律失常,与正常心电图相比,P-R间期显着延长（P<0.01）、QRS时程显着增宽（P<0.01）,心率显着加快（P<0.05,P<0.01）;②蟾酥抑制豚鼠左心室功能（dp/dtmax、Pmax和RPP显着下降（P<0.05,P<0.01）,Pmin显着升高（P<0.05,P<0.01））。4.筛选具有减低蟾酥心脏毒性的中药。通过文献查阅,选出10种文献报道有抗心律失常作用的中药。采用动态心电图记录10种中药对蟾酥心脏毒性的影响,经过多指标分析,结果显示中药成分黄芪甲苷和复方生脉饮对蟾酥诱导的小鼠心律失常的减毒作用最明显,人参总皂苷、西洋参总皂苷、薯蓣皂苷、银杏内酯、牛磺酸、小檗碱作用次之,炙甘草汤和人参芍药汤在目前条件下,减毒作用不显着。5.四类抗心律失常药对蟾酥致心律失常的作用。采用小鼠整体及离体心脏灌流实验,在整体实验中,发现苯妥英钠对蟾酥诱导小鼠心律失常具有显着抑制作用,其次是利多卡因和普奈洛尔,胺碘酮减毒作用不明显。发现维拉帕米对蟾酥致小鼠心律失常有双向影响:一方面,维拉帕米抑制了蟾酥诱导小鼠室性心律失常;另一方面,维拉帕米加剧了蟾酥诱导小鼠房室传导阻滞,存活时间缩短,提示维拉帕米与蟾酥类药物联用需谨慎。在离体实验中,采用Langendorff灌流装置,观察药物对小鼠心脏的直接作用,发现苯妥英钠对中毒小鼠离体心脏的保护作用最强,其次是利多卡因,普奈洛尔和胺碘酮没有明显减毒作用,维拉帕米减少了蟾酥在小鼠心脏的累积致死量。统计心电图的各项指标（P-R间期、QRS时程、Q-T间期、T波幅度和HR）和各种心律失常发生率,分析蟾酥诱导心律失常类型与离子通道的关系,结果显示:蟾酥诱导小鼠的室性心律失常可能与钠离子通道关系密切,室上性心律失常可能与β肾上腺素受体关系密切,传导阻滞可能与钙通道关系密切。6.维拉帕米对蟾酥心脏毒性的影响。前期实验表明维拉帕米对蟾酥致小鼠心律失常有双向作用,并且缩短中毒小鼠的存活时间,进一步采用豚鼠离体心脏灌流及心电图监测技术,观察维拉帕米对蟾酥致离体豚鼠心脏心律失常的影响,并采用UPLC-MS分析心脏中蟾酥各成分的摄取水平。结果表明维拉帕米抑制蟾酥诱导的QRS时程增宽（P<0.05）,增加P-R间期（P<0.05）,减慢心率（P<0.05,P<0.01）。并显着增加离体豚鼠心脏对6种蟾蜍甾烯类成分的摄取（P<0.05）。说明,蟾蜍甾烯类成分摄取量的增加可能是其毒性增加的潜在机制。7.苯妥英钠对蟾酥心脏毒性的影响。前期实验表明苯妥英钠对蟾酥致小鼠心律失常疗效显着,进一步采用豚鼠离体心脏灌流及心电图监测技术,观察苯妥英钠对蟾酥致离体豚鼠心脏心律失常的影响,并采用UPLC-MS分析心脏中蟾酥各成分的摄取水平。结果表明苯妥英钠能抑制QRS时程增宽（P<0.05）,并显着降低离体豚鼠心脏对4种蟾蜍甾烯类成分的摄取（P<0.05）。综上所述,本论文分析了人参总皂苷、西洋参总皂苷、薯蓣皂苷、黄芪甲苷、牛磺酸、银杏内酯、小檗碱、生脉饮、炙甘草汤、人参芍药汤、苯妥英钠、利多卡因、普奈洛尔、胺碘酮、维拉帕米分别对蟾酥心脏毒性的作用,结果表明:苯妥英钠对抗蟾酥诱导心律失常的作用最显着,这可能与其能降低心肌对4种蟾蜍甾烯类成分的摄取有关;维拉帕米对抗蟾酥诱导的心律失常有双向作用,且能缩短蟾酥中毒小鼠的存活时间,这可能与其能增加心肌对6种蟾蜍甾烯类成分的摄取有关;所筛选中药中,对蟾酥致小鼠心律失常疗效较明显的为黄芪甲苷和生脉饮。蟾酥诱导的心律失常可能与Na+、Ca2+通道关系较密切。通过本论文的实验研究,希望可以为蟾酥的临床应用及新药开发提供一定的实验依据。在选择心律失常药物时要针对心律失常性质,用药目的要明确,联合用药需慎重。
陶莉[9]（2008）在《可溶性Aβ25-35对新生大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道mRNA表达影响的研究》文中认为目的:Alzheimer’s病（AD）是影响记忆和认知功能的进行性退化性神经病变,是痴呆最常见的原因。研究表明,β淀粉样蛋白（Aβ）增加是AD中枢病因性过程,凝聚态Aβ具有明确的神经毒性作用。但亦有研究提出,Aβ在纤维性沉积前即可溶性Aβ也可产生神经毒性作用。海马是学习和记忆的关键部位,直接参与记忆的获取和建立。海马CA3区与空间辨别性学习记忆关系密切。而学习和记忆存储的分子和生理机制研究表明,钾通道、蛋白激酶C、记忆相关蛋白Cp20、细胞内钙调节在学习和记忆机制中起重要作用,其中钾离子通道在学习和记忆中起着关键作用,提示钾通道在老年痴呆发病过程中具有重要意义。有研究认为可溶性Aβ25-35对新生大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾电流（Ik）有明显抑制作用,其效应具有时间依赖性和电压依赖性,但具体作用机制不清。本实验以大鼠海马CA3区锥体神经元为研究对象,采用膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合的方法,研究可溶性Aβ25-35对新生大鼠海马CA3区锥体神经元几种代表性延迟整流钾通道亚型mRNA表达的影响,从分子生物学的角度探讨Ik变化的分子机制。为研究Aβ在AD发病过程中的作用机制以及临床应用钾通道调节剂预防和治疗AD提供理论依据。方法:采用酶解和机械分离相结合的方法,急性分离新生大鼠海马CA3区锥体神经元。运用膜片钳,借助其电极形成的吸收通道提取单个细胞,然后对其进行单细胞水平的分子生物学研究。由于单个细胞中提取的mRNA数量很少,应用传统的单对引物对单细胞mRNA进行RT-PCR扩增,得到的产物结果不够理想,故本实验采用的巢式设计的两对PCR引物,进行两轮PCR扩增。RT-PCR扩增后凝胶电泳成像分析,观察可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾离子通道亚型Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1表达的影响。结果:1.延迟整流钾通道亚型Kv1.2,Kv1.5,Kv2.1在正常大鼠海马CA3区锥体神经元上均有不同程度的表达。其中,Kv2.1的表达水平较高。2.加入浓度为1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分钟后,大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型Kv1.2mRNA的相对表达量与对照组相比明显降低,分别降低15.9%（P＜0.01）、24.0%（P＜0.01）、35.8%（P＜0.01）。3.加入浓度为1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分钟后,大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型Kv1.5mRNA的相对表达量与对照组相比明显降低,分别降低17.8%（P＜0.01）、23.2%（P＜0.01）、36.1%（P＜0.01）。4.加入浓度为1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分钟后,大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型Kv2.1 mRNA的相对表达量与对照组相比明显降低,分别降低17.2%（P＜0.01）、23.7%（P＜0.01）、36.9%(P＜0.011。5.加入浓度为5.0μM可溶性Aβ25-35孵育1、3、5、8、10分钟后,大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型Kv2.1 mRNA的相对表达量与对照组相比明显降低,分别降低了38.7%（P＜0.01）、43.5%（P＜0.01）、53.3%（P＜0.01）、65.6%（P＜0.01）、73.7%（P＜0.01）。结论:1.在正常新生大鼠海马CA3区锥体神经元细胞膜上,延迟整流钾通道亚型Kv1.2,Kv1.5,Kv2.1 mRNA均有不同程度的表达,其中以Kv2.1的表达较为丰富。2.可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型Kv1.2,Kv1.5,Kv2.1 mRNA的表达有较明显的抑制作用,这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性。3.可溶性Aβ25-35对大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道亚型mRNA表达的抑制导致钾通道数量减少,这可能是其对延迟整流钾电流抑制作用的机制之一。
李享元[10]（2005）在《基于离子通道动力学的神经药物作用机制的研究》文中研究说明阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是老年性痴呆中的一个主要类型,发达国家对此疾病的发病机制及预后研究较深入。许多研究表明胆碱能神经的功能缺失在AD 发病机制中具有重要的作用。目前,AD 已经和心、脑血管疾病、恶性肿瘤并列为导致老年人死亡的四大杀手。乙酰胆碱酯酶抑制药AChEI 获许用于AD 治疗,且今后仍是主要治疗用药。华中科技大学、香港科技大学、美国、台湾和上海药物研究所的不同学科和专业背景的学者,探索神经退行性疾病的发病机制和药物开发,取得了阶段性成果,并推出了第二代新型的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物Bis（7）-tacrine。Bis（7）-tacrine [bis（7）-tetrahydroaminacrine] 是一种新型的二聚体乙酰胆碱酯酶抑制剂,两个tacrine 分子通过庚烯键连接而成。实验证明它的药理作用比tacrine 强150倍,对抑制乙酰胆碱酯酶的选择性是tacrine 的250 倍。Tacrine 是首先用于缓解治疗Alzheimer’s disease 的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物。Bis（7）-tacrine 可以有效逆转老鼠AF64A 诱导方向性记忆缺陷。Bis（7）-tacrine 是一种多功能/多靶点乙酰胆碱酯酶抑制剂,可以作用于酶、神经递质、受体和离子通道等靶点。除了乙酰胆碱酯酶抑制作用,Bis（7）-tacrine 对几种配体门控离子通道也有调制作用,如大鼠海马神经元的GABAAR 受体,大鼠三叉神经元的5-HT3R 受体,和大鼠海马神经元的NMDAR 受体等等。本文的研究旨在探索bis（7）-tacrine 是否象FDA（美国食品和药物管理局）批准的乙酰胆碱酯酶抑制剂tacrine 一样对多种神经元的通道和受体具有调制作用及其对离子通道的动力学参数的影响。为此,综合利用膜片钳、电压钳和基因表达技术,进行了相应实验工作,验证了bis（7）-tacrine 神经药理作用,并且比tacrine 强两个数量级左右。本文创新性的研究工作如下: （1） 充分利用电子技术和计算机技术的成就和进步,研制了国内首台基于USB（Universal Serial Bus）的卵母细胞双电极电压钳和数据采集分析系统。在广泛听取电生理科研人员的意见和建议的基础上,研制的仪器易于操作,软件界面友好,并在试验中验证其性能指标,具有高输入阻抗、低噪声、低漂移、精度高和跟随响应速度快且性价比高。由于采用USB 接口,使仪器便于安装和调试。卵母细胞双电极电压钳系统,国内一直依赖进口,如NPI 的一个电压钳放大器价格达到八千到一万美
二、mRNA Expression Alteration of Inward Rectifier Potassium Channels in Rats Brain with Cholinergic Impairment（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、mRNA Expression Alteration of Inward Rectifier Potassium Channels in Rats Brain with Cholinergic Impairment（论文提纲范文）
（1）KATP通道SUR1亚单位在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.在体细胞外电生理记录 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 小鼠基因型鉴定实验步骤 |
| 1.5 在体细胞外电生理记录过程 |
| 1.5.1 玻璃电极的拉制 |
| 1.5.2 麻醉 |
| 1.5.3 颅骨开窗 |
| 1.5.4 细胞外记录神经元自发放电活动 |
| 1.5.5 组织学检查 |
| 2.脑内立体慢病毒注射 |
| 2.1 实验动物准备 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验过程 |
| 2.5 病毒感染位置检测 |
| 3.实时荧光定量PCR技术检测K_(ATP)通道各亚基的表达水平变化 |
| 4.Western blots法检测蛋白表达水平变化 |
| 5. 免疫荧光方法检测小鼠 SN 区 TH 阳性细胞数量的表达变化 |
| 6.高效液相色谱法(HPLC法)检测小鼠Str内 DA含量及其代谢产物含量 |
| 7.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.正常小鼠SN区DA能神经元自发放电活动鉴别 |
| 2.K_(ATP)通道开放剂二氮嗪可降低小鼠SN区 DA能神经元自发放电频率 |
| 3.K_(ATP)通道参与小鼠SN区 DA能神经元簇状放电活动 |
| 4.3月龄和6 月龄A53Tα-syn转基因小鼠SN区 DA能神经元自发放电频率增加且出现放电模式改变 |
| 5.敲低SUR1 可部分拮抗SN区由α-syn聚集诱发的DA能神经元损伤 |
| 6.MPTP制备的PD小鼠模型SN区 K_(ATP)通道的SUR1 亚单位表达上调 |
| 7.敲低SUR1 可拮抗MPTP诱导的小鼠SN区 DA能神经元的损伤 |
| 8.敲低SUR1 可拮抗MPTP诱导的氧化应激水平增高,减少细胞凋亡的发生 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读硕士期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（2）ASIC1a、TASK-1和TASK-3在癫痫持续状态模型中的表达及作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: ASIC1a、TASK-1和TASK-3在癫痫中的表达和作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Hypocretin调控内侧内嗅皮层的机制及其对学习记忆的影响（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hypocretin调控内侧内嗅皮层局部兴奋-抑制性环路及其机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 内源性hypocretin在调控内侧内嗅皮层神经元活动及网络振荡中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Hypocretin对内侧内嗅皮层相关空间学习记忆的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 觉醒系统调控内嗅皮层的研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间参与的其他工作 |
| 学习期间准备投稿和已发表的论文 |
| 致谢 |
（4）A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对慢性间歇低氧大鼠颏舌肌中枢调控的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :常氧大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌中枢调控的影响及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 溶液和药物配制 |
| 2.3.1 麻醉剂 |
| 2.3.2 免疫组化实验溶液 |
| 2.3.3 实验药物 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 经颅磁刺激记录 |
| 2.4.2 颏舌肌肌电记录 |
| 2.4.3 脑部扩散模型的制备 |
| 2.4.4 A7细胞群定位 |
| 2.4.5 A7细胞群损毁 |
| 2.4.6 A7细胞群微量注射 |
| 2.4.7 组织取材及切片 |
| 2.4.8 A7细胞群去甲肾上腺素能神经元免疫组织化学染色步骤 |
| 2.4.9 A7细胞群去甲肾上腺素能神经元免疫荧光染色步骤 |
| 2.4.10 A7细胞群DBH与 GIRK通道免疫荧光双标染色步骤 |
| 2.4.11 中性红染色步骤 |
| 2.4.12 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 实验大鼠一般情况观察 |
| 3.2 常氧大鼠A7细胞群神经元免疫荧光及免疫组化 |
| 3.3 脑部药物扩散模拟结果 |
| 3.4 微量注射部位标记 |
| 3.5 A7细胞群去甲肾上腺素能神经元特异性损伤 |
| 3.6 A7细胞群GIRK通道的免疫荧光双染 |
| 3.7 损伤A7细胞群去甲肾上腺素能神经元后对颏舌肌的影响 |
| 3.8 A7细胞群α_2受体对颏舌肌中枢调控的影响 |
| 3.9 A7细胞群GIRK通道对颏舌肌中枢调控的影响 |
| 3.10 A7细胞群α_2受体对颏舌肌中枢调控的功能与GIRK通道耦连 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :慢性间歇低氧大鼠A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对颏舌肌中枢调控的影响及机制研究 |
| 6 前言 |
| 7 材料和方法 |
| 7.1 实验动物 |
| 7.2 主要试剂及仪器 |
| 7.2.1 主要试剂 |
| 7.2.2 主要仪器 |
| 7.3 溶液和药物配制 |
| 7.4 实验方法 |
| 7.4.1 慢性间歇低氧模型大鼠制备 |
| 7.4.2 经颅磁刺激记录 |
| 7.4.3 颏舌肌肌电记录 |
| 7.4.4 A7细胞群损毁 |
| 7.4.5 A7细胞群微量注射 |
| 7.4.6 组织取材及切片 |
| 7.4.7 A7细胞群去甲肾上腺素能神经元免疫组织化学染色步骤 |
| 7.4.8 舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢免疫组织化学染色步骤 |
| 7.4.9 舌下神经核α_(1A)与α_(2A)受体免疫组织化学染色步骤 |
| 7.4.10 统计学方法 |
| 8 结果 |
| 8.1 实验大鼠一般情况观察 |
| 8.2 慢性间歇低氧条件下损伤A7细胞群去甲肾上腺素能神经元后对颏舌肌中枢调控的影响 |
| 8.3 慢性间歇低氧条件下A7细胞群α_2受体对颏舌肌中枢调控的影响 |
| 8.4 慢性间歇低氧对大鼠A7细胞群DBH表达的影响 |
| 8.5 慢性间歇低氧对大鼠舌下神经核去甲肾上腺素能纤维末梢的影响 |
| 8.6 慢性间歇低氧对大鼠舌下神经核α_(1A)受体表达的影响 |
| 8.7 慢性间歇低氧对大鼠舌下神经核α_(2A)受体表达的影响 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 本研究的创新性及自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 转录因子Tbx18介导c-kit~+犬间充质干细胞(cMSCs)在体外共培养环境中定向分化为窦房结样细胞的实验研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 使用流式细胞仪分选c-kit~+c MSCs犬窦房结、犬心房肌细胞原代分离培养.. |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 构建Tbx18 慢病毒载体转染c-kit~+cMSCs |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Tbx18 过表达促使c-kit~+cMSCs向窦房结样细胞分化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCN4和GJA7慢病毒载体构建与转染cMSCs |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化及检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第三部分 温敏水凝胶对Tbx18、HCN4、GJA7 基因转染cMSCs生物学活性的影响 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶体外细胞毒性检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶内细胞生长情况评价 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心脏生物起搏器的研究进展和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文及期刊 |
| 致谢 |
（6）复智胶囊及大黄素对VD大鼠海马和SH-SY5Y线粒体凋亡通路与Iκ电流关系的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 从肾论治血管性痴呆的中医药研究进展 |
| 1 从肾论治血管性痴呆的中医理论依据 |
| 2 从肾论治血管性痴呆的现代医学认识 |
| 3 马云枝教授治疗血管性痴呆的经验述评 |
| 4 局限与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 Bcl-2和Caspase在缺血性脑损伤线粒体凋亡通路中的重要角色 |
| 1 细胞凋亡和缺氧缺血性脑损伤 |
| 2 线粒体通路在缺血性脑损伤神经元凋亡中具有调控作用 |
| 3 局限与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 复智胶囊对VD模型大鼠线粒体凋亡通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 复智胶囊主要成分大黄素对 SH-SY5Y 缺糖缺氧损伤的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 复智胶囊有效成分大黄素对SH-SY5Y缺糖缺氧后I_κ的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在问题与不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 造模方法选择 |
| 附录二 阳性药选择 |
| 附录三 Morris水迷宫图 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（7）力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名词缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述一 运动对窦房结结构及功能的影响研究进展 |
| 1 运动与窦房结功能异常 |
| 1.1 窦性心动过缓 |
| 1.2 窦性心律不齐 |
| 1.3 病态窦房结综合征 |
| 1.4 房室交界区性逸搏 |
| 2 不同运动项目对窦房结功能变化的影响 |
| 3 运动导致窦房结功能异常的原因分析 |
| 4 结语 |
| 文献综述二 窦房结起搏活动相关离子通道研究进展 |
| 1 窦房结的位置和结构 |
| 1.1 窦房结的位置 |
| 1.2 窦房结的组成结构 |
| 1.3 窦房结细胞特性 |
| 1.4 心脏首要起搏点 |
| 2 窦房结起搏活动相关离子通道 |
| 3 窦房结起搏活动相关离子通道在自律性活动中的作用 |
| 3.1 Funny 电流与超级化激活环核苷酸门控通道 |
| 3.2 钙离子通道 |
| 3.3 延迟整流钾离子通道 |
| 3.4 内向整流钾离子通道 |
| 4 窦房结功能障碍 |
| 4.1 遗传性窦房结功能障碍 |
| 4.2 年龄与窦房结功能障碍 |
| 4.3 心力衰竭与窦房结功能障碍 |
| 4.4 心肌缺血与窦房结功能障碍 |
| 5 小结与展望 |
| 第一部分 力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道电流的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 主要试剂及其来源 |
| 1.6 主要实验试剂配制方法 |
| 1.7 动物模型建立 |
| 1.8 研究方法 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组间大鼠初始体重比较 |
| 2.2 各组大鼠心脏形态肉眼观察 |
| 2.3 各组大鼠心系数的变化 |
| 2.4 各组大鼠心电图变化特点 |
| 2.5 各组大鼠血液学指标检测 |
| 2.6 大鼠窦房结细胞鉴定 |
| 2.7 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_f电流的影响 |
| 2.8 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Ca,L)电流的影响 |
| 2.9 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Ca,T)电流的影响 |
| 2.10 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Kr)电流的影响 |
| 2.11 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Ks)电流的影响 |
| 2.12 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(KATP)电流的影响 |
| 3 结果分析与讨论 |
| 3.1 研究方法选定与实验动物模型建立 |
| 3.2 不同强度运动对大鼠各项生理学指标的影响 |
| 3.3 大鼠窦房结细胞的急性分离 |
| 3.4 全细胞膜片钳技术在离子通道研究中的应用 |
| 3.5 力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_f电流的影响 |
| 3.6 两周力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Ca,L)通道电流的影响 |
| 3.7 两周力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Ca,T)通道电流的影响 |
| 3.8 两周力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(Kr)通道电流的影响 |
| 3.9 两周力竭运动对大鼠窦房结细胞 I_(KATP)通道电流的影响 |
| 3.10 神经系统对力竭运动大鼠窦房结离子通道电流密度的影响 |
| 3.11 运动对机体的影响与窦房结功能障碍 |
| 3.12 运动引起窦房结离子通道改变与运动性窦房结功能障碍机制探讨 |
| 3.13 本章小结与展望 |
| 4 结论 |
| 第二部分 力竭运动对大鼠窦房结相关离子通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验动物分组 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 药品及试剂 |
| 1.6 主要溶液配制 |
| 1.7 动物模型建立 |
| 1.8 实时荧光定量 PCR 法测定窦房结离子通道亚基 mRNA 表达 |
| 1.9 Western blot 法测定窦房结离子通道亚基蛋白质表达 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 力竭运动对管家基因 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.2 力竭运动对 HCN 通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.3 力竭运动对 L-Ca~(2+)通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.4 力竭运动对 T-Ca~(2+)通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.5 力竭运动对快激活延迟整流 K~+通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.6 力竭运动对慢激活延迟整流 K~+通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 2.7 力竭运动对窦房结 ATP 敏感型 K~+通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3 结果分析与讨论 |
| 3.1 研究方法选定与实验动物模型建立 |
| 3.2 窦房结离子通道亚基基因表达特点 |
| 3.3 力竭运动对大鼠窦房结 HCN 通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3.4 力竭运动对 L-Ca~(2+)通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3.5 力竭运动对 T-Ca~(2+)通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3.6 力竭运动对快激活内向整流 K~+通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3.7 力竭运动对 ATP 敏感型 K~+通道亚基 mRNA 及蛋白质表达的影响 |
| 3.8 运动引起窦房结离子通道亚基基因表达改变原因分析 |
| 3.10 本章小结与展望 |
| 4 结论 |
| 第三部分 力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道的影响全文总结 |
| 1 力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道电流及亚基的影响 |
| 2 窦房结功能异常与运动性心律失常发生机制探讨 |
| 2.1 窦房结细胞除极障碍及复极障碍与运动性心律失常 |
| 2.2 窦房结电兴奋冲动产生异常与运动性心律失常 |
| 2.3 窦房结电兴奋冲动传导异常与运动性心律失常 |
| 2.4 窦房结电兴奋冲动产生合并传导异常与运动性心律失常 |
| 3 全文结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新贡献与未来研究展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）蟾酥的心脏毒性评价和减毒药物筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 蟾酥的研究进展 |
| 第二章 心律失常发病机制及抗心律失常药物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第三章 蟾酥的心脏毒性评价 |
| 第一节 蟾酥致大鼠心律失常的时毒关系 |
| 第二节 蟾酥对心电图、心功能的影响 |
| 第三节 蟾酥致小鼠神经毒性 |
| 参考文献 |
| 第四章 蟾酥减毒药物的筛选 |
| 参考文献 |
| 第五章 抗心律失常药物对蟾酥心脏毒性的影响 |
| 第一节 四类抗心律失常药对蟾酥致小鼠心律失常的影响 |
| 第二节 维拉帕米对蟾酥心脏毒性的影响 |
| 第三节 苯妥英钠对蟾酥心脏毒性的影响 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）可溶性Aβ25-35对新生大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道mRNA表达影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| Aβ_(25-35)对大鼠海马延迟整流钾通道mRNA表达的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 膜片钳技术与单细胞RT-PCR相结合应用于神经细胞研究的进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）基于离子通道动力学的神经药物作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 阿尔茨海默病和基于离子通道动力学的药物研究 |
| 1.1 老龄化与神经退行性疾病 |
| 1.2 阿尔茨海默病成为当今医学领域多学科研究的焦点 |
| 1.3 神经科学和脑科学的兴起为AD 研究奠定了基础 |
| 1.4 阿尔茨海默病研究进展 |
| 1.5 离子通道动力学模型 |
| 1.6 电压钳和膜片钳技术在离子通道研究的应用 |
| 1.7 离子通道研究及其在药物发现和筛选的应用 |
| 1.8 基于中草药的AD 药物开发研究 |
| 1.9 多学科融合在药物研究中的应用 |
| 1.10 AD 药物bis(7)-tacrine 和本课题的研究工作 |
| 2 双电极电压钳及其USB 数据采集系统的研制 |
| 2.1 细胞的生物电现象 |
| 2.2 电生理技术发展的回顾 |
| 2.3 卵母细胞电压钳记录技术 |
| 2.4 基于USB 的卵母细胞电压钳和数据采集系统 |
| 2.5 电压钳放大器的设计 |
| 2.6 基于USB 数据采集分析系统 |
| 2.7 本章总结 |
| 3 卵母细胞表达Kv4.2 钾通道动力学特征和AD 药物影响 |
| 3.1 卵母细胞表达系统 |
| 3.2 非洲爪蟾卵母细胞特征和分类 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 材料及方法 |
| 3.5 结果 |
| 3.6 讨论和总结 |
| 4 钾通道的动力学特征和AD 药物的影响 |
| 4.1 钾离子通道及其分类 |
| 4.2 电压门控性钾通道的结构和调控机制 |
| 4.3 临床治疗AD 药物 |
| 4.4 新型胆碱酯酶抑制剂bis(7)-tacrine |
| 4.5 钾通道实验材料和方法 |
| 4.6 结果 |
| 4.7 讨论和总结 |
| 4.8 国内外关于钾通道与AD 病的关系研究 |
| 5 钙通道的动力学特征和AD 药物的影响 |
| 5.1 钙离子通道结构及其分类 |
| 5.2 钙通道的功能和钙拮抗剂 |
| 5.3 钙通道实验材料和方法 |
| 5.4 全钙电流的动力学特征和药物的影响 |
| 5.5 药物对N 和P/Q 型钙电流动力学参数和药物影响 |
| 5.6 药物对L 型钙电流动力学参数和药物影响 |
| 5.7 Bis(7)-tacrine 对L 型钙通道电流的稳态激活和恢复时间的影响 |
| 5.8 药物对L 型钙通道的翻转电压、半激活电压和激活时间的影响 |
| 5.9 结果和讨论 |
| 5.10 国内外关于钙通道拮抗剂的神经保护作用 |
| 6 总结和展望 |
| 6.1 本文工作总结 |
| 6.2 进一步的研究和设想 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
四、mRNA Expression Alteration of Inward Rectifier Potassium Channels in Rats Brain with Cholinergic Impairment（论文参考文献）
- [1]KATP通道SUR1亚单位在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究[D]. 刘敏. 青岛大学, 2020(01)
- [2]ASIC1a、TASK-1和TASK-3在癫痫持续状态模型中的表达及作用[D]. 李凤珍. 新乡医学院, 2020(12)
- [3]Hypocretin调控内侧内嗅皮层的机制及其对学习记忆的影响[D]. 程晓芳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [4]A7细胞群去甲肾上腺素能神经元对慢性间歇低氧大鼠颏舌肌中枢调控的影响[D]. 聂昕时. 中国医科大学, 2019
- [5]Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究[D]. 肖华. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [6]复智胶囊及大黄素对VD大鼠海马和SH-SY5Y线粒体凋亡通路与Iκ电流关系的影响[D]. 孙邈. 北京中医药大学, 2016(04)
- [7]力竭运动对大鼠窦房结起搏活动相关离子通道的影响[D]. 薄冰. 上海体育学院, 2012(04)
- [8]蟾酥的心脏毒性评价和减毒药物筛选[D]. 陆文娟. 南京中医药大学, 2012(05)
- [9]可溶性Aβ25-35对新生大鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道mRNA表达影响的研究[D]. 陶莉. 天津医科大学, 2008(01)
- [10]基于离子通道动力学的神经药物作用机制的研究[D]. 李享元. 华中科技大学, 2005(05)