一、人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文文献综述）
周园媛[1]（2021）在《线粒体DNA单倍型类群M9在糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究》文中研究指明糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）作为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）主要的微血管并发症,是导致患者致盲的首要原因,且DR缺乏有效的治疗手段,势必对个人、家庭、社会构成巨大的经济负担。因此,预防DR并揭示其致病机制具有重要的战略意义。近年来,我国DR的患病形势不容乐观,有赶超发达国家的趋势。我国DR患病率存在地域差异,且具有农村高于城市,北方高于南部及东部沿海的特点。云南省位于中国西南高原地区,具有独特的地域、人文结构。前期的调查研究发现,相较于其他地区,云南省T2DM患者的DR患病率高于全国平均水平。因此,云南省DR的防治任务异常艰巨,积极寻找云南省DR的相关危险因素,并制定临床决策模型迫在眉睫。DR复杂的致病机制尚未完全阐明。现有证据显示DR可受到来自基因和环境因素的双重“压力”。因此,除外揭示DR相关的风险临床因素,进一步寻找能够集云南省地理环境、基因遗传特征于一身的因素,并探究该因素与DR的相关性显得尤为必要。既往研究显示线粒体不仅与视网膜密切相关,亦是沟通基因遗传和地域环境的关键“环节”。视网膜是人体集血管,神经系统为一体的特殊器官,需消耗大量的三磷酸腺苷以维持视觉功能。作为细胞能量代谢的重要场所,正常的线粒体的功能对维持视网膜的正常代谢至关重要。线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）突变引起的线粒体功能障碍被证实与DR有关。此外,由于缺乏组蛋白的保护,mtDNA极易突变。人类祖先在向世界各地迁移时,在适应自然环境的过程中使得一些古老的mtDNA变异不断积累,最终形成的特定mtDNA遗传背景,即mtDNA单倍型类群。近年的研究证实mtDNA单倍型类群具有功能性的后果,多与能量代谢性疾病有关,并受到地域、种族等因素的影响。截止目前,mtDNA单倍型类群与DR的研究主要局限于欧美国家,且结果尚存争议。更重要的是,相关研究在我国鲜有报道。因此,结合云南省独特的地理人文背景,进一步探究mtDNA单倍型类群与DR的相关性,并揭示其潜在的致病机制具有重要意义。综上,本研究本从以下三个阶段开展。第一阶段,揭示云南省DR的相关危险因素,并构建临床决策模型。第二阶段,在第一阶段样本的基础上,筛选与云南省DR相关的mtDNA单倍型类群,即候选单倍型类群。第三阶段,通过比较候选单倍型类群与对照单倍型类群融合细胞的线粒体功能,并进行点突变和转录组测序分析,揭示候选单倍型类群在DR中的相关分子机制。总之,从临床研究过渡到基础研究,层层递进,不断丰富DR的致病机制。第一部分云南省糖尿病视网膜病变的相关危险因素分析及临床决策模型构建[目 的]揭示云南省T2DM患者DR的相关危险因素,并构建临床决策模型。[方 法]入组1654名汉族T2DM患者,依据眼底照相结果分为:无视网膜病变（without DR,WDR）组（n=826）,DR 组（n=828）。DR 组依据病变严重程度进一步分为:非增殖性糖尿病视网膜病变（non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR）组（n=403）,增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）组（n=425）。采集患者临床资料,采用SPSS 20.0软件进行单因素和logistic回归分析,并构建临床决策树模型。[结 果]1.单因素分析显示,与WDR组相比,DR组的女性占比,糖尿病病程,卧位或立位收缩压（systolic pressure,SBP）,卧位舒张压（diastolic pressure,DBP）,胆固醇（cholesterol,Chol）,尿素氮（bloodureanitrogen,BUN）,尿酸（uric acid,UA）,血肌酐（serumcreatinine,Scr）,空腹血糖及糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）均显着升高（all P<0.05）;体重指数（body mass index,BMI）,臀围和预估肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）均显着下降（all P<0.05）。与NPDR组相比,PDR组的女性占比,卧位SBP,卧位DBP,Chol,低密度脂蛋白-胆固醇及BUN均显着升高（all P<0.05）,而年龄,臀围及eGFR均显着下降（all P<0.05）。2.Logistic回归分析显示,女性（优势比（oddsratio,OR）=1.520）,糖尿病病程≥10 年（OR=2.118）,立位或卧位 SBP≥ 140 mmHg（OR=1.417,OR=1.881）,Chol≥6.22 mmol/L（OR=1.591）是T2DM患者发生DR的风险因素。此外,慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）分期或HbA1c风险等级每增加一个等级,T2DM患者发生DR的风险逐级增加。此外,女性（OR=2.161）,糖尿病病程≥10年（OR=1.483）,CKD分期等级的增加亦是NPDR患者进展为PDR的风险因素。3.决策树模型中,糖尿病病程是影响T2DM患者发生DR的首要危险因素,即根节点。CKD分期,卧位SBP,立位SBP和BMI是内部节点,是否合并DR为叶节点。提取规则后解释为:对于糖尿病病程<10年的患者,若满足:①CKD分期=G3/G4/G5;或②CKD 分期=G2 且 BMI<24 kg/m2;或③CKD 分期=G1且立位SBP≥140mmHg,则容易发生DR。反之,对于糖尿病病程≥10年的患者,若满足:①卧位SBP<140 mmHg且CKD分期=G2/G3/G4;或②卧位SBP≥140 mmHg且CKD分期=G3/G4/G5,则容易发生DR。[结 论]女性,糖尿病病程≥10年,立位或卧位SBP≥140mmHg,Chol≥6.22 mmol/L,CKD分期和HbA1c风险等级的恶化是云南省汉族T2DM患者发生DR的重要危险因素。此外,本研究制定的决策树模型显示,对T2DM患者进行DR患病风险评估时,应首先考虑糖尿病病程。若糖尿病病程<10年,则依据CKD分期进一步评判立位SBP或BMI;若糖尿病病程≥10年,则依据卧位SBP进一步评判CKD分期,最终得出DR的分类结局。该模型简洁直观,能帮助云南地区的临床医生（尤其是缺乏眼底镜等相关DR检测手段的基层医务人员）对T2DM患者发生DR的风险做出更有效的临床预测,值得在未来的临床实践中推广。第二部分 云南省糖尿病视网膜病变的相关mtDNA单倍型类群及mtDNA单核苷酸变异位点分析[目 的]筛选与云南省T2DM患者DR相关的mtDNA单倍型类群及mtDNA单核苷酸变异位点。[方 法]依据眼底照相结果,将832名T2DM患者（均来自第一部分）分为WDR组（n=403）,DR组（n=429）。DR组依据病变严重程度进一步分为NPDR组（n=227）,PDR组（n=202）。首先,提取患者外周血基因组DNA,对mtDNA进行测序后划分患者的mtDNA单倍型类群。然后,采用SPSS 20.0软件进行如下统计学分析:①对入组患者的临床基线资料进行单因素分析,明确第二部分的受试人群能总体代表第一部分的受试人群。②依据mtDNA单倍型类群分布频率绘制主成分分析图。③采用logistic回归分析明确与DR相关的风险mtDNA单倍型类群,即候选单倍型类群。④比较候选单倍型类群与其他单倍型类群临床参数的差异。⑤分析mtDNA控制区单核苷酸变异位点与DR之间的关联。[结 果]1.单因素分析显示,DR组的年龄,糖尿病病程,臀围,卧位SBP,空腹血糖,HbAlc,Chol,BUN,UA,Scr 均与 WDR 组差异显着（all P<0.05）,且结果与第一部分的研究结果一致,提示该部分受试者的临床数据具有良好的稳定性。2.832例T2DM受试者大致可分为40类mtDNA单倍型类群。其中,分布频率≥3%的mtDNA单倍型类群包括:单倍型类群A、B、C、D、R9、M*、M7、M9 和 N9。3.主成分分析显示,尽管mtDNA单倍型类群在中国西南省份内紧密聚集,但没有明显的群体分层现象。中国南部和西南部的mtDNA单倍型类群分布较东部和东北部更为复杂。4.Logistic回归分析显示,单倍型类群M9是DR的独立保护因子（P=0.004,OR=0.1）。5.与其他non-M9单倍型类群受试者相比,单倍型类群M9受试者的Chol浓度显着降低（P=0.042）。即使在WDR受试者中,单倍型类群M9受试者的Chol浓度也明显低于non-M9单倍型类群者（P=0.038）。6.mtDNA控制区的3个单核苷酸变异位点,即mt.T146C、mt.T16298C和mt.C16327T 与 DR 相关（all P<0.05）。[结 论]中国南方和西南地区mtDNA单倍型类群分布较华东和东北地区更为复杂。本研究首次发现单倍型类群M9是云南省T2DM患者发生DR的独立保护因素。本研究中的单倍型类群M9受试者的Chol总体低于单倍型类群non-M9受试者。第三部分M9与non-M9融合细胞的线粒体功能比较及转录组分析[目 的]比较M9与non-M9融合细胞的线粒体功能,并进行点突变和转录组测序分析,揭示单倍型类群M9作为DR保护因子的分子机制。[方 法]首先,依据既往文献,将糖脂代谢不相关的mtDNA单倍型类群作为单倍型类群M9的对照,即non-M9。通过胞质融合技术构建M9和non-M9融合细胞,进一步比较融合细胞的线粒体功能。其次,构建mt.T3394C和mt.G4491A突变质粒,分别转染non-M9融合细胞。依据质粒种类,实验分为正常对照（normal control,NC）组、空载体（Vector）组、野生型（wide type,WT）组和突变型（mutant type,MUT）组,观察 mt.T3394C 和 mt.G4491A 突变对 M7融合细胞线粒体功能的影响。最后,提取M9和non-M9融合细胞的RNA进行转录组分析。[结 果]1.以单倍型类群M7和D5（与糖脂代谢不相关）作为单倍型类群M9的对照,即 non-M9。2.成功构建M9和non-M9（M7,D5）融合细胞。融合细胞线粒体相关功能检测显示,M9融合细胞的线粒体膜电位和线粒体质量显着高于M7融合细胞（P<0.001）,但与D5融合细胞无显着性差异（P>0.05）。ATP含量在M9,M7和D5融合细胞间无显着性差异（all P>0.05）。M9融合细胞的胞浆活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体超氧化物水平显着低于M7和D5融合细胞（all P<0.01）。3.成功构建mt.T3394C突变质粒转染M7融合细胞。MUT组的胞浆ROS水平显着低于NC组,WT组和Vector组（all P<0.05）。MUT组的线粒体超氧化物水平均显着低于Vector组和WT组（all P<0.001）,但高于NC组（P<0.001）。4.成功构建mt.G4491A突变质粒转染M7融合细胞。MUT组的胞浆ROS水平显着低于WT组和Vector组（all P<0.001）,高于NC组（P<0.001）。MUT组的线粒体超氧化物水平高于NC组和Vector组（all P<0.01）,但与WT组无显着差异（P>0.05）。5.转录组分析显示,与non-M9（M7,D5）融合细胞相比,M9融合细胞中有 892 个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中 450 个基因上调,442个基因下调。上述DEGs的基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释主要聚焦于细胞成分。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析显示,上调的DEGs富集于5条通路,下调的DEGs富集于3条通路。其中,4条通路（PI3K-Akt signaling pathway,ECM-receptor interaction,HIF-1 signaling pathway 和 NF-kappa B signaling pathway）与DR相关。对极端差异的DEGs（满足错误发现率<0.05且差异倍数≥2）进行聚类分析,显示有6个基因上调,9个基因下调。其中,NRCAM和ADAMTSL3在视网膜表达。[结 论]与non-M9（M7,D5）融合细胞相比,M9融合细胞的胞浆ROS和线粒体超氧化物水平较低,且与DR致病相关的关键信号通路以及核基因的表达亦显着下调,提示单倍型类群M9在DR的形成中发挥重要作用。此外,单倍型类群M9特有的突变mt.T3394C可有效降低M7融合细胞的胞浆ROS和线粒体超氧化物水平,提示该突变部分介导了单倍型类群M9对DR的保护。
刘书中[2]（2021）在《伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络构建及乳腺癌骨转移灶的转录组学研究》文中研究表明第一部分 生物信息学分析方法探究乳腺癌骨转移的生物学过程研究背景:相对于其他类型恶性肿瘤而言,乳腺癌患者生存期较长,骨转移事件的发生在罹患乳腺癌的患者中也尤为常见,并可诱发多种骨骼相关事件致使患者生活质量的严重下降。探究乳腺癌骨转移进程的发病机制和分子调控网络具有重要的科学价值。目的:应用全基因表达谱结合EMT和BMP相关基因探究乳腺癌转移过程中差异基因表达特点。建立伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络、肿瘤浸润免疫细胞模式及临床预后模型来描述乳腺癌骨转移的分子调控、免疫浸润和临床预测特点。方法:从GEO数据库中下载3套大样本转移性乳腺癌的基因表达谱数据,与dbEMT数据库联合分析筛选EMT相关差异表达基因;从GEO数据库中下载2套骨转移性乳腺癌数据集,分析BMP相关基因的差异表达情况。从TCGA数据库中获得1091例原发性乳腺癌样本mRNAs、lncRNAs和miRNAs的表达谱,其中58例有骨转移,1033例无骨转移。依据骨转移乳腺癌与非骨转移乳腺癌样本之间差异表达RNA情况构建伴发骨转移乳腺癌的ceRNA网络。CIBERSORT用于分析乳腺癌样本中的22种免疫细胞组成及临床意义。我们对ceRNA网络中的基因进行批量生存分析,探究与临床预后相关基因,构建相关基因预后模型并评估其预后价值。最后,完成前期研究中发现的部分差异表达分子的生物学验证。结果:整合分析3套GEO数据集（GSE20685、GSE12276、GSE16446）表达谱及dbEMT数据库,筛选得到304个可能参与乳腺癌转移进程的EMT相关基因。这些基因主要与PI3K-Akt、TGF-beta等信号通路相关。对2套伴发骨转移乳腺癌相关GEO数据集（GSE2034、GSE124647）进行BMP相关基因表达情况分析,这些基因主要与PI3K-Akt、TGF-beta等信号通路相关。两个数据集中BMPR2、BMP2、GREM1同时存在差异表达。从TCGA数据库中分析发现发生骨转移的乳腺癌和未发生骨转移的乳腺癌样本中的2个lncRNAs、18个miRNAs和20个mRNAs有显着性差异。ceRNA网络中有 4 个 PCG（GJB3、CAMKV、PTPRZ1、FBN3）在 Kaplan-Meier 分析中有显着临床意义。在22种免疫细胞类型中,有骨转移组和无骨转移组间plasma cell和follicular helper T cell在两种不同样本中存在显着差异。伴发骨转移的乳腺癌样本中mast cell、gamma delta T cell、plasma cell细胞比例与TNM分期具有一定的相关性。Follicular helper T cell 比例高的样本生存状态更好（P=0.025）;eosinophilic 比例低的样本生存状态更好（P=0.01）。基于ceRNA网络中6种基因及肿瘤浸润免疫细胞的ROC曲线分别证实其准确性良好。基于ceRNAs与多种免疫浸润细胞之间呈现的共表达模式,我们发现DLX6-AS1、WNT6、GABBR2和多种免疫细胞含量可能与乳腺癌骨转移相关。选取经病理学明确诊断的3例乳腺癌骨转移灶样本及3例用作对照的乳腺癌非骨转移骨组织样本、外周血样本行qRT-PCR检测,结果提示hsa-miR-132-3p、WNT6表达量在两组骨组织样本间存在显着性差异。结论:本部分研究探讨了转移性乳腺癌样本中EMT相关基因表达情况及伴发骨转移的乳腺癌样本中BMP相关基因表达特点。构建伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络并分析其免疫浸润模式,以探究乳腺癌骨转移生物学进程的起始阶段。本项研究为乳腺癌骨转移分子机制的阐明与临床预后模型的建立提供了一定的生物信息学基础。第二部分全转录组测序分析探究乳腺癌骨转移骨骼病灶的分子生物学特点及分子调控网络研究背景:乳腺癌骨转移严重威胁患者的身心健康并可缩短患者生存期。目前,国际上的相关研究主要集中在如何监测和治疗乳腺原位肿瘤,而乳腺癌骨转移病灶的诊断、监测和治疗常常被忽视。目的:本部分研究旨在探究乳腺癌骨转移进程中骨骼定植部位的分子生物学特点,以转录组生物学特征为切入点构建乳腺癌骨转移骨骼定植部位的分子调控网络。方法:本研究利用骨科手术中所取并经病理学证实的乳腺癌骨转移部位瘤体、瘤旁组织学样本进行全转录组测序分析,掌握乳腺癌骨转移部位lncRNAs、mRNAs、circRNAs、miRNAs等表达特点及差异表达情况,并应用生物信息学分析方法进行生物学功能预测及关联分析绘制乳腺癌骨转移的WTS网络及ceRNA网络。结果:乳腺癌骨转移病灶瘤体组织与瘤旁组织相比,共鉴定得到174个差异表达的lncRNAs（上调81个,下调93个）,富集分析提示其主要与TNF signaling pathway、Estrogen signaling pathway等通路相关;共鉴定得到13个差异表达的mRNAs（上调3 个,下调 10 个）,富集分析提示其主要与 Protein digestion and absorption、PI3K-Akt signaling pathway、Focal adhesion等通路有关;共鉴定得到149个差异表达的circRNAs（上调89个,下调60个）,富集分析提示其主要与B cell receptor signaling pathway、ErbB signaling pathway、T cell receptor signaling pathway 有关;共鉴定得到83个差异表达的miRNAs（上调57个,下调26个）,富集分析提示其主要与Pathways in cancer、MAPK signaling pathway等通路有关。根据测序分析结果进一步进行了乳腺癌骨转移的WTS网络及ceRNA网络构建与分析。结论:全转录组测序分析发现乳腺癌骨转移瘤体、瘤旁组织差异表达的lncRNAs、mRNAs、circRNAs、miRNAs信息,针对差异表达RNA特点进行GO、KEGG分析 预 测 并 构 建 WTS、ceRNA 调 控 网 络,发 现 了circRNA069718/miR-483-3p/COL 11A2轴等可能参与乳腺癌骨转移灶形成的调控轴。为乳腺癌骨转移的病因学、发病机制及临床诊疗提供一定的理论基础。
岳涛涛,张楠,鹿香云,张洪波,王晓岑,宫鹏涛,李建华,李新,张西臣[3]（2021）在《旋毛虫与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP的原核表达与鉴定》文中研究指明目的对旋毛虫（Trichinella spiralis）与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP进行原核表达,对表达产物进行鉴定及反应原性分析。方法利用抗MG-63细胞全蛋白抗血清筛选旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库得到旋毛虫TCTP基因。PCR扩增TCTP基因,连接至pET-32a（+）载体,构建重组质粒pET-32a（+）-TCTP,转化入感受态细胞BL21（DE3）后用IPTG诱导表达,利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及反应原性。结果经酶切鉴定和测序鉴定,重组质粒pET-32a （+）-TCTP构建正确。SDS-PAGE检测重组蛋白TCTP在原核表达系统中主要以可溶性形式表达,融合蛋白的相对分子质量约为43×103。Wetern blot检测重组蛋白TCTP可被抗MG-63细胞多抗血清识别。结论成功构建了重组质粒pET-32a（+）-TCTP,表达的重组蛋白TCTP具有反应原性,为该蛋白生物学功能的研究奠定了基础。
王永杰[4]（2020）在《骨肉瘤干细胞的富集及其转录组m6A修饰谱的构建》文中提出目的:富集骨肉瘤干细胞,构建其转录组m6A修饰谱,并进一步分析骨肉瘤干细胞和其亲本株之间存在的差异甲基化的基因和差异表达的基因。材料与方法:通过阿霉素逐步诱导法富集出具有耐药性的骨肉瘤干细胞。利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测m6A修饰相关酶的表达。利用Me RIP-seq和RNA-seq检测差异甲基化的基因和差异表达的基因。通过数据挖掘和生物信息学分析探究候选基因及其临床意义。结果:在骨肉瘤干细胞中,3个m6A修饰相关酶的表达显着变化。差异甲基化的基因被发现富集于干细胞多能性调节的相关通路。候选基因的表达趋势也与GSE33458数据集中的结果相一致,并与骨肉瘤患者的预后具有相关性。结论:m6A修饰可能通过激活调节干细胞多能性调节的相关通路以及抑制成骨分化从而促进骨肉瘤干细胞的产生,进而增强骨肉瘤细胞的获得性耐药性。FZD8、KLF4、BMP2和SMAD5可能是m6A修饰酶或去甲基化酶的靶基因。
叶晖[5]（2020）在《LncRNA NNT-AS1过表达与骨肉瘤进展及不良预后的相关性研究》文中指出一、目的检测LncRNANNT-AS1骨肉瘤组织与骨肉瘤细胞系中的表达水平,分析其表达与临床病理特征的相关性。进一步通过体外细胞系功能及体内OS-732裸鼠荷瘤模型进行实验探讨LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤发生发展过程中的作用及相关机制。二、材料与方法首先检测了 LncRNA NNT-AS1在47例骨肉瘤组织中的表达,随后检测了其在永生化的成骨细胞以及骨肉瘤细胞系中的表达水平。体外研究,首先采用CCK-8实验以及克隆形成实验检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达之后细胞增殖能力;随后使用流式细胞术分析了干扰LncRNA NNT-AS1后,骨肉瘤细胞的凋亡,细胞周期分布水平;同时使用了 Transwell实验分析了干扰LncRNA NNT-AS1后细胞的侵袭能力以及增殖、转移相关关键蛋白的表达变化。体内研究,将内源性LncRNA NNT-AS1下调的OS-732细胞皮下注射到裸鼠腋下,按时间点测量裸鼠体重与移植瘤大小。5周后处死裸鼠,切取移植瘤瘤体组织检测移植瘤组织中肿瘤增殖的情况（通过C-Myc染色）。三、结果1.LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织、细胞中显着上调使用实时定量PCR技术检测并分析LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织以及瘤旁骨组织中的表达,LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织中上调,并与Enneking分期相关。随后发现LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤细胞系中亦上调,提示LncRNA NNT-AS1可能作为一个原癌基因参与了骨肉瘤的发生、发展。2.体外实验探讨LncRNA NNT-AS1的生物学功能使用CCK-8实验以及克隆形成实验检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达之后细胞增殖能力,使用流式细胞术检测干扰LncRNA NNT-AS1的内源性表达后细胞的凋亡,细胞周期分布水平。结果显示,干扰LncRNA NNT-AS1可显着降低细胞的增殖能力,促进凋亡以及阻滞细胞周期。3.体外实验探讨LncRNA NNT-AS1对骨肉瘤细胞的侵袭能力Transwell小室实验检测下调LncRNA NNT-AS1的内源性表达后对骨肉瘤细胞侵袭能力变化的影响。此外,采用Western blot实验用检测增殖、凋亡相关基因的变化。结果提示干扰LncRNA NNT-AS1后,骨肉瘤细胞的侵袭能力下降,伴随着增殖、凋亡蛋白水平的改变。4.干扰LncRNA NNT-AS1可减小鼠成瘤能力为了进一步探讨LncRNA NNT-AS1在体内的作用,我们使用OS-732骨肉瘤细胞系建立裸鼠模型并分为2组:1、对照转染组;2、LncRNA NNT-AS1干扰组。肿瘤增长曲线显示干扰LncRNA NNT-AS1可明显减小肿瘤生长体积。通过对移植瘤组织的免疫组化染色分析我们发现LncRNA NNT-AS1下调组内肿瘤组织的增殖能力明显低于对照转染组（C-Myc染色）。这些结果提示LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色。四、结论1、LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织中显着上调,扮演着原癌基因的角色;2、干扰LncRNA NNT-AS1能影响骨肉瘤细胞凋亡以及细胞周期的改变,从而有效抑制骨肉瘤细胞增殖;3、体内实验表明干扰LncRNA NNT-AS1抑制成瘤能力。
戴楠[6]（2013）在《双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景放疗是骨肉瘤治疗的重要手段之一。放疗抵抗是影响患者疗效和预后的关键因素。前期研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（APE1）具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，在骨肉瘤放疗抵抗中发挥核心调节作用，敲低APE1能显着增强骨肉瘤放疗敏感性。然而其介导骨肉瘤放疗敏感性的机制不清。MicroRNAs（miRNAs）能在转录后水平负性调节靶基因的表达，对肿瘤发生、细胞凋亡和应激反应具有重要的调控作用，为研究和发现APE1基因调控通路和相互作用蛋白，阐明APE1介导的骨肉瘤放疗敏感性的机制提供了新的研究方向。此外，miRNAs作为内源性的小分子，在调控肿瘤细胞放疗敏感性中具有明显的优势，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供了新的策略。晚近的研究陆续报道了p53等肿瘤关键基因相互作用的miRNAs，但与APE1相互作用的miRNAs国内外鲜见报道。研究目的本研究旨在鉴定和研究APE1相互作用miRNAs及其在骨肉瘤放疗抵抗中的作用。研究方法1.通过生物信息学、miRNAs芯片和qRT-PCR筛选鉴定APE1-knockdown骨肉瘤细胞的miRNAs差异表达谱，分析其靶基因涉及的细胞生物学功能和信号通路。2.通过生物信息学、 EMSA、 RNAi和qRT-PCR实验初步验证APE1-转录因子-miRNAs的作用关系。3.利用生物信息学、双荧光素酶报告基因实验、AP位点切除实验及EMSA鉴定miRNAs对APE1的靶向调控作用，在细胞和动物水平验证miRNAs靶向抑制APE1对骨肉瘤细胞放疗后增殖和凋亡的影响。研究结果1. APE1-knockdown骨肉瘤细胞中有13个miRNAs显着变化，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、miR-129-5p和miR-31上调，miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484下调，其靶基因分别涉及TGF-β、Wnt、MAPK和p53等细胞信号通路，与细胞生存、增殖、粘附和肿瘤发生有关。2.生物信息学分析提示，转录因子与miRNAs启动子区有结合位点； APE1-knockdown后可下调NF-κB的DNA结合活性，而抑制NF-κB可下调let-7b和let-7i的表达。3. miR-513a-5p和miR-765能与APE1mRNA3’UTR区结合抑制APE1蛋白表达；miR-513a-5p可抑制APE1的AP位点剪切活性和NF-κB、p53、AP-1的DNA结合活性；在细胞和动物水平给予X射线照射后，过表达miR-513a-5p可增加凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖和Bcl-2的表达。结论1. APE1能直接影响骨肉瘤细胞miRNAs的表达；生物信息学分析表明APE1通过调控miRNAs可能影响下游靶基因的表达，参与肿瘤发生、细胞生存、增殖、粘附等生物学过程和多个信号通路，与骨肉瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。2.生物信息学分析表明APE1-转录因子-miRNAs具有相互作用；初步证实APE1通过调控NF-κB的DNA结合活性可能调控let-7b和let-7i的表达。3.首次证实APE1是miR-513a-5p和miR-765的靶基因，二者可靶向结合APE1mRNA3’UTR区抑制APE1蛋白表达。4. miR-513a-5p通过抑制APE1的DNA损伤修复和氧化还原双功能，抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，在细胞及动物水平均能增加骨肉瘤的放疗敏感性。
李星星[7]（2010）在《hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B的作用及机制探讨》文中提出研究背景和目的肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、经历多个阶段的复杂生物学过程,有许多信号分子参与其中。这些信号分子对肿瘤的作用、作用机制以及信号分子之间的相互关系均较复杂,尚待阐明。S100蛋白家族是一类具有EF-手形结构的钙结合蛋白信号分子,至少有25个成员。与钙离子及其靶蛋白结合后发挥多种生理功能:参与细胞增殖和分化、调节钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性及转录因子的调节。现已发现其中多个成员在肿瘤中表达异常,并参与肿瘤发生发展。S100A6就是其中的一员,在多数上皮肿瘤、多数骨肉瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞中高表达,但是其对肿瘤的作用尚无定论。基于此,本课题拟进一步研究S100A6对人骨肉瘤的体内和体外作用。Wnt/β-catenin信号途径是公认的与肿瘤发生发展密切相关的信号途径,β-catenin是其关键的信号分子。胞浆中β-catenin增多后,可转移到胞核,进而与其相应的转录因子结合,导致该信号途径下游靶基因的转录激活;这些靶基因（如c-myc、细胞周期素D1等）具有促进细胞增殖和迁移等作用。β-catenin的高表达和该信号途径的失调常见于大多数肿瘤,包括骨肉瘤。我们前期的研究发现:1)S100A6可以抑制人骨肉瘤细胞MG63和U2OS的增殖和迁移;2)S100A6可以增加骨肉瘤细胞MG63和U2OS中Wnt信号活性;3)Pull-down分析发现S100A6与Wnt信号途径的多个成员,β-catenin、糖原合成酶激-3β（glycogen synthase kinase,GSK-3β）和散乱蛋白DVL（dishevelled,DVL）之间有体外相互作用;同时,S100A6的高表达与β-catenin的增多和Wnt/β-catenin信号途径的失调常常同时存在于骨肉瘤。基于上述,我们推测:S100A6可能参与调节Wnt/β-catenin信号途径的活性,并因此实现对骨肉瘤细胞的生物学作用。为验证此假设,本课题拟通过蛋白质印迹法进一步探讨S100A6对另一株人骨肉瘤细胞143B中β-catenin水平的影响和通过免疫共沉淀的方法进一步确认S100A6与Wnt/β-catenin信号途径中主要成员之间直接相互作用的存在。同时,我们也拟通过酵母双杂交技术探寻与S100A6存在相互作用的分子,为全面地了解S100A6对骨肉瘤的作用及机制提供新的线索。综上,本课题拟通过重组腺病毒感染的方式分别转入hS100A6基因及其siRNA基因,探讨hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B细胞的体外作用（增殖、迁移和凋亡）和体外作用以及对该细胞中β-catenin的影响;通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）方法,探讨hS100A6与Wnt信号途径的主要成员（β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin）之间是否存在直接相互作用;同时,通过酵母双杂交方法寻找人骨肉瘤细胞株143B细胞中与S100A6相互作用的分子,为阐明S100A6对骨肉瘤细胞的作用及可能机制积累更翔实的实验依据,为发现骨肉瘤诊断和预后判断的分子标志物以及治疗的新靶点奠定基础。方法1.利用HEK293细胞扩增分别携带hS100A6基因、hS100A6的siRNA基因和β-catenin基因的重组腺病毒AdS100A6、AdsiS100A6和Adβ-catenin;也同样方法扩增它们的对照腺病毒（AdGFP和AdRFP）。2.通过重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分别上调和下调人骨肉瘤细胞143B中S100A6的表达后,用MTT法和台盼兰染色活细胞计数法检测细胞的增殖活性,Hoechst染色检测细胞凋亡, Transwell小室检测细胞的迁移能力。同时,在动物荷瘤模型上观察hS100A6对骨肉瘤的体内作用。3.通过重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6分别上调和下调人骨肉瘤细胞S100A6的表达后, Western Blot检测β-catenin蛋白的表达。4.用Co-IP方法检测S100A6与Wnt/β-catenin信号途径的主要成员β-catenin、GSK-3β、DVL和Axin之间的直接相互作用。5.利用Clontech试剂盒构建用于酵母双杂交的143B细胞的cDNA文库后,用酵母双杂交方法寻找143B细胞中与S100A6相互作用的分子。结果1.重组腺病毒感染的HEK293细胞中有相应的绿色或红色荧光蛋白表达,在72 h时感染率约为90%;扩增所获病毒液的滴度为108-109 pfu/ml。2.免疫细胞化学法证实:感染AdS100A6后的143B细胞中,S100A6的表达是实验对照组（AdGFP组）的1.19倍,而感染AdsiS100A6后的143B细胞中S100A6的表达仅为AdGFP组的61.2%,差异具有统计学意义（P<0.01）。提示:重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6均能将其携带的基因导入目的细胞,并正常表达,即两种重组腺病毒的干预有效。3.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。（1）MTT结果示:Ad100A6干预72 h后开始出现细胞增殖活性的减弱,并呈时间依赖性,OD值分别为AdGFP组的94.35%,88.66%和86.61%（P<0.05）;AdsiS100A6干预48 h后开始出现时间依赖性地细胞增殖活性的增强,OD值分别为AdGFP组的109%,106%,126%和120%（P<0.05）;实验对照组AdGFP与空白组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。应用台盼兰染色活细胞计数法所获得的实验结果与MTT法的结果一致。（2）Hoechst法检测结果显示:AdS100A6组的细胞在48和72 h的细胞凋亡率分别较AdGFP组增加25.3%,37.2%和45.8%（P<0.05）96 h时细胞崩解坏死明显;而AdsiS100A6组的细胞凋亡率自48 h起明显降低,分别较AdGFP组降低11.7%,25.9%,36.4%和39.3%（P<0.05）。AdGFP组与空白组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Transwell分析显示AdS100A6组72 h时穿过膜的细胞数较AdGFP组减少41.2%（P<0.01）,AdsiS100A6组则较AdGFP组增加了60.3%（P<0.01）,AdGFP组与空白组之间的差异无显着性（P>0.05）。（4）用不同处理因素处理的等量人骨肉瘤细胞143B接种入裸鼠皮下,30天时处死,空白组、AdGFP组、AdS100A6组、AdsiS100A6组的瘤体体积分别为:2796±154 mm3、2876±263mm3、1716±120mm3、4520±400 mm3,空白组和AdGFP组间差异无显着性（P>0.05）,AdS100A6组、AdsiS100A6组与对照组比较差异均具显着性（P<0.01）,两实验组组间差异也具有统计学意义（P<0.01）。同时在AdsiS100A6组发现有1只裸鼠肝转移,其它组均未发现。提示:外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。5.外源性hS100A6增加人骨肉瘤细胞143B中β-catenin表达。AdS100A6作用于143B细胞48 h后,能显着增加细胞中β-catenin水平,是AdGFP组的1.64倍（P<0.01）;与此同时,AdsiS100A6能降低细胞中β-catenin水平,仅为AdGFP组的79.8%（P<0.05）。AdGFP组与空白组之间的差异无统计学意义。提示:外源性hS100A6可增加人骨肉瘤细胞株143B的β-catenin水平。6. hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员β-catenin、GSK-3β和DVL之间存在直接相互作用;未检测到与Axin之间的直接相互作用。（1）hS100A6与β-catenin之间存在直接相互作用用pHAHA-S100A6转染HEK293细胞,再用Adβ-catenin感染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀含S100A6蛋白的复合物,后者再用抗β-catenin的抗体行Western Blot检测,出现分子量约42 kD的阳性条带,提示β-catenin存在于含S100A6蛋白的复合物中。同样,在用抗β-catenin的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在。提示:hS100A6与β-catenin之间存在直接相互作用。（2）hS100A6与GSK-3β之间有直接相互作用将pGST-S100A6和pcDNA-GSK-3β-HA共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗S100A6的抗体沉淀含S100A6蛋白的复合物,用抗HA-tag的抗体进行Western Blot分析,发现GSK-3β的存在。同样,在用抗HA-tag的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在。提示:hS100A6与GSK-3β之间存在直接相互作用。（3）hS100A6与DVL之间有直接相互作用将pHAHA-S100A6和pCMV-DVL-myc共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀S100A6蛋白,用抗-Myc的抗体进行Western Blot,发现DVL蛋白的存在。同样,在用抗-Myc的抗体沉淀的复合物中,也发现了S100A6的存在,提示:hS100A6与DVL之间存在直接相互作用。（4）没有检测到hS100A6与Axin之间的相互作用将pHAHA-S100A6和pCMV-Axin-Myc共转染HEK293细胞,48 h后裂解细胞,用抗HA-tag的抗体沉淀S100A6蛋白,用抗-Myc的抗体进行Western Blot,没有发现阳性条带,提示没有Axin蛋白的存在。同样,在用抗-Myc的抗体沉淀的复合物中,也没有发现S100A6的存在。提示:hS100A6与Axin之间可能没有直接相互作用。7.成功构建人骨肉瘤细胞株143B的酵母双杂交cDNA文库（1）成功提取143B细胞总RNA,分离纯化mRNA结果显示:RNA28S带和18S带清晰,可以用于下一步实验;紫外分光光度计显示:mRNA浓度高,其OD260 /OD280比值在1.8-2.0区间,证明纯度合适,适宜进行下一步实验。（2）文库双链合成电泳图显示cDNA双链呈弥散状,均在200-10000bp之间,且双链稍大于第一链,与预期相符。（3）文库滴度测定及多态性分析计算文库滴度为7.6×107 CFU/ml;菌落PCR结果显示,10个菌落有9个扩增出插入片段,即文库重组率为90%;插入片段大小较为集中,均在500-1000 bp之间。8.成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-S100A6用设计的引物从pGST-S100A6中扩增出S100A6基因片段,亚克隆至pGBKT7载体,经测序验证pGBKT7- S100A6重组质粒构建成功。经检测:pGBKT7-S100A6质粒的表达产物对AH109酵母细胞的生长没有毒性作用,也无渗漏和自激活。9.运用酵母双杂交方法检测143B细胞中与hS100A6存在相互作用的分子将文库转入Y187酵母细胞,同诱饵质粒共转入酵母AH109细胞,在选择性营养缺陷培养基上划板生长,经过4轮高严谨度筛选后,最终仅获得2个有插入片段的阳性克隆。经测序和经BLAST核苷酸相似性分析,这2个阳性克隆分别与S100A6蛋白编码基因和pGBKCg载体序列同源性高。这2个阳性克隆尚待进一步验证。结论1.外源性hS100A6能抑制人骨肉瘤细胞株143B细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡,同时能抑制人骨肉瘤细胞株143B的裸鼠皮下移植瘤的生长,甚至转移。2. hS100A6能够增加人骨肉瘤细胞株143B的β-catenin表达;hS100A6可能是导致骨肉瘤中β-catenin增加及Wnt/β-catenin信号途径活性增强的机制之一。3. hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员β-catenin、GSK-3β和DVL之间存在直接相互作用,这可能是上调β-catenin及Wnt/β-catenin信号途径活性的部分机制;未检测到hS100A6与Axin之间的直接相互作用。4.成功构建人骨肉瘤细胞株143B的酵母双杂交cDNA文库。5.成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-S100A6。6.运用酵母双杂交方法检测到2个阳性克隆,其编码基因分别与S100A6基因和pGBKCg载体序列的同源性高。尚待进一步验证。7.基于上述,我们推测: hS100A6对骨肉瘤的抑制性作用可能是经由其它信号途径介导的;hS100A6同时激活这些抑制性信号途径以及Wnt/β-catenin信号途径,通过这些途径之间的相互拮抗,实现对骨肉瘤细胞的增殖、迁移和凋亡能力的精细地调控。本研究为阐明hS100A6对骨肉瘤细胞的作用以及hS100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员之间的相互关系等提供了实验依据。
廖博[8]（2009）在《骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析》文中研究表明背景:骨肉瘤是一种恶性度很高的肿瘤。免疫治疗对于预防肿瘤形成以及清除荷瘤宿主体内的残留病灶,具有较好的应用前景,而建立肿瘤免疫治疗及制备骨肉瘤疫苗的一个重要前提就是要有可作为靶向的肿瘤抗原。目前已发现的能够引起特异性免疫反应的骨肉瘤抗原在动物实验及体外诱导骨肉瘤特异性CTL的产生中显示出了良好的作用。但总的来说,疫苗效果仍不理想,其原因之一在于目前发现的肿瘤抗原的免疫原性较弱,这是限制疫苗疗法进一步发展的主要问题。这就迫切需要我们识别更多的、免疫原性更强的肿瘤抗原,致力于多价疫苗的开发,推动骨肉瘤特异性主动免疫治疗的进一步研究。目的:①构建人骨肉瘤细胞cDNA表达文库;②采用骨肉瘤患者的混合血清对9901细胞cDNA表达文库进行免疫筛选,以得到可引起免疫应答的骨肉瘤肿瘤相关抗原;③通过生物信息学分析,比较筛选得到的阳性克隆,获取具有应用价值的独立知识产权的新基因,为本课题的进一步研究确定方向。方法:①提取9901细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5’端;Sephacryl-S400柱除去小于400bp cDNA片段,与噬菌体λgt11（载体）连接,用包装蛋白体外包装后建成初级cDNA文库;取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库大小及重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;提取质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小及多样性。②感染有重组λgt11噬菌体的大肠杆菌XL1-Blue MRF’铺于150mm NZY平板,37℃倒置培养6h后,将IPTG预先处理的硝酸纤维素膜覆盖于平板上,继续培养10h,做好标记;取下硝酸纤维素膜,用封闭液室温封闭1h后,置于1:100稀释的骨肉瘤患者血清（预先用大肠杆菌裂解物吸收）中孵育15h,再置于1:2500稀释的生物素化二抗中孵育1h,然后与1:2500稀释的碱性磷酸酶标记的亲合素孵育1h;采用NBT/BCIP对阳性噬斑显色;挑取阳性噬菌斑,再经3轮复筛,直至得到一致的阳性噬斑。③获得的阳性噬菌体克隆,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,在大肠杆菌XL1-Blue MRF’中剪切后,转变为PBK-CMV噬菌粒,感染大肠杆菌XLOLR后,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小,然后测序。④采用BLAST软件进行序列同源性分析;采用Grail、ProtParam、ScanProsite、SOPMA、TMpred、SignalP、Psort、HLABind等软件分析阳性克隆的编码区、功能位点、二级结构、特殊结构、细胞定位及抗原决定簇情况等,为进一步的功能研究奠定基础。结果:经计算,所建文库共含噬菌体1.5×106个;蓝白筛选平板上的242个噬斑均为白色噬斑,因此重组率在94.3%以上;通过酶切对插入片段大小进行鉴定,电泳结果显示:10个噬斑均切出插入片段,且大小不一,平均大小1.4kb左右。②第一轮筛选共得到阳性噬斑131个,再经过3轮复筛,最终得到32个阳性重组噬菌体,经剪切、感染及酶切鉴定后,全部送去测序;③测序结果经BLAST,共得到12条基因序列,其中已知基因5条,新基因7条,已全部登陆GenBank;④通过CrELISA测定新基因与患者血清反应的特异性,结果表明,OSAA-3和OSAA-5具有较高的OD值,免疫原性明显强于其他抗原。结论:①成功构建了人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库;经鉴定,其库容量高达1.5×106,重组率大于94.3%,具有较好的多样性;②对SEREX法加以改良:采用患者混合血清进行筛库,使阳性克隆的得率增加,降低筛库的风险;采用细胞系建库,使文库更具有代表性,同时正常细胞及B细胞的干扰,减少假阳性信号的产生。③阳性克隆测序后经同源序列比对分析,共获得已知基因5条,新基因7条;④通过生物信息学和酶联免疫检测分析,我们对OSAA-3和OSAA-5的理化性质和基本功能有了初步的了解,认识到它们作为骨肉瘤相关抗原免疫原性较强,可能在细胞的生长、增殖和分化中具有重要作用。
邓超[9]（2009）在《TRAIL联合阿霉素和IFNγ对人骨肉瘤细胞及TRAIL相关受体影响的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ分别对MG-63细胞增殖及凋亡的调节作用背景与目的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）能够诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，但并不是所有的肿瘤细胞都对其敏感。以往研究表明一些化疗药物能够增强TRAIL所诱导的肿瘤细胞凋亡。本部分实验旨在研究TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ分别作用于人骨肉瘤MG-63细胞时，对其增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法采用MTT法检测TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ在不同浓度及不同时间下，分别作用于人骨肉瘤MG-63细胞时，对其增殖的抑制作用。用流式细胞仪检测TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ分别作用于人骨肉瘤MG-63细胞时，诱导其凋亡的作用。DNA凝胶电泳检测TRAIL作用于人骨肉瘤MG-63后人骨肉瘤MG-63的凋亡率。结果（1）不同浓度TRAIL对MG-63细胞均具有杀伤作用。当TRAIL浓度较低（小于1000ng／ml）时，杀伤作用的增加不明显，相同时间不同浓度组比较，差异无显着性（P＞0．05）；而当其浓度增高时，相同时间不同浓度组比较，差异有显着性（P＜0．05）。（2）阿霉素可杀伤MG-63细胞，药物对细胞的杀伤率随着药物浓度的增高而增加，相同时间不同浓度组间比较差异具有显着性（P＜0．05）。（3）顺铂可杀伤人骨肉瘤MG-63细胞，药物对细胞的杀伤率随着药物浓度的增高而增加，相同时间不同浓度组间比较差异具有显着性（P＜0．05）。（4）IFN-γ可杀伤骨肉瘤细胞，这种杀伤作用在24小时内较弱，24小时后显着增大（P＜0．05）。结论（1）TRAIL浓度在高于1000 ng／ml时，对人骨肉瘤MG-63细胞的杀伤效果增加明显。（2）阿霉素浓度在高于4．3μl／ml时，对人骨肉瘤MG-63细胞的杀伤效果增加明显。（3）顺铂浓度在高于1μmol／L时，对人骨肉瘤MG-63细胞的杀伤效果增加明显。（4）IFN-γ杀伤作用在24小时内对人骨肉瘤MG-63较弱，24小时后显着增大。第二部分TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ联合作用对MG-63细胞增殖及凋亡的调节作用背景与目的化疗是治疗骨肉瘤的一种常用手段，但化疗药物对机体的毒副作用大，因而限制了其临床上的应用。因此，如何调整化疗药物剂量、减少其副作用是当前非手术治疗骨肉瘤的重点。本实验旨在研究TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ联合对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法采用MTT法检测当由TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ组成的不同组合，分别作用于人骨肉瘤MG-63时，对其增殖的抑制作用。用流式细胞仪检测由TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-γ组成的不同组合，分别作用于人骨肉瘤MG-63时，诱导其凋亡的作用。结果（1）TRAIL联合阿霉素及INF-γ组对人骨肉瘤MG-63细胞生长的影响相比其他联合应用组明显增加，差异有显着性（P＜0．05）。（2）TRAIL联合顺铂及INF-γ组对人骨肉瘤MG-63细胞生长的影响相比其他联合应用组增加明显，差异有显着性（P＜0．05）。结论（1）TRAIL联合阿霉素及INF-γ组对人骨肉瘤细胞MG-63的杀伤效果增加明显。（2）TRAIL联合顺铂及INF-γ组对人骨肉瘤细胞MG-63的杀伤效果增加明显。第三部分TRAIL、阿霉素、IFN-γ联合作用于人骨肉瘤MG-63，TRAIL相关受体表达研究背景与目的目前认为细胞表面死亡受体的表达状况，可以从一定程度上反映靶细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感度。如何通过上调死亡受体的表达水平而增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，使TRAIL选择性杀伤癌细胞成为近年来的研究热点本实验旨在研究TRAIL、阿霉素、IFN-γ联合作用于骨肉瘤MG-63细胞引起凋亡作用的机制。方法采用免疫组化法检测收集的病人骨肉瘤石蜡切片中DR5及YY1基因表达情况。用RT-PCR法检测TRAIL、阿霉素、IFN-γ组成的不同组合，分别作用于人骨肉瘤MG-63后人骨肉瘤MG-63中DR5及YY1的表达情况。用western blot法检测TRAIL、阿霉素、IFN-γ组成的不同组合，分别作用骨肉瘤MG-63后人骨肉瘤MG-63中DR5及YY1的表达情况。结果（1）收集的病人骨肉瘤细胞中DR5与YY1基因表达情况未发现有显着相关性（P＞0．05）。（2）TRAIL联合阿霉素及INF-γ对人骨肉瘤MG-63细胞中DR5及YY1的表达有较明显影响，差异有显着性（P＜0．05）。结论（1）收集的病人骨肉瘤石蜡切片中DR5与YY1基因表达情况未发现有显着相关性。（2）TRAIL联合阿霉素及INF-γ组对人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡作用强于其他组合（TRAIL组、阿霉素组和TRAIL+可霉素组），可能是因为他们联合作用时，通过增强TRAIL相关受体DR5基因的表达及降低YY1基因表达引起的。
黄涛[10]（2006）在《正反义人骨唾液酸蛋白基因在骨肉瘤细胞中的表达及对瘤细胞粘附侵袭行为的影响》文中提出目的构建正、反义人骨唾液酸蛋白基因真核表达载体，为进一步研究人BSP的生物学作用奠定实验基础；检测人骨唾液酸蛋白正、反义真核表达载体在骨肉瘤细胞MG-63中的表达；初步探讨人骨唾液酸蛋白正、反义真核表达载体在骨肉瘤粘附侵袭行为中的作用。方法以RT-PCR方法从人骨膜的总RNA中扩增出hBSP的开放阅读框序列，与克隆载体pUCm-T进行连接，构成克隆质粒。利用引物两端所设计的不同酶切位点将正反义目的片段定向亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP，将重组后的质粒进行细菌转化，质粒扩增、纯化后，酶切、测序证实其中有目的片段完整插入。分别将正义、反义和空质粒以脂质体介导转染入MG-63细胞，通过RT-PCR检测各组细胞中hBSP mRNA表达，通过Western blot检测各组细胞中hBSP蛋白表达。MTT法测定转染细胞在细胞外基质上的粘附情况，重组基底膜侵袭实验测定BSP对骨肉瘤细胞侵袭力的影响，细胞划痕实验测定转染BSP质粒对瘤细胞迁移情况的影响。结果从人骨膜细胞中成功扩增出hBSP的开放阅读框序列，与pUCm-T连接构建成功BSP克隆质粒，通过亚克隆过程，与pIRES2-EGFP真核表达载体连接，成功构建了人BSP正反、义核酸真核表达载体，转染骨肉瘤细胞后能够有效表达hBSP，与对照组相比，正义转染组高表达hBSP，瘤细胞粘附率提高（P＜0.05），侵袭力增强（P＜0.05），迁移速度增快（P＜0.05）。反义转染组低表达hBSP，瘤细胞粘附率降低（P＜0.05），侵袭力受到抑制（P＜0.01），迁移速度减慢（P＜0.05）。而空质粒转染组细胞和未处理瘤细胞组细胞在BSP表达上无明显区别，在细胞外基质的粘附能力，侵袭能力，和迁移能力上无显着性差异。结论骨肉瘤细胞中有BSP的表达；过表达BSP能促进骨肉瘤细胞的粘附，侵袭和转移；反义转染人BSP能明显抑制骨肉瘤侵袭转移相关的多个环节；BSP表达的改变可能在骨肉瘤的粘附、迁移过程中起重要作用。
二、人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文提纲范文）
（1）线粒体DNA单倍型类群M9在糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 云南省糖尿病视网膜病变的相关危险因素分析及临床决策模型构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 云南省糖尿病视网膜病变的相关mtDNA单倍型类群及mtDNA单核苷酸变异位点分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 M9与non-M9融合细胞的线粒体功能比较及转录组分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 线粒体DNA变异在2型糖尿病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络构建及乳腺癌骨转移灶的转录组学研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 生物信息学分析方法探究乳腺癌骨转移的生物学过程 |
| 第一章: 乳腺癌转移中EMT相关基因表达特点及BMP相关基因表达特点 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 第二章: 伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络构建、免疫浸润模式分析及预后模型建立 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 第三章: 针对乳腺癌骨转移相关指标在骨转移灶差异表达的探索 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 第二部分 全转录组测序分析探究乳腺癌骨转移骨骼病灶的分子生物学特点及分子调控网络 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 结束语(全文总结) |
| 文献综述 miRNA在乳腺癌骨转移发生机制中的意义研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）旋毛虫与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP的原核表达与鉴定（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体、菌株、细胞与虫株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 TCTP基因的获取与生物信息学分析 |
| 2.2 TCTP基因的扩增 |
| 2.3 pET-32a (+)-TCTP的构建 |
| 2.4 pET-32a (+)-TCTP的诱导表达及鉴定 |
| 2.5 TCTP蛋白的反应原性分析 |
| 结 果 |
| 1 相关抗原TCTP的生物信息学分析 |
| 2 TCTP基因的扩增 |
| 3 pET-32a (+)-TCTP 重组载体的构建 |
| 4 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 5 重组蛋白TCTP反应原性分析 |
| 讨 论 |
（4）骨肉瘤干细胞的富集及其转录组m6A修饰谱的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤概述 |
| 1.2 骨肉瘤干细胞概述 |
| 1.3 M~6A修饰概述 |
| 1.4 MERIP-SEQ概述 |
| 1.5 本研究概述 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人骨肉瘤细胞系和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系的培养 |
| 2.2.2 细胞系的复苏 |
| 2.2.3 细胞系的换液 |
| 2.2.4 细胞系的传代 |
| 2.2.5 细胞的种板操作 |
| 2.2.6 细胞系的冻存 |
| 2.2.7 阿霉素保存液和工作液的配置 |
| 2.2.8 诱导MG63耐药株 |
| 2.2.9 细胞计数试剂盒-8 检测(CCK-8) |
| 2.2.10 球形成实验(sphere formation assay) |
| 2.2.11 流式细胞术 |
| 2.2.12 体内成瘤能力检测 |
| 2.2.13 细胞RNA的提取 |
| 2.2.14 cDNA合成和Real-time PCR检测 |
| 2.2.15 甲基化RNA免疫沉淀结合二代测序 |
| 2.2.15.1 提供的样品及分组信息 |
| 2.2.15.2 服务内容 |
| 2.2.16 蛋白印迹实验 |
| 2.2.17 数据挖掘和分析 |
| 2.2.18 数据展示和统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 通过化疗诱导法获得多药耐药株MG63/DXR |
| 3.2 MG63/DXR具有骨肉瘤干细胞的若干特征 |
| 3.3 RNA M~6A修饰相关酶在骨肉瘤干细胞中的表达情况 |
| 3.4 MERIP-SEQ结果 |
| 3.4.1 总RNA质控报告 |
| 3.4.2 RNA完整性质控 |
| 3.4.3 甲基化RNA免疫沉淀反应富集的RNA的质控 |
| 3.4.4 测序文库质控 |
| 3.4.5 测序数据的生物信息学分析 |
| 3.4.5.1 测序Q30质控结果 |
| 3.4.5.2 测序reads统计结果 |
| 3.4.5.3 甲基化m RNA的识别 |
| 3.4.5.4 差异甲基化m RNA识别 |
| 3.4.5.5 MG63与MG63/DXR的m~6A修饰图谱 |
| 3.4.5.6 差异甲基化基因GO分析 |
| 3.4.5.7 差异甲基化基因KEGG通路富集分析 |
| 3.5 DMGS和DEGS的联合分析 |
| 3.6 候选基因的表达与骨肉瘤患者的无转移生存期较差有关 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 第5章 要点与后续工作总结 |
| 5.1 本文要点总结 |
| 5.2 后续研究工作总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（5）LncRNA NNT-AS1过表达与骨肉瘤进展及不良预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞株中的表达及临床意义 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 患者和样本采集 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 细胞系和细胞培养 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 主要仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 组织RNA的提取 |
| 3.2 RNA纯化 |
| 3.3 细胞培养及传代 |
| 3.4 细胞冻存 |
| 3.5 细胞复苏 |
| 3.6 细胞收集 |
| 3.7 RNA逆转录及qRT-PCR检测组织中LncRNA NNT-AS1的表达 |
| 3.8 分析LncRNA NNT-AS1与骨肉瘤病人临床病理特征的相关性 |
| 4. 统计分析 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 骨肉瘤组织和细胞系LncRNA NNT-AS1表达增加 |
| 5.2 长链非编码LncRNA NNT-AS1在骨肉瘤细胞株及正常成骨细胞系中的表达 |
| 5.3 LncRNA NNT-AS1的表达与临床病理、总生存率的关系 |
| 6. 讨论 |
| 7. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 下调LncRNA NNT-AS1的表达对骨肉瘤细胞生物学特性影响的研究 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 细胞系及来源 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 实验器具的清洗和消毒 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 分子生物学实验 |
| 3.4 细胞增殖试验 |
| 3.5 平板克隆形成实验 |
| 3.6 流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期的变化 |
| 3.7 迁移和侵袭实验 |
| 3.8 免疫印迹 |
| 4. 统计分析 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 验证LncRNA NNT-AS1稳定干扰细胞系 |
| 5.2 干扰内源性LncRNA NNT-AS1的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖能力 |
| 5.3 干扰LncRNA NNT-AS1对骨肉瘤MG-63及OS-732细胞凋亡和细胞周期的影响 |
| 5.4 干扰LncRNA NNT-AS1对骨肉瘤MG-63及OS-732细胞迁移和侵袭的影响 |
| 5.5 干扰LncRNA NNT-AS1调节增殖与转移关键蛋白 |
| 6. 讨论 |
| 7. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 体内下调LncRNA NNT-AS1对骨肉瘤细胞生长的影响 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 细胞系及来源 |
| 2.2 小鼠的来源以及饲养 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 3. 分子生物学实验 |
| 3.1 qPT-PCR检测 |
| 3.2 qPT-PCR验证骨肉瘤细胞Lnc RNA LncRNA NNT-AS1的干扰效率 |
| 4. 数据统计 |
| 5. 实验结果 |
| 5.1 LncRNA NNT-AS1在体内的生物学功能 |
| 5.2 干扰LncRNA NNT-AS1调节增殖关键蛋白C-Myc |
| 6. 讨论 |
| 7. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 APE1-knockdown 骨肉瘤细胞 miRNAs 差异表达谱的分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 APE1 调控 miRNAs 机制的初步探讨 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 miRNAs 靶向调控 APE1 的鉴定及其增加骨肉瘤放疗敏感性的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B的作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：hS100A6 对人骨肉瘤细胞株1438 的作用及机制探讨 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 hS100A6 对人骨肉瘤细胞株 143B 的体内体外作用 |
| 第一节 人骨肉瘤细胞株 143B 中 S100A6 的内源性表达、 hS100A6 及其 siRNA 的重组腺病毒(AdS100A6 和 AdsiS100A6)的制备及感染有效性的验证 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 hS100A6 对人骨肉瘤细胞 143B 的增殖、凋亡和迁移能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 hS100A6 对人骨肉瘤细胞 143B 的体内作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hS100A6 对人骨肉瘤细胞株 143B 中 β-catenin水平的影响及S100A6与Wnt/β-catenin信号途径中的主要分子之间的直接相互作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 酵母双杂交法筛选人骨肉瘤株 143B 细胞中 与 S100A6 相互作用的分子 |
| 第一节 用于酵母双杂交的人骨肉瘤株 143B 细胞的 cDNA 文 库的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 第二节 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-S100A6 的构建、鉴定以及其在酵母中的毒性、渗漏和自激活实验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 第三节 酵母双杂交筛选 S100A6 相互作用分子 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（8）骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 骨肉瘤9901 细胞cDNA表达文库的构建和鉴定 |
| 1.1 实验材料与实验方法 |
| 1.1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.1.2 骨肉瘤9901 细胞的培养及收集 |
| 1.1.3 9901 细胞总RNA的提取 |
| 1.1.4 总RNA完整性的定量和检测 |
| 1.1.5 mRNA的纯化 |
| 1.1.6 定向克隆cDNA表达文库的构建及扩增 |
| 1.1.7 cDNA文库多样性的鉴定 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 总RNA定量及完整性的检测 |
| 1.2.2 cDNA第1、2 链的同位素示踪 |
| 1.2.3 重组子插入片段大小分析 |
| 1.3 分析和讨论 |
| 1.3.1 cDNA文库的应用 |
| 1.3.2 cDNA文库构建方法的选择 |
| 1.3.3 肿瘤抗原筛选的研究方法及实验前景 |
| 1.3.4 实验方法的改进 |
| 实验二 骨肉瘤肿瘤相关抗原的免疫学筛选及结果的初步分析 |
| 2.1 实验材料与实验方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 cDNA文库的免疫筛选 |
| 2.1.3 阳性噬菌体pBK-CMV的剪切及感染 |
| 2.1.4 阳性克隆的测序及分析 |
| 2.1.5 CrELISA方法检测骨肉瘤相关抗原特异性 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 骨肉瘤9901 细胞cDNA表达文库的免疫筛选结果 |
| 2.2.2 序列测定及计算机分析结果 |
| 2.2.3 新基因表达产物与正常及其它骨肿瘤血清的交叉反应 |
| 2.3 分析和讨论 |
| 2.3.1 肿瘤抗原的血清学识别 |
| 2.3.2 筛库方法的选择 |
| 2.3.3 实验方法的改进 |
| 2.3.4 筛选结果的初步分析 |
| 2.3.5 SEREX筛选结果用于主动免疫治疗的探讨 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）TRAIL联合阿霉素和IFNγ对人骨肉瘤细胞及TRAIL相关受体影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-GAMMA单独作用对MG-63细胞增殖及凋亡的调节作用 |
| 材料和方法 |
| 实验结果图片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TRAIL、阿霉素、顺铂、IFN-GAMMA联合作用对MG-63细胞增殖及凋亡的调节作用 |
| 材料和方法 |
| 实验结果图片 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TRAIL、阿霉素、IFN-GAMMA联合作用于人骨肉瘤MG-63,TRAIL相关受体表达研究 |
| 材料和方法 |
| 实验结果图片 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 1 正文 |
| 2 参考文献 |
| 综述二 |
| 1 正文 |
| 2 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 学习期间发表文章 |
| 参编专着 |
| 致谢 |
（10）正反义人骨唾液酸蛋白基因在骨肉瘤细胞中的表达及对瘤细胞粘附侵袭行为的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 正文 |
| 第一部分 人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体在骨肉瘤细胞中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 正反义人骨唾液酸蛋白基因对骨肉瘤细胞粘附侵袭行为影响的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 总结 |
| 文献综述 |
| 综述一 骨唾液酸蛋白与肿瘤 |
| 综述二 骨肉瘤基因治疗的研究进展 |
| 致谢 |
四、人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定（论文参考文献）
- [1]线粒体DNA单倍型类群M9在糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究[D]. 周园媛. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]伴发骨转移的乳腺癌ceRNA网络构建及乳腺癌骨转移灶的转录组学研究[D]. 刘书中. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]旋毛虫与人骨肉瘤细胞MG-63相关抗原基因TCTP的原核表达与鉴定[J]. 岳涛涛,张楠,鹿香云,张洪波,王晓岑,宫鹏涛,李建华,李新,张西臣. 中国病原生物学杂志, 2021(03)
- [4]骨肉瘤干细胞的富集及其转录组m6A修饰谱的构建[D]. 王永杰. 上海交通大学, 2020
- [5]LncRNA NNT-AS1过表达与骨肉瘤进展及不良预后的相关性研究[D]. 叶晖. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究[D]. 戴楠. 第三军医大学, 2013(11)
- [7]hS100A6对人骨肉瘤细胞株143B的作用及机制探讨[D]. 李星星. 重庆医科大学, 2010(02)
- [8]骨肉瘤相关抗原的免疫学筛选及其生物信息学分析[D]. 廖博. 第四军医大学, 2009(12)
- [9]TRAIL联合阿霉素和IFNγ对人骨肉瘤细胞及TRAIL相关受体影响的实验研究[D]. 邓超. 华中科技大学, 2009(11)
- [10]正反义人骨唾液酸蛋白基因在骨肉瘤细胞中的表达及对瘤细胞粘附侵袭行为的影响[D]. 黄涛. 华中科技大学, 2006(03)