一、中国人大肠癌K-ras基因突变的研究（论文文献综述）
赵恒飞[1]（2014）在《KRAS基因第12、13位密码子突变型大肠癌患者的临床病理特征、靶向治疗疗效及生存分析》文中研究说明目的：大肠癌的患病率呈现逐年攀升的趋势，由于大肠癌具有早期症状不明显的特点，导致大部分患者确诊时已属于中、晚期大肠癌，其中一些患者已丧失手术最佳时间，这部分大肠癌患者可能只有不足8月的生存时间。大肠癌保持着较高的复发率，接近半数大肠癌复发时合并存在肝脏转移。临床医务人员长期对大肠癌的治疗前景充满期待。近几年，针对大肠癌的治疗手段及相关技术方法己有了明显进步，但化疗仍是治疗晚期大肠癌的重要手段，传统的化疗药物如亚叶酸钙、氟尿嘧啶、伊立替康等可以对患者的生存质量有一定程度的改善，增加了患者的生存期，但其治疗效果仍不令人满意，而且传统化疗的不良反应较重，患者的耐受性相对较差。贝伐单抗是重组的人源化的抗血管内皮细胞生长因子（vascular endothelialgrowthfactor，VEGF）的单克隆抗体，可以特异性地阻断VEGF，结合血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），抑制血管内皮细胞的生长与新血管增生，进而抑制肿瘤生长与进展。本试验旨在对比KRAS基因第12、13密码子突变类型分布情况，同时对比KRAS基因第12、13密码子突变与大肠癌患者临床病理特征、贝伐单抗治疗效果以及生存时间的关系，从而为KRAS基因第12、13密码子突变的大肠癌患者提供更好的个体化靶向治疗方案及判定预后的指标。方法：本课题收集我院收治的大肠癌患者共68例，时间从2011年3月至2012年9月。入组病例已通过病理学诊断为大肠癌。按要求摘录病例的临床病理资料（包括患者性别、年龄、肿瘤临床分期、采取的临床治疗方案及其疗效等）。应用K-ras基因的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及测序法检测KRAS基因第12、13密码子突变状态，并对比KRAS基因第12、13密码子突变与大肠癌患者临床病理特征、贝伐单抗治疗效果及生存时间的关系。试验所得数据输入SPSS19.0统计分析软件对各种率进行χ2检验；使用Kaplan-Meier法对各组间生存率的评估与生存函数曲线的绘制应用，比较各种KRAS基因第12、13密码子突变情况与大肠癌患者生存时间的关系，以P<0.05表示差异，有统计学意义。结果：1.入组病例中，男性患者40例（40/68，58.82%），女性患者28例（28/68，41.18%），年龄2384岁，中位年龄55岁；年龄≤55岁者37例（37/68，54.41%），年龄>55岁者31例（31/68，45.59%）；TNM分期Ⅱb期患者28例（28/68，41.18%），Ⅲ+Ⅳ期患者40例（40/68，58.82%）；单独原发灶检测突变阳性患者21例（21/68，30.88%），单独转移淋巴结检测突变阳性患者14例（14/68，20.59%），原发灶+转移淋巴结患者33例（33/68，48.53%）。2.本研究对入组的68例大肠癌患者进行KRAS基因第12、13密码子突变检测，KRAS基因12密码子突变56例（56/68，82.35%），13密码子突变12例（12/68，17.65%）。3. KRAS基因第12、13密码子突变大肠癌患者中男性突变率（58.82%）高于女性突变率（41.18%），两者间差异有统计学意义（P=0.040）；临床分期Ⅱb期患者突变率（41.18%）低于Ⅲ+Ⅳ期患者突变率（58.82%），两者间差异有统计学意义（P=0.040）；已行手术切除患者突变率高于未行手术（64.71%vs35.29%），两者间差异有统计学意义（P=0.001）；单独原发灶检测突变阳性患者比率（30.88%），单独转移淋巴结检测突变阳性患者比率（20.59%），原发灶+转移淋巴结突变检测阳性患者比率（48.53%），各组间突变率的差异具有统计学意义（P=0.002）；而年龄（≤55岁突变率54.41%，>55岁突变率45.59%）、肿瘤直径（≤5cm突变率48.53%，>5cm突变率51.47%）、肿瘤大体形态（隆起型突变率44.12%，溃疡型突变率55.88%）、分化程度（低分化突变率42.65%，高-中分化突变率57.35%）肿瘤生长部位（右半结肠突变率8.82%，横结肠突变率5.88%，左半结肠突变率44.12%，直肠突变率36.76%，两处及以上突变率4.41%）、ECOG评分（0-1分突变率45.59%，2分突变率54.41%），各组突变率间差异无统计学意义。4.68例入组患者均至少经过4周期的治疗疗效，试验组患者ORR和DCR分别为52.94%和85.29%；对照组患者ORR和DCR分别为29.41%和61.76%，试验组与对照组间的客观有效率（P=0.049）和疾病控制率（P=0.028）差异有统计学意义。5.试验组给予辅助应用贝伐单抗治疗的患者，无进展生存期（PFS）中位数在KRAS基因突变患者（共34例，PFS中位数为62周）中明显高于对照组未给予贝伐单抗治疗的患者（34例，PFS中位数为46周），P=0.001，两组间差异具有统计学意义。6.有准确生存数据的患者共68例，试验组34例，对照组34例，两组的中位生存时间分别为72周（95%CI，67.5周76.5周）和50周（95%CI，43.6周56.4周），p=0.001，两组间生存有明显差异。结论：1.本研究共完成68例K-ras基因第12、13位密码子突变的大肠癌患者的基因检测，其中第12位密码子突变率为82.35%，最常见的突变类型是GGT突变为GAT，第13位密码子突变率为17.65%，突变类型是GGC突变为GAC。2.大肠癌K-ras基因第12、13位密码子突变与患者性别、TNM分期、是否行手术治疗相关。大肠癌患者的年龄、肿瘤直径、肿瘤大体形态、分化程度、ECOG评分、肿瘤生长部位及是否合并淋巴转移、远处转移与K-ras基因第12、13位密码子突变，各组间比较，差异无统计学意义。3. K-ras基因第12、13位密码子突变可以作为评估贝伐单抗治疗效果的预测因子。4. K-ras基因第12、13位密码子突变患者辅助应用贝伐单抗治疗的中位PFS及中位OS均有所延长，两组之间差异具有统计学意义。
刘淑娟[2]（2014）在《大肠息肉EGFR、KRAS蛋白表达的临床意义》文中指出背景与目的：大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。目前一般认为，大肠癌的发生发展经过了正常肠上皮—增生性改变/微小腺瘤—早期腺瘤—中期腺瘤—晚期腺瘤—癌—癌转移阶段，大肠腺瘤被视为大肠癌癌前病变。目前治疗大肠息肉最普遍的方式是内镜下息肉摘除术，经研究证实内镜下摘除腺瘤可使大肠癌的发生率降低76%～90%。临床上对于5mm以上的大肠息肉尤其是腺瘤性息肉，处理多比较积极并尽量留取标本送检病理，而镜下形态较好未予送检者则可能因存在潜在恶变风险而延误随访时机；对于5mm以下的病变，临床上会根据经验选择性处理并选择性留取标本送检，这就有可能会导致部分存在恶变倾向的较小息肉在进行肠镜检查时未被处理而发生遗漏。由于息肉癌变的分子学表达往往早于其形态学改变，因此利用基因表达早期有效区分出有潜在恶变风险的息肉，尤其是组织学尚未表现出典型腺瘤样结构的息肉，并给予及时处理、缩短随访时间，这将对大肠癌的预防起到非常重要的作用。目前已证实大肠癌的发生发展是多种基因及信号转导通路功能异常积累的结果，EGFR的异常活化与K-ras及其引起的B-raf等基因及其产物的过度表达被认为是大肠癌发生与恶性演进的原因。本研究通过检测大肠息肉中EGFR及K-ras蛋白表达情况，探讨二者与大肠息肉临床参数之间的关系，旨从蛋白水平研究EGFR及K-ras蛋白在大肠息肉发生发展中所起的作用，以及这两种蛋白作为大肠腺瘤性息肉演进及恶性转化预警标志物的可行性。方法：留取肠镜下摘除大肠息肉标本53例，其中非腺瘤性息肉25例，腺瘤性息肉28例，大肠癌手术切除标本115例，采用免疫组化SP法检测EGFR及K-ras蛋白在大肠息肉及原发性大肠癌组织中的表达情况，分析该两种蛋白表达及其与大肠息肉临床参数之间的关系，以及二者在大肠息肉中表达的相互关系，所得结果在SPSS19.0软件中进行统计学分析。结果：1.大肠息肉（非腺瘤性、腺瘤性）组与大肠癌组EGFR蛋白的表达情况EGFR蛋白阳性表达率在大肠非腺瘤性息肉、大肠腺瘤性息肉及大肠癌组分别为32.00%（8/25）、64.29%（18/28）与62.61%（72/115），腺瘤性息肉组阳性表达率高于非腺瘤性息肉组，二者差异有统计学意义（P＜0.05），大肠癌组阳性表达率高于非腺瘤性息肉组，二者差异有显着统计学意义（P＜0.01），而腺瘤性息肉组与大肠癌组阳性表达率接近，二者无明显差异（P＞0.05）。2.大肠息肉组EGFR蛋白表达与患者临床参数的关系EGFR蛋白表达在非腺瘤及腺瘤组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而在男性及女性组、＜60岁及≥60岁组、单发及多发组、直肠、左半结肠及右半结肠组比较均无明显差异（P＞0.05）。3.大肠息肉（非腺瘤性、腺瘤性）组与大肠癌组K-ras蛋白的表达情况K-ras蛋白阳性表达率在大肠非腺瘤性息肉、大肠腺瘤性息肉及大肠癌组分别为36.00%（9/25）、78.57%（22/28）与46.09%（53/115），腺瘤性息肉组阳性表达率明显高于非腺瘤性息肉及大肠癌组，差异均有显着统计学意义（P＜0.005），而非腺瘤性息肉组与大肠癌组比较无明显差异（P＞0.05）。4.大肠息肉组K-ras蛋白表达与患者临床参数的关系K-ras蛋白表达在非腺瘤及腺瘤组比较差异有显着统计学意义（P＜0.005），而在男性及女性组、＜60岁及≥60岁组、单发及多发组、直肠、左半结肠及右半结肠组比较均无明显差异（P＞0.05）。5.大肠息肉组EGFR与K-ras蛋白表达的相关性分析大肠息肉组EGFR、K-ras蛋白表达呈显着正相关（P＜0.005，r=0.444）。结论：1.EGFR及K-ras蛋白在大肠腺瘤性息肉中有一定表达；2.EGFR及K-ras蛋白表达升高可能与大肠腺瘤性息肉的发生与恶性转化有一定关系；3.EGFR及K-ras蛋白在大肠息肉的发生发展中有协同作用。
刘佳[3]（2014）在《广西地区结直肠癌患者K-ras基因突变分析》文中认为目的：分析广西地区结直肠癌患者K-ras基因突变的情况，分析广西地区结直肠癌患者K-ras基因突变与临床特征的关系，为广西地区结直肠癌的预防和治疗提供科学依据。方法：选取2010年1月-2014年1月间广西医科大学附属肿瘤医院收治的经手术切除并经过病理确诊的本地区结直肠癌患者标本149例，采用突变特异性扩增系统（Amplification Refractory MutationSystem，ARMS） PCR法检测149例结直肠癌患者K-ras基因2号外显子第12和13位密码子突变情况，同时分析其突变与临床特征的关系。结果：在选取149例结直肠病例中，共有29例患者检出K-ras基因突变，突变总检出率为19.5%（29/149）。男性患者K-ras突变率为16.7%（16/96），女性患者K-ras突变率为24.5%（13/53）；≤60岁的患者K-ras基因突变率22.4%（22/98），>60岁的患者K-ras基因突变率为13.7%（7/51）；142例腺癌患者K-ras基因突变检出率为20.4%（29/142），6例黏液腺癌患者和1例印戒细胞癌患者中均没有检出K-ras基因突变；108例汉族结直肠癌患者中K-ras基因突变检出率为17.6%（19/108），壮族患者中K-ras基因突变检出率为24.1%（7/29）。不同性别、年龄和民族的患者突变率均没有显着性差异。K-ras基因突变以2号外显子12位密码子Gly12Asp的突变较为多见，其中Gly12Asp突变率为34.5%（10/29），Gly13Asp突变率为24.1%（7/29），Gly12Cys突变率为17.2%（5/29），Gly12Val突变率为13.8%（4/29），Gly12Ala突变率为6.9%（2/29）及Gly12Arg突变率为3.5%（1/29）。结论：广西地区结直肠癌K-ras基因突变以2号外显子第12位的突变为主，其中Gly12Asp突变率最高；K-ras基因的突变率与性别、年龄以及民族没有相关性。
高颖,昌红,沈兵,石峰,张建英[4]（2013）在《大肠癌组织中K-ras基因突变的检测》文中提出目的探讨大肠癌石蜡包埋组织中K-ras基因突变状态及其与年龄、性别、病理组织学分型和分化程度的关系。方法选用ADx-ARMS法检测84例大肠癌石蜡组织中K-ras基因7个突变热点。结果 82例大肠癌样本中共发现K-ras基因突变30例,突变率为36.6%。K-ras基因突变与患者年龄、性别、大肠腺癌组织学类型及分化程度无关（P>0.05）。结论 K-ras基因在大肠癌中的突变率与肿瘤类型、分化程度、患者年龄及性别无关。
高颖,昌红,沈兵,石峰,张建英[5]（2013）在《应用ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测》文中进行了进一步梳理目的探讨ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测情况。方法选择首都医科大学附属北京世纪坛医院2012年4～8月的大肠癌石蜡标本40例。应用ADx-ARMS法检测大肠癌石蜡标本中的K-ras基因7个热点突变,分析与年龄、性别、组织学分型以及病理分化程度的关系。结果 40例大肠癌样本中共发现K-ras基因突变14例,突变率约为35.0%。K-ras基因突变与年龄及组织学分型无关（P>0.05）,与患者性别（P<0.05）及腺癌分化程度（P<0.01）有关。结论 ADx-ARMS法检测大肠癌组织中K-ras基因突变效果满意,值得临床应用。
曹淑洋[6]（2013）在《hARD1过表达对人大肠腺癌细胞株增殖变化的研究》文中研究指明目的：本实验以三株人大肠腺癌细胞株SW620、HCT-8、LS-174-T为研究对象,通过构建pc-DNA3.1（-）-hARD1真核表达载体,转染至三株人大肠腺癌细胞株后,建立hARD1稳定过表达的三株大肠腺癌细胞系,观察大肠腺癌细胞的增殖变化的情况,从而探讨hARD1在大肠癌发生、发展中的作用。方法：1.hARD1目的基因的设计合成；2.利用重组DNA技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定真核表达载体pcDNA3.1（-）-hARD1;3. SW620、HCT-8、LS-174-T细胞的培养；4.通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将所构建的重组质粒导入三株人大肠腺癌细胞株,构建]hARD1过表达的稳定细胞系；5.应用Western blot法检测]ARD1稳定过表达的三株大肠癌细胞系中]ARD1的表达情况；6.采用EDU法检测过表达hARD1对三株人大肠腺癌细胞增殖的影响；结果：1.PCR扩增hARD1目的基因,琼脂糖凝胶电泳获得大约700bp的目的基因,提示目的基因扩增成功；2.经双酶切鉴定出700bp的hARD1目的基因片段和约5000bp的载体片段带,证明pcDNA3.1（-）-hARD1重组质粒构建成功。G418试剂成功筛选hARD1稳定过表达的三株大肠腺癌细胞系；3.EdU检测结果提示：实验组与空白对照组及阴性对照组比较,实验组的三株细胞增殖比例均明显升高,阴性对照组与空白对照组比较,阴性对照组的三株细胞增殖比例均明显降低；结论：1.本实验成功构建重组质粒pcDNA3.1（-）hARD1;2.转染了pcDNA3.1（-）hARD1重组质粒的三株大肠腺癌细胞系能够实现hARD1的成功高表达。3.本实验初步验证了人为干预hARD1在大肠腺癌细胞中高表达后,细胞增殖发生明显变化。4. hARD1重组质粒的成功构建,可为进一步研究hARD1与大肠癌的相关性及人工干预hARDl的高表达对其他不同肿瘤所产生的影响提供了有效的工具。
李丙生[7]（2012）在《高分辨率熔解曲线分析检测大肠肿瘤粪便DNA突变性能评价》文中进行了进一步梳理研究背景和目的全球结直肠癌（CRC）发病率位于恶性肿瘤的第3位,我国位于第4-6位,呈逐年上升的趋势。广东省CRC发病率的上升速度较快。CRC的预后与早期诊断密切相关。绝大多数CRC是由“正常-腺瘤-癌”逐步演变而来,从可辨认的腺瘤发展为侵袭性癌约需5-10年,这为预防及早期筛查提供了充裕的时间。大量研究已证实发生癌变的腺瘤主要为晚期腺瘤（AA,指直径≥1cm或组织学证实为绒毛状腺瘤或重度异型性增生的腺瘤）,通过临床筛查并及时切除癌前病变如腺瘤,可降低CRC发病率及病死率。结肠镜检查因准确性高且能治疗而被首选,但存在需要专业的内镜医生、风险较大、费用高、患者接受性差等不足,难以大规模应用于无症状人群的筛查；粪便隐血试验（FOBT）具有简便、无创、经济,接受性好等优点而被优选,但存在假阳性率及假阴性率较高、需要多次送检等不足,由于腺瘤检出率敏感度低,因而对癌症发病率的影响小；粪便DNA检测具有只需一次送检、易接受、依从性高、不需服药或控制饮食、不受肿瘤部位影响等优点而被重视。大量研究表明粪便DNA检测的敏感性和特异性比FOBT好,尤其腺瘤检出率高引人注目。已列为美国指南候选方法。但现有的粪便DNA检测方案尚需完善,主要是敏感性与特异性有待提高,费用需降低、操作需简单化等。除了尚需进一步优化/更替现有的标志物组合外,升级现有的检测方法也是关键环节。现有的高敏感性和特异性的粪便DNA检测方法,普遍存在费用高、操作复杂、过于专业化、受制于待检目标基因位点的等问题。因此寻求一种便捷易用、经济高效的检测方法是提升粪便DNA检测实用价值的必要条件。高分辨率熔解曲线分析（HRMA）是犹他州大学Wittwer实验室与美国Idaho公司联合研制的一种PCR后闭管操作技术：通过高密度荧光数据采集,直接用熔解曲线检测PCR扩增片段中微小序列差别。具有低成本、高通量、无污染、快捷、操作简单、不受变异位置影响、敏感性及特异性好等优势。自2003年被引入检测基因突变以来,HRMA的应用与发展如“雨后春笋”,在医学分子诊断中越来越受到关注。经荟萃分析发现其灵敏度达97.5%（95%置信区间（CI）,96.8-98.5）、特异度达95.8%（95%CI：95.3-96.3）,DNA样本的来源及饱合染料类型均对HRMA的灵敏度无影响。我们前期的研究已经初步展示HRMA用于粪便DNA突变检测,获得较高的检出率,具有潜在临床应用价值。目前国内尚无有关评价HRMA方法用于粪便DNA检测筛查CRC的文献报道。因此,本研究在前期研究基础上,以DNA测序结果作为金标准,扩大样本量、更新试验设计方案、优化实验条件及操作流程等方式对HRMA的准确性展开较为全面的评价性研究。首先在组织样本中建立与优化HRMA操作流程与实验参数；然后,在2个独立的样本集（包括“学习集”与“验证集”阶段）中对HRMA应用于粪便DNA KRAS与TP53突变的检测的敏感性和特异性进行全面评价；同时,在DNA系列稀释试验中评估HRMA技术的敏感性；最后,探讨检出的粪便KRAS、TP53突变与大肠肿瘤性病变的临床病理特征参数的关系及诊断价值。方法研究对象：2010.1-2010.7间在惠州市中心医院及南方医院接受肠镜检查者和/或普外科住院的术前CRC与AA患者中,及肠镜检查未发现明显异常的病人中。按下列纳入与排除标准,连续收集这些患者的粪便标本与临床病理特征参数资料,在“学习集”部分收集相应的肿瘤的FFPE组织标本。研究组纳入标准：（1）年龄大于40岁、且病理组织学检查确诊为结直肠AA与CRC患者；（2）能同时收集病变组织与合格粪便样本（重量不低于5克）的患者。研究组排除标准：（1）家族性或遗传性结直肠腺瘤或肿瘤；其他系统或器官肿瘤。（2）共患有炎症性肠病；（3）术前有放疗或化疗史；（4）妊娠或有严重肝肾功能不全者；（5）非原发癌灶者及不能确诊等其他情况；（6）既往有CRC或腺瘤病史；（7）肉眼见全血性大便者。粪便样本采集：在内镜检查或肿瘤切除手术前、接受任何形式的结直肠侵入性操作或服用泻剂肠道准备的1周后,收集至少5克新鲜粪便量于48小时内尽快冻存于-80℃冰箱待用。DNA提取与质控：按QIAamp粪便DNA、FFPE DNA的提取试剂盒的说明书方法提取DNA,在FFPE组织取样时,采用传统手工微切的方法,保留每—块样本中含有肿瘤细胞占的比例≥50%。提取DNA的浓度和纯度测定均用NanoDrop ND-1000分光光度计检测,达标要求：浓度≥50ng/μL,260/280nm的吸光度位于1.6-2.2且230/260nm位于2.0-2.5。达标的样本DNA均稀释到50ng/μL的终浓度,置入-20℃冰箱保存待用。HRMA检测：基于NCBI的TP53外显子5-8、KRAS2-3的参考基因序列设计引物,KRAS Exon2（92bp） f-TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA, r-TGAAT-TAGCTGTATCGTCAAGGCACT; Exon2（155bp） f-TTATAAGGCCTG CTGAAAAT-GACTGAA, r-TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT, Exon3f-GACTGTGTTTCT-CCCTTCTC, r-TGTACTGGTCCCTCATTGC; TP53Exon5f-GTGCAGCTGTGGGTT-GATT; r-AACCAGCCCTGTCGTCTCT, Exon6f-GAT TCCTCACTGATTGCTCTTA-G r-GGGCACCACCACACTATG; Exon7f-TTGGGCCTGTGTTATCTCCT r-TGGCA AG TGGCTCCTGAC,Exon8f-TTGCTTCTC TTTTCCTATCCTGAr-GCTTCTTGTCCTGCTTGCTT。其中, KRAS基因外显子2,设计2对引物,扩增的片段分别为92bp和155bp。KRAS基因外显子2（155bp）的检测是在LightCycler480PCR仪上操作；其他的KRAS基因外显子2（92bp）-3,TP53基因外显子5-8基因均在Rotor-GeneTM6000PCR仪上操作。反应体系：2μL（100ng）样本DNA,上下引物各为lμL（200nmol/L）,镁离子2μL（2.5mmol/L）, LightCycler480HRM Master/qPCR Master预混液12.5μL,加ddH2O至总体积25μL。反应条件参数：95℃预热5分钟,95℃×15秒→60℃-63℃×50秒→72℃×30秒→72℃×10分钟,共50个循环。PCR产物在95℃变性5分钟,冷却至40℃×1分钟（让异源双链形成）然后在65℃升至95℃间,荧光采集密度为25次/℃。HRMA分析：原始采集的荧光曲线经过正常化和温度调整处理后,野生型基因被用来作为阴性对照。曲线图形的差异表示扩增的样本基因序列存在变异。HRMA突变阳性样本记为异常熔解曲线。采集的数据经罗氏公司的基因分析软件（1.5版）及RotorGene的软件（V1.7.25版）分析得出结果。DNA测序检测：首先,对PCR产物进行酶切纯化：1、将每个样本PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶进行检测,确认目的条带是否单一；2、经上述琼脂糖凝胶检测条带单一的,使用SAP（虾碱性磷酸酶）和Exo I（外切核酸酶）进行酶切纯化；3、经上述琼脂糖凝胶检测有非特异性的条带,使用BioMIGA的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行割胶回收。接着,在用在ABI3730DNA测序仪上进行单向测序,采用的是Sanger法。最后,使用3730XL软件、DNAMAN软件对测序数据进行分析,得出最终结果。所有样本DNA的测序均送上海硕士生物有限公司检测分析。统计方法以α=0.05为检验水准,各组间年龄,两样本t检验；所有的计数资料的比较,多样本间采用χ2检验,四格表采用Fisher确切概率法,若配对资料采用McNemar检验,符合率采用Kappa分析。统计分析均使用SPSS13.0软件包及EpiCalc2000统计软件。结果参与患者的临床病理特征参数最初,有145例大肠肿瘤性病变患者,70例结肠镜检查阴性的病人（NC）作对照组。28例因粪便样本不符合纳入与排除标准而剔除。接下来,187提取DNA,12例因DNA质量不达标而排除。最终纳入研究共175例,63例CRC,52例AA,60例年龄相匹配的NC,所有参与者均是中国人。患者病情诊断的确定均是根据结肠镜检查结果和/或完整切除肿瘤的标本病理诊断。CRC组的平均年龄为61岁（41-87岁）,AA组的平均年龄为58岁（40-80岁）,对照组平均年龄为47岁（40-73岁）；病例组男女性比例69/57,其中CRC为32/31, AA为37/26,而对照组为24/36；CRC、AA原发部位位于近端结直肠分别为88.9%（56/63）、86.5%（45/52）；Duck’s分期中,A+B期占60.3%；病例组KRAS外显子2-3突变率为26.1%（30/115）,TP53外显子5-8突变率为21.7%（25/115）,对照组突变率3.3%（2/60）。“学习集”阶段研究为了建立及优化HRMA技术的实验条件与参数设定。我们在CRC与AA的组织样本中,对HRMA检测突变基因的准确性进行评价。先对合格的40例病人的FFPE的样本进行测序证实KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变情况,再用HRMA检测其基因突变的情况,我们检出22例病人有基因突变,其中17例来自29例CRC,5个来自AA,突变检出率55%（22/40）。两者检测结果完全一致,其敏感度与特异度均为100%。随后基于上述优化的HRMA的技术操作流程,我们就对其相应的粪便DNA的突变进行检测,结果发现,HRMA检出18例（18/40,45%）突变,其中,CRC14例（14/29,48.28%）,AA4例（4/11,36.36%）,这些检测结果均被随后的测序所证实,HRMA的敏感度与特异度均为100%。粪便DNA与相应组织的突变检出率的符合率高度一致,18/22（81.82%）,其中CRC14/17（82.35%）,AA4/5（80%）,Kappa值为0.794,在CRC、AA中分别为0.794、0.814。HRMA的敏感性分析为了评价HRMA在结直肠癌筛查的环境中检测粪便DNA突变的可靠性,我们采用DNA的系列浓度稀释试验评估HRMA检测最低水平基因突变的灵敏度。选用已知KRAS基因外显子2及TP53基因外显子6-8突变具体情况的粪便样品DNA系列稀释实验,选用同样的粪便DNA中的野生型样本作为稀释实验的背景。我们发现,HRMA检出突变基因的最低稀释浓度限度为1%,但样本间存在的差异大；HRMA能够稳定可靠的检出浓度为≥5%。“验证集”阶段研究基于前二个部分研究得出的HRMA具有与测序一致的敏感性与特异性,且检出突变基因的最低浓度限度能达1%。促使我们在“验证集”中进一步评价其准确性。75例病例组,包括34例CRC和41例AA,60例对照组。在病例组的粪便DNA中,共检出含有KRAS和／或TP53基因突变频率为（49.3%,37/75）显着高于对照组（3.3%,2/60）（P<0.001）；在病例组的亚组分析中,基因突变率在CRC亚组（58.8%,20/34）与AA亚组（41.5%,17/41）之间的存在显着性差异（P=0.02）。HRMA检测的结果,均被随后的测序证实,其敏感度与特异度均为100%。粪便基因突变与临床病理特征参数关系及临床诊断价值1、病例组中,CRC、AA原发于近端结直肠（88.9%、86.5%）明显多于远端结直肠（13.5%、11.1%）；Duck’s分期中,A+B期（60.3%）明显多于C+D期（39.7%）；在病例组与对照组间,CRC亚组与AA亚组间,均存在显着的性别构成比差异（P=0.004,P=0.035）,前者男性所占比例均明显多于后者；对KRAS基因外显子2突变,我们同时检测二个不同长度的片段（155bp和92bp）,发现两者的突变检出率完全一致。2、在CRC组中,检出19例（19/63,30.1%）KRAS突变,15例（15/63,23.8%）TP53突变。发现各基因突变频率与性别、部位、分化度、组织类型、大小、Duck’s分期、年龄均无统计学上差异。3、在AA组中,检出11例（11/52,21.2%）KRAS突变,10例（11/52,19.2%）TP53突变。发现TP53突变与年龄分组存在差异（P=0.036）,发现年龄≥60岁组突变检出率32.0%（8/25）高于<60岁组7.4%（2/27）。但发现各基因突变频率与性别、部位、异型增生度、组织类型、大小均无统计学差异。4、两基因联合突变发生率,CRC中为54.0%（34/63）,AA中为40.4%（21/52）；联合检测粪便DNA KRAS与TP53基因突变筛查CRC与AA的性能欠佳,敏感度分别为54%[95%CI0.41,0.66]与40%[95%CI0.27,0.55],特异度均为97%[95%CI0.87,0.99],准确性分别为75%与71%。结论“学习集”阶段1、在CRC与AA患者的组织样本中,HRMA检测KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变准确性与DNA测序结果完全一致,其敏感性与特异度均达100%。2、在其相应的粪便DNA样本中,HRMA检测KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变准确性与DNA测序结果完全一致,其敏感性与特异度均达100%。3、粪便DNA突变检出率与组织DNA突变检测出率的符合率高度一致,Kappa值为0.794,在CRC、AA中分别为0.794、0.814。HRMA的敏感性分析在野生型基因稀释的背景下,这可粗略估计出HRMA检测突变的敏感性能达1%稀释浓度,并且发现待检样本的序列变异直接影响HRMA检测的灵敏度,因此HRMA能稳定可靠地检出突变的敏感性是≥5%稀释浓度。“验证集”阶段1、病例组基因突变检出率（49.3%,37/75）显着高于对照组（3.3%,2/60）。表明KRAS和/或TP53基因突变与大肠肿瘤性病变相关。2、CRC患者基因突变检出率的显着高于AA患者,表明KRAS和/或TP53基因突变与CRC关系更密切。3、HRMA检测基因突变的结果均能被随后的测序所证实,其检测粪便DNA突变的敏感度与特异度均达100%。粪便基因突变与临床病理特征参数关系及临床诊断价值1、在所有病例患者的粪便DNA样本中,KRAS突变检出率为26.1%（30/115）,TP53突变检出率为21.7%（25/115）；CRC、AA原发于近端结直肠多于远端结直肠；Duck’s分期中,较早期病变（A-B期）明显多于较晚期（C+D期）；在病例组与对照组间、CRC亚组与AA亚组间,均存在显着的性别差异,前者男性所占比例均明显多于后者；同一基因的不同长度片段（155bp和92bp）对HRMA的突变检出率无影响。2、病例组中,均未发现KRAS、TP53各基因突变频率与性别、部位、分化度/异型增生度、组织类型、大小、Duke’s分期、年龄存在相关性。3、在AA组中,发现TP53突变与年龄相关,高龄组（年龄≥60岁）检出率高于低龄组（年龄<60岁）4、联合检测粪便DNA KRAS与TP53基因突变（CRC54.0%（34/63）AA40.4%（21/52））诊断CRC与AA的敏感度欠佳,分别为54%与40%,特异度均为97%。
宋芳[8]（2012）在《PKC-a、K-Ras蛋白在结直肠癌中的表达及意义》文中认为目的探讨蛋白激酶C（PKC）a及K-Ras蛋白在结直肠癌发生、发展中的作用。方法用免疫组织化学法分别检测10例正常结直肠黏膜组织、15例结直肠腺瘤及76例结直肠腺癌组织中PKC-a及K-Ras蛋白的表达。另用Western Blot方法检测以上标本其中的30例结直肠癌和10例正常结直肠黏膜组织中PKC-a及K-Ras蛋白的表达水平。分析两种蛋白之间的相关性及其与肿瘤临床病理特征之间的关系。结果1、免疫组织化学结果：①PKC-a在正常结直肠黏膜组织、结直肠腺瘤及结直肠癌的阳性表达率分别为80.0%（8∕10）、53.3%（8∕15）、35.5%（27∕76）。K-Ras蛋白在正常结直肠黏膜组织、结直肠腺瘤及结直肠癌的阳性表达率分别为10.0%（1∕10）、66.7%（11∕15）、68.4%（52∕76）。PKC-a在结直肠癌中的阳性表达率低于正常结直肠黏膜组织（P﹤0.05），K-Ras蛋白在结直肠癌和结直肠腺瘤中的阳性表达率均高于正常结直肠黏膜组织（P﹤0.05）。②PKC-a和K-Ras蛋白的表达与结直肠癌的临床病理分级有关（P﹤0.05）。随着病理分级的增加，PKC-a表达率逐渐降低， K-Ras则逐渐升高;二者的表达与性别、年龄、淋巴结转移及Dukes分期均无关（P＞0.05）。③在结直肠癌组织中PKC-a与K-Ras蛋白的表达之间呈负相关（r=﹣0.930，﹣1≤r﹤0）。2、Western Blot结果：PKC-a在结直肠癌的表达水平（0.1044±0.0274）低于正常结直肠黏膜组织（0.5775±0.0377）（P＜0.05），PKC-a的表达水平在不同分化程度间差异有显着性（P＜0.05）， K-Ras蛋白在结直肠癌的表达水平（0.6004±0.0386）高于正常结直肠黏膜组织（0.0629±0.0066）（P＜0.05），结直肠癌组织中PKC-a的表达量与K-Ras蛋白的表达量之间呈负相关（r=-0.535）。结论1、K-Ras蛋白在结直肠癌组织中高表达，且与癌组织的分化程度有关，说明原癌基因K-Ras可能与结直肠癌发展进程有关，且在一定程度上提示了肿瘤的愈后。2、PKC-a在结直肠癌组织中的低表达，且随着癌组织分化程度的降低而降低，说明PKC-a基因可以抑制肿瘤的发生，且与肿瘤的分化程度有关。3、PKC-a与K-Ras蛋白在结直肠癌中的表达呈负相关，提示二者比例失调可能是结直肠癌发展进程机制之一。
项芳芳,毛高平[9]（2012）在《大肠癌与抑癌基因相关性的研究现状》文中提出大肠癌是常见的高危害消化系恶性肿瘤,全球每年新发病例约为120万例.近年来,随着人们生活水平的提高,饮食习惯和结构的改变,我国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速,而且,发病年龄明显提前,目前,我国大肠癌中位发病年龄为58岁,比欧美等国家提前12-18年.大肠癌的发生是一个多阶段多步骤的、涉及多个基因改变的复杂过程.许多研究表明,结直肠癌变是一个涉及原癌基因激活、抑癌基因失活等多基因、多阶段、多步骤渐进演化的积累过程.与结直肠癌相关的抑癌基因有p53、APC、DCC、MMR等,原癌基因有k-ras、c-myc等.本文就以上基因改变与大肠癌的发生发展相关性的研究现状作一简单复习.
杨蔚蔚,张玲,陈慧娟,程俊峰,胡春明[10]（2011）在《某地区结直肠癌患者K-Ras基因突变检测结果分析》文中提出目的探讨广东地区结直肠癌患者组织中K-Ras基因突变模式,为临床治疗提供科学依据。方法选取广东地区的40例结直肠癌患组织标本,应用聚合酶链反应以及测序法对患者K-Ras基因进行检测,结果采用卡方检验进行统计学分析。结果在40例结直肠癌患者中发现4种K-Ras基因突变类型,包括密码子12位点GGT→GAT、GGT→GTT、GGT→TGT突变以及13位点的GGC→GAC突变,K-Ras基因突变率为35.00%。K-Ras基因突变与年龄和性别无统计学意义。结论广东地区结直肠癌患者K-Ras基因突变率为35.00%（14/40）。密码子12位点GGT→GAT是突变热点,占突变的93%,结直肠癌K-Ras基因突变与患者年龄及性别无关。
二、中国人大肠癌K-ras基因突变的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国人大肠癌K-ras基因突变的研究（论文提纲范文）
（1）KRAS基因第12、13位密码子突变型大肠癌患者的临床病理特征、靶向治疗疗效及生存分析（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 大肠癌中原癌基因 Ras 的研究现状 |
| 2.3 转移性大肠癌中 KRAS 基因的研究现状 |
| 2.4 抗 EGFR 治疗中 KRAS 基因的研究现状 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 研究对象 |
| 3.2 疗效评价 |
| 3.3 实验流程 |
| 3.4 试验试剂及主要仪器 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.6 不良反应 |
| 3.7 统计学处理 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 入组病例一般情况 |
| 4.2 KRAS 基因 12、13 密码子突变情况 |
| 4.3 KRAS 基因突变患者的临床病理特征对比分析 |
| 4.4 两组患者产生不良反应比较 |
| 4.5 两组患者治疗效果分析 |
| 4.6 生存分析 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 K-ras 基因突变特征 |
| 5.2 K-ras 基因 12、13 密码子突变与大肠癌患者临床病理特征的关系 |
| 5.3 大肠癌 K-ras 基因第 12、13 密码子突变与靶向药物疗效的关系 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）大肠息肉EGFR、KRAS蛋白表达的临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）广西地区结直肠癌患者K-ras基因突变分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和仪器 |
| 方法和步骤 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 结直肠癌 K-RAS基因及其检测方法的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）大肠癌组织中K-ras基因突变的检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂与方法 |
| 1.2.1 检测区域的选择 |
| 1.2.2 脱蜡 |
| 1.2.3 DNA提取及纯度检测 |
| 1.2.4 实时荧光PCR |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（5）应用ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 试剂与方法 |
| 1.2.1 检测区域的选择 |
| 1.2.2 石蜡组织脱蜡处理 |
| 1.2.3 样本DNA提取 |
| 1.2.4 样本DNA质量检测 |
| 1.2.5 实时荧光PCR检测 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 K-ras基因突变检测结果 |
| 2.1 患者临床、病理特征与K-ras基因突变状态关系 |
| 3 讨论 |
（6）hARD1过表达对人大肠腺癌细胞株增殖变化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 实验材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章情况 |
| 致谢 |
（7）高分辨率熔解曲线分析检测大肠肿瘤粪便DNA突变性能评价（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 参考文献 第一部分 |
| 在“学习集”中评价HRMA检测组织与粪便DNA突变的性能及检测粪便基因突变的可行性 引言 一、材料与方法 二、统计方法 三、研究结果 四、研究结论 第二部分 |
| 在粪便DNA的系列稀释试验中评估HRMA敏感性 引言 一、材料与方法 二、研究结果 三、结论 参考文献 第三部分 |
| 在“验证集”患者中进一步评价HRMA检测粪便基因突变的性能 引言 一、材料与方法 二、统计方法 三、研究结果 四、研究结论 参考文献 第四部分 |
| 粪便DNA中KRAS、TP53基因突变与临床病理特征参数的关系及潜在临床价值 引言 一、材料与方法 二、统计方法 三、研究结果 四、研究结论 参考文献 讨论 主要使用的仪器与试剂 本研究存在的不足 参考文献 综述 参考文献 攻读学位期间成果 附录 附表 致谢 统计学审稿证明 |
（8）PKC-a、K-Ras蛋白在结直肠癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）大肠癌与抑癌基因相关性的研究现状（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 大肠腺瘤-大肠癌发生过程中各阶段抑癌基因的表达 |
| 1.1 大肠息肉分类及特殊类型息肉与癌变的关系 |
| 1.2 腺瘤-大肠癌发生过程中的各个阶段中抑癌基因的表达基因的表达 |
| 1.2.1腺瘤阶段: |
| 1.2.2癌变早期阶段: |
| 1.2.3转移阶段及预后: |
| 2 抑癌基因与大肠癌诊断、治疗及预后 |
| 3 结论 |
| 背景资料 |
| 同行评议者 |
| 研发前沿 |
| 应用要点 |
| 名词解释 |
| 同行评价 |
（10）某地区结直肠癌患者K-Ras基因突变检测结果分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 检测方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 40例结直肠癌中发生突变的的百分率 见表1。 |
| 2.2 14例结直肠癌患者K-Ras基因各个位点的突变率 见表2。 |
| 2.3 40例结肠癌患者K-Ras基因突变与年龄的关系 见表3。 |
| 2.4 40例结肠癌患者中K-Ras基因突变与性别的关系 见表4。 |
| 3 讨 论 |
四、中国人大肠癌K-ras基因突变的研究（论文参考文献）
- [1]KRAS基因第12、13位密码子突变型大肠癌患者的临床病理特征、靶向治疗疗效及生存分析[D]. 赵恒飞. 吉林大学, 2014(03)
- [2]大肠息肉EGFR、KRAS蛋白表达的临床意义[D]. 刘淑娟. 大连医科大学, 2014(01)
- [3]广西地区结直肠癌患者K-ras基因突变分析[D]. 刘佳. 广西医科大学, 2014(11)
- [4]大肠癌组织中K-ras基因突变的检测[J]. 高颖,昌红,沈兵,石峰,张建英. 诊断病理学杂志, 2013(10)
- [5]应用ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测[J]. 高颖,昌红,沈兵,石峰,张建英. 中国医药导报, 2013(14)
- [6]hARD1过表达对人大肠腺癌细胞株增殖变化的研究[D]. 曹淑洋. 昆明医科大学, 2013(02)
- [7]高分辨率熔解曲线分析检测大肠肿瘤粪便DNA突变性能评价[D]. 李丙生. 南方医科大学, 2012(04)
- [8]PKC-a、K-Ras蛋白在结直肠癌中的表达及意义[D]. 宋芳. 辽宁医学院, 2012(04)
- [9]大肠癌与抑癌基因相关性的研究现状[J]. 项芳芳,毛高平. 世界华人消化杂志, 2012(05)
- [10]某地区结直肠癌患者K-Ras基因突变检测结果分析[J]. 杨蔚蔚,张玲,陈慧娟,程俊峰,胡春明. 国际检验医学杂志, 2011(19)