一、小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选（论文文献综述）
李梦静[1]（2021）在《基于CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略制备FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪》文中进行了进一步梳理卵泡抑素（Follistatin,FST）作为肌生长抑制素（myostatin,MSTN）的拮抗剂,是骨骼肌发育的重要调节因子。成熟的FST蛋白由N-末端区,C-末端区以及3个保守结构域（FSⅠ、FSⅡ和FSⅢ）构成。每个结构域均有不同的配体结合活性,FST的N-末端和FSⅠ结构域是与MSTN结合的最小区域。相比于FSⅡ结构域和FSⅢ结构域,FSⅠ结构域与MSTN的结合能力更强,删除FSⅡ结构域或者增加FSⅠ结构域可显着增强对MSTN的结合能力。在骨骼肌特异性启动子的调控下,过表达FSⅠ-Ⅰ（两个FSⅠ结构域串联）的转基因小鼠表现出骨骼肌质量和强度增加,将FSⅠ-Ⅰ转基因小鼠与Duchenne肌营养不良模型mdx小鼠杂交,mdx/FSⅠ-Ⅰ小鼠的骨骼肌重量增大且肌肉力量得到恢复。因此,将FSⅠ过表达在肌肉组织是治疗肌营养不良症的一种潜在策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术以其高效的基因敲除能力已经广泛应用于各领域,然而其介导的同源重组仍然低效,限制了精确的基因组插入修饰。研究表明,CRISPR/Cas9介导的同源性末端连接（HMEJ）策略相较于CRISPR/Cas9介导的同源重组（HDR）更高效,可以在基因组中实现精确的单碱基突变、基因敲除和基因插入。与传统的HDR同源修复模板相比,HMEJ同源修复模板还包含了两侧同源臂外端的sgRNA靶点。本研究旨在利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略,将FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ片段（编码信号肽、N-末端以及三个FSⅠ结构域的基因序列）定位整合至猪MSTN基因终止密码子前,利用猪MSTN内源性启动子的启动FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因表达,两个基因之间用P2A连接,在P2A的自剪切作用下使得两个蛋白能够同时表达,且表达量一致,同时不影响各自的活性。本研究主要包括三方面内容:1)通过优化电转染系统,提高了Cas9/sgRNA表达载体在猪胎儿成纤维细胞（PFFs）和小鼠成肌细胞中的转染效率,并筛选出了猪β-Actin基因位点、鼠β-Actin基因位点以及鼠MSTN位点的有效sgRNA序列。2)构建了针对3个基因位点的HMEJ以及HDR同源打靶载体,并比较了CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略与HDR策略在3个基因位点的敲入效率。结果表明,HMEJ在猪Rosa26基因座和猪β-Actin基因座的敲入效率（20.83%±0.7881%和15.40%±0.3606%）显着高于在PFFs中HDR的敲入效率（7.69%±0.3331%和4.98%±0.2961%）;HMEJ在鼠β-Actin基因座的敲入效率显着高于HDR的敲入效率（13.30%±0.1856%VS 5.83%±0.1417%）。这表明CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略在猪胎儿成纤维细胞和小鼠成肌细胞中产生的定点整合效率均高于CRISPR/Cas9介导的HDR策略。3)利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略和SCNT技术,成功制备了FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪。在敲入猪体内,无筛选标记基因、无外源性启动子、无脱靶效应、无随机插入情况发生,且FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因能够稳定遗传给F1代。重要的是,FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因敲入猪表现出后躯的肌肉肥大以及肌内边界和皮肤下可见的沟槽。H&E染色显示,FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因敲入猪相较于同窝野生型猪,其背腰最长肌肌和腓肠肌肌纤维面积均显着增大。此外,相比于野生型猪,FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因敲入猪体内Smad信号通路以及Erk通路被抑制,而PI3k/AKT通路则被活化。肌源性调节因子MyoD、Myf5和MyoG在FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因敲入猪中转录表达水平上调,而MRF4转录表达水平下调。这些结果均表明FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ基因通过抑制MSTN相关通路以及调节肌源性调节因子的表达进而介导骨骼肌的肌肉肥大。总之,CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略极大地提高了外源基因在PFFs中的敲入效率,有望成为制备基因修饰猪的有力工具;猪因其解剖和生理特性与人类高度相似,被认为是研究人类疾病的良好动物模型,FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪体内骨骼肌质量显着增加,有望成为人类肌营养不良的治疗模型。
华荣茂[2]（2021）在《体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建》文中提出促卵泡激素（FSH）是一种糖蛋白类激素,它是由FSHα亚基和FSHβ亚基通过非共价键组成的异源二聚体蛋白。解离分开的FSHα亚基和FSHβ亚基都不具备生物学功能,只有两个亚基正确的组装在一起才具备生物学功能。在女性体内,FSH的主要作用是刺激卵泡的发育、排卵和子宫内膜的生长。在男性体内,FSH的主要作用是刺激精子的产生和次级精母细胞的发育,并通过与促黄体生成素（LH）及雄激素的协同作用来刺激精子发育成熟。在临床上,FSH主要用于试管婴儿的制备以及不孕不育的治疗。目前上市的FSH产品主要有尿源FSH（uh FSH）和基因工程重组FSH（rh FSH）。尿源FSH来源不均一、纯化工艺较复杂,并且存在其他蛋白的残留,生物活性也不如rh FSH。rh FSH来源均一、生物活性好,且便于提取。目前上市的rh FSH产品主要由哺乳动物细胞生产,如商业化的rh FSH产品Puregon和Gonal-F,它们都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞分泌的,然而细胞制备的rh FSH蛋白产量相对较低且价格昂贵。随着转基因技术的发展,利用动物乳腺生物反应器来制备外源重组蛋白是一种富有前景的方法。动物乳腺生物反应器制备的外源蛋白有完整的翻译后修饰,且它们和天然的蛋白结构相似,最重要的是产量高。但是,国内外未见利用转基因大动物乳腺生物反应器来制备rh FSH蛋白药物的研究报导,主要原因是很多研究发现过量的具备生物活性的FSH积累在动物乳腺内会引发动物疾病乃至肿瘤,这预示着利用大动物乳腺制备FSH会对动物造成潜在的不良影响。因此如何实现利用大动物乳腺制备出rh FSH蛋白,同时又能避免因为有生物活性的FSH积累可能导致的转基因动物患肿瘤的风险,这仍需进一步研究和探索。本研究围绕上述问题进行了五个方面的研究工作,并获得了如下结果。（1）人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达通过构建p IRES-Hyg3-FSHα及p IRES-Neo-FSHβ/His真核表达载体,在CHO细胞中分别表达人FSHα、FSHβ亚基基因,获得了能够稳定表达人FSHα、FSHβ亚基蛋白的细胞株CHO-FSHα以及CHO-FSHβ。利用p Ad-FSHα及p Ad-FSHβ/His腺病毒表达载体在HEK 293A细胞中包装获得包含FSHα、FSHβ基因的重组腺病毒Ad-FSHα、Ad-FSHβ。通过腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞、羊乳腺上皮细胞（GMECs）以及羊乳腺中暂态表达,结果显示,在牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中均能成功制备FSHα、FSHβ亚基蛋白,FSHα、FSHβ亚基蛋白经过PNGase F酶切分析发现它们都具备N端的糖基化修饰。（2）人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白经过纯化后分别以不同的浓度在4℃按照1:1的摩尔比进行体外重组装,His tag pull-down试验表明CHO细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白能够在体外组装成一定的蛋白结构。ELISA结果显示,随着FSHα、FSHβ亚基蛋白浓度的升高,两个亚基蛋白的体外重组装效率也越高。利用建立的亚基蛋白体外重组装方法对牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外重组装,结果发现牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白都能够在体外进行重新组装,进一步证明了本研究建立的FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的有效性。（3）体外重组装rh FSH生物活性恢复技术及生物活性研究通过对FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装后体外稳定性环境条件（温度、浓度、p H值）进一步的优化,发现体外重组rh FSH在4℃、p H 7.4以及高浓度下具备更好的稳定性。对CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺表达的体外重组装rh FSH生物活性进行分析,结果表明,在4℃、p H 7.4条件下体外重组装rh FSH能够促使表达在HEK 293/SNAP-FSHR细胞膜上的FSHR受体内吞,同时显着刺激细胞产生环磷酸腺苷（c AMP）（P<0.01）。另外,一定剂量（6 pmol,8×）的体外重组装rh FSH能够显着促进大鼠卵巢增重（P<0.01）,并刺激大鼠卵泡成熟以及子宫内膜的生长。同时,10 pmol的体外重组装能够显着增加小鼠的排卵数（P<0.01）,其效果和Gonal-F相当。以上结果表明,本研究成功建立了体外重组装rh FSH生物活性恢复技术,CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺制备的重组装rh FSH在体外重新恢复了生物活性。（4）基于CRISPR/Cas9技术在山羊β-乳球蛋白基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立基于CRISPR/Cas9技术构建了针对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座第二外显子区域定点整合FSHα和FSHβ基因的2个基因打靶载体p Cas9-sg1、p Cas9-sg2和含目的基因的Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His,并利用GMECs细胞筛选出了具备打靶活性的p Cas9-sg2载体。将Donor载体p GHA-FSHα、p GHA-FSHβ/His分别与p Cas9-sg2共转染GMECs细胞后,筛选出2株稳定表达FSHα-G、FSHβ-G蛋白的GMECs阳性克隆细胞株,经过糖基化和唾液酸化分析发现GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G具备N端糖基化修饰以及唾液酸化。将GMECs细胞表达的FSHα-G、FSHβ-G亚基蛋白体外重组装成rh FSH-G,利用体内、体外生物活性试验进一步检测重组装rh FSH-G蛋白的生物学活性,结果表明rh FSH-G蛋白同样能够促使其受体FSHR内吞,并且刺激细胞产生c AMP。注射一定剂量的重组装rh FSH-G能够明显的促进小鼠排卵、大鼠卵巢增重、卵泡成熟以及子宫内膜的生长,并且呈现剂量依赖性。另外,基于建立的CRISPR/Cas9体系,构建了转FSHα和FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞,筛选出的两株阳性克隆细胞株中分别含有FSHα和FSHβ基因的整合。综上所述,本研究基于CRISPR/Cas9技术建立了有效的基因打靶体系,并利用该体系获得了转人FSHα和FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞,为将来转基因羊的制备奠定了研究基础。（5）转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究将构建的pBC1-FSHα和p BC1-FSHβ/His乳腺特异性表达载体显微注射到小鼠受精卵中制备转基因小鼠,经过PCR鉴定,分别制备得到1只转FSHα基因的阳性母鼠和2只转FSHβ基因的阳性母鼠,通过Western blotting和ELISA分析转基因小鼠乳汁中目的蛋白的表达,结果显示获得的转基因小鼠乳汁中含有FSHα和FSHβ目的蛋白的表达,免疫组化分析结果进一步证实了FSHα、FSHβ目的蛋白表达在转基因母鼠乳腺腺泡内壁。利用建立的亚基蛋白体外组装技术和体外重组装rh FSH恢复技术将转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白进行体外组装和组装后生物活性鉴定,结果表明,转基因小鼠乳腺表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白在体外组装成了具备生物活性的重组装rh FSH。对转基因小鼠乳腺和卵巢进行组织形态学分析发现,转FSHα及FSHβ基因小鼠的乳腺和卵巢组织形态与野生型小鼠卵巢形态无明显差异。总之,本研究成功制备了乳腺表达FSHα、FSHβ蛋白的转基因小鼠,更重要的是从转基因动物层面初步证明了转基因小鼠乳腺和卵巢组织未受到转基因带来的影响。综上所述,本研究创新性的建立了FSHα、FSHβ亚基蛋白的体外重组装方法。另外,通过建立重组装rh FSH体外生物活性恢复技术,将CHO细胞、牛乳腺上皮细胞、GMECs以及羊乳腺中制备的体外重组装rh FSH生物活性进行了恢复。利用CRISPR/Cas9技术针对山羊BLG基因座构建了定点整合FSHα、FSHβ目的基因的转基因体系,并获取了转FSHα、FSHβ目的基因的羊胎儿成纤维细胞。最后,通过制备的转FSHα、FSHβ基因小鼠模型进一步验证了FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装技术的有效性,初步证实了转FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及卵巢组织未明显受到转基因过程带来的影响。总之,本研究为将来通过转基因大动物乳腺生物反应器生产体外重组装rh FSH蛋白奠定了基础。
冯佩[3]（2021）在《利用CRISPR/Cas9和attP串联序列介导山羊ROSA26位点目的基因多拷贝整合的探究》文中进行了进一步梳理利用基因编辑技术可以实现物种自身缺陷基因的去除以及外源基因的稳定整合和特异性表达。将这一技术利用于转基因动物的制备,不仅对于动物改良、动物乳腺生物反应器奠定了一定的基础,同时对于各种疾病研究、疾病模型的建立也具有重要意义。在基因编辑技术中CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前应用最为广泛的技术,它使外源基因打靶省时省力,并且使基因编辑成本大大降低,但是CRISPR/Cas9技术实现外源基因多拷贝整合仍然存在技术难点。而Phi C31整合酶自身可介导特定的att位点实现外源基因不可逆插入,并且不仅限于单拷贝整合。将CRISPR/Cas9技术为代表的基因编辑技术与Phi C31整合酶结合起来为外源基因的多拷贝整合提供了新的思路。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将3×att P、6×att P序列和9×att P序列整合到山羊ROSA26基因座,通过药物筛选及Junction PCR鉴定获得相应的阳性克隆细胞并对其功能进行研究。主要结果获得如下:针对ROSA26基因座设计sg RNA,获得体外切割效率高的打靶位点。成功构建带有att P序列的供体载体ROSA26-PURO-3×att P、ROSA26-PURO-6×att P和ROSA26-PURO-9×att P。共转染不同的供体载体和Cas9真核打靶载体至奶山羊成纤维细胞中,用嘌呤霉素筛选获得att P稳定整合的阳性克隆,利用Junction PCR鉴定获得精准整合的阳性单克隆细胞。构建att B-Neo-m Cherry-EF1α供体载体与p CMVInt-Phic31表达载体对整合att P系列的阳性克隆细胞进行二次电转。Edu检测att P稳定整合阳性单克隆和F3奶山羊成纤维细胞,对比表明筛选出克隆细胞增殖活力较高可用于后续奶山羊体细胞核移植从而进行下一步验证。本试验虽然未获得有效的外源基因整合效率,但通过CRISPR/Cas9技术和Phi C31整合酶相结合的方法,对探究外源基因多拷贝整合提供了新的研究方向,也为乳腺生物反应器的发展、家畜基因组探究等提供了新的思路。
崔建敏[4]（2020）在《弓形虫与猪巨噬细胞的互作特征以及FASⅡ和磷酸转运在虫体生长中的生理功能》文中提出刚地弓形虫是一种顶复门原虫,其感染宿主非常广泛。研究表明弓形虫在寄生过程中,不仅能够调节宿主基因的表达,而且还可以改变自身的代谢等生物过程以适应不同的寄生环境。弓形虫与宿主的互作研究主要以模式动物小鼠为主,然而越来越多的证据表明不同宿主感染弓形虫后的病原-宿主互作机制不尽相同。猪是弓形虫的易感宿主,感染后导致母猪流产、死胎等,造成巨大的经济损失。然而目前关于猪与弓形虫互作的研究还非常有限。本研究以猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）为宿主细胞,选取弓形虫Me49虫株作为代表虫株,利用Dual RNA-seq技术进行互作转录组分析。我们的结果揭示了猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫后独特的应答反应,同时我们还发现弓形虫适应胞内寄生生活的代谢途径并对其中两个（II型脂肪酸合成与磷酸盐的吸收）在虫体生长繁殖中生理功能进行了研究,主要内容如下:（1）互作转录组数据分析对获得的高质量测序数据分析表明猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫以后虫体与宿主的转录谱均发生显着改变,猪肺泡巨噬细胞中上调基因主要与免疫应答相关,下调基因主要集中在细胞连接。对差异表达基因进行细致分析揭示了猪巨噬细胞与小鼠巨噬细胞响应弓形虫感染的差别。II型虫株可以诱导小鼠巨噬细胞上调IL-12基因转录水平,产生大量的IL-12;而猪肺泡巨噬细胞IL-12基因的转录水平在感染前、后没有发生变化,而且表达水平极低。同时,实验表明猪肺泡巨噬细胞产生NO的能力有限,NO可能不是猪巨噬细胞抵抗弓形虫感染的效应分子。此外,数据表明弓形虫对猪肺泡巨噬细胞凋亡具有抑制作用。弓形虫进入宿主细胞后上调基因的KEGG通路分析表明虫体核糖体活动增强,GO分析显示弓形虫代谢活性增强,II型脂肪酸合成途径（FASⅡ）中大多数酶在虫体进入宿主细胞后表达显着上升,多个潜在转运蛋白的表达量也显着上调,说明虫体进入宿主细胞后代谢活性明显提高,为生长复制奠定物质基础。（2）II型脂肪酸合成途径（FASⅡ）与哺乳动物宿主相比,FASⅡ是顶复门原虫特有的脂肪酸合成途径,参与其中的酶都定位于顶质体中,但它在虫体中扮演的角色不十分明确,我们的转录组学就发现FASⅡ途径相关基因的表达量在虫体进入宿主细胞后显着上调,这个结果也得到了q RT-PCR验证。本研究选取FASⅡ中的Fab D蛋白开展研究。结果表明敲除Tg Fab D基因造成弓形虫生长减慢,但不影响其入侵、逸出,更重要的是它的缺失不影响虫株的急性毒力,说明FASⅡ扮演重要但不必需的角色。（3）弓形虫磷酸盐转运蛋白功能研究对弓形虫进入宿主细胞后上调的跨膜蛋白进行分析,我们发现10个潜在的转运蛋白,其中TGGT1＿235150,与真菌中的磷酸盐转运蛋白具有同源性。进一步的利用生物信息学分析发现虫体共编码3个潜在的弓形虫磷酸盐转运蛋白TGGT1＿240210、TGGT1＿235150和TGGT1＿278990,分别命名为Pi T1、Pi T2和MPi T。进化分析显示弓形虫磷酸盐转运蛋白分别位于不同的进化分支,Pi T1和MPi T分布广泛,而Pi T2仅分布在成囊型球虫中,且跟真菌中的磷酸盐转运蛋白有一定的同源性。定位表明Pi T1和Pi T2位于弓形虫胞质膜,MPi T位于弓形虫线粒体。在RH中直接敲除Pi T1和MPi T,结果显示敲除这两个基因不影响弓形虫的生长及毒力。条件性敲低Pi T2导致弓形虫死亡,回补Pi T2恢复虫株生长。动物实验表明敲低Pi T2导致弓形虫在小鼠体内生长受阻。表明Pi T2对弓形虫在体内外的存活具有关键作用。酵母实验表明Pi T2能够有效改善磷酸盐转运缺陷菌株在低磷酸盐浓度下的生长状态,说明Pi T2具有转运磷酸盐的功能。综上所述,本研究探讨了猪肺泡巨噬细胞与弓形虫之间的互作机制,发现了猪肺泡巨噬细胞与弓形虫的独特的互作模式,丰富了弓形虫与其宿主相互作用的内容。对Fab D的研究表明FASⅡ途径在虫体中重要但不必需的功能。同时在弓形虫中鉴定出3个潜在的磷酸盐转运蛋白,发现在成囊型球虫中特异的磷酸盐转运蛋白对弓形的存活至关重要,这些结果为弓形虫药物设计等提供了重要信息。
韩静[5]（2020）在《优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率》文中认为动物乳腺生物反应器是利用转基因技术将外源基因导入动物基因组中并获得乳腺特异性表达目的蛋白转基因动物的一项技术,目前已有多种相关的医药蛋白产品获批上市,创造了巨大的经济价值,其中奶山羊由于大小合适、妊娠期短和乳汁分泌丰富的特点在乳腺生物反应器中广泛应用。但是目前制备转基因动物的技术仍不成熟,利用体细胞核移植技术获得的转基因动物怀孕率低、死亡率高以及位置效应导致的低表达等因素,都严重影响了动物乳腺生物反应器的应用和发展。基于此,选择高效的基因打靶技术和安全的打靶位点是保证目的蛋白在乳腺中高效表达以及提高转基因动物制备效率的重要因素。高效率、低成本和操作简便的CRISPR/Cas9技术是继ZFNs和TALENs之后出现的第三代基因编辑技术,已在多物种广泛应用,ROSA26基因座则是目前被认为最接近基因插入安全港定义的一个多物种均可整合外源基因的友好位点。本研究首次利用CRISPR/Cas9技术对奶山羊原代细胞的gROSA26基因座进行不同策略的基因打靶,旨在获得一种能够更高效安全制备奶山羊乳腺反应器的基因打靶系统。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞（goat mammary epithelial cell,g MECs）为试验材料,利用RACE技术获得gROSA26转录本序列,通过鉴定核心启动子区域及其启动强度确定了其启动筛选标记基因获取单克隆细胞的可能性。随后利用sgRNA设计网站CRISPOR在gROSA26的第1内含子区域筛选潜在脱靶位点最少的打靶位点,SSA双荧光检测不同位点的体外切割效率得到具有较高打靶效率和较低脱靶效率的sgRNA。进一步利用不同DSB修复机制构建HDR、HMEJ、NHEJ、MMEJ四种供体载体报告质粒,分别和Cas9打靶载体共转染至奶山羊乳腺上皮细胞筛选内源启动子启动筛选标记基因表达的阳性克隆,确认HMEJ策略下的打靶效率最高。最后构建gROSA26内源启动筛选标记以及乳腺特异性启动人溶菌酶的HMEJ供体载体,筛选人溶菌酶基因在gROSA26位点定点整合的阳性克隆,从而获得了一种外源基因整合效率更高并且表达更稳定的CRISPR/Cas9基因打靶系统,也为后续利用奶山羊乳腺生物反应器生产医药蛋白的规模化应用奠定了基础。
赵秀玲[6]（2020）在《应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究》文中研究指明性别控制技术对于加快优良母畜的繁殖速度,提高限性性状畜牧业的生产效益有重要意义,而早期胚胎性别鉴定是进行性别控制的一种重要方法。在XY型性别决定的哺乳动物中,Y染色体决定雄性性别,如果可以标记Y染色体,区分雌雄性别就会变得轻而易举。本研究的目的是通过基因编辑的手段进行Y染色体标记,建立一种无损伤快速鉴定哺乳动物早期胚胎性别的方法,为哺乳动物性别控制的研究提供一种新的思路。基于此,本研究进行了如下尝试:首先对CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率进行优化;基于优化的条件以小鼠为研究模型,采用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组技术获得Y染色体上插入e GFP基因的转基因雄性小鼠系,e GFP基因就可以随着Y染色体的分离传递到雄性后代的基因组中,绿色荧光蛋白（GFP）的表达可以直观地指示早期胚胎和后代的性别。为了拓展该方法在农业生产上的应用,本研究通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR对巴马猪的肾脏成纤维（PKF）和水牛胎儿成纤维（BFF）细胞进行基因编辑,分别获得Y染色体上整合e GFP基因的成纤维细胞系,通过体细胞克隆成功生产出基因型为Y-Chr-e GFP的转基因克隆胚胎。主要开展的工作和研究结果简述如下:1.CRISPR/Cas9系统介导的外源基因整合效率的优化为了提高HDR的效率,本章针对Tubb3和Actb两个靶位点分别构建了三种不同长度的模板载体,然后在小鼠细胞系中进行优化,结果发现模板载体的同源臂越长,同源重组效率越高。本研究也比较了BFF细胞中同源臂长度分别为300 bp,800 bp和1200 bp的模板载体的HDR效率,结果表明同源臂长度为1200 bp的模板载体的HDR效率更高。通过在BFF细胞中添加P53蛋白的小分子抑制剂Pifithrin-μ（PFT-μ）发现,PFT-μ可以显着提高BFF细胞Actb位点的HDR效率。另外,本研究对比HMEJ（homology mediated end joining,HMEJ）和HDR两种不同的外源基因整合机制介导的基因敲入效率发现,HMEJ介导的外源基因整合效率高于HDR,但差异并不显着（P>0.05）。2.应用CRISPR/Cas9系统介导的Y染色体标记进行小鼠植入前胚胎性别鉴定的研究本章以小鼠为研究对象,通过受精卵胞质注射和胚胎移植获得小鼠Y染色体Uty和Ddx3y基因间隔区导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因雄性小鼠系。将转基因雄鼠与野生型雌鼠交配,所获胚胎中表达绿色荧光蛋白的均为雄性,反之为雌性。将所有胚胎单个收集,巢式PCR确定胚胎性别发现,直观地通过荧光鉴定胚胎性别与PCR鉴定的结果完全一致。另外,分别统计Y-Chr-e GFP转基因小鼠与非转基因小鼠后代的性别比例,结果并没有显着差异。3.应用CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术生产巴马猪Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的研究首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体上导入e GFP基因的Y-Chr-e GFP转基因巴马猪PKF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后对比Y-Chr-e GFP转基因PKF细胞与非转基因细胞的生长特性,结果发现转基因细胞的生长速度和细胞活性均低于非转基因细胞。最后进行体细胞核移植,成功获得了基因型为Y-Chr-e GFP巴马猪转基因克隆胚胎。4.Y-Chr-e GFP转基因水牛胎儿成纤维细胞的生长、增殖、表观遗传相关基因的表达及克隆胚胎的生产首先,本章通过CRISPR/Cas9系统介导的HDR技术制备Y染色体导入e GFP基因的BFF细胞系,并验证外源基因整合位点的准确性。然后分析细胞的生长特性,发现Y-Chr-e GFP转基因细胞的增殖速度和细胞活性均低于非转基因细胞;实时荧光定量PCR的结果显示,转基因细胞中DNA甲基化相关基因DNMT1和DNMT3a的表达无显着变化,而组蛋白去乙酰化酶基因HDAC1,HDAC2,HDAC3的表达则显着升高;最后进行体细胞核移植,结果发现Y-Chr-e GFP转基因克隆胚胎的分裂率显着低于非转基因克隆胚胎,但囊胚率并没有显着变化。总之,本研究应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记的方法成功进行了小鼠早期胚胎的性别鉴定,为哺乳动物早期胚胎性别鉴定提供了一种快速且无损伤的鉴定方法。此外,本研究也获得了Y染色体标记的猪和水牛的转基因克隆胚胎,为大动物性别控制的研究提供了新的思路与方法,同时也为体细胞克隆介导的基因修饰技术进行转基因大动物的生产奠定了重要的研究基础。
吴彩霞[7]（2020）在《基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立》文中提出猪和兔是重要的农业经济动物和生物医药用动物,对猪和兔进行高效精确的基因编辑并获得基因修饰猪和兔模型具有非常重要的意义。在农业育种方面,基因修饰猪和兔模型可以成功提高动物个体生长速度,改良生产和抗病抗逆性状等,大大加速优良新品种的培育进程。在生物医药领域方面,由于物种差异性的存在,仅利用小鼠,大鼠等小型啮齿类动物模型几乎不能完全模拟人类的各种复杂的生命动态过程,例如模拟人类早期胚胎发育,特定组织器官生长发育过程以及人类疾病发生发展等。猪和兔是一种理想的大动物模型,相较于灵长类大动物模型而言,猪和兔繁殖周期更短,产仔数量更多,伦理道德限制更少;与啮齿类动物相比猪和兔在解剖及生理、生化特征以及营养代谢和免疫系统等方面与人更为接近。很多研究无法直接在人体中进行,可以构建基因修饰猪和兔模型进行更广泛的实验和评估,此外,基因修饰猪和兔模型对于特定基因的功能研究,在组织或器官生长发育过程的作用等生命动态过程研究方面具有重要的研究价值。哈佛大学教授贺熹《Cell》文章证实,Tiki1在爪蟾头部生成和发育的诱导过程中起着决定性的作用,而Tiki1基因在哺乳动物系统中发挥的功能和作用机制尚未有报道。Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因而无法利用啮齿类动物模型研究Tiki1基因在哺乳动物发育过程中的作用。本实验室对1215天处于原条期到神经沟阶段的猪胚胎进行了全胚胎原位杂交,实验结果也显示Tiki1基因在胚胎前端边缘处表达,但在猪等哺乳动物的胚胎发育过程中,Tiki1是否像在爪蟾上一样,对头部的诱导起着关键性的决定作用,需要加以验证。基因敲除是研究基因功能的主要途径之一,传统的基因敲除技术是同源重组,但对于猪这种既没有成功建立能够生殖系遗传的胚胎干细胞或诱导多能干细胞,克隆效率又较低的物种来说,利用同源重组结合体细胞克隆技术获得期望的基因打靶动物是极其困难的。本实验室曾尝试利用打靶效率极低的同源重组技术获得Tiki1基因打靶猪模型但未能成功。近几年兴起的核酸酶基因编辑技术,包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具,由于其效率高,为猪和家兔等这样一些克隆效率低下、又缺少能生殖系遗传的全能性胚胎干细胞物种的基因修饰开辟了新渠道,极大地推动了基因编辑猪和兔模型的研究进展。其中ZFN制备复杂、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修饰猪和兔研究中的应用。为了探究Tiki基因在不同物种间的功能差别,本研究先后利用TALEN与CRISPR/Cas9技术构建了Tiki基因敲除猪和兔。本研究首先针对猪内源性基因Tiki1基因外显子4设计了2对TALENs质粒,并在猪孤雌胚胎水平上进行了TALENs质粒的体外活性检测,比较了我们设计的TALENs质粒注射不同浓度时打靶效率及对胚胎发育的影响。结果表明:注射浓度升高,打靶效率也相应提高,TALENs的注射浓度对体外胚胎发育的影响不明显。利用我们设计的在胚胎水平上验证有效的TALENs质粒转染猪胎儿成纤维细胞,筛选获得86个细胞克隆,经测序鉴定其中6个为阳性细胞克隆,之后利用体细胞核移植技术成功构建了4头Tiki1单等位基因打靶猪模型。本研究利用X线计算机断层扫描（CT）和核磁共振成像（MRI）等影像学技术结合病理组织切片分析及临床生理生化分析等对Tiki1单等位基因敲除猪模型进行了表型分析,未发现Tiki1单等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到物种差异及兔成本低实验周期短,本研究利用TALEN技术成功构建了Tiki1单等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1单等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。由于TALEN的打靶效率尚不够高,本研究利用TALEN技术获得的猪和兔全是Tiki1单等位基因敲除动物模型。为了一步获得Tiki1双等位基因敲除猪模型,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了8个阳性单细胞克隆株,随后本研究利用体细胞核移植技术构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,经测序鉴定成功获得了12头Tiki1双等位基因敲除猪模型。后续本研究利用动物步态足迹实验和跑步机加速和恒速跑步等行为学实验对Tiki1双等位基因敲除猪模型进行了行为学表型分析,结果表明未发现Tiki1双等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到Tiki基因包括Tiki1和Tiki2,二者之间可能存在协同或代偿机制,由于兔实验成本低周期短,而与兔相比猪实验成本高周期长,本研究优先选择兔为研究对象,利用CRISR/Cas9技术一步直接获得了Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。综上所述,本研究通过上述所得各种基因型的Tiki基因敲除猪和兔模型均未发现具有与爪蟾上类似的表型,并且相关模型猪和兔均可以健康存活并能不断繁殖传代。本研究证实了Tiki基因在爪蟾与哺乳动物如猪和兔等不同物种间功能存在差异,Tiki基因在猪和兔等哺乳动物上确实对其早期胚胎的头部发育乃至个体的生长、发育和繁殖不是一个至关重要的基因,成功地澄清了Tiki基因与猪和家兔等哺乳动物早期胚胎头部发育的关系不同于爪蟾。
李红丽[8]（2019）在《CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究》文中研究表明小儿腹泻是一种由轮状病毒导致的病毒性疾病,新生婴儿的致死率达80%,全球性危害较严重。VP6蛋白是轮状病毒的免疫原性的结构蛋白,如能在动物的乳腺中表达VP6蛋白,将有可能生产出抗轮状病毒的口服疫苗。为此,本研究拟应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,将具有免疫原性的轮状病毒结构蛋白VP6基因敲入到兔酪蛋白基因座的下游,以期利用酪蛋白的内源性基因调控系统指导外源基因VP6蛋白的表达,在兔奶中获得轮状病毒VP6重组蛋白,为应用乳腺生物反应器生产抗腹泻的口服疫苗奠定基础。研究获得如下结果:1、CRISPR/Cas9介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测参考兔酪蛋白基因组序列,设计靶向兔酪蛋白位点第6外显子区的g RNA,构建4条g RNA载体对应的RGS载体,然后转染人293T细胞验证4条g RNA的切割活性。g RNA载体转染293T细胞48小时后的绿色荧光和红色荧光检测结果及流式细胞检测结果显示,4条g RNA均具有切割活性。电转Cas9表达载体及4条g RNA质粒到兔成纤维细胞,靶位点特异性PCR扩增及扩增片段的T7E1酶切结果显示,4条g RNA在内源性靶位点均具有切割活性,4条g RNA的效率分别为:g1:37.1%,g2:42.0%,g3:60.7%,g4:62.4%。显微注射Cas9m RNA及4条sg RNA到兔受精卵胞质,验证胚胎水平4条g RNA的编辑效率,结果发现,四组胚胎发育率无显着差异（g1:72.77±1.12%,g2:70.33±0.56%,g3:73.33±1.84%,g4:73.44±0.86%vs对照组:73.25±1.03%,P>0.05）,g RNA4的编辑效率（T7E1酶切分析结果）显着高于其余3条（g4:72.76±0.32%vs g1:30.14±1.93%,g2:38.53±0.75%,g3:52.26±1.16%,P<0.05）,表明g4位点的外源基因整合效率较高。2、不同长度同源臂对外源基因定点敲入酪蛋白位点效率的影响为验证不同长度同源臂的打靶载体在体内同源重组效率,在设计200bp长度同源臂及1000 bp长度同源臂的打靶载体,通过扩增靶向兔酪蛋白g4位点两端的序列,分别获得200 bp与1000 bp的同源臂序列,然后以p EGFP-N1为模板,扩增EGFP片段,经一步法将两端同源臂与EGFP基因克隆到双酶切的p MD18-T载体上,构建得到两组不同长度同源臂的打靶载体,再通过共转Cas9载体、g RNA4载体及两组同源打靶载体到兔成纤维细胞,验证两组载体的基因打靶效率。结果发现:两组长度打靶载体均能在内源性基因位点介导外源基因的定点整合。为验证两组打靶载体在胚胎水平的敲入效率,两组打靶载体分别与体外转录的Cas9m RNA和sg RNA4胞质注射到兔受精卵内,培养5天后收集单个囊胚进行5’J和3’J特异性检测。结果显示:1000 bp同源臂的打靶载体效率与200 bp同源臂的打靶载体差异不显着（17.25±1.60%vs 19.23±1.73%,P>0.05）,但200 bp打靶载体介导的阳性敲入胚胎中未能检测到完整的5’J和3’J PCR产物（多为3’J）,而1000 bp打靶载体组阳性敲入胚胎中75%的胚胎能够完整的扩增出5’J和3’J PCR产物。表明同源臂为1000 bp的打靶载体打靶效率较高。3、CRISPR/Cas9介导的VP6定点整合兔的生产与鉴定在上述工作的基础上,利用靶向兔酪蛋白的g4位点构建1000 bp同源臂的轮状病毒结构蛋白VP6基因的打靶载体,然后与Cas9和g RNA4共转兔成纤维细胞验证打靶载体的效率。PCR和测序结果显示,VP6基因整合到了酪蛋白基因座g4位点,表明构建的VP6打靶载体在细胞水平是有效的。而后,将Cas9m RNA（100 ng/μL）和Cas9蛋白（100 ng/μL）分别与sg RNA4（50 ng/μL sg RNA4）及VP6打靶载体（100 ng/μL）混合注射到兔受精卵胞质,培养5天后收集囊胚进行外源基因整合检测。结果显示:虽然Cas9m RNA组的整合效率显着高于Cas9蛋白组（20.0%±2.6%vs10.3%±3.1%,P<0.05）,但Cas9蛋白组阳性胚胎100%完整的整合,而Cas9m RNA组有37.5%未完整整合。将来自Cas9m RNA组的91枚胚胎移植到12只受体兔,8只怀孕,产仔20只;将来自Cas9蛋白组的82枚胚胎移植到11只受体兔,6只怀孕,产仔15只。Cas9m RNA移植组获得两只VP6整合仔兔,但两只均未能完整扩增5’J和3’J产物（F0-A3:3’J;F0-A12:5’J）,而Cas9蛋白组成功获得一只VP6定点完整整合的基因编辑兔。上述结果表明,g RNA4的酪蛋白位点靶向切割效率较高;打靶载体的同源臂长度对基因打靶效率有影响,1000 bp的同源臂优于200 bp的同源臂;Cas9蛋白的同源重组效率优于Cas9m RNA,注射Cas9蛋白、sg RNA4和VP6-Donor质粒到兔受精卵胞质,可以获得兔酪蛋白定点敲入VP6的家兔。
康健[9]（2019）在《定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制》文中指出肌肉生长抑素（mystatin,MSTN）作为骨骼肌生长发育的负调控因子,其表达能够显着抑制肌肉的生长发育。MSTN基因在哺乳动物进化过程中高度保守,其功能缺失会引起动物体内肌肉过度生长,导致动物出现双肌（double muscle,DBM）表型。自然突变的MSTN基因已经在牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、兔等动物中发现,通过基因编辑技术同样在许多物种中实现了MSTN基因的人工诱变。在现代家畜育种中,利用人工核酸酶技术介导MSTN基因突变产生双肌表型,可以提高家畜胴体产肉率。然而,具有“双肌”表型的动物由于体内肌肉异常增加,导致脂肪含量相对减少,直接影响肉的品质。脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipose fatty acid-binding protein,FABP4）作为一种脂质蛋白伴侣,对长链脂肪酸具有高亲和力,促进其在细胞内的溶解和转运。研究发现,FABP4基因参与动物体内脂肪沉积,与皮下脂肪含量以及肌内脂肪（intermuscular fat,IMF）含量密切相关。与国外优质肉牛品种相比,我国本土肉牛品种产肉量较低,牛肉品质相对较差。为了解决这一问题,本研究通过基因编辑技术将与IMF沉积有关的FABP4基因定点整合到鲁西黄牛MSTN基因座,同时引入G938A点突变,借助内源性启动子实现FABP4基因在骨骼肌组织中的特异性表达,在提高胴体产肉量的同时增加体内IMF含量。本研究主要内容和结果如下:1.在小鼠MSTN基因终止密码子TGA位点附近筛选得到1个CRISPR/Cas9系统介导的sgRNA打靶位点,并构建相应的同源重组打靶载体,通过原核显微注射技术获得F0代阳性转基因小鼠。对转基因小鼠进行扩繁,通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测,鉴定出可用于后续表型研究的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的杂合子与纯合子转基因小鼠模型。2.分别取同日龄野生型小鼠、杂合子以及纯合子转基因小鼠进行解剖,全身主要部位肌肉形态对比发现,纯合子转基因小鼠具有明显的双肌表型。对主要脏器以及骨骼肌进行组织学检测,结果显示纯合子转基因小鼠双肌表型是由于肌纤维横截面积增大引起的。对骨骼肌组织中FABP4蛋白与甘油三酯含量进行检测,结果显示FABP4蛋白含量显着增加促进肌肉中甘油三酯的沉积。3.在鲁西黄牛MSTN基因座找到一个能够融合表达外源插入基因的区域,借助CHOPCHOP和Cas-OFFinder在线分析软件对该区域内所有sgRNA靶点进行了潜在脱靶位点统计与分析,初步筛选得到脱靶位点相对较少的4个候选sgRNA靶点。构建相应的CRISPR/Cas9切割载体,并在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中进行切割活性检测与脱靶效应检测,最终确定sgRNA1靶点具有相对较高的切割效率,同时对应的20个潜在脱靶位点中均未发生脱靶效应。4.针对sgRNA1靶点,构建了定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体,并与相应的CRISPR/Cas9切割载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,应用嘌呤霉素进行克隆细胞筛选。通过Junction PCR、Long-range PCR以及Southern blot检测鉴定出6株双等位基因打靶的阳性单克隆细胞。5.以上述阳性单克隆细胞作为核移植供体细胞,利用体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎,对随机挑选的转基因克隆胚胎进行PCR检测,排除供核细胞中混有非基因打靶细胞的可能。对发育形态良好的克隆囊胚进行胚胎移植,截至目前共计19头受体牛维持妊娠。综上所述,本研究通过构建定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠模型,验证MSTN基因纯合点突变能够引起动物产生双肌表型,FABP4基因特异性表达能够增加骨骼肌组织中的甘油三酯含量。同时,应用CRISPR/Cas9系统进行定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因肉牛的生产,为我国高产优质肉牛新品种的培育提供重要育种材料。
李昊[10]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
二、小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略制备FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪（论文提纲范文）
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| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因编辑技术的发展和应用 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统的简介和发展 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 系统的应用 |
| 第2章 MSTN研究进展 |
| 2.1 MSTN的结构与表达 |
| 2.2 MSTN与骨骼肌发育 |
| 第3章 FST研究进展 |
| 3.1 FST的结构与表达 |
| 3.2 FST的生物学作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 转染系统的优化以及CRISPR/Cas9表达质粒的构建和效率验证 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 同源打靶载体的构建及定点整合效率的优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
（2）体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FSH的概述 |
| 1.2 FSH的作用机理及应用 |
| 1.3 FSH产品的发展与应用 |
| 1.4 基因工程重组FSH的研究进展 |
| 1.5 蛋白的自组装 |
| 1.5.1 蛋白自组装现象 |
| 1.5.2 蛋白自组装的机制及影响因素 |
| 1.6 乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.6.1 乳腺生物反应器简介 |
| 1.6.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.6.3 乳腺生物反应器的应用 |
| 1.7 基因编辑技术在乳腺生物反应器应用 |
| 1.7.1 基因编辑技术简介 |
| 1.7.2 基因编辑技术在动物乳腺生物反应器中的应用 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 第二章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.2 FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.3.4 数据统计和分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FSHα、FSHβ基因在CHO工程细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.2 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在牛乳腺上皮细胞中表达及鉴定 |
| 2.4.3 腺病毒介导FSHα、FSHβ基因在羊乳腺及GMECs中表达及鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.3.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装 |
| 3.3.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.3.4 数据统计和分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装方法的建立 |
| 3.4.2 牛乳腺上皮细胞表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.4.3 羊乳腺及GMECs表达的人FSHα、FSHβ亚基蛋白体外重组装分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术及生物活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 体外重组装rhFSH体外稳定性恢复技术研究 |
| 4.3.2 CHO细胞表达的体外重组装人rhFSH-C生物活性分析 |
| 4.3.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装人rhFSH-B生物活性分析 |
| 4.3.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 4.3.5 数据统计和分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 体外重组装rhFSH生物活性恢复技术研究 |
| 4.4.2 CHO细胞表达的重组装rhFSH-C生物活性分析结果 |
| 4.4.3 牛乳腺上皮细胞表达的体外重组装rhFSH-B生物活性分析结果 |
| 4.4.4 羊乳腺及GMECs表达的体外重组装rhFSH生物活性分析结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9 技术在山羊BLG基因座定点整合人FSHα、FSHβ基因打靶体系的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 GMECs的培养 |
| 5.3.2 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.3.3 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/Cas9介导人FSHα、FSHβ基因在山羊BLG基因座定点整合及蛋白表达 |
| 5.3.6 GMECs细胞表达的FSHα、FSHβ亚基蛋白糖基化及唾液酸化分析 |
| 5.3.7 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.3.8 基于CRSIPR/Cas9构建转FSHα、FSHβ基因的羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.3.9 数据统计和分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 pCas9-sgRNA敲除载体的构建及基因编辑活性分析 |
| 5.4.2 pGHA-FSHα基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.3 pGHA-FSHβ/His基因打靶Donor载体的构建及鉴定 |
| 5.4.4 基因打靶载体定点整合目的基因效率及表达功能分析 |
| 5.4.5 GMECs特异性表达的体外重组装rhFSH生物功能分析 |
| 5.4.6 基于CRISPR/Cas9技术构建转FSHα及FSHβ基因羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及其功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试验材料 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.3.2 试验鼠的准备及显微注射 |
| 6.3.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.3.4 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白鉴定 |
| 6.3.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.3.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.3.7 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.3.8 数据统计和分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 乳腺特异性表达人FSHα、FSHβ基因载体的构建及鉴定 |
| 6.4.2 转人FSHα、FSHβ基因小鼠的制备及鉴定 |
| 6.4.3 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺表达目的蛋白检测 |
| 6.4.4 RT-PCR检测转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺及其他组织中目的基因的表达 |
| 6.4.5 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺免疫组化分析 |
| 6.4.6 转人FSHα、FSHβ基因小鼠乳腺和卵巢组织形态学分析 |
| 6.4.7 转人FSHα、FSHβ基因小鼠表达的亚基蛋白体外重组装分析 |
| 6.4.8 转基因小鼠乳腺表达的体外重组装rhFSH生物活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）利用CRISPR/Cas9和attP串联序列介导山羊ROSA26位点目的基因多拷贝整合的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 基因编辑技术及位点特异性重组酶概述 |
| 1.1 基因编辑技术概述 |
| 1.1.1 常用基因编辑核酸酶 |
| 1.1.2 常见提高基因打靶效率方法 |
| 1.2 位点特异性重组酶概述 |
| 1.2.1 常见位点特异性重组酶 |
| 1.2.2 PhiC31 整合酶及其应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 靶向山羊ROSA26 基因座的基因打靶位点筛选及供体载体构建 |
| 2.1 材料及试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 奶山羊耳缘成纤维细胞分离及培养 |
| 2.2.2 免疫荧光鉴定成纤维细胞纯度 |
| 2.2.3 ROSA26 高效打靶位点筛选 |
| 2.2.4 同尾酶原理扩增attP序列 |
| 2.2.5 attP供体载体构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 奶山羊耳缘成纤维细胞分离、培养及鉴定 |
| 2.3.2 打靶位点效率检测 |
| 2.3.3 同尾酶原理扩增attP序列 |
| 2.2.4 attP-3/-6/-9 供体载体构建 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 阳性克隆细胞筛选及外源基因多拷贝整合检测 |
| 3.1 材料及试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 attP系列供体载体阳性克隆筛选 |
| 3.2.2 attB供体载体构建 |
| 3.2.3 Phic31 整合酶介导二次电转阳性克隆筛选 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 attP系列供体载体阳性克隆筛选 |
| 3.3.2 attB供体载体构建 |
| 3.3.3 Phic31 整合酶介导二次电转阳性克隆筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）弓形虫与猪巨噬细胞的互作特征以及FASⅡ和磷酸转运在虫体生长中的生理功能（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 弓形虫生活史 |
| 1.2 弓形虫的危害 |
| 1.3 抗弓形虫感染的免疫应答研究 |
| 1.4 弓形虫对宿主细胞的入侵与修饰 |
| 1.5 弓形虫免疫逃避机制 |
| 1.6 弓形虫在宿主细胞内的营养物质合成与转运研究 |
| 1.6.1 弓形虫脂肪酸代谢研究 |
| 1.6.2 弓形虫转运蛋白研究 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 虫株、细胞和菌株 |
| 3.1.3 载体与质粒 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂盒 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞传代培养 |
| 3.3.2 细胞及虫株的冻存及复苏 |
| 3.3.3 互作转录组测序样品的收集 |
| 3.3.4 转录组样品文库构建及测序 |
| 3.3.5 测序数据分析 |
| 3.3.6 基因组DNA提取方法 |
| 3.3.7 RNA提取及反转录 |
| 3.3.8 荧光定量q RT-PCR分析转录组差异基因 |
| 3.3.9 连接产物的转化 |
| 3.3.10 质粒提取 |
| 3.3.11 切胶回收目的DNA片段 |
| 3.3.12 CRISPR/Cas9 质粒的构建 |
| 3.3.13 具有同源臂重组质粒的构建 |
| 3.3.14 弓形虫基因敲除虫株的构建 |
| 3.3.15 间接免疫荧光 |
| 3.3.16 弓形虫复制实验 |
| 3.3.17 空斑实验 |
| 3.3.18 弓形虫入侵检测 |
| 3.3.19 弓形虫逸出检测 |
| 3.3.20 CCCP抑制剂对弓形虫体外生长影响的检测 |
| 3.3.21 小鼠毒力实验 |
| 3.3.22 荷虫量检测 |
| 3.3.23 酵母试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 互作转录组测序及分析 |
| 4.1.1 获得高质量的RNA样品 |
| 4.1.2 获得高质量的测序数据 |
| 4.1.3 测序序列具有较高的比对率 |
| 4.1.4 生物学重复样品间具有较高的相关性 |
| 4.1.5 差异基因分析及验证 |
| 4.1.6 猪肺泡巨噬细胞感染弓形虫前后差异表达基因功能分析 |
| 4.1.7 弓形虫适应细胞内寄生的潜在机制分析 |
| 4.2 Tg Fab D基因的敲除及功能研究 |
| 4.2.1 FabD在弓形虫进入宿主细胞后表达升高 |
| 4.2.2 Tg Fab D敲除虫株的构建 |
| 4.2.3 ΔFabD表型分析 |
| 4.3 弓形虫磷酸盐转运蛋白功能研究 |
| 4.3.1 弓形虫编码3个潜在的磷酸盐转运蛋白 |
| 4.3.2 弓形虫磷酸盐转运蛋白进化分析揭示不同的保守性 |
| 4.3.3 弓形虫磷酸盐转运蛋白生物信息学分析 |
| 4.3.4 弓形虫磷酸盐转运蛋白的定位研究 |
| 4.3.5 弓形虫磷酸盐转运蛋白基因的敲除/敲低 |
| 4.3.6 弓形虫磷酸盐转运蛋白基因敲除/敲低虫株表型分析 |
| 4.3.7 获得PiT2回补虫株 |
| 4.3.8 PiT2回补虫株表型实验 |
| 4.3.9 CCCP抑制弓形虫在体外的生长 |
| 4.3.10 利用重组酵母实验验证弓形虫磷酸盐转运蛋白的活性 |
| 5 讨论 |
| 5.1 转录组学在宿主-病原互作中的应用研究 |
| 5.2 猪肺泡巨噬细胞与弓形虫互作转录组研究 |
| 5.2.1 样品制备与测序 |
| 5.2.2 互作转录组数据分析揭示猪肺泡巨噬细胞独特的应答反应 |
| 5.2.3 弓形虫进入宿主细胞前后差异表达基因功能分析 |
| 5.3 FASⅡ脂肪酸合成途径在弓形虫中的生理功能 |
| 5.4 弓形虫磷酸盐转运蛋白对弓形虫在体内外生长具有关键作用 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A |
| 作者简介 |
（5）优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 基因安全港与基因打靶制备羊乳腺生物反应器 |
| 1.1 基因安全港概述 |
| 1.1.1 常用的基因安全座 |
| 1.1.2 rosa26基因座的研究进展 |
| 1.2 基因打靶制备羊乳腺生物反应器进展 |
| 1.2.1 制备转基因动物的发展 |
| 1.2.2 高效基因打靶技术的发展 |
| 1.2.3 羊乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊ROSA26基因座及其核心启动子鉴定 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 奶山羊乳腺上皮细胞原代分离和培养 |
| 2.2.2 免疫荧光染色鉴定乳腺上皮细胞纯度 |
| 2.2.3 奶山羊ROSA26基因座鉴定 |
| 2.2.4 gROSA26核心启动子鉴定 |
| 2.2.5 高效打靶位点筛选 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞原代分离、培养和鉴定 |
| 2.3.2 奶山羊ROSA26基因座鉴定 |
| 2.3.3 gROSA26核心启动子鉴定 |
| 2.3.4 不同打靶位点效率检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同打靶策略下稳定整合ROSA26位点的阳性克隆筛选 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 不同修复策略下报告载体构建 |
| 3.2.2 不同修复策略下打靶效率对比 |
| 3.2.3 人溶菌酶稳定整合ROSA26基因座的阳性克隆筛选 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同修复策略下报告载体构建 |
| 3.3.2 不同修复策略下打靶效率分析 |
| 3.3.3 人溶菌酶基因稳定整合细胞克隆筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 性别决定理论的发展 |
| 1.2 性别控制技术的发展 |
| 1.2.1 X、Y精子的分离 |
| 1.2.2 早期胚胎性别鉴定 |
| 1.3 绿色荧光蛋白示踪的应用 |
| 1.4 基因编辑相关靶向核酸酶的兴起和应用 |
| 1.4.1 ZFNs的发展和应用 |
| 1.4.2 TALENs的发展和应用 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的发展和应用 |
| 1.5 转基因动物的生产 |
| 1.5.1 转基因动物的构建方法 |
| 1.5.2 体细胞克隆的发展历史和研究现状 |
| 1.5.3 应用体细胞克隆构建基因修饰动物 |
| 1.6 P53蛋白在维持细胞基因组完整性中的作用 |
| 1.6.1 P53蛋白的概述 |
| 1.6.2 P53在维持细胞基因组完整性中的作用 |
| 1.6.3 Pifithrin-μ的作用机制 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 系统介导的外源基因整合效率的优化 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 相关载体的构建 |
| 2.2.2 mES细胞的培养 |
| 2.2.3 N2A、NIH/3T3和BFF细胞的培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 水牛胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2.6 水牛胎儿成纤维细胞电转参数的优化 |
| 2.2.7 应用RGS报告载体筛选sg RNA |
| 2.2.8 同源臂长度对HDR效率的影响 |
| 2.2.9 HDR和 HMEJ介导的外源基因整合效率的比较 |
| 2.2.10 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞HDR效率的影响 |
| 2.2.11 细胞周期检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 载体的构建 |
| 2.3.2 水牛Actb位点sg RNA的筛选 |
| 2.3.3 同源臂长度对同源重组效率的影响 |
| 2.3.4 HMEJ和 HDR介导的基因敲入效率的比较 |
| 2.3.5 水牛胎儿成纤维细胞的制备 |
| 2.3.6 水牛胎儿成纤维细胞嘌呤霉素筛选浓度的优化 |
| 2.3.7 水牛胎儿成纤维细胞电转电压和脉冲次数的优化 |
| 2.3.8 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞HDR效率的影响 |
| 2.3.9 PFT-μ对水牛胎儿成纤维细胞周期的影响 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 应用CRISPR/Cas9介导的Y染色标记技术进行小鼠植入前胚胎性别鉴定的研究 |
| 前言 |
| 3.1 试验材料与仪器设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 sgRNAs(single-guideRNAs)的设计及筛选 |
| 3.2.2 模板质粒的构建 |
| 3.2.3 体外转录PCR模板的制备 |
| 3.2.4 Cas9体外转录与纯化 |
| 3.2.5 sgRNA体外转录模板的制备 |
| 3.2.6 sgRNA体外转录与纯化 |
| 3.2.7 合子注射与胚胎移植 |
| 3.2.8 Y-Chr-eGFP转基因小鼠的生产、鉴定及脱靶检测 |
| 3.2.9 小鼠组织总RNA的提取 |
| 3.2.10 RNA的反转录 |
| 3.2.11 实时荧光定量PCR |
| 3.2.12 胚胎性别鉴定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 sgRNA的筛选 |
| 3.3.2 模板载体的鉴定 |
| 3.3.3 Y-Chr-eGFP转基因小鼠的生产、鉴定及脱靶分析 |
| 3.3.4 胚胎性别鉴定 |
| 3.3.5 Q-PCR检测转基因小鼠相关基因的表达情况 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 应用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术生产Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎的研究 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料与仪器设备 |
| 4.1.1 动物材料 |
| 4.1.2 主要仪器与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与溶液配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 巴马猪肾脏成纤维细胞的制备 |
| 4.2.2 巴马猪肾脏成纤维细胞电转电压的优化 |
| 4.2.3 sgRNA的设计和筛选 |
| 4.2.4 模板载体的构建 |
| 4.2.5 单细胞克隆的筛选和鉴定 |
| 4.2.6 细胞生长曲线的测定 |
| 4.2.7 细胞活性检测 |
| 4.2.8 卵母细胞的获取与成熟培养 |
| 4.2.9 体细胞核移植生产Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 巴马小香猪肾脏成纤维细胞的制备 |
| 4.3.2 广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞电转电压的优化 |
| 4.3.3 载体鉴定 |
| 4.3.4 sgRNA设计和筛选 |
| 4.3.5 Y-Chr-eGFP转基因巴马猪肾脏成纤维细胞的生产 |
| 4.3.6 转基因和非转基因细胞活性和增殖速度的比较 |
| 4.3.7 Y-Chr-eGFP转基因巴马猪克隆胚胎的生产 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Y-Chr-eGFP转基因水牛胎儿成纤维细胞系的建立及转基因克隆胚胎的生产 |
| 前言 |
| 5.1 试验材料与仪器设备 |
| 5.1.1 动物材料 |
| 5.1.2 主要仪器与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 sgRNA的设计和筛选 |
| 5.2.2 模板载体的构建 |
| 5.2.3 水牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定 |
| 5.2.4 单细胞克隆的筛选培养和鉴定 |
| 5.2.5 细胞生长曲线的测定 |
| 5.2.6 细胞活性检测 |
| 5.2.7 转基因细胞相关基因mRNA表达水平的检测 |
| 5.2.8 细胞基因组DNA的提取 |
| 5.2.9 卵母细胞的获取与成熟培养 |
| 5.2.10 颗粒单层的制备 |
| 5.2.11 体细胞核移植生产Y-Chr-eGFP转基因克隆水牛胚胎 |
| 5.2.12 转基因克隆胚胎发育潜能的检验 |
| 5.2.13 统计学分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 sgRNA的筛选 |
| 5.3.3 Y-Chr-eGFP转基因水牛胎儿成纤维细胞的生产 |
| 5.3.4 转基因和非转基因细胞活性和增殖速度的比较 |
| 5.3.5 转基因和非转基因细胞表观遗传相关基因表达情况分析 |
| 5.3.6 Y-Chr-eGFP转基因克隆水牛胚胎的生产 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 全文总结 |
| 本研究的不足与展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 英文缩写-中文名称对照表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一篇 :综述 |
| 第一章 :基因编辑猪在大动物分子遗传育种以及生物医学上的应用 |
| 1.1 培育抗病力和适应性强的动物品种 |
| 1.2 培育提高生产性能的动物品种 |
| 1.3 培育改善动物肉类品质的动物品种 |
| 1.4 培育“环保型”动物品种 |
| 1.5 作为人类疾病动物模型 |
| 1.6 作为异种器官移植供体 |
| 第二章 :基因编辑克隆猪培育主要技术环节及其影响因素 |
| 2.1 卵母细胞 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.3 核移植重构胚胎的构建 |
| 第三章 :大动物遗传修饰相关的精准基因编辑技术研究进展 |
| 3.1 传统的同源重组技术 |
| 3.2 ZFN基因编辑技术研究进展 |
| 3.3 转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALEN)研究进展 |
| 3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究进展 |
| 第二篇 :研究内容 |
| 第一章 :利用TALEN基因编辑系统对猪和兔进行Tiki1 基因敲除的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 :利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统对猪和兔进行Tiki基因敲除的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 全文结论及创新之处 |
| 未来研究展望 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 轮状病毒亚单位疫苗研究进展 |
| 1 轮状病毒研究简介 |
| 1.1 轮状病毒结构 |
| 1.2 轮状病毒的类型 |
| 1.3 轮状病毒疫苗研究进展 |
| 2 VP6亚单位疫苗研究进展 |
| 2.1 轮状病毒结构蛋白VP6简介 |
| 2.2 VP6蛋白作为候选疫苗的研究进展 |
| 第二章 基因编辑技术与转基因动物 |
| 1 传统的转基因动物研究技术 |
| 1.1 原核注射法 |
| 1.2 胞质注射法 |
| 1.3 体细胞核移植法 |
| 1.4 胚胎干细胞法 |
| 1.5 病毒载体介导法 |
| 1.6 精子载体法 |
| 1.7 转座子技术 |
| 2 基因编辑技术 |
| 2.1 锌指核酸酶(ZFN)技术 |
| 2.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)技术 |
| 2.3 CRISPR-Cas9 基因打靶技术 |
| 3 CRISPR/Cas9 研究进展 |
| 3.1 CRISPR/Cas系统研究简介 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑动物 |
| 3.3 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入 |
| 3.4 动物乳腺生物反应器与基因编辑 |
| 第三章 DNA双链断裂与断裂修复途径的选择 |
| 1.DNA双链断裂 |
| 2 NHEJ修复涉及的相关的修复蛋白 |
| 2.1 核酸酶 |
| 2.2 聚合酶 |
| 2.3 连接酶复合体 |
| 2.4 多核苷酸激酶,抑肽酶和酪氨酰DNA磷酸二酯酶1 |
| 3 不同末端结构介导的NHEJ修复途径 |
| 3.1 Ku-XRCC4-DNA连接酶介导的平末端连接 |
| 3.2 核酸酶依赖性修复途径 |
| 3.3 聚合酶依赖性修复途径 |
| 3.4 XLF和 PAXX介导的连接修复途径 |
| 4 其他修复途径的选择 |
| 4.1 微同源序列介导的末端修复(a-EJ修复途径) |
| 4.2 单链退火(SSA)修复途径 |
| 4.3 同源重组修复 |
| 4.4 细胞周期对修复途径的影响 |
| 研究目的与意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 :CRISPR/Cas9 介导的兔酪蛋白位点基因组编辑效率检测 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔酪蛋白位点gRNA的设计及CRISPR/Cas9 相关载体的构建 |
| 2.2 RGS双荧光报告载体构建 |
| 2.3 质粒转化及Cracking鉴定 |
| 2.4 PCR片段及酶切产物胶回收 |
| 2.5 去内毒质粒大提 |
| 2.6 细胞解冻与培养 |
| 2.7 Cas9 载体、gRNA载体与RGS载体脂质体共转染293T细胞 |
| 2.8 Cas9 载体、gRNA载体共同电转染兔胎儿成纤维细胞 |
| 2.9 细胞基因组的提取 |
| 2.10 靶序列位点T7E1酶切突变检测 |
| 2.11 体外转录 |
| 2.12 兔的超排与受精卵的收集 |
| 2.13 兔受精卵胞质注射 |
| 2.14 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 兔CSN2基因分析及酪蛋白WB检测 |
| 3.2 兔CSN2 位点gRNA设计及CRISPR/Cas9 相关表达载体的构建 |
| 3.3 双荧光报告载体RGS载体的构建 |
| 3.4 Cas9、gRNA及 RGS载体通过脂质体共转染293T细胞验证4条sgRNA切割活性 |
| 3.5 Cas9 载体及gRNA载体共同电转兔胎儿成纤维细胞验证4条gRNA基因组内源性靶位点的编辑效率 |
| 3.6 CRISPR/Cas9 介导的4条sgRNA在胚胎水平基因编辑效率检测 |
| 4 讨论 |
| 第五章 不同长度同源臂对EGFP基因定点敲入兔酪蛋白位点的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 靶向兔酪蛋白位点不同长度同源臂打靶载体的构建 |
| 2.2 Cas9、gRNA、同源打靶载体共转兔成纤维细胞 |
| 2.3 定点敲入外源基因的检测 |
| 2.4 Cas9、gRNA、同源打靶载体共注射兔受精卵 |
| 2.5 囊胚基因型的分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 靶向兔酪蛋白g4位点200bp同源臂打靶载体的构建 |
| 3.2 靶向兔酪蛋白g4位点1000bp同源臂打靶载体的构建 |
| 3.3 EGFP-Donor1与Cas9、gRNA4 共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证 |
| 3.4 EGFP-Donor2与Cas9、gRNA共同电转兔成纤维细胞定点敲入的验证 |
| 3.5 两种打靶载体分别与Cas9m RNA、sgRNA4 共注射兔受精卵基因敲入效率的检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 靶向酪蛋白位点定点整合VP6转基因兔的制备 |
| 前言 |
| 1 实验材料与设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 轮状病毒亚单位结构VP6基因打靶载体的构建 |
| 2.2 Cas9 质粒、gRNA4 质粒及VP6-Donor质粒共同电转兔成纤维细胞 |
| 2.3 Cas9m RNA、sgRNA4及VP6-Donor质粒共注射兔受精卵 |
| 2.4 胚胎移植 |
| 2.5 F0代仔兔的基因型检测 |
| 2.6 Southern Blot |
| 2.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测 |
| 2.8 F0-A3阳性兔F1代建立 |
| 2.9 F1 代阳性兔乳汁的采集及外源蛋白Western Blot检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 轮状病毒免疫原性结构蛋白VP6打靶载体的构建 |
| 3.2 Cas9、gRNA4、VP6-Donor载体电转兔成纤维细胞基因敲入的验证 |
| 3.3 Cas9、gRNA4、VP6 Donor载体共注射兔受精卵基因敲入效率的检测 |
| 3.4 F0代转基因兔的检测 |
| 3.5 三只阳性兔Southern blot分析 |
| 3.6 F0 代敲入阳性兔Rabbit1(F0-B6)的基因型分析 |
| 3.7 F0-B6阳性兔的脱靶检测 |
| 3.8 F0-A3后代的扩繁及F1代仔兔的转基因检测(生殖系遗传) |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
（9）定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 基因编辑技术研究进展 |
| 1.1 基因编辑原理 |
| 1.1.1 非同源末端连接修复机制 |
| 1.1.2 同源重组修复机制 |
| 1.2 应用于基因编辑的核酸酶技术 |
| 1.2.1 HE技术 |
| 1.2.2 ZFN技术 |
| 1.2.3 TALEN技术 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9 技术 |
| 1.3 基因编辑技术在转基因家畜生产中的应用 |
| 1.3.1 在家畜抗病育种中的应用 |
| 1.3.2 在家畜品种改良中的应用 |
| 1.3.3 动物生物反应器的建立 |
| 1.3.4 改善动物福利 |
| 1.3.5 在生物医学上的应用 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 系统的发展及应用 |
| 2.1 CRISPR/Cas系统的进化与分类 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas系统的进化 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 2.2 CRISPR/Cas系统的作用机制 |
| 2.2.1 适应性阶段 |
| 2.2.2 表达性阶段 |
| 2.2.3 干扰性阶段 |
| 2.3 降低CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 |
| 2.3.1 sgRNA的设计与筛选 |
| 2.3.2 全基因组水平的基因编辑脱靶检测技术 |
| 2.3.3 Cas9 蛋白变体的研发与应用 |
| 2.4 CRISPR/Cas9 系统的多元化应用 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因表达调控 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas9 系统介导的表观遗传修饰改变 |
| 2.4.3 CRISPR/Cas9 系统介导的活细胞染色质成像 |
| 2.4.4 CRISPR/Cas9 系统应用于细胞谱系追踪 |
| 2.4.5 CRISPR/Cas9 系统应用于全基因组筛选 |
| 试验研究 |
| 第三章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变转基因小鼠模型建立 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 靶向小鼠MSTN基因终止密码子TGA的 sgRNA设计 |
| 3.2.2 小鼠定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 3.2.3 F0 代阳性转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.2.4 F1 代杂合子转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.2.5 F2 代纯合子转基因小鼠的生产及鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 靶向小鼠MSTN基因终止密码子TGA的 sgRNA脱靶评估 |
| 3.3.2 小鼠定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组载体的酶切鉴定 |
| 3.3.3 F0 代阳性转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.3.4 F1 代杂合子转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.3.5 F2 代纯合子转基因小鼠鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突转基因小鼠表型鉴定 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转基因小鼠肌肉形态检测 |
| 4.2.2 转基因小鼠组织学检测 |
| 4.2.3 转基因小鼠骨骼肌组织中相关基因m RNA表达水平检测 |
| 4.2.4 转基因小鼠骨骼肌组织中FABP4 蛋白和TG含量检测 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转基因小鼠肌肉形态检测 |
| 4.3.2 转基因小鼠组织学检测 |
| 4.3.3 转基因小鼠骨骼肌组织中相关基因m RNA表达水平检测 |
| 4.3.4 转基因小鼠骨骼肌组织中FABP4 蛋白和TG含量检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变转基因肉牛的研制 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 鲁西黄牛MSTN基因CRISPR/Cas9 切割载体的构建与活性检测 |
| 5.2.2 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 5.2.3 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变阳性克隆细胞的筛选 |
| 5.2.4 利用体细胞核移植技术生产转基因鲁西黄牛 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 鲁西黄牛MSTN基因CRISPR/Cas9 切割载体的构建与活性检测 |
| 5.3.2 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变同源重组打靶载体的构建 |
| 5.3.3 鲁西黄牛定点整合FABP4 基因和MSTN基因点突变阳性克隆细胞的筛选 |
| 5.3.4 利用体细胞核移植技术生产转基因鲁西黄牛 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 创新之处与进一步研究课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR/Cas9介导的HMEJ策略制备FSⅠ-Ⅰ-Ⅰ定点整合基因修饰猪[D]. 李梦静. 吉林大学, 2021(01)
- [2]体外重组装人促卵泡激素的制备及转基因小鼠模型的构建[D]. 华荣茂. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]利用CRISPR/Cas9和attP串联序列介导山羊ROSA26位点目的基因多拷贝整合的探究[D]. 冯佩. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]弓形虫与猪巨噬细胞的互作特征以及FASⅡ和磷酸转运在虫体生长中的生理功能[D]. 崔建敏. 华中农业大学, 2020(01)
- [5]优化CRISPR/Cas9系统提高奶山羊ROSA26位点基因打靶效率[D]. 韩静. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [6]应用CRISPR/Cas9介导的Y染色体标记技术进行哺乳动物胚胎性别鉴定的研究[D]. 赵秀玲. 广西大学, 2020(02)
- [7]基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立[D]. 吴彩霞. 吉林大学, 2020(08)
- [8]CRISPR/Cas9靶向整合轮状病毒VP6基因构建兔乳腺生物反应器模型的初步研究[D]. 李红丽. 广西大学, 2019(02)
- [9]定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变转基因小鼠及肉牛的研制[D]. 康健. 西北农林科技大学, 2019
- [10]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)