一、蛋白质组学及其在新药研究中的应用（论文文献综述）
许静[1]（2021）在《心梗致心衰潜在预警标志物发现及生脉注射液作用解析研究》文中研究表明研究背景心力衰竭（Heart Failure,HF）是多种心血管疾病的终末阶段,心梗是引起心衰常见因素之一,虽然心梗的治疗已经取得了一定的进展,但其患者仍是发生心衰的危险人群。心梗到心衰演变过程是一个动态、复杂、连锁的反应包括心肌细胞丢失、神经体液系统的激活及心脏重塑等,静态的观察心梗与心衰制约了对其疾病演变过程的解析。本研究关注于心梗致心衰演变过程的动态变化,通过对心梗致心衰的疾病表型与分子变化进行分析,有助于对心梗到心衰演变过程进行解析,揭示不同时间、不同环节之间的相互作用规律,为阐释心梗致心衰的分子机制奠定基础。心衰一旦发生很难挽回,因此“早发现、早治疗”在心力衰竭的治疗中至关重要。生物标志物有助于心衰患者的临床诊断与预后等,虽然目前对于心衰标志物的研究取得了一定进展,但是由于检测受限、对药物的不明反应、易受到非心源性因素的影响,限制了新型标志物的临床应用;除此之外,目前标志物主要关注于心衰诊断与预后,缺少提供早期预警信息的标志物,因此寻找在心梗致心衰演变过程中发挥早期预警作用的生物标志物具有重大意义。中药复方因疗效好、毒副作用小等特点广泛应用于临床治疗中,但是其成分复杂、又作用于复杂生命体,增加了中药复方作用机制与主要干预环节解析的难度。生脉注射液（SMI）来源于“生脉散”,其组方简单、疗效好,是急性、慢性以及难治性心力衰竭的推荐用药。但是目前对于生脉注射液的研究多集中于临床观察,对于心力衰竭尤其是心梗致心衰的主要作用环节还鲜有报道,因此开展生脉注射液作用机制及主要作用环节的研究是至关重要的。综上所述,针对心梗到心衰动态演变过程病机不明、缺乏早期预警标志物、生脉注射液在心梗致心衰演变过程干预环节不清的问题,本课题首先对心梗致心衰演变过程进行研究,其次对心梗致心衰潜在早期预警标志物进行筛选与验证,最后根据心梗致心衰动态分子特征谱对生脉注射液的主要干预环节进行研究并加以验证,期以服务临床寻找潜在早期预警标志物,阐明生脉注射液主要干预环节,为生脉注射液的临床精准应用提供研究策略。研究内容1.第一部分对心梗致心衰演变过程进行研究,利用大鼠左冠状动脉前降支结扎模型,对心梗后早期（心梗后1周）、中期（心梗后2、3周）及后期（心梗后4周）的血生化指标、心功能与病理改变进行分析;其次利用蛋白质组学技术对心梗后早期、中期及后期的大鼠左心室蛋白进行分析,并利用生物信息学进行富集分析,结合疾病表型与分子特征揭示心梗致心衰演变过程。2.第二部分对心梗致心衰潜在早期预警标志物进行分析及验证。首先对心梗后早期、中期及后期的差异表达蛋白进行分析,筛选出具有早期预警作用的候选标志物;其次利用ELISA法对心梗致心衰不同时间大鼠血清中候选标志物表达水平进行检测;最后在细胞水平对筛选出的标志物进行验证,基于Ang Ⅱ诱导H9c2细胞模型,采用免疫荧光法对候选标志物表达进行分析,并利用免疫荧光法对生脉注射液干预后潜在标志物的变化进行分析。3.第三部分对生脉注射液的主要干预环节进行研究。利用网络药理学对生脉注射液主要干预环节进行预测分析,并从动物水平与细胞水平确证生脉注射液的主要干预作用。动物层面采用大鼠左冠状动脉前降支结扎模型,从心功能与病理染色对生脉注射液进行药效学评价。利用ELISA法对生脉注射液干预后VCAN、COL1A1与P Ⅰ CP表达水平进行检测。细胞层面基于Ang Ⅱ诱导H9c2细胞模型,评估生脉注射液干预后对LDH、ROS及胞内Ca2+浓度的影响;利用免疫荧光法对ANP与CTGF表达水平进行分析。研究结果第一部分心梗致心衰演变过程研究1.疾病表型变化心梗致心衰演变过程中,心功能最先发生异常。超声心动分析结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠在心梗后第1周射血分数及短轴缩短率显着下降,并且在第2周、第3及第4周持续下降,表明心肌收缩能力受损;与假手术组相比,模型组大鼠左心重比与心重比在第2周出现显着升高的现象,并且在第3周、第4周持续升高,表明在第2周发生心肌肥大现象并逐步加重;病理染色结果表明,模型组大鼠心肌组织在第3周与第4周出现心肌组织结构异常、并发生心肌纤维化损伤;血生化指标分析结果表明,模型组大鼠血清中的BNP与NT-proBNP在第4周显着性升高,表明心室负荷超载。2.蛋白质组学结果（1）通过蛋白质组学分析共鉴定到6127个蛋白。与假手术组相比,模型组在第1周有838个差异表达蛋白,第2周有716个差异表达蛋白,第3周有416个差异表达蛋白,第4周有781个差异表达蛋白,在心梗后第2周、第3周及第4周上调蛋白逐渐增多,表明心梗到心衰演变过程中大量蛋白表达上调。（2）第1周到第4周差异表达蛋白参与钙离子转运、氧化应激以及心脏收缩、心率调节等生物学过程;在第2周差异表达蛋白还与炎症反应、凋亡等生物学过程有关,第3周差异表达蛋白还与与肌原纤维产生相关功能,在第4周差异表达蛋白还与细胞外基质生成有关。第二部分心梗致心衰早期预警标志物的发现与验证1.潜在早期预警标志物的筛选结果基于非监督模式分析共筛选出33个在心梗致心衰演变过程中与疾病分型相关,并且具有早期预警意义的蛋白;利用COX单因素与多因素回归分析最后筛选出候选标志物。2.动物水平验证结果利用ELISA法对大鼠血清中候选标志物的表达水平进行检测,结果表明COL1A1与VCAN表达水平分别在第2周、第3周显着升高（p<0.05）,在第4周仍显着性的升高（p<0.05）。3.细胞水平验证结果（1）利用免疫荧光法检测10-3 μM至10-6 μM AngⅡ处理H9c2细胞24 h后目标蛋白的表达水平,结果表明VCAN的表达水平在10-3 μM至10-4 μM Ang Ⅱ处理后显着升高（p<0.05）,COL1A1在10-4 μM与10-5μM Ang Ⅱ处理后显着升高（p<0.05）。（2）利用生脉注射液进行干预,结果表明1 μL/4 mL到1μL/2 mL SMI干预后COL1A1的表达水平显着降低（p<0.05）。第三部分生脉注射液主要干预环节研究1.SMI主要干预环节预测分析结果共收集到生脉注射液化学成分190个、靶标1612个,构建“成分-靶标”网络,发现生脉注射液主要与钙离子通道调节、炎症反应、心肌收缩、氧化应激、心肌纤维化等生物学过程有关。通过与差异表达蛋白进行分析,结果表明生脉注射液与心梗后第1周、第2周及第3周显着相关,其中与心梗后第二周差异表达蛋白建立相互关系的靶标数量最多,对这些靶标进行富集分析,结果表明缓心肌纤维化损伤可能为生脉注射液在心梗致心衰演变过程中的主要干预环节之一。2.SMI主要干预环节验证结果在动物水平,SMI能够改善心梗后导致的心功能降低的情况、降低心肌纤维化损伤及COL1A1、VCAN与P Ⅰ CP的表达水平;在细胞水平,生脉注射液能够减缓Ang Ⅱ处理后的细胞损伤程度,降低ROS过量积累的损伤及胞内钙离子的浓度,并能够降低AngⅡ处理H9c2细胞引起的ANP与CTGF的表达水平的升高。结论1、通过对心梗致心衰演变过程进行研究,结果表明心梗到心衰演变过程中,心功能逐渐下降,心肌肥大、心肌纤维化及心室机械应力逐步加重;蛋白质组学分析表明心梗致心衰差异表达蛋白主要与细胞外基质生成、炎症等生物学过程有关。2、实验证实VCAN与COL1A1的变化与心梗致心衰有关,可能为心力衰竭的发展、预后提供可供参考的信息。3、利用网络药理学技术对生脉注射液的靶标与心梗致心衰演变过程中动态分子特征谱进行分析,结果表明生脉注射液在心梗致心衰演变过程中的主要干预环节可能与减轻心肌纤维化损伤有关;动物实验证实生脉注射液能够减缓心梗导致的心肌纤维化损伤,细胞实验证实生脉注射液具有降低Ang Ⅱ引起的心肌细胞损伤的作用。本研究表明基于心梗致心衰的动态分子特征谱解析已上市中成药在心梗到心衰演变过程中主要干预环节分析策略具有可行性。创新点1、心梗致心衰的演变过程包括心肌细胞丢失、神经体液系统的激活等多个生物学过程,静态的观察心梗与心衰制约了对其疾病演变过程的解析。本研究关注于心梗致心衰演变过程的动态变化,通过对心梗致心衰的疾病表型与分子变化进行分析,揭示心梗致心衰的动态演变过程,并在此基础上更准确地筛选心梗致心衰早期预警标志物;2、对心梗致心衰演变过程进行研究,提出COL1A1与VCAN可能为心梗致心衰潜在早期预警标志物;3、本研究以生脉注射液为范例,采用“动态分子特征谱-主要干预环节-实验验证”的分析策略,对生脉注射液的主要干预环节进行预测分析并加以验证。本研究将为其他已上市中成药在心梗致心衰演变过程中的精准应用提供研究策略。
梁至[2]（2021）在《海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究》文中研究表明肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）组织中高水平的活性氧（ROS）使其对传统的放疗和化疗药物均不敏感,迫切需要寻找针对新靶点、具有新结构的肾癌治疗药物。海洋微生物天然产物是新颖药源分子的重要来源,本论文从海洋天然产物中筛选抗肾癌新药,并遵从新药研发“Fail early,Fail cheap”这一原则,将ADMET研究引入药物研发过程,对药物进行早期成药性评价,形成一个从海洋候选药物抗肾癌新靶标筛选、新机制研究到成药性评价的完整研究体系。抗肾癌新靶标筛选:本课题组与合作者从两株海洋放线菌中发现了 33个粉蝶霉素类（Piericidins）候选化合物,包括21个新结构化合物,其中PA三糖糖苷是首次报道。PA及其单糖苷GPA作为产量最大的粉蝶霉素类（PAs）化合物,对ACHN肾癌细胞的IC50分别达0.4 μM和0.2μM,抗肾癌活性显着优于索拉菲尼（P<0.001）。因此,挖掘PA/GPA抗肾癌新靶点是开发PAs抗肾癌候选药物的首要任务。本研究首先利用蛋白配体垂钓技术发现ACHN细胞中过氧化物氧化还原酶蛋白1（PRDX1）与PA有直接相互作用。PRDX1在体内主要发挥清除ROS从而维持机体稳态的功能;当胞内ROS水平异常升高或PRDX1蛋白浓度增加时,PRDX1形成二聚体或十聚体,作为功能调节蛋白调控NF-κB等蛋白的活性,或发挥分子伴侣作用,同时失去氧化还原酶活性。据文献报道,PRDX1在不同肿瘤组织中的高表达促进肿瘤的发生发展,而与大部分实体瘤相反,PRDX1在肾癌组织中低表达,因此阐明PRDX1与ROS的关系对挖掘PA/GPA抗肾癌新机制至关重要。抗肾癌新机制研究:利用临床人肾细胞癌样本,联合2个队列的肾细胞癌与癌旁组织转录组数据证实PRDX1在肾癌组织中低表达（P<0.0001）。PA对ACHN细胞转录组数据分析发现PA能上调PRDX1的表达。对此我们设计并构建了 PRDX1敲低ACHN稳转细胞株用于考察上调的PRDX1对ROS水平的影响。实验结果表明,PA/GPA能显着下调ACHN细胞内ROS水平,当PRDX1蛋白表达被抑制后,PA/GPA下调ROS的作用消失。由此,我们确认PRDX1是PA/GPA的作用靶标。作为一类多功能蛋白,PRDX1的酶活性和蛋白调节功能在维持机体稳态中起关键作用。我们检测了 PRDX1蛋白Tyr194磷酸化,发现PA/GPA能抑制蛋白磷酸化,使PRDX1总蛋白水平增加。为了进一步探讨PRDX1蛋白浓度的升高是否影响其过氧化物酶活性,我们检测了PRDX1的总体酶活性,发现500 nM PA/GPA处理后PRDX1酶活性分别提高至1.36倍和1.60倍（P<0.01）。利用表面等离子共振技术（SPR）发现PA/GPA与PRDX1蛋白可直接结合,这可能是抑制Tyr194磷酸化保持过氧化物酶活性的原因。此外,细胞共定位技术发现PA/GPA能促使PRDX1入核,抑制NF-κB的表达,发挥功能调节蛋白的作用。由此,我们证明了 PA/GPA抗肾癌新机制与靶向PRDX1增强其ROS清除能力相关,这一新机制的发现为抗肾癌天然产物的研发提供了新的研究思路。ADME/T成药性评价:为了进一步证实PA/GPA的抗肾癌效果,我们构建了 ACHN细胞荷瘤裸鼠,在PA/GPA给药三周后,肿瘤体积明显下降,分别减少至50%（P<0.01）和41%（P<0.001）,同时伴随着肝毒性的发生。因此,我们继续通过ADME/T研究挖掘PA/GPA肝毒性靶点,探讨PAs化合物的毒效关系。结合PA对ACHN细胞的定量蛋白质组和转录组数据分析发现,PA对胆汁分泌通路具有显着影响。SPR研究发现PA直接结合肝脏核受体LXRα,调控CYP7A1和LDLR,增加胆固醇吸收并抑制其代谢,加剧肝脏胆固醇堆积,引起肝细胞的线粒体毒性导致细胞凋亡。PA/GPA的药动学结果表明PA可聚集在肝脏产生肝毒性（肝脏药物浓度达血浆29倍）,而GPA在肝脏内转化为PA（转化率高达29.6%）。我们将5个PA类苷元和12个糖苷PA类似物与LXRα做SPR和分子对接实验,发现糖基的存在阻碍化合物与LXRα蛋白结合。这极大可能是GPA无LXRα结合活性,但在肝脏转化为苷元产生肝损伤的重要原因。同时,我们利用人肝微粒体酶和重组人CYP/UGT纯酶孵育体系证实PA主要发生Ⅱ相代谢,UGT1A7、1A8、1A9和1A10是其主要代谢酶（代谢率均>40%）。综上,本研究联合多组学技术,基于药物ADMET特性阐明了粉蝶霉素类候选化合物的抗肾癌新机制和药物毒效关系,证实GPA 比 PA具有更优的成药性,为寻找成药性更好的抗肾癌候选药物奠定了基础。我们立足于本论文的研究结果,通过对PA类候选化合物进行结构优化,以期提高PA类候选化合物的肾癌靶向性和生物利用度,同时显着降低肝毒性,进一步推动我国具有自主知识产权的抗肾癌原创靶向药物的研发。
王新娜[3]（2021）在《醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究》文中进行了进一步梳理目的:明确醒脑健神方对缺血性中风（痰热腑实证）患者的临床疗效、复方中的化学成分以及明确其体外的抗缺氧机制,为临床用药提供客观依据和指导。方法:第一章是入组缺血性中风（痰热腑实证）的临床患者,应用非随机对照的临床试验方法评价治疗前后NIHSS、BI、mRS、中医证候（内风、痰湿、内火及血瘀）积分及便秘疗效的变化情况,明确临床治疗效果的相关结论。第二章是应用网络药理学的分析方法构建“药物—成分—疾病”的靶点集合及生物信息预测,探索醒脑健神方在缺血性中风病中可能发挥作用的机制通路与潜在靶点。第三章是应用HPLC-MS/MS的方法进行醒脑健神方的全谱分析,明确方中所含化学成分。第四章是应用PC12细胞在体外进行神经细胞的形态功能模拟,并进行化学缺氧造模,分组干预后应用蛋白质组学4D lable free等方法检测,明确醒脑健神方的体外抗缺氧机制。结果:1.临床结果。通过比较试验组与对照组的NIHSS、BI与mRS的治疗前后变化,可以说明联用醒脑健神方的干预方法优于单纯使用西医基础治疗;通过对两组患者的中医证候要素积分变化情况的统计,可以说明联用醒脑健神方的干预方法优于单纯使用指南推荐的西医基础治疗,较为明显地改善痰湿、内火、血瘀证候表现,但在改善内风证候方面的疗效无明显差异;试验组的首次通便时间要长于对照组的西医对症治疗、便秘症状积分在第3天、第7天改善情况较对照组有统计学差异,便秘疗效的总有效率高于对照组。2.网络药理学预测结果。本研究将醒脑健神方中的药物成分与缺血性中风疾病的靶点进行网络互作,经过KEGG等生物信息分析后发现其主要调控的通路Apoptosis、HIF-1信号通路等,而且这些通路均与缺血性脑血管病有着密切联系,同时也确定了NF-κBp65、Bcl-2、Caspase 3等目标蛋白,且应用蛋白印迹实验进行了验证,可确定其为药效作用的具体靶点。3.全谱分析结果。醒脑健神方中共检测出398种成分,正离子模式293种、有64类（含暂不能归类的）;负离子模式105种、有24类。其中,正、负离子取交集发现成分种类吻合的是黄酮类化合物,也是复方中相对浓度表达较高的成分。黄酮类化合物共有46种化学成分,浓度高度突出的是黄酮榕碱和槲皮素-3,4’-二-O-葡糖苷等。4.体外抗缺氧机制实验结果。缺氧后PC12细胞的存活能力有所下降,在造模基础上应用醒脑健神方预孵育后可以显着增加因缺氧而损伤的细胞活力。蛋白质组学的结果发现醒脑健神方的抗缺氧机制主要富集在凋亡、调控细胞各类代谢等方面,具体的机制通路富集到了PPAP、PI3K/AKT、HIF-1、Steroid biosynthesis、Metabolic pathways等;根据关联强度与差异倍数确定兴趣蛋白并进行了PRM的蛋白验证,发现Perilipin、CoA synthase蛋白的变化趋势与蛋白组学的结果一致,说明醒脑健神方确实具有抗缺氧的作用机制。根据PC12各组细胞处理后使的抗体与抗原识别结合,可以发现醒脑健神方干预后可以使细胞样本发生三甲基化、乙酰化、乳酸化及泛素化的修饰变化。结论:临床研究的结论是醒脑健神方对缺血性中风（痰热腑实证）患者确实具有临床治疗效果,联合应用可比对照组的疗效更明显。网络药理学的结论是醒脑健神方在本病中确实有调控作用,经过western验证发现其可调控凋亡标志蛋白。LC/MS的结论是醒脑健神方中有多种化学成分,很有可能的药效物质成分是黄酮类化合物,当然这需要实验来进行后续验证。体外实验的结论是醒脑健神方对PC12具有抗缺氧调控作用,主要的机制通路富集在凋亡、调控细胞糖脂及产物的代谢等,且在组蛋白修饰层面可能对蛋白基团具有三甲化、乙酰化、乳酸化及泛素化的调控作用。
钟卓珩[4]（2021）在《UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究》文中研究表明药用植物次生代谢产物是创新药物的重要来源。长春花中的吲哚生物碱与白桑中的异戊烯基化合物均具良好的生物活性,吲哚生物碱及其衍生物广泛用于肿瘤的临床治疗领域;但这些化合物在天然植株中的含量偏低,化学合成难度大,严重阻碍了大规模开发应用。前期研究表明,紫外线B（Ultraviolet B,UVB）辐射作为一种诱导因子,与暗培养手段结合,能引起长春花和白桑体内次生代谢物合成关键酶的响应并相应提升吲哚生物碱与Diels-Alder型加合物及其前体的含量,增加其药用价值,但UVB辐射下涉及的次生代谢激活及调控机制,如在信号转导、能量产生等方面,仍不清楚。本论文基于系统生物学研究思路,整合蛋白质组学、代谢组学、分子生物学等手段,对长春花及白桑响应UVB辐射的分子机理进行了探究,为阐明药用植物中活性成分生物合成机制奠定了基础,主要内容和结果如下:（1）UVB辐射下长春花磷酸化信号通路及初生代谢变化研究为探究UVB辐射下长春花叶片的响应,开展了ATP含量测定、磷酸化蛋白质组学分析、GC-MS代谢组学分析及Western-Blotting实验。结果表明,在UVB辐射下,叶片中ATP含量显着上升;磷酸化蛋白质组学分析鉴定了242个变化的磷酸化蛋白,这些磷酸化蛋白主要与蛋白质合成、修饰、降解及信号传递、转导相关,其中钙调蛋白、钙离子依赖型蛋白激酶、热激蛋白含量显着增加;GCMS代谢组学分析鉴定了110个变化的代谢物,主要属于糖类、有机酸类、氨基酸类、醇类,其中戊糖类、芳香族氨基酸类、苯丙素类代谢物显着增加;整合组学数据与Western-Blotting结果发现,糖酵解与活性氧清除系统相关途径显着变化。这些结果说明,UVB辐射对植物造成了氧化胁迫,并激活了钙离子依赖型的蛋白磷酸化/去磷酸化修饰。一方面,糖酵解途径蛋白精准调控,三羧酸循环上调,促进了ATP生成,为次生代谢中的合成反应提供能量;另一方面,氧化还原反应相关的蛋白上调,并参与催化部分次生代谢中的反应,进一步促进次生代谢物积累。（2）UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢物积累研究为进一步探究UVB辐射下长春花叶片中线粒体对能量调控的作用及与次生代谢的联系,开展了线粒体酶活抑制实验、亚细胞器蛋白质组学分析、LC-MS靶向/非靶向代谢组学分析及q RT-PCR实验。线粒体酶活抑制实验表明,线粒体ATP合酶的抑制阻止了UVB辐射下ATP含量的上升。亚细胞器蛋白质组学分析鉴定了1051个线粒体相关蛋白质,其中线粒体呼吸链复合体I蛋白含量减少,复合体II、复合体IV蛋白含量增加;甲基赤藓糖磷酸（MEP）途径蛋白含量增加,香叶基焦磷酸（GPP）合酶含量增加,GPP还原酶含量降低;q RT-PCR实验证实这些蛋白对应基因的m RNA水平变化与蛋白变化趋势一致。LC-MS代谢组学分析鉴定了126个变化代谢物,主要包括生物碱类、有机酸类、糖类、苯丙素类、脂肪酸类,其中8个吲哚类生物碱含量显着增加。整合多组学数据分析发现,部分氨基酸代谢水平下降,色氨酸合成水平上升。这些结果说明,线粒体参与了UVB辐射反应的调控,一方面,不同复合体的响应保持了高ATP供应,MEP途径激活,GPP合酶含量增加,推动了GPP到单萜类骨架的转化,促进了吲哚生物碱单萜类前体的积累。另一方面,线粒体中部分氨基酸代谢水平下降,调控氮流参与色氨酸合成,促进吲哚生物碱另一前体积累。（3）UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究为探究药用植物UVB辐射下调控机制存在的共性与特点,以白桑为例,开展了UVB辐射下白桑蛋白质组学分析、代谢物指纹图谱差异分析、体外抗氧化活力测定、化合物含量测定及q RT-PCR实验,分析了UVB辐射后暗培养不同阶段下及未处理植株不同组织部位间的差异。在未处理的白桑中,根部Diels-Alder型加合物及其前体含量显着高于其他部位,桑黄酮H、桑根皮素、chalcomoracin在根部的含量是其他部位的10倍以上。在UVB辐射处理后暗培养阶段,叶片中chalcomoracin等5个Diels-Alder型加合物及其前体含量显着增加;在暗培养30h下蛋白变化最为显着,有253个蛋白发生了变化,涉及黄酮类合成的查尔酮合酶、二氢黄酮醇-4-还原酶、柚皮素-2-酮戊二酸双加氧酶、苯香豆素苄基醚还原酶都有所增加。与长春花类似,UVB辐射下白桑内MEP途径激活,该途径中3个负责催化终产物异戊烯基单体合成的蛋白增加,使异戊烯基单体大量合成,促进了MEP途径下游以之为底物的反应,导致异戊烯基类化合物积累。由于白桑次生代谢途径仍未阐明,推测芳香类异戊烯基转移酶（Aromatic PT）催化的异戊烯基转移参与了Diels-Alder型加合物及其前体合成的调控。（4）白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究为进一步研究白桑体内异戊烯基的转移机制,对白桑新型Aromatic PT展开研究。经过BLAST比对筛选、基因克隆、载体构建、体外酵母/烟草表达及功能验证实验,发现一条编码新型Aromatic PT的转录本,在UVB辐射后暗培养阶段RPKM值增加,能够催化GPP到氧化白藜芦醇的转移,命名为Ma OGT。通过生化性质测定及亚细胞定位实验,证实Ma OGT具有Aromatic PT的典型特征,拥有富含天冬氨酸的保守功能域,且定位于细胞质体。Ma OGT是首个接受GPP为异戊烯基供体的芪类PT,它的发现丰富了桑科Aromatic PT的信息,并为桑科更多未知Aromatic PT的深入挖掘提供参考。本论文通过对两种药用植物在UVB辐射下调控机制的共性与特点展开研究,阐明其在UVB辐射下分子响应及调控机制,揭示了MEP途径异戊烯基骨架合成及转移对下游物种特异性次生代谢途径激活的重要意义,对调控MEP途径活性成分的生物合成奠定了基础。
吕琪[5]（2020）在《基于化学蛋白质组学的活性天然产物靶点研究》文中指出目前,世界上半数以上的小分子新药直接或间接来源于天然产物（Natural products,NPs）及其衍生物,以活性天然产物作为先导化合物开发药物是新药研发的重要途径。新药的研发是一个极其耗费时间的过程,且花费巨大。在药物研发的初始阶段,明确先导化合物的作用靶点和作用机制不但可以了解其毒性和副作用的产生原因,还可以有针对性的进行结构改造。然而,尽管小分子化合物的数量在不断增加,其靶点识别仍然是医学和生物学的一大难题,阻碍了它们在生物及医药方面的广泛使用。因此,有效的活性天然产物靶点研究策略十分重要,能够推进药物研发进程,缩短时间,提高效率。在众多的靶点研究策略中,化学蛋白质组学因其独特的优势得到广泛应用,它是表征药物与靶点相互作用的强大工具。同时,可以识别化合物与除靶点以外的其他蛋白质的不良反应,帮助预测副作用,有助于优化候选药物分子。化学蛋白质组学的技术核心是小分子探针的设计合成,小分子探针要具备和先导化合物类似的生物学活性及选择性。本文利用化学蛋白组学对我们的活性天然产物进行靶点识别。我们选择了在前期体外活性筛选中表现出良好生物学活性的天然产物,在前期先导化合物构效研究的基础上,通过对活性天然产物进行生物素化,合成小分子探针,利用小分子探针与细胞共同孵育,“钓取”与化合物结合的蛋白质,利用生物素-链霉亲和素（BSA）系统富集纯化蛋白质,运用两种化学蛋白质组学策略:基于凝胶的亲和性蛋白组学和基于质谱的亲和性蛋白组学相结合。使用高分辨率质谱进行鉴定。经过数据分析,筛选富集蛋白。对其进行全面的生物学功能注释,利用GO和Reactome进行富集分析。综合两种化学蛋白质组学策略的质谱数据,预测最有可能的化合物蛋白靶点。我们运用化学蛋白质组学鉴定出本文中活性天然产物可能作用在DNA复制合成、蛋白质的转录翻译、有丝分裂细胞周期通路上,同时预测到五个蛋白靶点。为化学蛋白组学进一步应用于识别活性天然产物靶点及作用途径提供证据,对后续其他活性天然产物靶点的识别具有借鉴意义。
谢佳[6]（2020）在《甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究》文中指出神经肽类激素是一类进化上古老的内源性活性物质,其主要受体类型G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞膜上最大的蛋白质超家族。它们介导的信号传导途径不仅广泛参与动物正常生长发育过程中的各种生命活动,而且还与多种疾病的发生、发展和治疗密切相关。因此,神经肽及GPCRs可作为重要的药物靶标,其相应的研究也一直位于医学新药研发、农业杀虫剂潜在靶标探索的前沿。由弥散神经内分泌系统分泌的甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）家族成员及其受体（parathyroid hormone receptors,PTHRs）在脊椎动物的钙和磷的调节、肾脏和骨骼的发育过程中发挥重要作用,人工合成的PTH也已在市面上获批用于骨质疏松症、甲状旁腺功能减退症等疾病的治疗。而在无脊椎动物中,对该信号系统的研究较少。本课题组和日本Tanaka课题组分别率先、相继在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）等代表性昆虫中发现了PTHRs的类似受体,命名为i PTHRs。然而,在昆虫等无脊椎动物中是否存在i PTHRs的内源性配体一直未见报道,i PTHRs仍以孤儿受体的形式存在。另外,本课题组早期对赤拟谷盗i PTHRs的功能研究发现,其干扰之后严重影响了昆虫蛹至成虫的蜕皮羽化过程及表皮形态建成,但具体作用机制尚不明确。基于以上背景,本研究主要以完全变态昆虫赤拟谷盗为实验材料,对其适应性进化机制进行分析,筛选鉴定其潜在的内源性配体并进行功能研究,同时利用组学测序对该信号系统的作用机制进行进一步的挖掘,另外,也在不完全变态昆虫褐飞虱中开展了对i PTHRs进行初步的结构和功能验证。通过上述实验,本研究试图为全面了解PTHRs/i PTHRs的进化、生理功能及作用机制提供新的线索,可望为害虫生物学防治中绿色杀虫剂的开发提供候选作用靶标,甚至为PTH信号系统影响人类钙磷代谢失调与骨质疏松、甲状旁腺功能减退症等疾病的发生和治疗提供参考。首先,本研究通过筛选更多类别无脊椎动物的i PTHR（含节肢动物蛛形纲、软体动物等类群）联合脊椎动物各纲代表性物种的PTHRs进行系统发生关系分析,并利用PAML（Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood）软件包中的Code ML程序对无脊椎动物的i PTHRs进行适应性进化分析,结果显示脊椎动物、无脊椎动物PTHRs/i PTHRs中发生了独立的复制和丢失事件,且无脊椎动物i PTHRs数目更多样化;无脊椎动物i PTHRs经历了选择压力,筛选出21个多位于胞外近膜端及跨膜结构域的正选择位点。由于正选择位点富集的部位为配体和受体结合的关键区域,暗示无脊椎动物中配体在序列上可能存在较大变异;其次,通过广泛搜集比对信息和利用Blast搜索筛选出昆虫i PTHRs的候选配体PXXXamide。赤拟谷盗的PXXXamide的蛋白质编码区域编码109个氨基酸,与脊椎动物PTH没有显着的序列同源性,但在节肢动物中比较保守;利用GPCR受配体鉴定系统对其与i PTHRs的关系进行鉴定,结果表明候选配体PXXXamide能显着激活i PTHRs表达细胞中钙离子关联的荧光信号,证明了PXXXamide的确是i PTHRs的内源性配体,命名为i PTH。利用实时荧光定量PCR和免疫组化对其进行时空表达分析,发现其在晚期蛹、中枢神经系统、肠呈现高表达,其中组织表达模式与受体i PTHRs一致。然而,利用RNA干扰技术对其进行功能分析,结果却表明i PTH干扰后对赤拟谷盗的生长发育没有影响,这与受体造成的畸形表型不一致;原因之一是可能在昆虫体内还存在另外的配体发挥作用,原因之二是结合免疫组化结果可知,干扰i PTH之后在中枢神经系统和肠组织中的大部分神经投射的阳性荧光信号已消失,但在一些神经肠内分泌细胞依旧保持着免疫阳性,可能这些仅存的i PTH即可保证机体的需要;再次,利用实时荧光定量PCR对该系统干扰后蜕皮激素合成与代谢、保幼激素合成与代谢及调控羽化相关基因的表达量进行检测,结果表明,i PTH信号系统在干扰之后,蜕皮激素合成通路中的关键酶基因CYP307A1、转录因子E74、Broad complex（Br-C）、FTZ-F1的表达量在i PTHRs干扰后均未发生改变;即使合成通路中的CYP315A1和CYP314A1表达量呈现轻微下调,并未造成干扰组3天蛹和5天蛹蜕皮激素含量的改变;保幼激素合成关键酶CYP15A1和JHAMT的表达量在i PTHRs干扰后显着上调;羽化相关神经肽CCAP、bursicon的受体CCAPRs、Rickets表达未受影响。这些结果表明了i PTHRs造成的蜕皮羽化失败并不是通过影响蜕皮激素合成与代谢、羽化相关调控基因造成的,而保幼激素的合成受到影响则可能是原因之一;另外,通过差异转录组学和相对定量蛋白质组学对i PTHRs干扰之后的下游调控网络进行分析,结果显示,在转录层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出1231个、1683个差异表达基因,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组仅鉴定出14个差异表达基因。其中,i PTHRs在干扰后主要引起了能量与营养代谢（如异柠檬酸脱氢酶、ATP结合盒蛋白、果糖1,6-二磷酸酶）、表皮结构成分（几丁质合酶1、几丁质脱乙酰基酶、表皮蛋白若干家族成员）相关基因表达量改变,同时保幼激素代谢相关的保幼激素酯酶、保幼激素环氧水解酶表达量也明显上调;在蛋白层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出34个、39个差异表达蛋白,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组鉴定出41个表达蛋白（主要由于dsi PTHR1组异常表达所致）。与转录组学测序一致的是,与对照组相比,干扰组的差异表达蛋白也集中在能量与营养代谢、表皮结构成分上,其中多个基因（如ATP合成酶亚基delta、肌钙蛋白亚基T、CPR18、CPAP1-H等）在转录、蛋白水平上均显示出下调趋势,表明了i PTHRs可能通过影响能量代谢影响赤拟谷盗的羽化行为,并造成表皮成分的合成异常;最后,通过对不完全变态昆虫褐飞虱i PTHRs的序列分析及RNA干扰功能验证,我们发现,其两个i PTHRs为物种内复制,序列相似性高达53.06%,这两个受体与赤拟谷盗i PTHR2更为接近,结合其它物种的i PTHRs多序列比对分析,表明i PTHR2可能是昆虫中的祖先基因;RNA干扰结果显示四龄若虫干扰i PTHR1和i PTHR2后部分个体蜕皮羽化失败,存活率分别降低至26.7%和55.5%,表明了i PTHRs在不完全变态昆虫褐飞虱的生长发育过程中也承担着至关重要的作用。
谯明[7]（2020）在《转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究》文中指出目的:筛选芹菜子和芹菜根抗肝纤维化有效部位及单体活性成分;构建芹菜子活性成分-作用靶点网络和蛋白互作网络,初步预测芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制;阐明芹菜素对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的影响及作用机制,为后续新药研发提供理论基础。方法:1)采用TGF-β1诱导HSC-LX2细胞活化,建立体外肝纤维化模型。通过检测细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量比较芹菜子和芹菜根不同提取物及其萃取部位体外抗肝纤维化活性;2)通过检测HSC-LX2细胞增殖、凋亡及肝纤维化指标含量,观察芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性;采用GC-TOF-MS和UHPLC-MS/MS技术对芹菜子有效成分进行识别分析,共同考察芹菜子抗肝纤维化活性与有效成分之间的相关性;3)采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、ODS和聚酰胺柱色谱等方法对芹菜子化学成分进行分离纯化,利用1H-NMR和13C-NMR鉴定化合物结构,并对所有单体化合物进行体外抗肝纤维化活性筛选;4)通过TCMSP数据库、文献挖掘和本实验室已有研究获取芹菜子活性成分,Swiss Target Prediction平台和BATMAN-TCM数据库获取成分靶点,Gene Cards和OMIM数据库预测和筛选肝纤维化的作用靶点。采用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络,String和Cytoscape软件绘制蛋白互作网络。采用DAVID对靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,结合相关文献分析芹菜子活性成分抗肝纤维化的作用机制;5)雄性Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、阳性对照组(复方鳖甲软肝片,0.60g·kg-1)及芹菜素高剂量组(0.60g·kg-1)、中剂量组(0.30g·kg-1)和低剂量组(0.15g·kg-1),每组15只。除正常组外,其余各组灌胃给予40%CCl4花生油溶液(1m L·kg-1),正常组给予相应体积花生油,每周2次,连续9周。从造模第5周起,给药组分别灌胃给予相应的受试药物,正常组和模型组给予等量溶媒,每天1次,连续5周。给药结束后收集大鼠血清和肝、脾组织,采用全自动生化仪检测大鼠血清ALT、AST、ALB、TP、ALP和LDH水平;试剂盒测定大鼠血清TB、DB、GSH-PX、Hyp、SOD和MDA水平;ELISA法检测大鼠血清中HA、LN、PCIII和IV-C含量;HE和Masson染色观察肝脏病理组织学变化;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1和COL-I蛋白的表达;6)采用转录组学和蛋白质组学方法筛选大鼠肝组织中差异表达的基因和蛋白质,对差异表达的基因和蛋白质进行生物信息学分析。整合转录组学和蛋白质组学分析结果,对差异m RNA-protein进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并采用q RT-PCR和Western blot对富集程度高的靶蛋白进行验证,进一步阐明芹菜素抗肝纤维化的作用机制。结果:1)芹菜子60%乙醇提取物和芹菜根95%乙醇提取物及其石油醚部位可有效抑制HSC-LX2细胞活化,降低LN、HA和PCIII的含量,促进细胞凋亡,其中芹菜子60%乙醇提取物石油醚部位体外抗肝纤维化作用最强,故将芹菜子作为后续研究对象;2)芹菜子60%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位高剂量对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为75.14%、73.52%、54.09%和43.36%,细胞凋亡率分别为37.5%、4.3%、0.7%和0.1%,石油醚部位细胞上清液中肝纤维化指标含量更接近于正常组。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位中共鉴定识别出122个化学成分,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位体外抗肝纤维化活性呈现由强到弱的趋势,与所含芹菜素、芹菜甲素、秦皮乙素及其含量呈正相关;3)从芹菜子中共分离鉴定了9个单体化合物,分别为芹菜素、佛手柑内酯、芹菜苷、芦丁、山柰酚、木犀草素、槲皮素、大叶茜草素和芹菜甲素。芹菜素、芹菜苷、芦丁、山柰酚、槲皮素和芹菜甲素对HSC-LX2细胞增殖抑制率分别为71.32%、30.87%、15.81%、22.02%、48.28%和61.93%;4)筛选得到芹菜子17个活性成分,其中apigenin、aesculetin和3-n-butylphthalide具有较多的作用靶点,可能在芹菜子的药理作用中起到较为核心的作用。芹菜子活性成分作用的69个靶点主要涉及collagen catabolic,inflammatory response和negative regulation of cholesterol storage等生物过程,通过调节TGF-β,NF-κB和PI3K/AKT等信号通路来发挥抗肝纤维化作用;5)与模型组相比,芹菜素各剂量组大鼠血清肝纤维化四项指标HA、LN、PCIII和IV-C含量均显着降低（P<0.05）;血清肝功能指标AST、ALT、ALP、MDA、LDH、Hyp、TP、TB和DB水平显着下降（P<0.05）,ALB、SOD和GSH-PX水平显着升高（P<0.05）;大鼠的肝脾指数明显降低（P<0.05）。病理组织学及免疫组化结果显示,芹菜素低、中、高剂量组大鼠肝纤维化及炎性程度逐渐减轻;6)通过转录组学分析,芹菜素组中有161个基因上调,891个基因下调,涉及的信号通路主要包括Cytokine-cytokine receptor interaction,PPAR signaling pathway,Focal adhesion和Cell adhesion molecules。通过蛋白质组学分析,芹菜素组中正调控蛋白207个,负调控蛋白332个,涉及的信号通路主要包括HIF-1/VEGF/MAPK signaling pathway,Focal adhesion和ECM-receptor interaction。转录组学和蛋白质组学数据整合分析结果显示,芹菜素可能通过HIF-1/MAPK/e NOS/VEGF/PI3K/AKT signaling pathway,Focal adhesion和Regulation of actin cytoskeleton发挥抗肝纤维化作用。q RT-PCR和Western blot验证实验结果显示,大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、HIF-1α、VEGF、i NOs、FAK和p38 MAPK m RNA和蛋白表达受到抑制,肝组织炎症及纤维化程度明显减轻。结论:1)从芹菜子中分离得到9个化合物,其中佛手柑内酯和大叶茜草素为首次从芹菜子中分离得到,大叶茜草素为首次从该属植物中分离得到。芹菜子有效成分识别分析结合单体化合物体外药效实验,确定了芹菜素、芹菜甲素和秦皮乙素是芹菜子抗肝纤维化的主要活性成分,其中芹菜素生物活性最强;2)网络药理学初步预测了芹菜子活性成分抗肝纤维化主要涉及的生物过程和信号通路,体现了芹菜子“多成分-多靶点-多途径”的作用特点,为进一步开展芹菜子活性成分抗肝纤维化作用的药理学研究提供了新思路和新方法;3)转录组学和蛋白质组学联合分析,从整体水平探讨了芹菜素抗肝纤维化作用机制,建立了“多靶点-多通路”复杂网络关系,从系统层面探析芹菜素抗肝纤维化机制为通过TGF-β、HIF-1、MAPKs、PI3K/AKT、e NOS和VEGF介导的FAK磷酸化途径来改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化。
牟翔宇[8]（2019）在《肝疏泄不及病理与疏肝药理-PMDD肝气郁证大鼠主要病理变化与柴芍皂苷主要药效机理研究》文中研究说明目的:经前烦躁障碍症（Premenstrual Dysphoric Disorder,PMDD）属传统中医学中的月经前后诸症范畴,时至今日,其深层病理机制仍然有待深入研究。治疗该症的现代化合类药物副作用大、未区分亚型故疗效欠佳,因此寻找替代疗法迫在眉睫。柴胡-白芍药对在中医临床上被广泛应用于治疗肝气郁结,虽PMDD肝气郁证是PMDD的重要亚型,但却鲜见二药治疗PMDD肝气郁证的报道。故本研究拟在检索肝主疏泄理论及实验文献的基础上,制备PMDD肝气郁病证结合动物模型并探查柴胡皂苷与芍药苷配伍（下文中简称柴芍皂苷）治疗该证的作用。通过检测模型大鼠关键生物指标变化以及海马脑区蛋白质组学,以期发现PMDD肝气郁证发病及柴芍皂苷干预的生物标记物,进而揭示肝疏泄不及的深层发病机制并促进治疗药物的研发。方法:（1）通过知网中国期刊全文数据库、万方数据库及PubMed数据库对柴胡皂苷、芍药苷的药理作用及经前烦躁障碍症、肝主疏泄等关键词进行文献检索及理论研究;（2）首先利用强迫游泳实验（Forced Swimming Test,FST）、悬尾实验（Tail Suspension Test,TST）对柴芍皂苷进行基于治疗抑郁样情绪小鼠的效果评价。（3）结合阴道电阻检测动情周期方法,利用强迫游泳应激筛选制备出PMDD肝气郁证大鼠模型,利用FST、高架十字迷宫实验（Elevated Plus-Maze,EPM）、洒水实验（Splash Test）对模型大鼠进行行为学评价。（4）对符合PMDD肝气郁证大鼠模型标准的大鼠予以三个剂量的柴芍皂苷及氟西汀干预,干预结束后再次对实验大鼠进行上述行为学评价,验证柴芍皂苷治疗PMDD肝气郁证的效果。（5）利用ELISA（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测模型大鼠外周血、下丘脑、海马中的P、ALLO、E2等生物学指标,并进行各组间的含量变化对比。（6）应用TMT相对定量蛋白质组学技术对PMDD肝气郁证模型大鼠海马脑区进行研究,样品经Q Exactiv eTM HF-X质谱仪在数据依赖采集模式下检测。串联质谱图经过PEAKS Studio version X（Bioinformatics Solutions Inc,Waterloo,Canada）分析后,通过GO分析、KEGG分析结果探讨PMDD肝气郁证模型大鼠海马脑区蛋白表达变化。结果:（1）小鼠药效研究部分:通过小鼠FST以及TST实验发现,各给药组对比空白对照组都出现了较为明显的变化。氟西汀给药组对比空白对照组其悬浮不动时间在三次实验中都呈降低趋势,且第二次实验显示其悬浮不动时间显着降低（P<0.05,P<0.01）。柴芍皂苷高剂量组对比空白对照组其悬浮不动时间在三次实验中也都显示出了相同的降低趋势,且第二次实验与第三次实验都显示其相对空白对照组出现了显着降低（P<0.05,P<0.01）,柴芍皂苷低剂量组对比空白对照组其悬浮不动时间出现了降低趋势,三次实验中第二次实验中的两组对比存在显着性差异（P<0.01）。（2）通过强迫游泳实验结合动情周期规律性检测,成功制备出了符合PMDD肝气郁证临床表现规范的大鼠模型,即模型大鼠具有规律的动情周期与“经前出现症状,经后症状消失”的特点,模型大鼠非接受期悬浮不动时间与接受期悬浮不动时间存在显着性差异（P<0.05,P<0.01）,高架十字迷宫实验结果与洒水实验结果都辅证了利用FST制备PMDD肝气郁证模型具有较好的效度。而给予模型组大鼠柴芍皂苷及氟西汀治疗后,其悬浮不动时间、悬浮不动次数以及洒水实验中的修饰时间等都出现了明显的改变。（3）ELISA结果提示PMDD肝气郁证模型大鼠的抑郁状态与ALLO、P、E2在外周血清及海马脑区内的含量改变存在高度相关,ALLO含量受P的下降影响而显着减少,模型组大鼠血清中E2含量的降低可能是PMDD肝气郁证的发病机制之一。柴芍皂苷能够通过升高血清内的ALLO、P、E2含量以及海马脑区中ALLO含量,下丘脑中P含量以改善PMDD肝气郁证症状。（4）蛋白质组学结果显示,与模型组相比,正常对照组共发现70个差异蛋白,柴芍皂苷低剂量组共发现260个差异蛋白,氟西汀给药组共发现189个差异蛋白。与正常对照组相比,柴芍皂苷给药组共发现277个差异蛋白,氟西汀给药组共发现228个差异蛋白。对模型组、柴芍皂苷给药组及正常对照组的差异蛋白取交集后发现,模型组下调、柴芍皂苷给药组上调且功能明确的差异表达蛋白有Edem3、Xk、Rraga、Kcnma1、Thsd7b;而模型组上调、柴芍皂苷给药组下调且功能明确的差异表达蛋白有Eipr1、Prkaca、Hba-a3、Ywhah。结论:（1）中医学认为本病病位主要在肝且病性虚实夹杂,故治疗多从肝论治且归病因于肝失疏泄,利用含柴胡—白芍药对治疗肝疏泄不及所致肝气郁结一证的经典方剂在临床上被广泛应用,故采用柴芍二药组分治疗PMDD肝气郁证有着很高的研究价值。本研究中小鼠行为学测试表明柴芍皂苷干小鼠抑郁样情绪有明显的改善作用,而大鼠实验表明柴芍皂苷对于PMDD肝气郁证大鼠模型同样有着良好的治疗效果。（2）PMDD肝气郁证大鼠模型的发病机制与外周血及部分脑区孕酮、四氢孕酮、雌二醇的含量改变存在密切关联,柴芍皂苷可以通过上调上述激素含量改变起到治疗作用。（3）蛋白质组学结果提示,PMDD肝气郁证发病机制可能与Prkaca、Kcnma1以及Ywhah等蛋白表达相关,其中Kcnma1蛋白的下调提示钙离子通道激活调控、Prkaca蛋白的上调提示cAMP信号通路调控,Ywhah蛋白上调提示磷酸丝氨酸结合蛋白介导信号传导。而柴芍皂苷可以通过多途径、多靶点的治疗效应逆转上述蛋白表达,因此我们推测PMDD肝气郁证的发病机制可能与海马脑区中Ywhah及Prkaca等蛋白的表达相关,而将上述蛋白作为PMDD肝气郁证的诊断生物标志物及柴芍皂苷的治疗靶点值得进一步深入验证与探索。
孙启慧[9]（2019）在《双黄连制剂抑菌抗病毒药效物质基础和组方结构配伍及作用机理研究》文中提出目的:本研究通过对双黄连制剂的化学成分表征、指纹图谱建立、体内外药效学实验、大数据谱效相关分析以及多组学联合等研究,阐明双黄连制剂抑菌抗病毒的药效物质基础,揭示其组方配伍规律,探寻该药物的作用靶点及作用机理,进而,建立谱-效相关质量评价系统,并对组方进行优化加减,为中药新药研发提供技术支撑。方法:1.收集不同厂家不同批次的双黄连口服液共计50批,不同产地、厂家和批次的金银花、黄芩和连翘各10批,原药材按照2015版《中国药典》双黄连口服液制备方法,分别制备双黄连制剂复方、拆方以及各单味药制剂共计70批。在课题组前期对双黄连口服液研究的基础上,建立双黄连制剂的LC-QTOF/MS的指纹图谱测定方法,筛选共有峰并对其进行定性和相对定量。2.以金黄色葡萄球菌和呼吸道合胞病毒为研究对象,进行体内外抗RSV和体外抑菌的药效学实验。体内抗RSV以小鼠体重、脏器指数、肺组织病理切片以及不同的炎性因子为检测指标;体外抗RSV以治疗指数（TI）为指标;体外抑菌以抑菌率为指标,判断双黄连制剂的体内外药效。3.采用灰色关联度分析结合偏最小二乘回归分析方法,对不同配伍方式的双黄连制剂中药效物质进行敏感度和贡献度分析,探寻双黄连制剂中针对不同药理实验发挥关键作用的化学成分,从而推断该复方的君、臣配伍关系。另外,采用最小二乘支持向量机（LS-SVM）法建立双黄连制剂的谱-效相关质量评价系统。4.采用LC-MS/MS技术分别对小鼠的肺组织进行蛋白质组学和代谢组学分析,使用R语言、XCMS、SPSS以及SIMCA-P等对数据进行处理,分析小鼠肺组织中蛋白质和内源性代谢物的差异性变化,筛选差异性蛋白以及潜在的生物标志物,探寻双黄连制剂体内抗RSV的作用靶点和机理。结果:1.通过标准品对照,一级和二级质谱信息解析以及结合文献报道,对双黄连制剂复方制剂中的93个成分进行了初步定性,其中45个来源于金银花,26个来源于黄芩,22个来源于连翘,明确了双黄连制剂的药效物质基础;并对双黄连制剂中的48个出峰稳定、线性良好的物质峰进行了相对定量。2.采用PLS建模综合评价不同双黄连制剂体内抗RSV的药效结果显示,RSV小鼠模型复制成功,体重、脏器指数、肺组织病理切片、炎性因子等各项药理指标显示模型组小鼠病变严重,经不同配伍的双黄连制剂干预后均出现不同程度的回调状态,其中购买的双黄连口服液和制备的双黄连口服液整体药效最好,在其他各拆方和单味药中连翘表现出相对较好的体内抗RSV的效果。体外抗病毒和抑菌实验结果显示:购买的50批双黄连口服液体外抗RSV效果差别较大,TI值在4-40之间;原型药2倍稀释液体外抑菌效果在60%-95%之间;实验室制备的双黄连制剂复方治疗效果显着,其他拆方和单味药均未表现出较好的体外抗RSV的效果,体外抑菌结果显示双黄连制剂复方以及单味药连翘效果十分显着均达到85%以上。3.灰色关联度和偏最小二乘回归分析结果显示:体外抑菌结果影响显着的成分包括槲皮素、金丝桃苷、连翘苷等物质大多来自于连翘药材,说明双黄连制剂在体外抑制金黄色葡萄球菌生长作用中起主要作用的成分来自连翘,组方中连翘发挥了主要的药效作用。双黄连制剂体外抗RSV的主要化学成分来自金银花,分析结果显示金银花中的咖啡酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和断氧马钱子苷等成分与抗RSV关联度大,影响显着,组方中发挥主要药效作用的为金银花。采用LS-SVM法分别构建了60批双黄连复方制剂体外抑菌和抗RSV的谱-效关系数学模型,结果显示所构建的数学模型对每批样品的拟合药效结果偏差均在0.35%以内,验证样本的相对偏差均在5%以内。4.蛋白质组学研究发现了38个与该模型以及药物干预密切相关的差异性蛋白,包括Cd81,Oas3,Rock1等这些差异性蛋白主要涉及的信号通路包括免疫系统过程,防御反应过程,花生四烯酸结合过程,Toll样受体结合过程等。代谢组学研究结果显示模型组小鼠肺组织中多种内源性代谢物代谢异常包括:牛磺酸、葡萄糖、氨基酸、甘油磷脂等物质,给药组小鼠中以上多种代谢异常的物质趋于正常,主要涉及TCA循环、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、泛酸和Co A生物合成等代谢通路。结论:1.双黄连复方制剂中含有多种药效成分,体外抑制金黄色葡萄球菌,体内外抗RSV均有显着的治疗作用。2.指纹图谱与药效的相关性分析得出:双黄连制剂体外抑菌起主要作用的成分主要来自连翘,体外抗RSV起主要作用的成分主要来自金银花;该结果量化分析了双黄连组方中主要药效成分及其归属,科学阐释了双黄连组方的配伍规律,为复方中药配伍及组分新药研究提供了新的思路和方法。3.双黄连制剂复方构建的数学模型不仅可以单纯根据指纹图谱信息对药物进行质量评价,而且能够做到根据指纹图谱预测药效结果,可以为双黄连口服液谱效相关质量综合评价体系的建立提供基础,进一步实现药物评价的全面性、合理性和准确性。4.多组学联合实验发现双黄连复方制剂治疗RSV感染的小鼠模型作用靶点与炎症过程和免疫过程密切相关;小鼠在感染RSV以后机体多种内源性物质发生代谢紊乱,包括牛磺酸、苯丙氨酸、葡萄糖、甘油磷脂等;双黄连复方制剂能够在氨基酸代谢、甘油磷脂代谢TCA循环等多个代谢通路上对RSV感染引起的代谢紊乱进行一定的正向调节作用,使机体紊乱的代谢水平逐步恢复正常,为中药复方作用机制研究提供了新的思路和方法。
尚志[10]（2019）在《核酸结合蛋白和血清的定量蛋白质组学研究及其在肺癌中的应用》文中进行了进一步梳理定量蛋白质组学是开展癌症研究的重要工具,特别是发现诊疗标志物和调控关键蛋白。肺癌的转移和耐药一直是其诊疗中面临的难题,如何评价癌症治疗的效果亟需发现特异的分子指标。血液作为人体最重要的体液,是临床常用的检测样本。定量比较肺癌治疗不同阶段血清中蛋白质组的变化,有助于发现癌症治疗评价的生物标志物,探究癌症转移、耐药的分子机制。核酸结合蛋白（NABPs）广泛介导细胞内的基本功能,由于缺乏高效的富集方法,其分离分析极具挑战性,开发新策略将有助于其在癌症中的功能研究。本研究利用多种定量蛋白组学技术,对NABPs和肺癌血清蛋白质组进行了系统的研究,取得的成果如下。第一,发展了一种基于碳纳米材料的NABPs富集新策略,发现肺癌进展相关蛋白。通过比较不同碳纳米材料提取细胞NABPs的差异,我们发现氧化石墨烯（GO）携带的羟基和羧基通过阳离子介导的离子键可以吸附更多的核酸,从而富集NABPs的效率最高。从GO富集的样品中,我们成功鉴定了约2400种蛋白质。与全细胞裂解物相比,鉴定的NABPs中88%被显着富集,表明新策略的高效和高选择性。将发展的方法用于比较两种不同进展能力肺癌细胞中的NABPs,免标记定量（Label-free）蛋白质组学技术筛选出117个差异表达的NABPs,在肺癌细胞和肺癌血清中的验证结果表明,蛋白SAMHD1的水平在肺癌进展时显着增加,可作为肺癌进展潜在的标志物。第二,基于抗体微阵列,发现并验证纤维蛋白原二型异构体（FGA2）是表皮生长因子受体（EGFR）突变肺癌靶向治疗预后的标志物。我们利用含41472个抗体的微阵列芯片,对EGFR突变肺癌患者靶向治疗前（基线）、治疗后部分缓解（PR）和耐药后肺癌进展（PD）三个时期的血清样品进行分析。对候选蛋白的抗体初步验证后,通过免疫共沉淀联合质谱鉴定候选蛋白质是纤维蛋白原α链二型异构体（FGA2）。在发现组和预验证组血清样本中的验证结果显示,血清FGA2水平与EGFR-TKI靶向治疗效果相关（p<0.05）。FGA2在区分基线组与正常组和PR组的AUC值分别为1.0和0.98。细胞水平的研究结果同样证实EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）可以抑制FGA2的表达和分泌,部分揭示了肺癌患者在治疗期间血清中FGA2下调的机制。第三,通过血清定量蛋白质组学研究,发现并证明蛋白TRIM33的缺失通过上调SERPINE1的表达促进肺癌EGFR-TKI耐药的产生。利用串联质谱标签（TMT）和免标记定量蛋白质组学技术,分别从肺癌患者治疗前后血清和EGFR突变的肺癌细胞系中寻找EGFR-TKI耐药相关的关键蛋白,联合分析发现并验证了三个候选蛋白,包括BZW1、TRIM33和SERPINE1,它们在靶向治疗基线期、治疗PR期和PD三个时期的血清中有显着的变化并与靶向治疗的疗效相关（p<0.05）。蛋白功能研究表明,TRIM33的缺失可以促进厄洛替尼敏感细胞株产生耐药性,并增强了肺癌细胞的侵袭能力。实验发现,TRIM33敲低的细胞中SERPINE1的表达上调,同时敲低SERPINE1可以恢复肺癌细胞对EGFR-TKI的敏感度,并降低细胞的侵袭能力。综上所述,我们围绕肺癌的转移和耐药等难题,基于定量蛋白质组学开展了NABPs富集新方法研究和血清蛋白质组研究,发现并验证了肺癌转移、耐药、靶向治疗相关的重要蛋白。发展的NABPs富集新方法具有简单、高效、高选择的优势,有望广泛用于生物医学研究。通过抗体微阵列芯片发现的FGA2可以作为评估EGFR突变肺癌靶向治疗预后的指标,为相关研究提供重要参考。从血清样品中发现并验证的参与耐药发生的关键蛋白,对于临床上抑制耐药发生的关键靶点发现具有重要的指导意义,对阐明癌症耐药机制提供新的思路和策略。
二、蛋白质组学及其在新药研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白质组学及其在新药研究中的应用（论文提纲范文）
（1）心梗致心衰潜在预警标志物发现及生脉注射液作用解析研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 心衰标志物研究进展 |
| 1 心肌细胞损伤与应激 |
| 1.1 心肌损伤 |
| 1.1.1 心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin, cTn) |
| 1.1.2 心型脂肪酸结合蛋白(Heart fatty-acid binding protein, H-FABP) |
| 1.1.3 肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain 1,MLCK-Ⅰ) |
| 1.2 心肌压力 |
| 1.2.1 脑钠肽(Brain Natriuretic Peptides, BNPs) |
| 1.2.2 肾上腺髓质素(Adrenomedullin, ADM) |
| 1.2.3 神经调节蛋白(Neuregulin 1,NRG-1) |
| 2 神经激素类 |
| 2.1 内皮素-1(Endothelin-1,ET-1) |
| 2.2 精氨酸加压素(Arginine vasopressin, AVP) |
| 3 炎症与心室重塑 |
| 3.1 半乳糖凝集素-3(Galectin 3,Gal-3) |
| 3.2 生长分化因子15(Growth-differentiation factor 15, GDF-15) |
| 3.3 ST2 (Interleukin-1 receptor-like 1, ST2) |
| 3.4 基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases 9,MMP-9) |
| 3.5 C反应蛋白(C reactive protein, CRP) |
| 4 小结 |
| 综述二 生脉注射液在心血管疾病中的研究进展 |
| 1 生脉注射液在心血管疾病中的临床应用 |
| 1.1 心肌梗死 |
| 1.2 心力衰竭 |
| 1.3 心肌病 |
| 1.4 冠心病及其他 |
| 2 生脉注射液作用机制研究进展 |
| 2.1 调节能量代谢 |
| 2.2 减缓氧化应激损伤 |
| 2.3 抗炎作用 |
| 2.4 保护心肌细胞 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 心梗致心衰演变过程研究 |
| 第一章 心梗致心衰演变过程疾病表型变化研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及心肌梗死模型的建立 |
| 2.2 取材及样本的处理与保存 |
| 2.3 ELISA法检测cTnT、BNP与NT-proBNP的表达水平 |
| 2.4 LDH与CK-MB检测 |
| 2.5 超声心动法检测心功能 |
| 2.6 HE染色与Masson染色 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌酶与cTnT表达水平的变化 |
| 3.2 BNP与NT-proBNP表达水平的变化 |
| 3.3 心功能变化 |
| 3.4 HE与Masson染色结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 心梗致心衰演变过程心脏蛋白质组学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠心肌组织蛋白样本的收集与制备 |
| 2.2 蛋白质组学分析 |
| 2.3 生物信息学和统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 心梗致心衰演变过程分子变化 |
| 3.2 心梗致心衰演变过程GO及通路富集结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 心梗致心衰潜在早期预警标志物的发现与验证 |
| 第一章 心梗致心衰潜在预警标志物的发现 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 非监督模式分析 |
| 2.2 早期预警标志物筛选 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 非监督模式分析结果 |
| 3.2 早期预警标志物筛选结果 |
| 第二章 心梗致心衰潜在预警标志物验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 ELISA法检测候选标志物表达水平 |
| 2.2 H9c2细胞复苏、培养与冻存 |
| 2.3 实验分组与处理 |
| 2.4 免疫荧光法检测BNP、ANP、VCAN与COL1A1表达水平 |
| 2.5 生脉注射液对COL1A1表达水平的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠血清候选标志物验证结果 |
| 3.2 细胞水平BNP与ANP表达水平变化 |
| 3.3 细胞水平VCAN与COL1A1表达水平变化 |
| 3.4 生脉注射液干预后对COL1A1表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 生脉注射液在心梗致心衰演变过程中主要干预环节研究 |
| 第一章 基于网络药理学对生脉注射液主要干预环节预测分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 “成分-靶标”网络构建 |
| 2.2 生脉注射液高关联性靶标谱分析 |
| 2.3 功能与通路富集分析 |
| 2.4 生脉注射液干预环节预测结果 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 “成分-靶标”网络的构建 |
| 3.2 生脉注射液调控机制初步探究 |
| 3.3 主要干预环节分析结果 |
| 第二章 生脉注射液主要干预环节体内验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物与分组 |
| 2.2 取材及样本的处理与保存 |
| 2.3 心功能评价 |
| 2.4 HE染色与Masson染色 |
| 2.5 ELISA法检测PⅠCP、COL1A1、VCAN表达水平 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生脉注射液能够改善心梗致心衰演变过程中心功能下降 |
| 3.2 生脉注射液能够降低心梗导致的心肌纤维化损伤 |
| 3.3 生脉注射液能够降低PⅠCP、VCAN与COL1A1的表达 |
| 第三章 生脉注射液主要干预环节体外验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药品及试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组及给药处理 |
| 2.2 化学荧光法检测ROS含量 |
| 2.3 微板法检测LDH浓度 |
| 2.4 微板法检测胞内Ca~(2+)浓度 |
| 2.5 免疫荧光法检测ANP与CTGF表达水平 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生脉注射液能够减缓细胞损伤 |
| 3.2 生脉注射液能够降低ROS的积累 |
| 3.3 生脉注射液能够降低胞内Ca~(2+)浓度 |
| 3.4 生脉注射液能够降低ANP、CTGF的表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PA类抗肾癌活性候选药物筛选及肾癌靶点挖掘 |
| 第一章 PA类抗肾癌活性候选药物筛选 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 PAs化合物的结构 |
| 3 PAs化合物的肾癌细胞增殖抑制活性 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞给药 |
| 3.3 PA/GPA抗肾癌增殖活性优于索拉菲尼 |
| 4 PA和GPA的理化性质分析 |
| 5 小结与讨论 |
| 第二章 多组学挖掘PA/GPA抗肾癌作用新靶点 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 转录组学挖掘PA抗肾癌靶点 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 转录组文库构建、质检和上机测序 |
| 2.3 差异表达基因显着性分析 |
| 3 定性蛋白质组学筛选PA相互作用新靶标 |
| 3.1 实验路线及操作方案 |
| 3.2 液-质连用(HPLC-MS/MS)分析与小分子PA结合的蛋白质成分 |
| 4 WGCNA分析发现PRDX1/4与PA所影响基因处于同一表达模式 |
| 5 RT-qPCR验证PA/GPA对PRDX1的影响 |
| 5.1 样品制备 |
| 5.2 数据处理及显着性标准 |
| 5.3 RT-qPCR结果分析 |
| 6 临床人肾透明细胞癌组织与癌旁组织PRDX1表达情况 |
| 6.1 样品准备 |
| 6.2 临床人肾透明细胞癌组织中PRDX1低表达 |
| 7 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞增殖抑制率 |
| 7.1 慢病毒转染 |
| 7.2 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞的增殖抑制率 |
| 8 小结与讨论 |
| 第三章 PA/GPA直接结合PRDX1诱导肾癌细胞凋亡 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 激光全息细胞成像系统检测PA诱导ACHN细胞凋亡 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 结果 |
| 3 PA/GPA降低ACHN细胞ROS水平 |
| 3.1 PA降低ACHN肾癌细胞ROS水平 |
| 3.2 PRDX1敲低后PA/GPA降ROS作用消失 |
| 4 PA/GPA通过抑制PRDX1的Tyr194磷酸化增加过氧化物酶活性 |
| 5 PA/GPA促使PRDX1入核增加 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 结果 |
| 6 表面等离子共振实验证明PA/GPA与PRDX1蛋白结合 |
| 6.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 6.2 结果 |
| 7 PA/GPA作用于PRDX1二聚体结合界面 |
| 8 小结与讨论 |
| 第四章 PA/GPA对ACHN荷瘤裸鼠成瘤能力的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 人肾癌裸鼠移植瘤模型建立及给药方案设计 |
| 2.1 人肾癌裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 2.2 实验设计与分组 |
| 2.3 数据处理及显着性标准 |
| 3 荷瘤小鼠体重、肿瘤体积、重量及免疫组化检测 |
| 4 PA/GPA下调PRDX1抑制荷瘤小鼠肿瘤生长 |
| 5 PA/GPA诱发荷瘤裸鼠肝毒性 |
| 6 小结与讨论 |
| 第二部分 PA/GPA肝毒性机制研究 |
| 第五章 PA/GPA毒性机制挖掘 |
| 1 试剂和仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 TMT标记定量蛋白质组学差异表达蛋白鉴定 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 差异表达蛋白鉴定与KEGG通路富集 |
| 3 转录组学与定量蛋白质组学关联研究PA/GPA肝毒性靶点 |
| 3.1 差异靶基因的挖掘 |
| 3.2 差异靶基因的肝肾组织分布 |
| 3.3 PA/GPA对HepG2细胞胆固醇代谢靶基因表达的影响 |
| 4 PA/GPA的线粒体毒性 |
| 4.1 样品准备 |
| 4.2 PA/GPA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5 PA/GPA增加HepG2细胞对低密度脂蛋白的摄取 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 PA/GPA对HepG2细胞摄取LDL能力的影响 |
| 6 PA/GPA加剧高胆固醇诱导的小鼠肝损伤 |
| 6.1 实验动物 |
| 6.2 总体实验设计与分组 |
| 6.3 数据处理与显着性标准 |
| 6.4 小鼠肝脏形态学和生化指标 |
| 7 LXRα的激活是PA/GPA产生肝毒性的必要条件 |
| 8 PA/GPA延缓肝脏胆固醇代谢 |
| 9 PA/GPA对胆汁酸代谢信号通路Cyp7a1基因具有抑制作用 |
| 10 PA/GPA通过抑制LXRα调控CYP7A1的表达 |
| 10.1 siLXRα敲低HepG2细胞株的构建 |
| 10.2 PA/GPA通过抑制LXRα下调CYP7A1的表达 |
| 11 小结与讨论 |
| 第六章 PA/GPA与LXRα蛋白体外结合能力探讨 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 薛定谔Maestro v11.1对PA/GPA-LXRα进行计算机模拟分子对接 |
| 3 SPR实验证明PA与LXRα蛋白直接结合 |
| 3.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 3.2 PA能在体外与LXRα蛋白直接结合 |
| 4 粉蝶霉素类化合物与LXRα毒效关系探讨 |
| 5 小结与讨论 |
| 第七章 PA/GPA早期ADME研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 PA/GPA的吸收与分布 |
| 2.1 动物准备 |
| 2.2 总体实验设计与分组 |
| 2.3 高分辨质谱、UPLC、UPLC-MS/MS鉴定方法 |
| 2.4 样品的处理和进样 |
| 2.5 PA/GPA在小鼠体内的药时曲线和肝组织含量 |
| 3 PA的代谢 |
| 3.1 PA在人肝微粒体中的CYP代谢 |
| 3.2 PA在人肝微粒体中的UGT代谢 |
| 4 小结与讨论 |
| 第八章总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 本论文的创新之处 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（3）醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 醒脑健神方治疗缺血性中风(痰热腑实证)的临床研究 |
| 1 试验目的 |
| 2 试验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 网络药理学预测及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 HPLC-MS/MS法成分测定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 基于蛋白质组学的醒脑健神方对PC12的抗缺氧机制研究 |
| 第一节 4D Lable Free定量蛋白质组学检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二节 PRM定量蛋白质组学检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第三节 修饰预筛选 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 药用植物长春花及白桑在肿瘤治疗的应用现状及前景 |
| 1.1.2 药用植物对紫外UVB辐射的响应 |
| 1.2 蛋白质组学技术发展及其在植物胁迫响应机制方面的研究进展 |
| 1.2.1 蛋白质组各流程技术及进展 |
| 1.2.2 植物单细胞型、亚细胞器及修饰型蛋白质组学研究进展 |
| 1.3 代谢组学及多组学联合分析在研究胁迫响应机制的进展 |
| 1.3.1 植物代谢组学研究技术与进展 |
| 1.3.2 代谢组学及多组学分析植物胁迫响应机制进展 |
| 1.4 植物来源异戊烯基转移酶研究进展 |
| 1.4.1 植物体内异戊烯基化反应及意义 |
| 1.4.2 植物芳香类异戊烯基转移酶功能及特性 |
| 1.4.3 植物芳香类异戊烯基转移酶研究现状及前景 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 |
| 第二章 UVB辐射下长春花磷酸化通路及初生代谢研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 植物来源及处理 |
| 2.2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.3 叶片ATP含量的测定 |
| 2.2.4 磷酸化蛋白的提取与富集 |
| 2.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 2.2.6 全叶片代谢组样品制备及代谢组学分析 |
| 2.2.7 Western-Blotting |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 长春花叶片UVB辐射下ATP含量变化 |
| 2.3.2 磷酸化蛋白的鉴定及丰度检测 |
| 2.3.3 基于GC-TOF/MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 2.3.4 关键差异表达蛋白的Western-Blotting鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 UVB辐射下长春花叶片内钙离子相关通路激活 |
| 2.4.2 UVB辐射下长春花糖酵解相关通路变化导致ATP增加 |
| 2.4.3 UVB辐射对长春花叶片造成氧化胁迫并激活次生代谢途径 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 UVB辐射下长春花能量调控及次生代谢研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 植物来源及处理 |
| 3.2.2 试剂及仪器 |
| 3.2.3 不同线粒体呼吸复合体抑制剂作用下ATP含量测定 |
| 3.2.4 叶片线粒体的纯化与蛋白富集 |
| 3.2.5 蛋白质组鉴定 |
| 3.2.6 全叶片代谢组学分析 |
| 3.2.7 qRT-PCR |
| 3.2.8 数据处理与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同线粒体呼吸链抑制剂处理后长春花叶片在UVB辐射下ATP含量变化 |
| 3.3.2 长春花叶片线粒体蛋白富集与纯化程度检测 |
| 3.3.3 UVB辐射下长春花叶片线粒体差异蛋白的鉴定与功能注释 |
| 3.3.4 基于LC-MS技术检测的长春花UVB辐射下代谢物变化 |
| 3.3.5 差异蛋白质组与代谢组结合分析 |
| 3.3.6 关键差异表达蛋白基因的表达变化情况 |
| 3.4 .讨论 |
| 3.4.1 线粒体参与调控UVB辐射下长春花叶片内ATP含量的变化 |
| 3.4.2 UVB辐射下MEP途径被激活使得单萜类前体物质积累 |
| 3.4.3 氨基酸代谢调控UVB辐射下长春花叶片中吲哚类生物碱的合成 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 UVB辐射结合不同时长暗培养下白桑调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 植物来源与取样 |
| 4.2.2 试剂及仪器 |
| 4.2.3 蛋白质提取及蛋白质组鉴定 |
| 4.2.4 抗氧化水平检测 |
| 4.2.5 甲醇提取物指纹图谱建立与代谢物定量分析 |
| 4.2.6 总黄酮含量测定 |
| 4.2.7 qRT-PCR |
| 4.2.8 数据处理与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点差异蛋白鉴定 |
| 4.3.2 桑叶UVB辐射后不同暗培养时间点次生代谢相关差异蛋白功能分析 |
| 4.3.3 桑叶、枝、根部代谢物指纹图谱及差异代谢物含量测定 |
| 4.3.4 桑叶、枝、根部蛋白鉴定及功能分析 |
| 4.3.5 桑叶、枝、根部次生代谢相关差异性分析 |
| 4.3.6 不同部位差异表达蛋白基因的表达量分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 白桑UVB辐射后暗培养阶段MEP途径内蛋白的变化及意义 |
| 4.4.2 异戊烯基化合物在白桑根部大量积累 |
| 4.4.3 白桑不同组织部位有效成分及相关蛋白分布存在巨大差异 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 白桑叶片UVB辐射下异戊烯基转移酶的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 生物材料来源 |
| 5.2.2 试剂与仪器 |
| 5.2.3 异戊烯基转移酶基因的筛选 |
| 5.2.4 酵母表达载体构建 |
| 5.2.5 酵母表达体系建立 |
| 5.2.6 最适底物的筛选 |
| 5.2.7 烟草瞬时表达载体及表达体系构建 |
| 5.2.8 基因在植物中的功能及亚细胞定位分析 |
| 5.2.9 最适反应条件摸索及米氏常数测定 |
| 5.2.10 基因系统进化分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 白桑中异戊烯基转移酶基因序列及表达信息挖掘 |
| 5.3.2 基因在酿酒酵母细胞内的表达与功能验证 |
| 5.3.3 基因在本氏烟草内的瞬时表达亚细胞定位与功能验证 |
| 5.3.4 异戊烯基转移酶Ma OGT的最适反应条件 |
| 5.3.5 基因系统发育分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 MaOGT的功能及生化性质特点 |
| 5.4.2 MaOGT在白桑次生代谢生物合成途径的意义 |
| 5.4.3 MaOGT在进化发育的位置及意义 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（5）基于化学蛋白质组学的活性天然产物靶点研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状及分析 |
| 1.2.1 天然产物是新药研发的重要来源 |
| 1.2.2 靶点识别在新药研发中的重要作用 |
| 1.2.3 生物活性小分子的蛋白靶点识别策略 |
| 1.2.4 化学蛋白质组学原理与应用 |
| 1.2.5 引入生物素标签构建分子探针的应用 |
| 1.3 简析 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方案 |
| 第2章 活性天然产物与分子探针的生物学活性比较 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 溶液及缓冲液 |
| 2.2.4 溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分子探针的设计与合成 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞复苏 |
| 2.3.4 细胞计数 |
| 2.3.5 细胞传代 |
| 2.3.6 细胞冻存 |
| 2.3.7 XTT比色法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 获取分子探针结合蛋白质的质谱信息 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 溶液及缓冲液 |
| 3.3 分子探针原位标记癌细胞系 |
| 3.3.1 细胞接种 |
| 3.3.2 原位标记MCF7细胞系 |
| 3.4 生物素-链霉亲和素系统富集蛋白质 |
| 3.4.1 可溶性蛋白质溶液的制备 |
| 3.4.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 3.4.3 链霉亲和素磁珠富集蛋白质 |
| 3.5 基于凝胶的亲和性蛋白质组学 |
| 3.5.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.5.2 凝胶质谱样品考染前的银染检测 |
| 3.5.3 凝胶质谱样品的考马斯亮蓝染色 |
| 3.5.4 凝胶胰蛋白酶消化及除盐 |
| 3.5.5 实验结果 |
| 3.6 基于高分辨质谱的亲和性蛋白质组学 |
| 3.6.1 高分辨质谱样品制备前的银染检测 |
| 3.6.2 高分辨质谱样品胰蛋白酶消化及除盐 |
| 3.6.3 实验结果 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 活性天然产物蛋白质组数据处理与功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 分析流程概述 |
| 4.3 富集蛋白筛选 |
| 4.3.1 基于凝胶的亲和性蛋白质组学的富集蛋白筛选 |
| 4.3.2 基于高分辨质谱的亲和性蛋白质组学的富集蛋白筛选 |
| 4.3.3 筛选结果讨论 |
| 4.4 富集蛋白GO及 Reactome富集分析 |
| 4.4.1 介绍 |
| 4.4.2 分析过程 |
| 4.4.3 分析结果 |
| 4.4.4 结果讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词简表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 神经肽及其受体 |
| 1.2.1 神经肽的概念 |
| 1.2.2 神经肽受体 |
| 1.2.3 昆虫等无脊椎动物的神经肽与受体 |
| 1.3 甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.3.1 脊椎动物的甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.3.2 昆虫等无脊椎动物的甲状旁腺激素信号系统 |
| 1.4 昆虫的蜕皮羽化行为及表皮发育 |
| 1.4.1 昆虫的蜕皮与羽化行为 |
| 1.4.2 神经肽对昆虫蜕皮与羽化行为的调控及其它影响因素 |
| 1.4.3 昆虫的表皮形成与发育 |
| 1.5 多组学分析及其在昆虫学中的研究应用 |
| 1.5.1 转录组学分析及其在昆虫学中的应用 |
| 1.5.2 蛋白质组学分析及其在昆虫学中的应用 |
| 1.6 本实验的研究内容和目的意义 |
| 第二章 PTHRs/i PTHRs的适应性进化分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因序列的获取 |
| 2.2.2 序列整理 |
| 2.2.3 系统进化关系的构建 |
| 2.2.4 选择压力的分析 |
| 2.2.5 将正选择位点定位到蛋白质结构 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 代表性的后生动物PTHRs/i PTHRs的系统发生关系分析 |
| 2.3.2 枝位点模型检测到的无脊椎动物类群的正选择位点 |
| 2.3.3 正选择位点在蛋白质结构中的分布 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 i PTHRs的内源性配体i PTH的鉴定及其功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 筛选赤拟谷盗i PTHRs的潜在配体并进行生物信息学分析 |
| 3.3.2 候选配体PXXXamide的 c DNA全长克隆及序列比对 |
| 3.3.3 建立赤拟谷盗i PTHRs的细胞表达系 |
| 3.3.4 候选配体PXXXamide与 i PTHRs的结合实验 |
| 3.3.5 赤拟谷盗内源性配体iPTH的表达模式分析 |
| 3.3.6 赤拟谷盗内源性配体iPTH的功能分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 内源性配体的筛选与鉴定 |
| 3.4.2 PXXXamide在赤拟谷盗及代表性节肢动物中的序列比对 |
| 3.4.3 PXXXamide与赤拟谷盗i PTHRs的的配体-受体关系验证 |
| 3.4.4 赤拟谷盗i PTH的表达模式分析及其与i PTHR1 的共定位关系 |
| 3.4.5 赤拟谷盗内源性配体i PTH的 RNAi结果及原因分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 赤拟谷盗iPTH系统影响蜕皮及羽化的作用机制分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 赤拟谷盗iPTH系统对蜕皮激素合成通路的影响 |
| 4.3.2 赤拟谷盗iPTH系统对保幼激素合成通路的影响 |
| 4.3.3 赤拟谷盗iPTH系统对羽化相关基因的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 赤拟谷盗iPTH系统对蜕皮激素合成通路的影响 |
| 4.4.2 赤拟谷盗iPTH系统对保幼激素合成通路的影响 |
| 4.4.3 赤拟谷盗iPTH系统对羽化行为调控关键基因的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 差异转录组学分析赤拟谷盗i PTHRs的下游信号通路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 转录组学测序样品准备 |
| 5.3.2 转录组学测序的上机流程及后期分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 转录组学测序样品质量分析 |
| 5.4.2 转录组学测序数据质量评估 |
| 5.4.3 Clean Reads回帖参考基因组分析 |
| 5.4.4 基因表达水平分析 |
| 5.4.5 差异表达基因分析 |
| 5.4.6 差异表达基因GO富集分析 |
| 5.4.7 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 相对定量蛋白质组学分析赤拟谷盗i PTHRs的下游信号通路 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 实验试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 蛋白质组学测序样品准备 |
| 6.3.2 蛋白质组学测序样品的上机流程及后期分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 蛋白质组学测序样品质量分析 |
| 6.4.2 蛋白质鉴定结果 |
| 6.4.3 差异表达蛋白质筛选 |
| 6.4.4 差异表达蛋白分析 |
| 6.4.5 差异表达蛋白的GO功能富集分析 |
| 6.4.6 差异表达蛋白的KEGG分析 |
| 6.4.7 基于GO与 KEGG富集的差异表达蛋白功能分析 |
| 6.4.8 差异表达蛋白的干扰表型分析 |
| 6.4.9 共同的差异表达蛋白和差异表达基因分析 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 i PTHRs在不完全变态昆虫褐飞虱中的功能初探 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料、仪器和试剂 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.2.3 实验试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 褐飞虱i PTHRs的结构分析及序列比对 |
| 7.3.2 褐飞虱i PTHRs对其生长发育的影响 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 褐飞虱i PTHRs的基因结构分析 |
| 7.4.2 褐飞虱i PTHRs与赤拟谷盗的i PTHRs的序列比对分析 |
| 7.4.3 褐飞虱i PTHRs对其生长发育的影响 |
| 7.5 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 附录 |
| 附录 A:Gene Bank数据库搜索中获取的i PTH序列Fasta文件 |
| 附录 B:转录组学分析中基于GO与 KEGG富集的差异表达基因分类 |
| 参考文献 |
| 在读期间已/待发表的学术论文及研究成果 |
| 已/待发表的学术论文 |
| 科研项目 |
| 致谢 |
（7）转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 芹菜子和芹菜根抗肝纤维化物质基础研究 |
| 实验一 芹菜子和芹菜根不同提取物及萃取部位体外抗肝纤维化活性筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于GC-TOF-MS和 UHPLC-MS/MS的芹菜子化学成分及抗肝纤维化活性相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 芹菜子单体化合物的分离纯化及其体外抗肝纤维化活性 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 基于网络药理学的芹菜子活性成分抗肝纤维化作用机制预测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 芹菜素对CCl_4诱导的肝纤维化大鼠的保护作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 基于转录组学和蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 实验一 基于转录组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 基于蛋白质组学的芹菜素抗肝纤维化作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 转录组学和蛋白质组学联合分析及验证实验 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与试药 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 芹菜化学成分及药理作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）肝疏泄不及病理与疏肝药理-PMDD肝气郁证大鼠主要病理变化与柴芍皂苷主要药效机理研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 PMDD肝气郁证的传统认识及现代研究进展 |
| 1.PMDD肝气郁证的传统中医学认识 |
| 2.PMDD肝气郁证的现代研究及进展 |
| 3.PMDD肝气郁证的现代研究方法 |
| 第二章 柴芍皂苷对小鼠抑郁样行为的治疗效果研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与药品 |
| 1.3 设备与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物饲养 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 动物给药 |
| 2.4 行为学实验 |
| 2.5 重复实验 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1强迫游泳实验 |
| 3.2悬尾实验 |
| 4.讨论 |
| 第三章 PMDD肝气郁证动物模型的制备及柴芍皂苷的治疗效果评价 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与药品 |
| 1.3 设备与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 制备PMDD肝气郁证大鼠模型 |
| 2.2 PMDD肝气郁证模型大鼠行为学检测 |
| 2.3 实验结果的统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1强迫游泳实验 |
| 3.2高架十字迷宫实验 |
| 3.3洒水实验 |
| 4.讨论 |
| 第四章 PMDD肝气郁证动物模型脑中枢及外周血微观机制探查 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 实验所用仪器平台 |
| 1.4 其他耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 样本的采集 |
| 2.3 ELISA试剂盒的检测方法 |
| 2.4 数据的处理与分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 大鼠外周血血清及下丘脑、海马脑区的ALLO含量检测结果 |
| 3.2 大鼠外周血血清、下丘脑、海马脑区P含量检测结果 |
| 3.3 大鼠外周血血清中E2 含量检测结果 |
| 4.讨论 |
| 第五章 PMDD肝气郁证大鼠模型海马脑区蛋白质组学研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 2.TMT蛋白质组学原理 |
| 3.实验流程 |
| 3.1 样本制备 |
| 3.2 总蛋白的定量 |
| 3.3 SDS-PAGE(样品检测) |
| 3.4 蛋白还原烷基化及酶解 |
| 3.5 TMT标记 |
| 3.6 LC-MS/MS上机测定 |
| 3.7 数据库的检索 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 数据分析流程 |
| 4.2 蛋白质组学结果统计分析 |
| 4.3 差异表达蛋白 |
| 4.4 应用KEGG数据库对差异蛋白进行聚类分析 |
| 5.讨论 |
| 第六章 :分析与总结 |
| 1.研究工作总结 |
| 2.全文结论 |
| 研究特色与不足 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 论文着作 |
（9）双黄连制剂抑菌抗病毒药效物质基础和组方结构配伍及作用机理研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 双黄连制剂药效物质基础研究薄弱 |
| 2 双黄连制剂组方配伍君、臣药味不明确 |
| 3 双黄连制剂质量评价系统需要更全面、科学 |
| 4 双黄连制剂药效作用靶点与机制不明确 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 双黄连制剂化学成分研究进展 |
| 1 双黄连制剂各单味药中化学成分研究进展 |
| 2 双黄连复方制剂中化学成分研究进展 |
| 3 双黄连制剂入血成分研究进展 |
| 第二节 双黄连制剂药理作用研究进展 |
| 1 体外抗病毒和抑菌作用研究进展 |
| 2 体内药理作用研究进展 |
| 3 临床应用研究进展 |
| 第三节 双黄连制剂谱-效相关研究进展 |
| 1 双黄连制剂质量评价技术研究进展 |
| 2 谱-效相关中药质量评价研究进展 |
| 第四节 双黄连制剂组方配伍规律研究进展 |
| 1 不同复方中药配伍规律研究方法进展 |
| 2 双黄连机制复方配伍研究进展 |
| 第五节 双黄连制剂作用机制研究进展 |
| 1 抗病毒作用机理研究进展 |
| 2 抗菌作用机理研究进展 |
| 3 蛋白质组学研究进展 |
| 4 代谢组学研究进展 |
| 第二章 双黄连制剂的化学成分研究和指纹图谱的建立 |
| 第一节 双黄连制剂样品的收集和制备 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 样品收集和制备 |
| 3 双黄连制剂提取物的制备 |
| 4 实验结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 第二节 双黄连制剂中化学成分的LC-Q-TOF/MS分析 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 5 实验结论 |
| 第三节 双黄连制剂指纹图谱的建立 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结论和讨论 |
| 第三章 双黄连制剂的体内和体外药效学研究 |
| 第一节 双黄连制剂对RSV感染小鼠模型整体药效学研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结论和讨论 |
| 第二节 双黄连制剂体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)药效学研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结论和讨论 |
| 第三节 双黄连制剂原型药和含药血清体外抑制金黄色葡萄球菌的药效学研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结论和讨论 |
| 第四章 双黄连制剂谱效相关分析 |
| 第一节 双黄连制剂化学成分与体外抑菌、抗病毒的相关性分析 |
| 1 确定系统特征 |
| 2 无量纲化处理 |
| 3 关联系数与关联极性的确定 |
| 4 偏最小二乘回归分析方法(PLS) |
| 5 实验结果分析 |
| 6 实验讨论和结论 |
| 第二节 双黄连复方制剂谱-效相关数学模型的建立 |
| 1 建立数学模型 |
| 2 实验结论与讨论 |
| 第五章 多组学联合分析双黄连制剂体内抗RSV的作用机制 |
| 第一节 双黄连复方制剂体内抗RSV的蛋白质组学初步研究 |
| 1 仪器与试药 |
| 2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4 生物信息学分析 |
| 5 实验结果与讨论 |
| 第二节 双黄连复方制剂体内抗RSV的代谢组学研究 |
| 1 仪器和试药 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论和讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（10）核酸结合蛋白和血清的定量蛋白质组学研究及其在肺癌中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质组学及定量蛋白组学研究方法概述 |
| 1.1.1 蛋白质组学介绍 |
| 1.1.2 定量蛋白质组学技术 |
| 1.1.3 蛋白质微阵列芯片 |
| 1.2 肺癌及其诊断生物标志物和靶向治疗研究概述 |
| 1.2.1 肺癌简介 |
| 1.2.2 肺癌生物标志物研究现状 |
| 1.2.3 肺癌靶向治疗简介 |
| 1.3 核酸结合蛋白研究概述 |
| 1.3.1 核酸结合蛋白简介 |
| 1.3.2 DNA结合蛋白 |
| 1.3.3 DNA结合蛋白研究方法 |
| 1.3.4 RNA结合蛋白 |
| 1.3.5 RNA结合蛋白研究方法 |
| 1.4 本研究的立题依据、研究目的、研究内容和意义 |
| 第二章 核酸结合蛋白富集新方法的建立与评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养和细胞裂解 |
| 2.3.2 碳纳米材料提取NABPs |
| 2.3.3 GO提取NABPs阴性对照 |
| 2.3.4 复合物DAPI染色 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.6 细胞内核酸提取效率 |
| 2.3.7 上清液中DNA和 RNA提取 |
| 2.3.8 碳纳米材料对RNA的提取效率 |
| 2.3.9 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.10 质谱分析前的蛋白样品前处理 |
| 2.3.11 蛋白肽段除盐 |
| 2.3.12 Nano-LC-Q Exactive-Orbitrap质谱分析 |
| 2.3.13 蛋白鉴定和免标记定量 |
| 2.3.14 生物信息学分析 |
| 2.3.15 数据统计 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 NABPs富集新策略 |
| 2.4.2 两种NABPs富集策略的比较 |
| 2.4.3 SDS对 NABPs提取效果的影响 |
| 2.4.4 不同碳纳米材料提取NABPs的比较 |
| 2.4.5 碳纳米材料吸附核酸的机制 |
| 2.4.6 基于氧化石墨烯富集NABPs方法的评价 |
| 2.4.7 NABPs的生物信息学分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 肺癌进展相关核酸结合蛋白的发现与验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 NABPs提取 |
| 3.3.3 细胞迁移 |
| 3.3.4 细胞增殖 |
| 3.3.5 细胞RNA提取 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR |
| 3.3.7 血清收集 |
| 3.3.8 生物信息学分析 |
| 3.3.9 数据统计 |
| 3.3.10 其余实验方法 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 肺癌进展细胞系的选择 |
| 3.4.2 H460和H1299中NABPs的定量蛋白组学分析 |
| 3.4.3 差异NABPs的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 抗体微阵列在EGFR突变肺腺癌靶向治疗预后标志物发现中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料、试剂和仪器 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 抗体微阵列芯片设计原理 |
| 4.3.2 芯片质控 |
| 4.3.3 芯片扫描 |
| 4.3.4 芯片扫描原始数据修正 |
| 4.3.5 血清样本收集 |
| 4.3.6 血清高丰度蛋白去除 |
| 4.3.7 全蛋白生物素标记 |
| 4.3.8 生物素标记质控 |
| 4.3.9 蛋白质免疫印记 |
| 4.3.10 蛋白胶内酶解 |
| 4.3.11 质谱分析及蛋白鉴定 |
| 4.3.12 siRNA转染 |
| 4.3.13 细胞活力检测 |
| 4.3.14 细胞培养 |
| 4.3.15 数据统计 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 本研究所用血清临床样本信息 |
| 4.4.2 EGFR突变肺腺癌靶向治疗预后标志物的发现策略 |
| 4.4.3 候选生物标志物的筛选 |
| 4.4.4 候选蛋白质的鉴定 |
| 4.4.5 FGA2在发现组血清中的独立验证 |
| 4.4.6 FGA2在预验证组血清中的独立验证 |
| 4.4.7 厄洛替尼抑制肝细胞FGA2的表达和分泌 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 基于定量蛋白质组学的肺癌靶向治疗耐药机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、试剂和仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血清样本收集 |
| 5.3.2 血清高丰度蛋白去除 |
| 5.3.3 细胞蛋白提取与蛋白质免疫印记 |
| 5.3.4 蛋白质样品前处理和TMT标记 |
| 5.3.5 HPLC分级 |
| 5.3.6 质谱分析 |
| 5.3.7 质谱数据搜库 |
| 5.3.8 sh TRIM33 载体构建 |
| 5.3.9 慢病毒包装 |
| 5.3.10 病毒滴度检测 |
| 5.3.11 稳转细胞系的建立 |
| 5.3.12 siRNA转染 |
| 5.3.13 厄洛替尼处理细胞IC50检测 |
| 5.3.14 细胞培养 |
| 5.3.15 细胞侵袭 |
| 5.3.16 数据统计 |
| 5.3.17 生物信息学分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 研究策略 |
| 5.4.2 差异蛋白生物信息学分析 |
| 5.4.3 候选蛋白的验证 |
| 5.4.4 候选蛋白功能分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结和展望 |
| 6.1 研究内容总结 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间已发表或录用的论文及专利申请 |
四、蛋白质组学及其在新药研究中的应用（论文参考文献）
- [1]心梗致心衰潜在预警标志物发现及生脉注射液作用解析研究[D]. 许静. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究[D]. 梁至. 南方医科大学, 2021
- [3]醒脑健神方治疗缺血性中风（痰热腑实证）的临床观察及抗缺氧机制研究[D]. 王新娜. 长春中医药大学, 2021(01)
- [4]UVB诱导长春花及白桑次生代谢激活及调控的系统生物学研究[D]. 钟卓珩. 浙江大学, 2021(01)
- [5]基于化学蛋白质组学的活性天然产物靶点研究[D]. 吕琪. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [6]甲状旁腺激素类似受体（iPTHRs）及其配体对昆虫发育与表皮形成的影响及作用机制研究[D]. 谢佳. 南京师范大学, 2020(03)
- [7]转录—蛋白质组学的芹菜子抗肝纤维化物质基础及机制研究[D]. 谯明. 新疆医科大学, 2020(03)
- [8]肝疏泄不及病理与疏肝药理-PMDD肝气郁证大鼠主要病理变化与柴芍皂苷主要药效机理研究[D]. 牟翔宇. 山东中医药大学, 2019(05)
- [9]双黄连制剂抑菌抗病毒药效物质基础和组方结构配伍及作用机理研究[D]. 孙启慧. 山东中医药大学, 2019(05)
- [10]核酸结合蛋白和血清的定量蛋白质组学研究及其在肺癌中的应用[D]. 尚志. 上海交通大学, 2019(06)