一、致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响（论文文献综述）
钱治,仲泽远,崔元斌,钱军,禹宝庆[1]（2021）在《T细胞与骨代谢》文中研究指明免疫已经广泛应用于骨代谢性疾病。适应性免疫的生理学功能有利于调节骨骼系统,然而在病理状态下,如类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症等,骨骼系统会随着免疫应答做出相应调整,从而导致骨丢失或骨折风险增加等后果。T淋巴细胞和其他各种免疫细胞参与骨调节及骨稳态。本综述将讨论T细胞及其亚群等淋巴细胞在骨代谢性疾病中的作用。活化T细胞可通过分泌不同的细胞因子直接或间接调节骨健康,从而调节骨代谢。雌激素的缺乏可通过IL-7、IFN-γ、TNF等诱发T细胞增殖,引起骨丢失,导致骨质疏松。CD4+T细胞是类风湿性关节炎炎性滑膜炎形成、软骨及骨破坏的关键因素,且衰老CD4+T细胞作用更甚。CTLA4-Ig对于缓解骨质破坏具有积极作用。在骨关节炎的发病过程中,活化T细胞或异常T细胞的免疫应答可诱发关节炎中骨丢失和骨破坏。CD4+T、Th1、Th1/Th2、Th17等增多会增强破骨细胞活性,而CD8+T细胞、Treg、CTLA-4等增多则有抑制破骨细胞的作用。因此,随着免疫细胞与骨代谢之间的不断交叉,骨免疫学将越来越受到人们的重视,了解并熟悉免疫细胞与骨代谢之间的关系非常有必要。
刘雨婷[2]（2021）在《青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究》文中研究说明自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,包括系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）,类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）,银屑病,炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）等。其中,SLE由于多器官受累,临床表现复杂,免疫异常的表型多样,几乎覆盖整个免疫系统,被认为是自身免疫性疾病的原型。B细胞功能及表型异常是SLE疾病发生发展的关键因素。记忆性B细胞在自身免疫反应中快速应答,并维持自身反应性抗体分泌细胞的分化。近年发现的一群具有记忆性表型的年龄相关的B细胞（age-associated B cells,ABCs）亚群随SLE疾病进展快速扩增,其变化趋势与SLE应答指数高度相关。因此,探究调控ABCs分化及功能的通路,明确候选药物对ABCs形成及病理效应的影响,将有助于发现指示疾病预后和预测药物疗效的特征性细胞亚群,据此提高SLE治疗手段的有效性。RA与SLE同为典型的自身免疫介导的风湿性疾病,以滑膜炎症、破骨细胞过度分化所致骨破坏为主要病理特征,患者可出现关节变形及进行性关节功能丧失。自身反应性B细胞分泌大量RA相关的自身抗体,通过Fcγ受体交联信号促进破骨前体细胞分化;同时,浸润在RA患者关节滑膜中的B细胞还可通过产生核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB Ligand,RANKL）,增强关节部位破骨形成作用。因此寻找具有理想活性窗口的B细胞胞内信号通路的小分子抑制剂,可望通过多环节干预,阻断RA的病理过程。水溶性青蒿素衍生物马来酸蒿乙醚胺（SM934）是治疗SLE的候选新药,正在开展Ⅱ期临床研究。本课题研究发现,SM934对狼疮模型小鼠MRL/lpr的治疗作用,与其控制淋巴器官和肾脏中ABCs的扩增、改变异常的细胞能量代谢密切相关。ABCs细胞是与SLE患者的疾病活动度和治疗应答指数高度相关的记忆性B细胞亚群。通过在疾病各进展阶段采用SM934干预,检测狼疮相关自身抗体指标及肾炎相关血生化、尿液指标,综合考察免疫细胞表型和能量代谢模式,结果发现:1)MRL/lpr小鼠脾脏和肾脏中ABCs细胞数量快速增加,与疾病活动指征呈正相关性;2)脾脏中B细胞的糖酵解和线粒体呼吸随疾病进展显着增强,而肾脏中浸润的B细胞的代谢水平低于正常小鼠,两者呈现出相反的能量代谢变化趋势;3)SM934在疾病确立阶段干预治疗,显着减少MRL/lpr小鼠免疫器官和肾脏中的ABCs细胞,该抑制作用与治疗作用呈正相关;4)SM934治疗,逆转了疾病进展期MRL/lpr小鼠免疫器官和肾脏中B细胞的异常能量代谢模式。临床近95%的SLE患者并发关节炎和关节痛,狼疮性关节炎的疾病表征与早期RA类似。姥鲛烷（pristane）诱导的狼疮模型是典型的SLE伴随RA的实验动物模型,被广泛用于研究自身免疫反应和炎症的病理机制。本研究运用pristane诱导的类风湿性关节炎（pristane-induced arthritis,PIA）模型开展SM934对狼疮伴发关节炎的治疗作用及机制研究。实验结果表明,SM934口服给药1)显着降低PIA模型小鼠的关节临床评分和关节炎症;2)降低血清中自身抗体和抗Ⅱ型胶原抗体水平。机制研究发现,SM934通过干预巨噬细胞极化,改变关节腔炎症微环境,改善关节损伤。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）是B细胞受体（B cell receptor,BCR）和Fcγ受体（Fc gamma receptor,FcγR）信号的关键调节分子,参与包括RA在内的自身免疫性疾病的病理过程。靶向BTK能够调节多种RA相关的免疫细胞（B细胞和髓系细胞）功能,具有巨大的治疗潜力。SOMCL-17-016是高度激酶选择性的新结构三环类BTK抑制剂,本课题研究发现其具有优异的体内外免疫抑制活性。运用胶原诱导的小鼠关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）模型,证实SOMCL-17-016口服治疗显着改善CIA模型小鼠的关节损伤和炎症,且效价高于第一代BTK抑制剂Ibrutinib及第二代BTK抑制剂Acalabrutinib。进一步机制研究发现,SOMCL-17-016通过抑制BTK,1)降低B细胞产生RA相关自身抗体水平;2)减少滑膜炎症部位浸润的RANKL分泌型B细胞数量,改变关节局部破骨细胞的分化环境;3)通过抑制RANK-BTK-PLCγ2信号通路抑制破骨前体细胞分化。SOMCL-17-016靶向BTK,干预激酶调控的多个信号通路及免疫学事件,快速起效缓解CIA症状,有望成为治疗RA的候选药物。综上所述,本课题研究关键细胞亚群和胞内信号分子在SLE和RA疾病进展和组织损伤中的病理作用及调控机制,确证BTK抑制剂SOMCL-17-016的在自身免疫性疾病中的疗效作用,进一步探究了青蒿素衍生物SM934治疗SLE的作用机制,初步建立其疗效作用与对敏感细胞亚群调控作用的内在关联,将有助于发现和确立新型的自身免疫性疾病候选药物和治疗靶点。
刘志文[3]（2021）在《艾可清颗粒抑制破骨细胞分化改善去卵巢大鼠骨丢失的作用机制研究》文中研究说明目的:绝经后骨质疏松是由于雌激素缺乏导致的骨量减少、骨的微观结构退化引起的代谢性骨骼疾病。中医理论认为绝经导致的肾脾亏虚是造成骨质疏松的主要病因。由广州中医药大学热带医学研究所研发的复方中药配方“艾可清颗粒”具有补肾健脾、益气扶阳之功效,临床用于HIV-1感染者和艾滋病患者的辅助治疗。为了进一步拓展艾可清的临床应用范围,本研究就其是否可改善绝经后肾脾亏虚所致的骨质疏松进行了研究。在本研究中,我们采用卵巢切除大鼠模型模拟绝经后妇女,探讨了艾可清对雌激素缺乏致骨丢失的体内保护作用。同时采用体外细胞模型进一步探讨了艾可清对成骨细胞活性的影响,以及对RANKL诱导的破骨细胞分化的抑制作用和机制。方法:1.艾可清对去卵巢大鼠骨丢失的作用（1）动物分组和治疗双侧卵巢切除的SD大鼠（6-8月龄）随机分为模型组（OVX）、戊酸雌二醇0.1 mg/kg/d组（EV）、艾可清1g/kg/d组（ALD）、艾可清2 g/kg/d组（AMD）和艾可清4 g/kg/d组（AHD）进行治疗,每组10只。行假手术（Sham）的10只同龄雌性大鼠为随行对照。连续给药3个月后结束治疗。（2）检测和分析:①Micro-CT扫描分析骨组织形态计量学参数、重建骨组织三维结构;②H&E染色观察骨组织病理学变化;③TRAP染色观察骨组织内破骨细胞数量;④心、肝、脾、肺、肾、子宫的脏器指数变化;血清样本中肝功能指标（ALT和AST）和肾功能指标（CRE和BUN）检测。⑤荧光定量PCR法检测骨组织中骨吸收功能相关基因（CA2、CTSK、MMP9和ATP6V0D2）和骨形成相关基因（BMP-2和Sp7）的mRNA水平。⑥Western blot法检测骨组织中骨吸收相关功能蛋白Tracp、CTSK和c-fos的表达水平。2.艾可清对成骨细胞增殖和分化的影响MC3T3-E1成骨细胞,（1）经艾可清干预48h或72h,CCK-8法检测细胞增殖活力;（2）经艾可清干预7d,ALP检测试剂盒检测ALP活性,ALP染色试剂盒检测ALP表达,评价细胞的成骨活性。3.艾可清对破骨细胞分化的影响（1）艾可清对骨髓来源巨噬细胞增殖的影响:从C57BL/6小鼠骨髓提取单核细胞,经M-CSF诱导4天得到骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）。BMMs经艾可清干预48 h或72h后,CCK-8法检测细胞增殖活力。（2）艾可清对破骨细胞分化的影响:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。采用TRAP染色试剂盒染色观察破骨细胞并计数;采用免疫荧光染色观察破骨细胞F-actin环的形成。（3）破骨分化标志性基因mRNA水平检测:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总RNA,荧光定量PCR法检测骨吸收功能基因（Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2）,破骨细胞表面受体基因（Calcr、RANK）和破骨细胞前体细胞融合基因（c-fos、Dcstamp）的mRNA水平。（4）破骨细胞标志性蛋白表达检测:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总蛋白,Western blot法检测骨吸收功能相关蛋白Mmp9、Ctsk 和 Tracp 的表达。4.艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制（1）艾可清对破骨分化关键转录因子的表达和核移位的影响:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总蛋白,Western blot法检测转录因子NFATc1和c-fos的蛋白表达水平;免疫荧光法观察NFATcl和c-fos的核移位情况。（2）艾可清对破骨分化关键调节通路的影响:BMMs经艾可清预处理后再采用RANKL刺激0、5、10、20、30或60 min。提取总蛋白,Western blot法检测不同时间点 NFκB 通路（p65、p-p65、IκBα和 p-IκBα）、JNK 通路（JNK 和 p-JNK）和 p38通路（p38和p-p38）蛋白水平。（3）艾可清对p65核移位的影响:BMMs细胞用艾可清预处理后再采用RANKL刺激0、30或60 min。分别提取细胞核和细胞质蛋白,Western blot法检测p65水平;免疫荧光法观察细胞核中p65表达。（4）艾可清对RANK和TRAF6结合的影响:巨噬细胞Raw264.7用艾可清预处理后再采用RANKL刺激20 min。免疫共沉淀法观察RANK和TRAF6之间的相互作用。结果:1.艾可清对去卵巢大鼠股骨骨丢失的影响（1）显着增加股骨的骨密度、骨体积分数和骨小梁数量①Micro CT扫描:与Sham组相比,OVX组骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）都明显降低;与OVX组相比,艾可清剂量依赖地增加了大鼠的BMD、BV/TV和Tb.N,且这些指标在高剂量组（AHD）中有显着增加。②H&E染色:与Sham组相比,OVX组股骨BV/TV值明显降低;与OVX组相比,艾可清剂量依赖地提高BV/TV值,其中AHD组BV/TV升高最为显着。（2）显着抑制股骨组织内破骨细胞的形成破骨细胞TRAP染色结果:与Sham组相比,OVX组大鼠骨组织内骨表面破骨细胞数（N.Oc/BS）和破骨细胞周长百分比（Oc.S/BS）明显增加;与OVX组相比,ALD组Oc.S/BS则明显降低,AMD组N.Oc/BS明显降低,而AHD组N.Oc/BS和Oc.S/BS均明显降低。（3）未见对脏器组织有不良影响①脏器指数:与Sham组相比,OVX组大鼠的心、肝、肺、肾和子宫脏器指数明显下降;与OVX组相比,除AMD和AHD组肺脏器指数明显增加外,艾可清各剂量组对其他各脏器指数无明显影响。提示艾可清可能有益肺作用。②肝肾功能生化指标:与Sham组相比,OVX组血清中ALT、AST、CRE含量无明显变化,BUN含量明显升高;与OVX组相比,艾可清各剂量组血清中ALT、AST、CRE含量无明显变化,BUN含量明显下降。提示艾可清可能对肾功能有改善作用。（4）显着抑制骨吸收相关基因的mRNA表达与Sham组相比,OVX组骨组织中骨吸收相关基因CA2、MMP9、CTSK和ATP6V0D2的mRNA表达明显升高,骨形成相关基因BMP-2和Sp7的mRNA表达水平明显降低。与OVX组相比,ALD组CA2和MMP9的mRNA水平明显下调;AMD组和AHD组CA2、MMP9和CTSK的mRNA水平明显下调;艾可清各剂量组BMP-2和Sp7的mRNA水平均无明显变化。提示艾可清的作用在于抑制骨吸收,而不是促进骨形成。（5）显着抑制骨吸收相关蛋白的表达与Sham组相比,OVX组骨组织中骨吸收相关蛋白Tracp、Ctsk和c-fos的表达明显升高;与OVX组相比,艾可清各剂量组Tracp表达明显降低,AHD组Ctsk和c-fos的蛋白水平明显下调。进一步说明艾可清是通过抑制骨吸收起到骨保护作用的。2.艾可清对MC3T3-E1成骨细胞增殖和成骨分化的影响艾可清在浓度大于50 μg/mL时对细胞增殖有抑制作用,浓度低于50 μg/mL时不影响细胞的增殖和ALP活性。说明艾可清无促成骨分化作用。3.艾可清对骨髓来源巨噬细胞增殖活力的影响艾可清在10—100μg/mL浓度范围对BMMs有明显促增殖作用。4.艾可清对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响（1）显着抑制BMMs分化为破骨细胞（TRAP染色）:在诱导BMMs破骨分化的过程中加入艾可清干预,可浓度依赖地减少TRAP阳性细胞的数量,说明艾可清明显抑制破骨分化。艾可清在50 μg/mL浓度时几乎完全抑制了破骨细胞的形成,且对破骨分化的抑制作用具有时间依赖性。（2）显着抑制破骨细胞F-actin环形成（免疫荧光染色）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地减少破骨细胞F-actin环的面积,抑制F-actin环的形成。（3）显着抑制骨吸收功能基因的表达（荧光定量PCR）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地抑制骨吸收相关基因Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2、Dcstamp、Calcr的mRNA表达;艾可清在50 μg/mL浓度时,对骨吸收功能基因（Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2）,破骨细胞表面受体基因（Calcr、RANK）和破骨细胞前体细胞融合基因（Dcstamp、c-fos）的mRNA表达的抑制作用呈时间依赖性。（4）显着抑制骨吸收功能蛋白的表达（Western blot）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地抑制骨吸收功能蛋白Mmp9、Ctsk和Tracp的表达;艾可清在50μg/mL浓度时,对Mmp9、Ctsk和Tracp蛋白表达的抑制作用具有时间依赖性。5.艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制（1）显着抑制破骨细胞分化关键转录因子NFATc1和c-fos的表达（Western blot）:在诱导BMMs破骨分化时加入艾可清干预,可浓度依赖地抑制转录因子NFATc1和c-fos的蛋白表达;艾可清在50 μg/mL浓度下对NFATc1和c-fos蛋白表达的抑制作用也表现出时间依赖性。说明艾可清可抑制RANKL诱导的NFATc1和c-fos表达上调。（2）显着抑制NFATc1和c-fos的核移位（免疫荧光染色）:在诱导BMMs破骨分化时加入艾可清干预,可显着抑制NFATc1和c-fos在细胞核的表达,说明艾可清可抑制RANKL诱导的NFATc1和c-fos的核移位。（3）显着抑制破骨细胞分化关键通路NFκB和MAPK的激活（Western blot）:BMMs经RANKL刺激后,NFκB通路蛋白（p65和IκBα）和MAPK通路蛋白（JNK和p38）的磷酸化（p-p65、p-IκBα、p-JNK和p-p38）水平逐渐升高,IκBα水平逐渐降低,说明NFκB和MAPK通路被激活。艾可清（50 μg/mL）干预可降低p-p65、p-IκBα、p-JNK和p-p38水平,升高IκBα水平。说明艾可清抑制RANKL诱导的NFκB和MAPK通路激活。（4）显着抑制p65的核移位（Western blot和免疫荧光染色）:BMMs细胞经RANKL刺激30和60 min后,细胞质内的p65蛋白明显减少,细胞核内的p65含量增加,说明NFκB通路被激活。艾可清（50μg/mL）干预可使细胞质内的p65表达升高,使p65停留在细胞质内并抑制其入核,说明艾可清抑制RANKL诱导的NFκB通路激活。免疫荧光染色结果进一步证实艾可清可抑制p65的核移位。（5）显着抑制RANK-TRAF6复合物的形成（免疫共沉淀）:Raw264.7细胞经RANKL刺激20 min后,增加了和TRAF6结合的RANK的水平;艾可清（50μg/mL）干预可显着减少和TRAF6结合的RANK的水平,说明艾可清抑制了 RANKL诱导的RANK和TRAF6的结合。结论:1.补肾健脾复方中药“艾可清颗粒”对雌激素缺乏诱导的骨丢失具有保护作用。其补肾健骨作用和抑制体内破骨细胞的生成和骨吸收功能有关。2.“艾可清颗粒”在体外可显着抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性。其作用机制为抑制RANK和TRAF6的结合,从而影响RANKL介导的下游NFκB、p38和JNK通路的激活。3.“艾可清颗粒”具有预防和治疗绝经后骨质疏松的临床应用前景。
谭张奎[4]（2021）在《基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究》文中进行了进一步梳理目的采用补肾化痰方干预去卵巢大鼠,观测肠道黏膜屏障功能变化,血清及骨组织中促炎因子与抗炎因子表达,以及该方对IL-6/JAK2/STAT3和IL-2/JAK1/STAT5信号通路、CD4+T细胞亚群辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）/调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）平衡的影响,探讨补肾化痰方防治绝经后骨质疏松症的机制。方法6月龄雌性SD大鼠90只,按随机数字表分为假手术组（Sham）、模型组（Ovariectomized,OVX）、戊酸雌二醇组（Estradiol valerate,EV）、补肾化痰方低剂量组（OVX+BL,BL）、补肾化痰方中剂量组（OVX+BM,BM）、补肾化痰方高剂量组（OVX+BH,BH）。除Sham组外,其他组均采用手术切除卵巢,制作绝经后骨质疏松症模型。术后1周灌胃给药,OVX组和Sham组以等体积的生理盐水灌胃,1次/d,灌胃12周后取材。实验一:运用苏木精-伊红染色,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,碱性磷酸酶染色,观察骨组织的病理形态;微计算机断层扫描技术检测大鼠骨量及骨微结构,观察骨量及骨小梁的变化。实验二:运用苏木精-伊红染色观察结肠组织病理形态变化;采用酶联免疫吸附法检测结肠组织中白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、IL-2、IL-10、IL-17含量;运用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测肠道紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA及蛋白表达。实验三:采用酶联免疫吸附法检血清中IL-6、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor,TNF-α）含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA的表达,免疫印迹法检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。实验四:采用酶联免疫吸附法检测血清中IL-2、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、STAT5 m RNA的表达,免疫印迹法检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、P-JAK1、STAT5、P-STAT5蛋白表达。实验五:采用酶联免疫吸附法检测血清中叉头框蛋白p3（Forkhead Box,Foxp3）、维甲酸相关核孤受体γt（Retinoic acid-related orphan receptorγt,RORγt）、IL-10、IL-17含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17 m RNA表达,免疫印迹法检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17蛋白表达。流式细胞术检测骨组织中Th17,Treg细胞数量及Th17/Treg比值。结果实验一:苏木精-伊红染发现,Sham组股骨组织结构完整,骨小梁丰富,脂肪细胞少。OVX组股骨组织骨微结构破坏,髓腔内出现大量空泡状脂肪细胞。EV组髓腔脂肪细胞数量减少,网状结构略微修复,结构仍不完整。BL、BM、BH组骨小梁形态结构较OVX组明显改善。破骨与成骨细胞计数:与sham组比较,OVX组破骨细胞（Osteoclast,OC）数量显着增多（P<0.01）,成骨细胞（Osteoblast,OB）数量无统计学意义;与OVX组比较,EV、BM、BH组OC数量显着减少（P<0.01或P<0.05）,BL组差异无统计学意义;OB数量显着增多（P<0.01或P<0.05）,EV、BL组差异无统计学意义。骨微结构:与Sham组相比,OVX组中骨组织骨微结构参数BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低（P<0.01）,Conn.D.、Tb.Sp升高（P<0.01）;与OVX组相比,EV、BL、BM、BH组中BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高（P<0.05,P<0.01）,Conn.D.、Tb.Sp降低（P<0.01,P<0.05）。三维重建中sham组大鼠骨组织骨小梁结构较均匀,排列整齐,连接呈网状,形态较完整;OVX组骨小梁结构明显变细、断裂、变薄,且骨皮质变薄,形态结构性差,骨质疏松样改变典型。实验二:苏木精-伊红染发现,Sham组结肠黏膜结构较完整,未见上皮细胞明显变性坏死或脱落,肠腺排列较为密集,固有层内杯状细胞丰富,形态及数量正常,未见明显炎症细胞浸润。与Sham组相比,OVX组结肠黏膜完整性受到破坏,上皮细胞变性坏死或脱落,固有层内部肠腺腺腔扩张,可见炎性细胞浸润黏膜肌层。与OVX组相比,EV、BM、BH组结肠黏膜各层次结构较为清晰,肠腺排列较规则,炎症细胞浸润减少,杯状细胞数量增加,形态改善。BL组结构改善不明显。与Sham组比较,OVX组IL-6、IL-17浓度显着升高,IL-2、IL-10浓度显着降低（P<0.01）。与OVX组比较,EV、BM、BH组IL-6、IL-17浓度显着降低（P<0.01）,IL-2、IL-10浓度显着升高（P<0.01或P<0.05）;BL组IL-6浓度降低（P<0.05）,IL-17浓度差异无统计学意义,IL-2浓度升高（P<0.05）,IL-10浓度差异无统计学意义。PCR及WB:与Sham组比较,OVX组Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA及蛋白表达显着降低（P<0.01）;与OVX组比较,BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA表达升高（P<0.01,P<0.05）,EV组ZO-1 m RNA表达升高（P<0.05）,BM组Claudin-1、ZO-1 m RNA表达升高（P<0.05）,EV、BM、BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达显着升高（P<0.01,P<0.05）,BL组各项指标差异没有统计学意义。实验三:与Sham比较,OVX组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量显着升高（P<0.01）;骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA表达显着增加（P<0.01）,IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达显着增加（P<0.01）。与OVX组比较,各干预组血清中IL-6、TNF-α含量显着降低（P<0.01）;骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3m RNA表达显着降低（P<0.01）,IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达降低（P<0.01或P<0.05）。与BL组比较,BH组血清中IL-6、TNF-α含量显着降低（P<0.01）。骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA表达显着降低（P<0.01）,IL-6、IL-6R、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显着降低（P<0.01）。实验四:与Sham比较,OVX组大鼠血清中IL-2、TGF-β1含量显着降低（P<0.01）;骨组织中IL-2、IL-2RA IL-2RB m RNA及蛋白表达显着降低,JAK1、STAT5 m RNA表达显着升高（P<0.01）,JAK1、P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,各干预组血清中IL-2、TGF-β1含量显着升高（P<0.01）,EV、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB m RNA表达显着升高,JAK1、STAT5m RNA表达显着降低（P<0.01,P<0.05）,BL组中仅IL-2RA差异有显着性统计学意义（P<0.05）。EV、BL、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达升高（P<0.01,P<0.05）,P-JAK1、P-STAT5蛋白表达降低（P<0.01,P<0.05）。JAK1、STAT5蛋白差异无统计学意义。与BL组比较,BH组血清中IL-2、TGF-β1含量显着升高（P<0.01）。BH组骨组织中IL-2、IL-2RB m RNA表达显着升高,JAK1、STAT5 m RNA表达显着降低（P<0.01,P<0.05）。IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达显着升高,P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显着降低（P<0.01,P<0.05）。实验五:与Sham组比较,OVX组血清中Foxp3、IL-10浓度显着降低,骨组织中Foxp3、IL-10 m RNA及蛋白表达显着降低（P<0.01）,RORγt、IL-17m RNA及蛋白显着升高（P<0.01）;与OVX组比较,各干预组血清中Foxp3、IL-10浓度显着升高（P<0.01）,RORγt、IL-17浓度显着降低（P<0.01,P<0.05）。EV、BM、BH组骨组织中Foxp3、IL-10m RNA显着升高（P<0.01,P<0.05）,BL组差异无统计学意义,EV、BL、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17m RNA显着降低（P<0.01,P<0.05）。EV、BM、BH组骨组织Foxp3、IL-10蛋白表达显着升高（P<0.01,P<0.05）,BL组Foxp3蛋白表达升高（P<0.05）,IL-10蛋白差异无统计学意义;EV、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17蛋白表达显着降低（P<0.01,P<0.05）。BL组中差异无统计学意义。流式分析:与Sham组比较,OVX组CD4+CD25+Foxp3（Treg）细胞数量显着降低（P<0.01）,CD4+IL-17A（Th17）细胞数量显着升高（P<0.05）,Th17/Treg比值显着升高（P<0.01）。与OVX组比较,EV、BL、BM、BH组CD4+CD25+Foxp3（Treg）细胞数量显着升高（P<0.01）,CD4+IL-17A（Th17）细胞数量在EV、BM、BH组显着降低（P<0.01,P<0.05）,在BL组差异无统计学意义;Th17/Treg比值显着降低（P<0.01）。结论补肾化痰方可能通过修复肠道黏膜屏障功能,改变骨免疫环境,调节Th17/Treg平衡,双向调节骨形成与骨吸收,起到防治PMOP的作用。
王婕[5]（2021）在《OPG诱导小鼠破骨细胞焦亡的研究》文中认为骨保护素（OPG）是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员,它作为核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的诱饵受体,可以通过与核因子κB受体活化因子（RANK）竞争性结合核因子κB受体活化因子配体（RANKL）,从而抑制破骨细胞的分化及活性。研究发现OPG可诱导体外成熟破骨细胞发生凋亡,凋亡可作为其抑制成熟破骨细胞活性的途径之一,由此发挥保护骨组织的作用。细胞焦亡是不同于细胞凋亡的一种新型细胞死亡方式,以细胞膜破裂和炎性因子释放为特征,OPG是否可以通过诱导成熟破骨细胞发生焦亡来发挥保护对骨组织的作用尚不明确。本研究以原代分离的小鼠骨髓单核巨噬细胞（BMMs）诱导分化为成熟的破骨细胞为研究对象,添加不同浓度的OPG,通过流式细胞术、qRTPCR、Western blot等技术手段,以揭示OPG对破骨细胞活性及焦亡相关基因和蛋白表达的影响,初步阐明OPG诱导破骨细胞发生焦亡的分子机制,为相关药物的研发提供理论依据和新思路。1.OPG诱导小鼠破骨细胞发生焦亡本研究取4周龄Balb/c小鼠骨髓单核细胞,体外培养过程中,采用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导使其分化为成熟破骨细胞,在此细胞模型中加入不同浓度的OPG（0、40、80、100ng/ml）处理12h。通过CCK8试剂盒、LDH细胞毒性试剂盒、流式细胞术检测细胞死亡率,ELISA试剂盒检测相关炎性因子的释放,Western blot检测焦亡关键蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,OPG处理组破骨细胞的存活率显着降低（p<0.05）,并在40ng/ml和100ng/ml时呈现极显着降低（p<0.01）;细胞培养上清中IL-1β和IL-18含量均上升,并在80ng/ml和100ng/ml时呈现极显着差异（p<0.01）;培养上清中LDH活性在40ng/ml OPG处理时无显着变化（p>0.05）,但随着OPG浓度的增加其释放量呈剂量依赖性增加（p<0.05）;明场下观察到大量的破骨细胞质膜破裂,失去细胞形态。与对照组相比,OPG处理组破骨细胞内GSDMD-N的蛋白表达量显着增加（p<0.01）。表明OPG可使破骨细胞细胞膜发生破裂从而诱导破骨细胞焦亡,并伴随焦亡相关炎性因子的释放。2.OPG诱导小鼠破骨细胞焦亡的分子机制为了探究OPG诱导破骨细胞发生焦亡的分子机制,本研究取4周龄Balb/c小鼠骨髓单核细胞,体外培养过程中,采用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导使其分化为成熟破骨细胞,在此细胞模型中加入不同浓度的 OPG（0、40、80、100ng/ml）处理12h,采用qRTPCR和Western blot等实验方法对焦亡经典途径相关基因的转录水平及其蛋白表达水平进行了检测。结果显示,与对照组相比,OPG处理组焦亡经典途径相关基因ASC、NLRP3、caspase 1和GSDMD等的转录水平显着升高（p<0.05或p<0.01）,蛋白表达水平也显着增加（p<0.05或p<0.01）;除此之外,焦亡相关炎性因子IL-1β、IL-18的基因转录水平显着升高（p<0.05或p<0.01）,并且IL-1β的蛋白表达量也显着升高（p<0.05或p<0.01）。以上结果说明,OPG可通过经典途径诱导破骨细胞发生焦亡。综上所述,OPG可诱导破骨细胞发生焦亡,其机理与ASC、NLRP3、Caspase 1、GSDMD等焦亡经典途径相关蛋白的表达水平升高有关。
马雪峰[6]（2021）在《OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究》文中研究说明[研究背景及目的]骨保护素（osteoprotegerin,OPG）和核因子-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK）及其配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）是能够调控破骨细胞分化激活的细胞因子,其调控机制在近年来备受关注,在骨质疏松患者的相关性骨代谢中起重要作用。RANK与RANKL相结合可以诱导破骨细胞分化激活,并同时抑制破骨细胞凋亡,而骨保护素（OPG）可以阻断RANK与RANKL的结合,从而减少骨质被破坏。β-catenin作为经典的Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子,参与成骨细胞分化、成熟、凋亡全部过程。OPG/RANKL-Wnt/β-catenin信号系统参与调控多种骨代谢相关疾病,是极具发展前景的治疗靶位。本研究着重探究OPG/RANKL-Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松的骨代谢中的作用及潜在机制。[研究方法]1.分别从健康对照患者和骨质疏松患者获取和培养原代人成骨细胞进行培养,检测各组细胞在基础状态下和1,25-二羟维生素D3刺激后DKK1、DKK2、磷酸化β-catenin和RANKL/OPG在mRNA和蛋白水平的表达、骨钙素和碱性磷酸酶的合成以及细胞增殖情况。2.在小鼠的成熟破骨细胞中条件敲除β-catenin蛋白,与同窝野生型小鼠进行对照:通过破骨细胞特异性的TRAP免疫组化染色和HE染色分析小鼠骨量变化和破骨细胞形态学改变;获取原代骨髓来源的破骨细胞进行体外培养,给予RANKL和M-CSF刺激,评估RANKL-Wnt信号通路对于破骨细胞成熟、分化及数量的影响;real-time PCR检测两组小鼠股骨组织中OPG和RANKL的mRNA表达水平。[研究结果]1.与健康对照组病人对比,骨质疏松组RANKL/OPG比值明显增高（P<0.05）,外源性给与维生素D3处理使各组细胞RANKL/OPG值和DKK2表达增加,DKK1表达降低,但对β-catenin的表达水平无明显影响。并且骨质疏松组的成骨细胞中可见骨钙素和碱性磷酸酶的产生及成骨细胞增殖减少。2.我们成功实现了小鼠破骨细胞β-catenin基因的特异性敲除,并发现破骨细胞中敲除β-catenin基因后,小鼠会在4周龄前维持正常的骨骼发育,但是4周后即出现严重的骨量丢失和破骨细胞数量的增加。进一步体外实验证实:Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进破骨细胞的凋亡,减少破骨细胞数量,并且敲除β-catenin基因也会导致非破骨细胞中的OPG表达降低,进而导致全身骨量的减少。[研究结论]1.骨质疏松病理状态下的成骨细胞通过自分泌或旁分泌机制影响DKK家族成员的合成和分泌,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路,导致成骨细胞的骨特异性蛋白骨钙素合成减少、细胞增殖活性及成骨活性降低,并且通过增加RANKL的表达而刺激骨吸收。2.骨质疏松病理状态下的破骨细胞以细胞自主的方式影响Wnt/β-catenin信号通路来调控破骨细胞寿命,减少破骨细胞数目,同时通过调控OPG导致RANKL/OPG的平衡失调,促进破骨细胞的成熟及分化,造成总体骨量丢失,最终导致骨质疏松的形成。
相丽欣[7]（2021）在《Crif1促进放射后骨质疏松的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景:随着核能、放射治疗、放射性同位素技术以及航天飞行等的广泛应用,人类受到放射损伤的几率不断增加。放射对组织和器官造成不可逆的损害,除可破坏造血系统外,对骨组织也会造成一定的损伤:抑制骨形成,促进骨吸收,进而引起骨质的快速丢失。骨质疏松通常是放射治疗的长期并发症之一,其主要特征是骨形成减少而骨吸收增强,骨的微结构被破坏以致患者易发生骨折。放射治疗虽然在一定程度上提高了肿瘤患者的生存率,但是放疗后患者易发生骨折,导致其生活质量受到影响。目前骨质疏松药物的治疗效果较好,但是由于通常需要较长的用药周期,大部分药物对患者都存在副作用。因此,进一步探明放射致骨质疏松的病理机制,有利于临床在骨质疏松症预防和治疗过程中寻找疗效强安全性高的药物。成骨细胞以及破骨细胞在骨的内稳态调控过程中扮演不同角色。核因子κB受体激活蛋白配体（Receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL）可启动破骨细胞分化程序。骨髓中多种细胞可分泌RANKL。放射损伤、炎症刺激、细胞因子、激素等都可促进RANKL的表达。骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）是破骨形成的抑制因子,可阻止RANKL介导的下游信号通路的启动。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem/stromal cells,BM-MSCs）不仅可支持造血,还有成骨、成脂分化能力。BM-MSCs的成骨、成脂定向分化平衡对于维持其造血支持作用和骨内稳态具有关键作用,然而放射损伤打破了这种平衡。放射损伤后BM-MSCs的成骨定向分化减少,骨形成受抑制;BM-MSCs的成脂定向分化增强,即脂肪细胞数量显着增多。但是在放射诱导的骨缺失过程中决定BM-MSCs细胞命运的分子机制不完全清楚。放射导致的骨质疏松,一方面是由于放射抑制了骨形成,而另一方面则是由于放射促进了骨吸收,进而扰乱了骨的内稳态。放射不仅会造成DNA的损伤,还会导致过多活性氧（Reactive oxygen species,ROS）。ROS参与了骨的内稳态调控,如可通过NF-κB通路启动破骨细胞分化程序。Crif1（CR6-interacting factor 1/growth arrest and DNA-damage-inducible,gamma interacting protein 1,Crif1）不仅参与了线粒体核糖体大亚基的构成,还可诱导细胞周期阻滞、调控细胞氧化应激及细胞放射抗性以及转录因子的转录活性,参与调控细胞的多种生理功能。我们的前期研究表明Crif1可通过cAMP/PKA信号通路促进放射后BM-MSCs的成脂分化。近期的研究表明,Crif1在肝癌细胞中存在异常高表达,并且可通过ROS/NF-κB通路促进肝癌细胞的生长及转移。本研究中,应用放射致小鼠骨质疏松模型及Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl证实Crif1参与调控骨质疏松形成的作用,在体外实验中探讨了相关的分子机制,并以Crif1的His120为靶点进行了Life Chemicals化合物库的生物信息学筛选,筛选出五种可显着抑制RNAKL分泌及成脂分化的小分子化合物。材料和方法:1.建立放射致小鼠骨质疏松模型并检测放射损伤后Crif1在骨髓细胞中的表达情况。1)5Gy的Co-60γ全身照射小鼠,建立放射致小鼠骨质疏松模型;Micro-CT、H&E染色等技术检测放射后小鼠骨损伤情况;2)检测放射损伤后骨髓细胞中Crif1及破骨细胞分化相关因子RANKL、OPG的表达情况。2.构建Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl,证实Crif1参与放射后骨质疏松的形成。1)构建Crif1骨髓特异性条件敲除小鼠Lyz2Cre;Crif1fl/fl;2)5 Gy的Co-60全身照射Lyz2Cre;Crif1fl/fl小鼠及相应对照组小鼠;Micro-CT、H&E染色等技术检测放射后小鼠骨损伤情况;3)检测放射损伤后骨髓细胞中破骨细胞分化相关因子RANKL、OPG的表达情况。3.在破骨前体细胞中,探讨Crif1通过NF-κB通路促进破骨细胞分化的分子机制。1)检测放射后RAW264.7细胞内ROS水平、细胞增殖、细胞凋亡及向破骨细胞分化的变化情况;检测放射后NF-κB和MAPKs蛋白家族中蛋白磷酸化水平;2)敲除RAW264.7细胞中的Crif1,探讨缺失Crif1后对RAW264.7细胞内ROS水平、细胞增殖、细胞凋亡及向破骨细胞分化的影响;3)敲除RAW264.7细胞中的Crif1,检测放射后NF-κB和MAPKs蛋白家族中蛋白磷酸化水平变化;探明放射前后Crif1与NF-κB p65在细胞内的定位情况及NF-κB p65在细胞核内分布情况。4.在骨髓间充质干细胞中,进一步探讨Crif1通过cAMP/PKA通路参与破骨细胞分化调控的可能机制。1)在BM-MSCs中过表达Crif1,探讨其对RANKL、OPG的表达及破骨细胞分化的影响;2)敲除BM-MSCs中的Crif1,探讨其对RANKL、OPG的表达、破骨细胞分化及成脂分化的影响;3)分别添加PKA的激动剂及抑制剂,证实Crif1通过cAMP/PKA信号通路促进RANKL的表达,进而促进破骨细胞的分化。5.以Crif1的His120为靶点通过生物信息学筛选Crif1的小分子化合物抑制剂。1)以Crif1的His120为靶点的Life Chemicals化合物库的生物信息学筛选;2)小分子化合物对几种细胞系的细胞毒性检测;3)小分子化合物的有效性检测:小分子化合物添加到BM-MSC中后,检测RANKL、OPG的分泌情况及RANKL/OPG比值变化情况;检测CREB磷酸化水平变化情况;检测BM-MSCs成脂分化变化情况。结果:1.放射致小鼠骨质疏松并诱导骨髓细胞高表达Crif1。1)小鼠经5 Gy放射处理后7d,取左腿股骨。Micro-CT分析显示放射后小鼠的骨体积分数（BV/TV）、连接密度（Conn.D）、骨小梁数量（Tb.N*）、骨矿物密度（v BMD）等指标显着降低;而骨小梁间隙（Tb.Sp*）、结构模型指数（SMI）则显着升高,骨小梁厚度（Tb.Th*）在未放射组及放射组小鼠中差异不显着;H&E染色显示放射后小鼠的骨小梁数量显着减少,骨髓腔内脂肪细胞显着增多;TRAP染色结果显示,放射后小鼠股骨骨髓腔内破骨细胞数量显着增多。以上结果提示,放射导致脂肪细胞及破骨细胞分化增强;2)RT-q PCR结果显示,放射后小鼠骨髓细胞中RANKL的表达显着升高,对OPG的表达无显着影响,RANKL/OPG比值显着升高。值得注意的是,放射后小鼠骨髓细胞中Crif1的表达水平也显着升高;2.条件敲除Crif1可减轻小鼠放射后的骨质疏松。1)RT-q PCR结果显示放射后Crif1敲除组小鼠中RANKL的表达、RANKL/OPG显着低于Crif1未敲除对照组,OPG无显着差异;2)放射前Crif1敲除组小鼠同未敲除对照组的各项指标均无显着差异。尽管放射后Crif1敲除组小鼠及未敲除组小鼠的BV/TV、Conn.D、Tb.N*均显着低于相应未放射组小鼠,但是放射后Crif1敲除组小鼠的BV/TV、Conn.D、Tb.N*显着高于放射后未敲除组;放射后Crif1敲除组小鼠及未敲除组小鼠的Tb.Sp*均有所升高,但值得注意的是,放射后Crif1敲除组小鼠的Tb.Sp*显着低于放射后未敲除组小鼠;3)小鼠经5 Gy放射后7d,敲除组小鼠股骨骨髓腔内破骨细胞数量显着低于未敲除组。3.Crif1通过NF-κB通路促进破骨细胞的分化。1)放射诱导RAW264.7细胞内ROS水平升高,抑制其细胞增殖并诱导其细胞凋亡;2)放射诱导RAW264.7细胞高表达Crif1并分化为破骨细胞;3)敲除Crif1导致RAW264.7细胞内ROS水平升高,放射后向破骨细胞分化减少;4)敲除Crif1导致放射后NF-κB p65的磷酸化水平减低;5)敲除Crif1导致放射后NF-κB p65入核减少。4.Crif1通过cAMP/PKA通路促进RANKL的表达。1)过表达Crif1促进RANKL的分泌及破骨细胞的分化;敲除BM-MSCs中的Crif1可显着降低放射前后RANKL的表达及RANKL/OPG比值;放射及未放射组中,敲除Crif1均可显着减少TRAP阳性细胞;2)敲除BM-MSCs中Crif1可显着降低其向脂肪细胞分化的能力以及成脂分化后RANKL的分泌;3)RANKL的表达、RNAKL/OPG比值在添加25μM forskolin后显着升高,但是敲除BM-MSCs中Crif1可显着减弱forskolin的这种促进作用;在PKA的抑制剂H-89存在的情况下,RANKL的表达、RNAKL/OPG比值在Crif1过表达BM-MSCs及对照组BM-MSCs中均显着降低;4)过表达Crif1及添加PKA的激动剂forskolin均可显着增加TRAP阳性细胞数量,而敲除Crif1及添加PKA的抑制剂H-89则可显着减少TRAP阳性细胞数量;5)CREB的磷酸化在添加25μM forskolin后显着升高,但是敲除BM-MSCs中Crif1可显着减弱forskolin的这种促进作用;在PKA的抑制剂H-89存在的情况下,CREB的磷酸化在Crif1过表达BM-MSCs及对照组BM-MSCs中均显着降低。5.Crif1抑制剂可以有效抑制RANKL的表达及成脂分化。1)通过虚拟筛选选择了结合自由能<-10.0 kcal/mol的前13种化合物;其中5种化合物F0382-0033、F3408-0076、F1430-0134、F3408-0031、F1430-0130在浓度为25μM时显示了较低的细胞毒性;2)5种化合物均可显着抑制RANKL的表达,降低RANKL/OPG的比值;3)5种化合物均可显着抑制H-BM-MSCs的成脂分化;4)5种化合物可显着抑制由forskolin刺激引起的CREB磷酸化。结论:本研究证实Crif1可通过NF-κB及cAMP/PKA通路在不同细胞中参与破骨细胞分化的调控作用。一方面,在破骨前体细胞中,放射后Crif1介导NF-κB p65的磷酸化及核转位促进破骨细胞的分化;另一方面,在BM-MSCs中,放射后高表达的Crif1促进了RANKL的分泌进而促进破骨细胞的分化,同时也增强了BM-MSCs成脂分化能力。条件敲除Crif1可减轻小鼠放射后的骨质疏松。Crif1抑制剂可以有效抑制RANKL的表达及BM-MSCs的成脂分化。我们的研究进一步丰富了放射诱导的骨质疏松形成的病理机制,为放射诱导的骨损伤提供了新的治疗靶点以及潜在的治疗策略。
滕兆伟[8]（2021）在《LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究》文中研究表明[目的]骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种骨量减小、骨组织微结构退化,继而致骨脆性增加、骨折风险剧增的系统性骨病,其所致骨折为老年人致畸致死的主要原因之一[1]。全球OP患者约2亿余,平均每3秒便会新发一例OP所致骨折[2]。伴随老龄化加剧,OP患者数量将进一步呈爆发式增长,给国家和社会带来沉重负担。OP发病率高、危害巨大,发病机制却难以揭示,OP越发成为亟待解决的全球性健康难题。因此,不断深入研究OP发病的分子机制对改善人民的生活质量、提高人民的健康寿命,具有极为重要的战略意义。骨髓间充质干细胞（Hone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化在其发生发展过程中发挥重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）对骨髓间充质干细胞成骨分化起重要作用,而外泌体承载多种lncRNA,因而外泌体可能参与骨髓间充质干细胞的成骨分化调控。本课题拟探究骨质疏松患者血浆外泌体是否携载了调控骨髓间充质干细胞成骨分化的lncRNA,拟明确目的基因lncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能与机制,从而为骨质疏松的精准防治奠定理论基础并提供新思路。[方法]第一部分:提取骨质疏松患者与骨质正常志愿者血浆外泌体,透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63、CD81、TSG101的表达,纳米颗粒跟踪分析（Nanosight Analysis,NTA）外泌体粒径大小及分布。外泌体鉴定成功后,提取RNA,通过高通量测序,筛选出差异表达lncRNA;扩大临床样本量,qRT-PCR再次验证lncRNA的表达,筛选出显着高表达目的lncRNA。第二部分:通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证目的基因lncRNA016908对骨髓间充质干细胞的调控功能;选用高表达lncRNA016908的外泌体孵育骨髓间充质干细胞,验证携载高表达lncRNA 016908的外泌体对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响;构建lncRNA 016908过表达载体,合成lncRNA 016908干扰序列siRNA,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。过表达骨髓间充质干细胞lncRNA 016908,分析下游mRNA表达谱情况,分析下游蛋白质组表达情况,初探lncRNA 016908可能调控的骨代谢相关信号通路。第三部分:通过核质分离与FISH实验定位目的lncRNA 016908在骨髓间充质干细胞内的定位;采用RNA pull down实验手段,拉取与目的基因lncRNA 016908可能结合的蛋白质,经质谱鉴定后,选取与骨代谢、衰老等相关的目的蛋白质;然后进行RIP实验,反向拉取与目的蛋白结合的RNA,qRT-PCR验证目的基因lncRNA016908的富集情况。通过基因功能获得与缺失实验,茜素红染色等,验证RNA pull down拉到的目的基因真核翻译起始因子 5A2（Eukaryotic translation initiation factor 5A-2,EIF5A2）,是否具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的生物学功能。构建EIF5A2过表达载体,合成EIF5A2干扰序列,转染骨髓间充质干细胞,诱导其成骨分化,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。通过挽救实验,验证lncRNA 016908是否通过靶向EIF5A2调控骨髓间充质干细胞成骨分化。过表达lncRNA 016908的同时,沉默EIF5A2,qRT-PCR、Western blot检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况;沉默lncRNA 016908 的同时,过表达 EIF5A2,qRT-PCR、Western blot 检测成骨分化相关基因表达情况;茜素红染色实验检测骨髓间充质干细胞成骨分化后的钙沉积情况。[结果]第一部分:成功获取了大量血浆来源外泌体,经NTA、透射电镜方法以及Western blot检测,其大小、形态、粒径及表面标志物均符合外泌体特征。经高通量测序,筛选到大量差异表达lncRNA,其中lncRNA 016908显着高表达,且经qRT-PCR验证,其稳定高表达于骨质疏松患者血浆外泌体。第二部分:外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达lncRNA 016908后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰lncRNA 016908表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。第三部分:LncRNA016908主要定位于骨髓间充质干细胞的细胞核;本课题通过RNA pull down实验,拉取到与目的基因lncRNA 016908结合的蛋白质EIF5A2;进一步通过RIP实验与qRT-PCR检测,反向验证到大量lncRNA 016908富集于EIF5A2。EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能:过表达EIF5A2后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达降低,钙沉积减少,骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱;干扰EIF5A2表达后,成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2等表达升高,钙沉积增多,骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。沉默EIF5A2能够挽救过表达lncRNA 016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱,从而增强其成骨分化能力;过表达EIF5A2能够逆转沉默lncRNA016908导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强,从而降低其成骨分化能力。[结论]1、携载lncRNA 016908的外泌体具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。2、LncRNA 016908具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。3、EIF5A2具有抑制骨髓间充质干细胞成骨分化的功能。4、LncRNA 016908可以通过靶向EIF5A2抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,进而影响骨质疏松发病。
何易祥,赵宇昊,高昭,赵海燕,王文己[9]（2021）在《B淋巴细胞及相关细胞因子在骨免疫系统中对破骨细胞分化的作用》文中研究表明背景:作为免疫系统组成中重要的免疫细胞——B淋巴细胞可参与骨代谢过程的调控,对破骨细胞的分化发育发挥着重要的作用。目的:就B淋巴细胞的特征及其对破骨细胞分化过程产生的作用进行综述。方法:以关键词"骨免疫;B细胞;破骨细胞"在CNKI、万方等数据库中检索;以关键词"osteoimmunology;B lymphocyte;osteoclast"在PubMed、Web of Science等数据库中检索。检索自建库至2020年9月发表的相关文献,排除与主题不相关及重复性研究的文献,对最终纳入的58篇文献进行归纳分析。结果与结论:研究认为,体内的多种活性物质在调控免疫细胞分化的同时,也可对成骨细胞及破骨细胞产生调控作用。B细胞可能参与了骨破坏形成,并与疾病的活动度相关。B细胞通过维持RANKL/RANK/OPG通路中各因子的平衡,来维持骨代谢平衡。有多种物质可通过上调或下调B淋巴细胞诱导成熟蛋白1水平,参与破骨细胞的调控。B淋巴细胞可产生自身抗体参与破骨过程,也可通过非抗体依赖途径产生骨破坏效应。在人体内环境中,免疫系统和骨骼系统除了二者的关键细胞直接作用外,也可通过转录因子、细胞因子及相关受体等间接联系,并对二者的发育过程产生相互调节的作用。
石铁[10]（2021）在《B10细胞调控实验性牙周炎宿主局部免疫的效应及特点》文中进行了进一步梳理目的:牙周病是由牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌等多种牙周致病菌单一或独立引发的牙周支持组织感染性疾病。随着炎症的进一步扩展,牙周膜、牙槽骨等牙周主要支持组织发生破坏,患牙通常可表现牙齿松动、牙龈红肿或出血,其咀嚼功能下降或完全丧失。鉴于上述病理特征,牙周炎已经成为造成当代成年人牙列缺损的主要原因。除影响咀嚼功能外,牙周炎亦可对患者的美观、发音甚至心理状态产生较大的影响。这也是当下口腔医师需要重点关注的问题。研究证实,B细胞所主导的适应性免疫反应是牙周组织损伤的主要原因。因此剖析B细胞功能对研究牙周组织稳定具有重要意义。B10细胞是调节性B细胞的功能性亚群之一,以表达较高水平的IL-10为主要特征。虽然B10细胞的功能尚未完全明晰,但已有研究证实该亚群在感染性疾病、自免疫疾病甚至肿瘤等疾病的病理进程中均发挥重要作用。B10细胞调控牙周炎症反应可基于两条途径,一是表达IL-10影响牙槽骨稳态,二是调控其它免疫细胞影响免疫反应。然而B10细胞在牙周炎时的动态变化以及其对局部免疫的调控效应及机制仍未完全明确。本研究以牙周炎病理模型为分析对象,通过动物实验及细胞实验,采用ELISA、Flow cytometry、实时荧光定量PCR以及western blot等多种免疫研究技术分析并说明牙周炎对B10细胞的影响以及B10细胞调控牙周炎宿主Th17/Treg的效应及机制,以期为后续研究提供参考。研究方法:本研究由以下三部分组成:1.牙周致病菌对宿主B10细胞分化及功能的影响及机制我们首先建立了牙周炎动物模型。提取模型动物与健康动物的牙龈及外周血中的淋巴细胞,分析不同状态下不同组织内IL-10+B细胞的变化趋势及特点。另取健康的脾源性B细胞,在常规条件下以及在Pg-LPS诱导下培养一周后分别采用流式细胞术、ELISA以及实时荧光定量PCR从基因及蛋白水平评价各培养条件下B细胞表达分泌IL-10的水平。本部分拟揭示牙周炎宿主B10细胞的变化特点并分析牙周致病菌对该细胞分化及功能的影响。2.B10细胞调节Th17/Treg在牙周炎宿主免疫中的效应研究取前一步实验中经牙周致病菌活化的B10细胞,以1*106个/m L剂量经尾静脉回输建立过继转移模型。分别采用健康动物以及过继转移动物建立牙周炎模型,以健康动物为对照。分别取各组动物牙龈、龈沟液及外周血液,采用上述免疫分析技术评价局部及外周组织中Th17/Treg的表达水平以及相关细胞因子RANKL、TGF-β、IL-6、IL-10以及IL-17A的表达水平,以期明确B10细胞在牙周炎发展过程中对宿主免疫的调控效应。3.B10细胞调控Th17/Treg分化的机制研究分取健康动物源性B10细胞及Th0细胞,分别在常规条件以及伴Pg-LPS条件下进行共培养。采用流式细胞术探索各组CD4+IL-17+细胞、CD4+IL-10+细胞、CD4+TGF-β+细胞比例,采用ELISA法分析各培养基中IL-10、TGF-β以及IL-17A浓度,并采用实时荧光定量PCR法检测细胞内IL-10、TGF-β以及IL-17A m RNA表达水平。并采用western blot评价各细胞内IL-10Rα的表达水平以及其与上述指标的关系。本部分研究拟通过研究说明B10细胞调控Th17/Treg分化的特点以及潜在的机制。结果:1.无论是健康个体还是牙周炎宿主,均可在其牙龈及外周血液中检测到B10细胞的存在。在牙周炎时,局部组织内B10细胞比例显着升高,但在外周血中却并未发现上述变化。在牙周炎进程中,B10细胞的迅速升高更多的体现在疾病早期,在病程晚期上此变化趋于平稳。将初始B细胞与牙周致病菌共培养,其内的B10细胞分化水平显着升高,细胞内IL-10 m RNA水平以及培养基中IL-10浓度也同时升高。2.B10细胞过继转移下调了受体模型动物局部组织内Th17比例,同时在一定程度上补偿了Treg的失调。在牙龈中,B10细胞过继转移显着下调了RANKL及IL-17A这两类促炎因子的表达水平,同时上调了IL-10的表达水平。相比于常规牙周炎模型,过继转移组实验动物龈沟液内RANKL及IL-17A降低、IL-10升高。3.在共培养体系下,B10细胞可同时上调CD4+IL-10+细胞、CD4+TGF-β+细胞比例,下调CD4+IL-17+细胞比例;同时提高培养基内IL-10、TGF-β浓度及T细胞内其m RNA水平,并降低培养基内及细胞内IL-17A及其m RNA水平。当Pg-LPS存在时B10细胞降低了CD4+TGF-β+细胞比例,但不影响培养体系中TGF-β的浓度。Pg-LPS还促进了Th17的分化以及IL-17的表达,并伴随有T细胞表达IL-10Rα表达水平及磷酸化的提高。结论:1.牙周致病菌促进宿主B10细胞分化及功能。2.B10细胞可调控牙周炎宿主局部Th17/Treg比例及功能状态。
二、致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响（论文提纲范文）
（1）T细胞与骨代谢（论文提纲范文）
| 1 骨代谢概述 |
| 2 T细胞与骨细胞、成骨细胞及破骨细胞 |
| 3 T细胞与内分泌激素 |
| 3.1 T细胞与雌激素 |
| 3.2 T细胞与甲状旁腺激素 |
| 4 T细胞与骨代谢性疾病 |
| 4.1 T细胞与类风湿性关节炎 |
| 4.2 T细胞与骨关节炎 |
| 4.3 T细胞与骨质疏松症 |
| 5 总结 |
（2）青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 自身免疫性疾病概述 |
| 1.2 系统性红斑狼疮 |
| 1.2.1 系统性红斑狼疮概述 |
| 1.2.2 B细胞异常在系统性红斑狼疮中的致病机制 |
| 1.2.3 系统性红斑狼疮治疗策略 |
| 1.3 类风湿性关节炎 |
| 1.3.1 类风湿性关节炎概述 |
| 1.3.2 类风湿性关节炎致病机理 |
| 1.3.3 类风湿性关节炎疾病动物模型 |
| 1.3.4 类风湿性关节炎治疗策略 |
| 1.4 科学问题与研究意义 |
| 第二章 青蒿素衍生物SM934 调控ABCs细胞分化及代谢状态治疗SLE的作用机制探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药物及试剂 |
| 2.2.2 仪器及耗材 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 小鼠分组及给药 |
| 2.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞制备 |
| 2.3.4 血生化指标检测 |
| 2.3.5 肾脏浸润单核细胞(kidney mononuclear cells,KMNCs)制备 |
| 2.3.6 细胞分选 |
| 2.3.7 Seahorse XF96 线粒体压力细胞代谢测试实验 |
| 2.3.8 流式细胞术 |
| 2.3.9 血清抗自身抗体测定 |
| 2.3.10 蛋白尿检测 |
| 2.3.11 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 2.3.12 组织免疫荧光 |
| 2.3.13 TLR激动剂诱导B细胞反应 |
| 2.3.14 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MRL/lpr小鼠脾脏中ABCs增加并与疾病活动性相关 |
| 2.4.2 SM934 治疗抑制脾脏中ABCs的同时改善MRL/lpr小鼠疾病指征 |
| 2.4.3 SM934 治疗改善MRL/lpr小鼠脾脏中B细胞分化异常 |
| 2.4.4 SM934 治疗改善MRL/lpr小鼠脾脏B细胞代谢异常 |
| 2.4.5 MRL/lpr小鼠肾脏中ABCs浸润随周龄增大而增多 |
| 2.4.6 SM934 治疗抑制MRL/lpr小鼠肾脏中ABCs细胞浸润 |
| 2.4.7 SM934 抑制TLR受体激活影响的B细胞代谢 |
| 2.5 总结与讨论 |
| 第三章 青蒿素衍生物SM934对Pristane诱导的类风湿性关节炎治疗作用及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 药物及试剂 |
| 3.2.2 仪器及耗材 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 PIA模型建立及小鼠分组给药 |
| 3.3.3 小鼠关节临床评分 |
| 3.3.4 血清抗体检测 |
| 3.3.5 微计算机断层扫描(micro computed tomography,Micro-CT) |
| 3.3.6 组织病理学分析 |
| 3.3.7 甲苯胺蓝染色 |
| 3.3.8 液相悬浮系统检测血清及结关节组织匀浆中细胞因子水平 |
| 3.3.9 细胞培养 |
| 3.3.10 BMDM提取及分化 |
| 3.3.11 SM934 对巨噬细胞向M1 型极化的影响 |
| 3.3.12 SM934 对巨噬细胞向M2 型极化的影响 |
| 3.3.13 细胞免疫荧光 |
| 3.3.14 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 3.3.15 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.3.16 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SM934 治疗改善PIA发病严重程度及关节病变 |
| 3.4.2 SM934 治疗降低PIA小鼠血清自身抗体水平 |
| 3.4.3 SM934 治疗降低PIA小鼠脾脏炎性细胞浸润 |
| 3.4.4 SM934 治疗体内调控巨噬细胞极化 |
| 3.4.5 SM934 治疗体外调控巨噬细胞极化 |
| 3.4.6 SM934 影响Stat1和Stat6 的磷酸化调节巨噬细胞极化 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第四章 新型三环类BTK抑制剂SOMCL-17-016 抗类风湿性关节炎药效学及机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 药物及试剂 |
| 4.2.2 仪器及耗材 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验动物 |
| 4.3.2 小鼠脾脏淋巴细胞制备 |
| 4.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞和RAW264.7 细胞毒性实验 |
| 4.3.4 丝裂原(Con A和 LPS)诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应 |
| 4.3.5 OVA诱导的抗原特异性免疫反应 |
| 4.3.6 小鼠CIA模型建立 |
| 4.3.7 CIA小鼠分组及给药 |
| 4.3.8 OVA小鼠血清抗OVA特异性抗体检测 |
| 4.3.9 CIA小鼠临床评分标准 |
| 4.3.10 组织病理学分析 |
| 4.3.11 Micro-CT |
| 4.3.12 免疫组织化学检测 |
| 4.3.13 CIA小鼠血清抗CⅡ特异性抗体检测 |
| 4.3.14 液相悬浮系统检测血清及结关节组织匀浆中细胞因子水平 |
| 4.3.15 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(q RT-PCR) |
| 4.3.16 细胞培养 |
| 4.3.17 组织免疫荧光 |
| 4.3.18 人血细胞沉渣PBMC分离 |
| 4.3.19 PBMC体外刺激体系 |
| 4.3.20 破骨细胞分化 |
| 4.3.21 TRAP染色 |
| 4.3.22 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 4.3.23 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SOMCL-17-016 体外免疫抑制活性 |
| 4.4.2 SOMCL-17-016 抑制卵清蛋白(OVA)特异性的免疫细胞反应 |
| 4.4.3 SOMCL-17-016 改善CIA小鼠临床评分及骨侵蚀程度 |
| 4.4.4 SOMCL-17-016 抑制自身反应性B细胞效应及病理因子产生 |
| 4.4.5 SOMCL-17-016 抑制滑膜B细胞产生RANKL及破骨前体细胞分化 |
| 4.5 总结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）艾可清颗粒抑制破骨细胞分化改善去卵巢大鼠骨丢失的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 绝经后骨质疏松的病机及治疗研究进展 |
| 1.1.1 绝经后骨质疏松概述 |
| 1.1.2 雌激素影响绝经后骨质疏松的机制 |
| 1.1.3 绝经后骨质疏松的药物治疗 |
| 1.2 骨质疏松的中医病因及中药治疗的研究进展 |
| 1.2.1 中医对骨质疏松病因与病机的认识 |
| 1.2.2 治疗骨质疏松的常用中药 |
| 1.3 艾可清的临床应用及其组方药物的化学成分研究进展 |
| 1.3.1 艾可清的临床应用 |
| 1.3.2 艾可清组方中药的化学成分研究进展 |
| 第二章 艾可清改善去卵巢大鼠骨丢失的作用研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 艾可清对破骨细胞分化和成骨细胞分化的影响 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
（4）基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 中医对绝经后骨质疏松症的认识 |
| 2 西医对绝经后骨质疏松症的认识 |
| 3 补肾化痰方组成及药理研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 补肾化痰方对去卵巢大鼠骨量及骨组织病理形态的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 补肾化痰方对OVX大鼠肠道物理屏障功能的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 补肾化痰方对IL-6/JAK2/STAT3 通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 补肾化痰方对IL-2/JAK1/STAT5 通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 补肾化痰方对 Th17/Treg 平衡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 综述 肠道微生物与骨的相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 博士期间学术成果 |
| 致谢 |
（5）OPG诱导小鼠破骨细胞焦亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 OPG/RANKL/RANK系统 |
| 1 破骨细胞的形成与活性调节 |
| 2 OPG/RANKL/RANK系统的发现及其作用 |
| 3 OPG/RANKL/RANK系统与其他信号通路的相互作用 |
| 4 OPG/RANKL/RANK系统与骨相关疾病 |
| 4.1 骨质疏松和甲状旁腺功能亢进 |
| 4.2 炎性骨疾病 |
| 4.3 其他骨骼疾病 |
| 5 小结 |
| 第二章 细胞焦亡 |
| 1 细胞焦亡的发现和发展 |
| 2 细胞焦亡的分子机制 |
| 2.1 经典途径 |
| 2.2 非经典途径 |
| 2.3 Caspase-3/8介导的途径 |
| 2.4 颗粒酶介导的途径 |
| 3 小结 |
| 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 OPG诱导小鼠破骨细胞发生焦亡 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要化学试剂 |
| 1.4 溶液配制 |
| 1.5 破骨细胞的诱导及培养 |
| 1.6 CCK8法检测破骨细胞存活率 |
| 1.7 LDH试剂盒检测细胞外LDH释放量 |
| 1.8 光学显微镜下观察破骨细胞形态学变化 |
| 1.9 流式细胞术检测细胞焦亡率 |
| 1.10 小鼠ELISA试剂盒检测培养基上清中IL-10及IL-18的含置 |
| 1.11 Western Blot检测焦亡关键蛋白的变化趋势 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 OPG对破骨细胞存活率及细胞膜完整性的影响 |
| 2.2 OPG对破骨细胞焦亡的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 OPG诱导小鼠破骨细胞焦亡的分子机制 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要化学试剂 |
| 1.4 破骨细胞的诱导及培养 |
| 1.5 QRT PCR技术检测破骨细胞焦亡相关基因转录水平 |
| 1.6 Western Blot法检测焦亡相关蛋白表达量 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 OPG对破骨细胞焦亡相关基因转录水平的影响 |
| 2.2 OPG对破骨细胞焦亡相关蛋白表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、OPG/RANKL系统与骨质疏松的关系 |
| 二、Wnt信号通路与骨质疏松发生的关系 |
| 第一部分 OPG/RANKL-Wnt信号通路在骨质疏松患者原代成骨细胞中的调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 OPG/RANKL-Wnt信号通路对骨质疏松模型中破骨细胞成熟及分化的调控作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）Crif1促进放射后骨质疏松的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语词表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章放射致小鼠骨质疏松并诱导小鼠骨髓细胞高表达Crif1 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 条件敲除Crif1可减轻小鼠放射后的骨质疏松 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 Crif1 通过NF-κB通路促进破骨细胞分化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Crif1通过cAMP/PKA通路促进RANKL的表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 Crif1抑制剂可以有效抑制RANKL的表达及成脂分化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨质疏松症治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 骨质疏松患者血浆外泌体提取、鉴定、长链非编码RNA测序分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 临床样本入组标准 |
| 2. 材料与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 血清外泌体的鉴定 |
| 2. 外泌体lncRNA测序 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. 间充质干细胞的分离及鉴定 |
| 2. 外泌体孵育BMSCs |
| 3. LncRNA 016908抑制骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 4. LncRNA 016908下游mRNA表达谱 |
| 5. LncRNA 016908下游蛋白质表达谱 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 LncRNA 016908协同EIF5A2调控骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA 016908定位 |
| 2. LncRNA 016908互作蛋白鉴定及筛选 |
| 3. RIP验证lncRNA 016908与EIF5A2互作 |
| 4. EIF5A2调控BMSCs成骨分化中的作用 |
| 5. Rescue实验验证EIF5A2对BMSCs成骨分化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 非编码RNA在骨质疏松发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）B淋巴细胞及相关细胞因子在骨免疫系统中对破骨细胞分化的作用（论文提纲范文）
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 文献筛选 |
| 1.2.1 纳入标准 |
| 1.2.2 排除标准 |
| 1.2.3 文献提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 骨骼系统与免疫系统 |
| 2.2 B淋巴细胞及相关因子与破骨细胞 |
| 2.2.1 B淋巴细胞 |
| 2.2.2 B淋巴细胞在RANKL/RANK/OPG通路中的作用 |
| 2.2.3 结节性硬化症复合体1(tuberous sclerosis complex 1,TSC1) |
| 2.2.4 B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B lymphocyte induced matu-ration protein 1,Blimp1) |
| 2.2.5 B-1淋巴细胞 |
| 2.2.6 其他 |
| 2.3 骨骼系统对B淋巴细胞的作用 |
| 3 展望Prospects |
（10）B10细胞调控实验性牙周炎宿主局部免疫的效应及特点（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:牙周致病菌对宿主B10 细胞分化及功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组与牙周炎模型建立 |
| 2.2.2 组织处理与淋巴细胞纯化 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 流式细胞检测 |
| 2.2.5 ELISA实验 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同组织中B10 细胞表达水平 |
| 3.2 牙周致病菌对B10 细胞分化及功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:B10 细胞调节Th17/Treg在牙周炎宿主免疫中的效应研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞准备 |
| 2.2.2 过继转移 |
| 2.2.3 流式细胞术 |
| 2.2.4 ELISA实验 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 B10 细胞过继转移对牙槽骨吸收的影响 |
| 3.2 牙周炎宿主不同组织中Th17/Treg表达水平 |
| 3.3 牙周炎局部组织中各炎症因子表达水平 |
| 3.4 宿主体液中相关炎症因子的表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:B10 细胞调控Th17/Treg分化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞准备 |
| 2.2.2 细胞培养实验 |
| 2.2.3 流式细胞术 |
| 2.2.4 ELISA |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.2.6 蛋白印迹实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 B10 细胞调控Th17 分化的效应分析 |
| 3.2 B10 细胞调控Treg亚型分化的效应分析 |
| 3.3 IL-10 通路在B10 细胞调控Th17/Treg中的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 B10 细胞调节宿主免疫在相关疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、致敏淋巴细胞对破骨细胞分化及骨吸收的影响（论文参考文献）
- [1]T细胞与骨代谢[J]. 钱治,仲泽远,崔元斌,钱军,禹宝庆. 中国免疫学杂志, 2021
- [2]青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究[D]. 刘雨婷. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [3]艾可清颗粒抑制破骨细胞分化改善去卵巢大鼠骨丢失的作用机制研究[D]. 刘志文. 广州中医药大学, 2021
- [4]基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究[D]. 谭张奎. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [5]OPG诱导小鼠破骨细胞焦亡的研究[D]. 王婕. 扬州大学, 2021(02)
- [6]OPG-RANKL-WNT信号通路在骨质疏松骨代谢中的作用及机制研究[D]. 马雪峰. 南方医科大学, 2021(02)
- [7]Crif1促进放射后骨质疏松的作用及机制研究[D]. 相丽欣. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [8]LncRNA 016908调控骨髓间充质干细胞成骨分化影响骨质疏松发病的功能与机制研究[D]. 滕兆伟. 昆明医科大学, 2021
- [9]B淋巴细胞及相关细胞因子在骨免疫系统中对破骨细胞分化的作用[J]. 何易祥,赵宇昊,高昭,赵海燕,王文己. 中国组织工程研究, 2021(29)
- [10]B10细胞调控实验性牙周炎宿主局部免疫的效应及特点[D]. 石铁. 中国医科大学, 2021(02)