一、抗病基因质粒pAHCGG的构建及应用研究（论文文献综述）
王宏泽[1]（2021）在《玉米多重病害抗性位点qLMchr7的图位克隆及功能解析》文中提出玉米是世界三大粮食作物之一,同时也是我国第一大作物,保障玉米的产量和品质对于我国粮食安全和国民经济发展至关重要。然而,我国主要玉米产区常年受到玉米大斑病（东北产区）,玉米南方锈病（黄淮海产区）以及玉米灰斑病（西南山地产区）的危害,严重影响了我国玉米行业的发展。目前,防治玉米病害最经济有效的方法,是利用抗病基因去培育并推广抗病品种。因此,鉴定并克隆抗病基因,尤其是能够同时提升玉米对多种病害产生抗性的基因,对于培育抗病品种、防治玉米病害、增加玉米产量和品质有十分重要的意义。为了在玉米中克隆具有同时对抗多种病害的基因,我们对一个具有多病害抗病相关表型（类病斑表型）的大刍草导入系材料C117展开了研究。通过遗传学和分子生物学分析的方法,我们对多病害抗病基因进行了图位克隆,并对其功能进行了解析,得到的结果如下:1.利用C117和其背景材料Mo17配合的F2群体,我们在C117中寻找到了 3个控制类病斑表型的QTL位点。其中效应值最大的qLMchr7位于玉米第7号染色体bin 7.00上,正向控制类型斑表型。2.通过精细定位的工作,我们将qLMchr7定位在了ZmMM1基因3’UTR中的1 kb区间内。利用在B73背景下的突变体材料zmmm1-1和C117亲本配合的F2:3群体,我们证明了qLMchr7通过调控ZmMM1基因形成类病斑表型,并结合烟草瞬时表达实验证明了ZmMM1基因能够正向贡献植物细胞坏死。3.利用两种不同的NIL材料,我们通过qPCR,WB以及Ribosome profiling的实验方法,证明了调控序列qLMchr7能够在转录后对ZmMM1mRNA的翻译效率进行调控,qLMchr7C117单倍型能够提升ZmMM1的翻译效率,提高ZmMM1的蛋白水平,最终产生类病斑表型。4.通过多重序列比对分析,我们得到了qLMchr7中的功能位点SR,该位点由2个SNP和1个InDel组成。我们在烟草中证明了qLMchr7元件在玉米中和烟草中所表现的功能相似,且利用烟草系统我们证明了来源于C117的SR能有效提高ZmMM1蛋白含量。5.利用KASP的检测方法,我们在玉米品种、地方种品种以及大刍草品种群体中检测了qLMchr7C117单倍型存在的比率。我们发现在地方种以及大刍草品种中,qLMchr7C117是一种非常稀有的单倍型,同时这种单倍型在玉米品种中并不存在。6.利用存在表型差异的NIL材料以及ZmMM1的野生型及突变体材料,我们在自然发病的条件下,多年多点的观测了材料的抗性差异。我们发现ZmMM1能够同时正向贡献玉米对玉米大斑病、玉米南方锈病以及玉米灰斑病的抗性;同时,qLMchr7C117单倍型能够增强玉米对这三种病害的抗性。7.通过检测不同材料在PAMPs刺激后ROS产生的含量,我们证明了ZmMM1能够正向贡献ROS的产生,而qLMchr7C117调控元件能够进一步增强这个过程。在病原菌入侵的情况下,ZmMM1蛋白能够缓慢积累从而提高ROS的水平来对抗病原菌,qLMchr7C117调控元件能够进一步提升ZmMM1蛋白的含量,从而加快并加强ROS的产生,介导更强的抗性。8.利用分子生物学的实验,我们证明了ZmMM1编码一个含有MYB DNA结合域的转录抑制子,在抗病过程中主要影响植物的ncRNA的调控通路,进而影响抗病能力。ZmMM1的下游一共检测到4个靶标基因,其中功能最强的靶标基因我们命名为ZmMT3,其被注释为LncRNA。通过ZmMT3的转基因材料,我们证明了 ZmMT3可以抑制ROS产生,负向调控植物抗病能力的。9.通过对玉米关联群体的表型以及ZmMM1的单倍型进行考察,我们解析了在玉米品种中ZmMM1的变异所带来的影响。ZmMM1的编码区段在群体中非常保守,且不同单倍型之间功能不存在差异,主要变异存在于ZmMM1的调控序列上。这些调控序列的变异并不会导致类病斑类型的产生,但是仍然对抗病有着不同的贡献能力,这意味着ZmMM1在玉米材料抗病的过程中被新的调控元件精确调控。10.通过对两种NIL材料产量的考察,我们揭示了qLMchr7的应用价值。具有qLMchr7C117单倍型的材料,正常生长过程中产生的类病斑表型,并不会导致产量的降低;但是在发病条件下,具有qLMchr7C117单倍型的材料是否能在产量上有所提高,还有待进一步的考察。
蒲小剑[2]（2021）在《红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化》文中研究指明红三叶（Trifolium pratense L.）是营养价值和草产量仅次于苜蓿（Medicago Sativa L.）的多年生豆科牧草之一。该牧草用途广泛,具有广阔的开发应用前景。白粉菌（Erysiphales）作为一类普遍而重要的专性生物营养型病原菌,可严重降低红三叶草产量与品质,限制其在草牧业中的应用与发展。为阐明白粉菌对红三叶生理生化、内源激素和细胞结构的影响并验证抗白粉病TpGDSL基因的功能,本研究首先对感白粉病品种（岷山红三叶）和×抗白粉病品种（“甘农RPM1”红三叶）的杂交F2代进行抗病性评价,并建立白粉病抗性分离群体,采用人工接菌的方法,测定白粉菌侵染后不同抗性群体的生理生化变化、内源激素含量和细胞结构变化;利用F2代群体的抗病单株和感病单株作为试验材料,进行转录组分析;克隆由转录组分析得到的红三叶抗白粉病相关候选基因TpGDSL,同时构建p HB-GDSL过表达载体,并遗传转化拟南芥。取得的主要结果如下:1.白粉病病原菌为三叶草白粉菌（Erysiphe trifoliorum）;人工接菌后抗病材料的电导率（EC）先升高后降低、感病材料持续升高,接菌15 d时感病材料EC较接菌前增加3.57倍。抗病材料的相对含水量（RWC）先降后升,感病材料持续降低,接菌15d时感病材料的RWC含量较接菌前减少了31.85%。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性和可溶性糖（WSC）含量分别在接菌后第7 d和11 d升高,随后降低,其最高值分别为534.43±10.07 U·g-1·min-1 FW、411.73±4.08 U·g-1·min-1 FW、136.53±1.00 U·g-1·min-1 FW和32.02±0.57 mg·g-1。接菌第15 d的丙二醛（MDA）与游离脯氨酸（Pro）含量分别是接菌前的4.84和5.38倍。接白粉菌后第1和7 d,抗病材料的玉米素（ZR）、茉莉酸（JA）与水杨酸（SA）含量出现两个峰值,感病材料接菌第1d后增加,之后持续降低。抗病材料的ABA含量先升后降,感病材料的变化趋势相反。抗病材料的ZR、JA、SA与ABA含量的分别在接菌第7 d、1 d、7 d和1 d时最大,其值分别为12.23±1.27 ng·g-1、15.55±0.30 ng·g-1、124.82±1.68 ng·g-1、483.50±125.50 ng·g-1,分别较接菌前增加3.52、0.93、1.60和1.04倍。接菌后红三叶抗病材料内源激素变化幅度大于感病材料,表明抗病材料中白粉菌对红三叶体内内源激素的效应更明显。2.抗病红三叶单株叶片的上表皮细胞宽,叶片厚度、栅栏组织厚度及蜡质含量均极显着高于感病材料（P<0.01）,分别高16.13%、22.29%、29.99%与85.90%;抗病材料的上表皮细胞宽度增大、栅栏组织加厚、栅栏组织细胞排列更紧密有序,感病材料的海绵组织厚度显着增加、海绵细胞排列松散混乱。白粉菌侵染增加了细胞壁的半纤维素、纤维素和木质素含量,降低了可溶性果胶的含量,其中抗病材料纤维素、半纤维素、木质素和羟脯氨酸糖蛋白含量略高于感病材料。3.白粉菌侵染后抗性差异红三叶代谢中DEGs分别富集在苯丙烷途径、甲醛戊酸途径、木质素和木酚素途径与硫代葡萄糖苷等代谢途径。CHRs、C2H2、HAD、MYB、b ZIP和MADS等转录因子家族基因参与红三叶白粉病防御反应。SA与IAA通路中相关基因AXR1、CYP、CAND1和PPR-like可能在红三叶白粉病防御反应中具有积极作用。细胞色素P450、氧化酶类、磷酸酶、腈水解酶及GDSL脂肪酶等家族中DEGs分别富集23、20、18、14与2条。木质素代谢途径中PAL、C4H、4CL和BGL、ABA调控路径中NAD（P）-binding Rossmann-fold、赤霉素代谢途径中2-氧戊二酸/铁（II）依赖双加氧酶及JA合成前体12-Oxo-PDA等基因均参与调控红三叶的防御过程。转录组分析显示红三叶GDSL同源基因有较高的本底表达和差异表达倍数,Log2（FC）为10.62,本研究选择GDSL基因进行研究。4.克隆得到编码366个氨基酸,全长1101bp的TpGDSL基因。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）GDSL基因与该基因氨基酸序列相似性高达86.47%。TpGDSL基因编码蛋白分子式为C1776H2704N470O561S15,相对分子量为40.9672kD,理论等电点（p I）为4.39,正、负电荷残基为20和35,不稳定系数为31.38,为不稳定蛋白,脂肪系数为81.01。TpGDSL编码蛋白可能存在于细胞外基质（Extracell）。TpGDSL蛋白主要包括36.34%α螺旋（Alpha helix,Hh）、4.10%β转角（Beta turn,Tt）、17.49%延伸链（Extended strand,Ee）、及42.08%无规则卷曲（Random coil,Cc）。该基因翻译的蛋白均由二级结构和三维结构覆盖,覆盖率和可信度分别达82%和100%。本试验采用农杆菌介导的花序浸染法将重组过表达载体p HB-GDSL转入模式植物野生型拟南芥中,得到16 lines T1代阳性转基因种子,为TpGDSL基因的功能分析奠定了基础。
杨鹏辉[3]（2021）在《菜豆普通细菌性疫病抗性候选基因功能分析》文中研究指明普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）是世界上种植范围最广、栽培面积最大的食用豆类。在生产中,普通细菌性疫病对普通菜豆危害日趋严重。实验室前期在普通菜豆8号染色体p8s433与p8b17标记之间精细定位到候选区段。本研究对候选区段进行分析,并验证候选基因功能,以期确定抗性基因,并对抗性基因进行功能分析,挖掘抗病种质中优异等位变异,探究抗性相关分子机制,为提升普通菜豆分子育种水平奠定基础。研究获得如下主要结果:1.候选区段序列分析在感病品种中,候选区段的物理距离为18.5kb,包含Gene1、Gene2、Gene3和Gene4等4个基因,其中Gene4与Gene3序列相似度为97%;在抗病品种中,候选区段的物理距离为14.2kb,包含3个基因,并且分别与感病品种中的Gene1、Gene2、Gene3为同源基因。对候选基因进行注释:Gene1编码AAA+ATPase（ATPase Associated with a wide variety of cellular Activities）蛋白,Gene2编码PPR蛋白（Pentatricopeptide repeat protein）,Gene3编码UDP-葡萄糖转移酶。2.候选基因表达模式分析Gene1、Gene2、Gene3在叶、茎、花中均有表达;Gene1、Gene2、Gene3在抗病品种中表达量分别为感病品种的1.5倍、1.7倍和0.96倍。荧光定量PCR分析候选基因对普通细菌性疫病病原菌响应结果表明:Gene1表达量受病原菌诱导后显着上调,并且Gene1表达量在抗病品种中显着高于感病品种;Gene2表达量在抗病品种中先上升后下调,感病品种中表达量变化不显着,趋于稳定;Gene3表达量在抗感品种中均为先上调后下降,72 h处抗病品种Gene3表达量为感病品种1.6倍。3.候选基因功能验证候选基因在抗病品种中基因沉默结果表明:71.4%Gene1沉默植株发病等级达感病,且基因表达量越低,发病等级越高;Gene2与Gene3沉默植株未出现发病症状。候选基因在感病品种中基因过表达结果表明:76%Gene1过表达植株发病等级为中抗,且过表达植株中Gene1表达量越高,植株抗性越好;而Gene2与Gene3过表达植株仍出现严重发病症状。综合以上结果认为,Gene1为抗性基因。4.Gene1序列多样性分析对71份宽叶菜豆种质资源进行普通细菌性疫病抗性鉴定,鉴定出61份抗性种质,表明宽叶菜豆的抗性水平要高于普通菜豆;在宽叶菜豆中对Gene1序列多样性分析结果表明:Gene1的CDS区域序列在抗感种质间序列一致,而启动子区域存在较大的差异。5.抗性候选基因转录组分析以抗性品种HR45及其抗性亲本宽叶菜豆PI319433和感病品种秘鲁菜豆为材料,分析接菌后不同时间点的差异基因;共筛选到334个基因与抗性相关,主要包括R基因、蛋白激酶基因和转录因子和氧化还原酶基因;Gene1与14个抗性基因共表达,2个含有NB-ARC结构域的R基因,2个转运体蛋白基因、1个糖基转移酶基因、2个转录因子基因,1个PPR基因,6个基因未注释。
刘婧[4]（2021）在《谷子和葡萄抗病相关基因的筛选及功能验证》文中研究表明植物真菌病害是制约农业生产,特别是农作物和经济作物产量提高的主要因素之一。谷子和葡萄分别是我省主要的杂粮作物和经济作物,本研究旨在揭示谷子和葡萄在与真菌病原菌相互作用过程中的关键抗病基因,为加速抗真菌病害的谷子品种和葡萄品种的选育提供分子依据。谷子（Setaria italica L.）是我省的特色小杂粮。黑穗病是制约我省谷子产量的主要真菌病害,主要由担子菌门真菌黑粉菌（Ustilago crameri）引发,因其会造成染病谷子穗部变黑而得名。虽然目前我省已培育出部分抗黑穗病的谷子品种,然而随着连年种植这些品种的抗病性均有所下降。因此,借助基因工程的手段加速培育抗黑穗病谷子新品种迫在眉睫。为了筛选谷子在抵抗黑粉菌病害中的关键抗病基因,本研究采用转录组测序的方法,利用目前已知的谷子抗黑穗病抗病品种冀谷20和感病品种长农35作为取材对象,对其黑粉菌拌菌组和非拌菌组的幼穗进行基因表达谱分析。通过筛选差异表达基因,本研究发现在冀谷20拌菌组中有341个基因显着上调表达,1371个基因显着下调表达,而在长农35中显着上调和下调表达的基因数目分别为533和633。对上述差异表达基因的维恩图分析表明,其中有288个基因在冀谷20和长农35中表达存在显着差异。进一步通过KEGG分析,本研究发现上述差异表达基因主要在以下三个通路富集:植物-病原菌互作途径、MAPK信号转导通路和植物激素信号转导途径。进一步,本研究通过综合运用植物生理学和分子生物学的研究方法从中筛选出关键的抗病基因如下:SiBGL、SiCHI、SiRPM1、SiSGT1、SiHSP、SiCDPK、SiRboh F和SiPAL。除此以外,本研究还发现晚期胚胎富集蛋白SiLEA14在冀谷20和长农35拌菌组中表达均显着高于非拌菌对照组,为了验证SiLEA14在谷子抵抗黑穗病中的具体作用机制,本研究对该基因进行了克隆,并在拟南芥中异源过表达,为后续的基因功能鉴定奠定了基础。葡萄是全球范围内主要的栽培果树之一,也是我省主要的经济作物。我省栽培的葡萄品种主要为欧洲葡萄（Vitis vinifera L.）,虽然其具有营养价值丰富,口感优良等优点,但是却表现出抗病性差的缺点,特别是对以灰霉菌（Botrytis cinerea）为代表的真菌表现出易感病性。已有研究表明,使用葡萄采后常用保鲜剂SO2处理可以提高葡萄果实对灰霉菌的抵抗能力,但是其抗病机制尚不清楚。本研究通过转录组测序对SO2保鲜组和对照组葡萄果实的基因表达谱进行分析,发现抗逆相关的WRKY、bHLH、AP2/ERF和MYB类转录因子基因差异性表达。本研究选取其中功能未知的葡萄WRKY转录因子VvWRKY70,综合运用细胞生物学和分子生物学的方法进行基因克隆、亚细胞定位分析和拟南芥异源过表达分析。结果表明,该基因定位在细胞核中,其拟南芥过表达植株与野生型植株相比表现出较强的灰霉菌抵抗能力。该结果暗示VvWRKY70在葡萄抵抗灰霉菌的过程中发挥正调控作用。
刘亚荣[5]（2021）在《甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探》文中指出甜瓜（Cucumis melo L.）是一种重要的园艺和经济作物,在生长发育的各个阶段都易遭受真菌病害如枯萎病、白粉病等的侵扰,严重影响着其生长发育及果实质量,传统上对该类病害的防治主要采用农药喷施的方法,但该方法不仅容易导致病菌产生抗药性,还会对环境造成极大的污染。近年来,利用基因工程技术指导的植物抗病育种和生物农药开发因具有绿色环保、效果显着等优点而越来越受到关注,应用该技术的关键在于抗病基因的筛选。类甜蛋白（Thaumatin-like protein,TLP）是一种在植物病害胁迫响应中扮演着重要角色的蛋白,目前在甜瓜中仍未见报道。基于此,本研究对甜瓜中的类甜蛋白进行了系统的鉴定,并对关键抗性基因CmTLP17的功能与潜在的应用进行了深入的探究。本研究主要由三部分构成。第一部分对甜瓜中的类甜蛋白进行了鉴定及特性研究。运用生物信息手段,本研究在甜瓜基因组中共鉴定到了28个类甜蛋白,分属于9个不同的亚家族。表达特性分析发现,多个成员在枯萎病菌和白粉病菌侵染后呈现出高表达量,表明它们可被病菌诱导表达。其中,成员CmTLP17在两种病菌侵染后均呈现出较高的表达量,表明该基因可能在甜瓜抗病中起到重要的作用。第二部分对CmTLP17的抗病功能进行了深入研究。利用基因工程的方法,通过将该基因在烟草中进行异源表达发现,过表达CmTLP17可以增强烟草对枯萎病的抗性,表明该基因具有抗病功能。第三部分对CmTLP17的体外抑枯萎病菌活性进行了检测。通过将该基因在大肠杆菌中进行诱导表达,摸索获得了该基因的最佳诱导表达条件。之后,通过体外抑菌实验发现CmTLP17蛋白表达产物可以抑制枯萎病菌的生长,表明其具有体外抑菌活性。综上,本研究对甜瓜中的类甜蛋白进行了鉴定和分析,并对关键基因CmTLP17的抗病功能进行了深入的研究。本研究的结果不仅可以为甜瓜的抗病育种提供指导,也可供其他植物中的相关研究借鉴。
贺浪[6]（2021）在《陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究》文中进行了进一步梳理棉花是世界上最主要的农作物之一,棉花生产的稳定性,对我国经济发展至关重要。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是影响棉花生产的最主要病害,我国的黄萎病菌主要是大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）。目前,棉花抗黄萎病的机制尚不清楚,且黄萎病菌在土壤中的存活时间长,现有的防治药剂效果并不理想。因此,挖掘棉花与黄萎病菌互作的相关基因,进一步研究相关基因的功能,为培育棉花抗黄萎病提供候选基因。本论文通过对前期转录组测序分析的基础上,筛选了3个下调表达基因Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7进行调控抗黄萎病机理的研究,为培育棉花抗黄萎病品种奠定理论基础。1)利用Real-time PCR技术研究Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7在陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中的表达模式。结果表明,黄萎病菌侵染不同抗感材料后,在感病品种中3个基因对比CK的表达呈现上调表达,在抗病品种中三个基因对比CK的表达无显着差异或者呈现下调表达的趋势。通过外源植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）处理,Gh TGA7、Gh BZR1的表达能被外源SA、JA诱导,Gh WRKY74的表达能被外源SA、JA抑制。2)利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）,发现Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默感病品种86-1植株,发现其对棉花黄萎病菌的抗病性增强。对Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默植株的叶片进行台盼蓝染色,发现基因Gh TGA7、Gh WRKY74、Gh BZR1沉默植株具有减缓细胞坏死的作用。3)利用RACE技术获得Gh BZR1、Gh WRKY74基因全长。Gh BZR1基因全长1515bp,3′UTR350bp,5′UTR 223bp,ORF 942bp,具有BES1＿N超家族结构域,启动子序列中有两个与参与脱落酸的反应的ABRE顺式作用元件;还有一个MYB结合位点参与类黄酮生物合成基因调控的MBSI作用元件。Gh WRKY74基因全长1786bp,其中3′UTR 514bp,5′UTR 291bp,ORF 995bp,Gh WRKY74属于Ⅱd组WRKY成员,该蛋白具有一个WRKY结构域和C2H2模式（CX（4-5）CX（22-23）HXH）的锌指结构。用电子克隆技术获得Gh TGA7基因全长,Gh TGA7全长1786bp,3′UTR 69bp,5′UTR 348bp,ORF 1074bp,该蛋白上有典型的b ZIP蛋白的DNA结合域与DOG1蛋白结构域。另外,通过亚细胞定位技术构建Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7表达载体,在烟草中瞬时表达,结果表明3个基因均定位于细胞核,符合转录因子的特征。4)利用超表达技术,研究转基因Gh BZR1拟南芥对棉花黄萎病的抗性,筛选到的T2代阳性植株进行抗黄萎病鉴定。结果表明,超表达Gh BZR1的转基因拟南芥对黄萎病易感性增强。对防御通路相关基因的表达量分析发现,转Gh BZR1基因拟南芥SA通路相关基因At PR-1、At PR-5、At PAL1的表达量显着上调,JA通路相关基因At PDF1.2、At LOX2的表达受到抑制。因此,Gh BZR1负调控作用参与棉花黄萎病抗性和JA相关通路。
郭铭[7]（2021）在《大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究》文中认为大麦条纹病（Barley leaf stripe）是对大麦危害最严重的病害之一,发病严重年份造成产量损失可达70%以上,该病害由麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）引起。研究大麦条纹病病原菌的致病机制,能够为大麦条纹病防治及抗条纹病新品种选育提供理论依据。本研究以大麦条纹病强致病野生菌株QWC中的基因Pgr07060为对象,对其功能进行了初步研究。研究结果包括以下3个方面:1.本研究克隆到了大麦条纹病菌强致病菌株QWC中的基因Pgr07060,生物信息学分析表明:Pgr07060基因的开放阅读框全长为1119 bp,总共编码372个氨基酸,其中苏氨酸占比最高,为11.80%;分析其蛋白二级结构得出,以无规则卷曲占比为主,比例达到了56.18%;Pgr07060基因编码蛋白的不稳定性指数为51.96,说明该蛋白质为不稳定的蛋白,且为亲水性蛋白;该基因编码的蛋白存在跨膜区,属于跨膜蛋白。2.构建基因Pgr07060的瞬时表达载体PVX:Pgr07060和亚细胞定位载体PCAMBIA1300-35S-GFP:Pgr07060,并转入到农杆菌GV3101中,通过注射法侵染烟草叶片,进行瞬时表达,对照组为PVX:BAX、PVX:INF1和PGR107,结果显示:PGR107不能在烟草叶片上引起细胞坏死,而PVX:BAX、PVX:INF1及基因Pgr07060均使烟草叶片发生严重皱缩,出现坏死的现象,表明基因Pgr07060可使细胞发生坏死,从而诱导免疫反应;运用在线软件Cell-PLoc 2.0预测出基因Pgr07060携带核定位序列（NLS）PPSASTKTKKKKKKSTP,为细胞核内表达基因,亚细胞定位结果显示,基因Pgr07060的绿色荧光与细胞核自发荧光重合度很高,同时膜上荧光也很强,说明基因Pgr07060既能在细胞核内表达,也能在细胞膜上表达。3.成功构建基因Pgr07060的干扰载体p Silent-1:Pgr07060与过表达载体p BARGPE1:Pgr07060。采用PEG4000介导法进行遗传转化,经潮霉素抗性筛选和荧光定量分析,获得3株干扰转化菌株和2株过表达转化菌株。转化菌株及野生株QWC中Pgr07060基因表达量检测结果表明,与野生株QWC相比较,3株干扰转化菌株的基因表达量分别下降了45.17%、65.38%和68.09%,而2株过表达菌株的基因表达量分别升高了668.88%和908.79%;通过观察培养7 d的菌落生长状况发现,与野生株QWC相比,3株干扰转化菌株的菌落生长速度分别降低了26.91%、48.19%及52.21%,而2个过表达转化株的生长速度分别增加了61.02%和95.76%（P<0.05）。观察菌株的菌丝形态发现,野生株QWC的菌丝呈细长平滑态,菌丝生长正常,而干扰和过表达转化株的菌丝均出现了明显的分隔,且菌丝间的夹角均小于野生株QWC;致病性分析显示,野生株QWC与3个干扰菌株侵染大麦高抗品种甘啤2号后均未发病,而侵染高感品种Alexis后,3个干扰菌株的发病率较野生株QWC分别降低了52.22%、49.29%和49.04%（P<0.05）,并且经野生株QWC侵染的大麦长势较弱,叶片明显萎缩,叶片上有大面积病斑,发病较为严重,而干扰菌株侵染的大麦叶片发病较轻,呈黄绿色,出现较少病斑。
杨丽娟[8]（2021）在《病毒/类病毒侵染的桃树miRNA分析及其侵染性克隆构建》文中认为桃是我国重要的栽培果树,桃树主要以嫁接的方式进行无性繁殖,极易造成病毒的积累与传播。随着近年来桃树种植面积的增加,病毒/类病毒的侵染和蔓延逐渐成为影响桃产业健康发展的重要因素。本研究对受病毒/类病毒侵染的桃miRNA及其靶基因进行了全面分析,扩增了油桃茎痘相关病毒（nectarine stem-pitting-associated virus,NSPaV）及桃潜隐花叶类病毒（peach latent mosaic viroid,PLMVd）的基因组全长序列,构建了NSPaV的全长c DNA侵染性克隆和PLMVd的二倍体侵染性克隆并进行了侵染活性测定,为探究桃中miRNA响应病毒/类病毒侵染的调节机制,以及研究桃上不同病毒、类病毒间的互作关系提供了参考。1.本研究构建了4个包含NSPaV和PLMVd复合侵染的高质量的桃s RNA文库,并利用高通量测序技术和RT-q PCR方法对桃叶片及果实组织中的miRNA及其靶标进行了全面分析。（1）共鉴定出49个miRNA家族的116个已知桃miRNA,其中包括一些高度保守的miRNA,例如miR156、miR166、miR167、miR390、miR395、miR482。预测了303个新miRNA,大多数新miRNA长度为24 nt,且多数新miRNA来自MIR5271和MIR7717家族。对组间差异表达的miRNA进行靶基因预测显示,这些miRNAs共靶向2785个基因,涉及转录调控、形态发生、信号转导、病原体应答等多个方面。（2）叶片和果实组织miRNA比较分析表明,尽管受到不同病毒/类病毒复合侵染,来自27个已知miRNA家族的45个miRNA在叶片和果实组织间表现出显着的差异表达,例如,与叶片相比,miR167a、miR172a-3p、miR319a、miR395a-5p、miR398a-3p在果实组织中表达下调,而miR1511-5p、miR156a、miR159、miR162、miR164a、miR171d-5p在果实组织中表达上调。这些miRNAs的表达具有明显的组织特异性。（3）不同病毒/类病毒复合侵染下,在叶片组织间差异表达的miRNA比在果实中数量更多,并鉴定出少数在响应病毒/类病毒感染中发挥重要作用的miRNA（miR482d-5p、miR6271、pp06-33439等）,其预测的靶基因编码钙调蛋白、泛素蛋白连接酶、锌指蛋白、RPM1互作蛋白等抗病相关基因。2.以感染NSPaV及PLMVd的田间桃样品作为材料,利用RT-PCR,RACE方法,扩增了NSPaV及PLMVd全长基因组,分别以表达载体p CB301和p GEM-T为骨架,构建了NSPaV的全长c DNA侵染性克隆和PLMVd二倍体侵染性克隆,利用农杆菌注射法和摩擦接种法分别将NSPaV和PLMVd接种至常见草本指示植物叶片进行草本寄主的筛选,并在番茄、黄瓜上早期检测到阳性植株,有待后续确认。同时,构建的侵染性克隆接种到桃实生苗,但是可能受木本植物病毒接种的困难性、病毒/类病毒侵染具有潜伏性以及发病条件不适宜等因素的影响,接种1个月后斑点杂交（Dot blot）检测时出现疑似阳性斑点,但在后续2-4个月的检测中均未检测到阳性植株,有待后续对其进行持续的监测。
陈凯园[9]（2021）在《利用CRISPR技术创建水稻抗病相关突变体的研究》文中研究表明植物病害严重影响作物的品质和产量,威胁世界粮食安全。水稻作为世界最重要的粮食作物之一,建立高效的功能基因组学研究方法,获得丰富的遗传资源,对于深入了解水稻抗病分子机制,加速水稻抗病育种具有重大意义。近年来,CRISPR-Cas9基因组编辑技术的出现为生命科学研究带来了前所未有的变革。随着该领域的迅速发展,除了使用最为广泛的CRISPR-Cas9之外,新的CRISPR系统被不断发现,尤其是CRISPR-Cas12a,极大拓展了基因组编辑的范围。此外,基于CRISPR-Cas系统的各种遗传操作工具也被开发出来,使CRISPR系统的应用不再局限于基因编辑,还可以进行转录调控、表观修饰、碱基编辑等。本研究旨在建立并优化多种适用于植物的CRISPR技术,加速水稻抗病相关基因的鉴定。为此,我们在水稻中建立了CRISPR转录激活系统以及基于Cas12a的多位点编辑系统。此外,我们还开发出了一种全新的阵列式CRISPR文库构建方法,并基于该方法构建了靶向水稻全部类受体激酶（receptor-like kinases,RLKs）的CRISPR突变体库。本研究的主要结果如下。第一,构建并比较了基于dCas9的不同载体系统的转录激活效率。本研究建立了三种不同的转录激活载体系统,包括在d Cas9上融合转录激活结构域VP160的d Cas9-VP160系统、d Cas9融合SNAC1转录激活结构域（SNAC1 activation domain,SA）的d Cas9-SA系统以及基于d Cas9-MCP-VP160的协同激活系统。通过在水稻原生质体中的比较,d Ca9-VP160表现出最高的激活效率,可将目标基因的表达提高22.8倍。随后,利用内含子表达t RNA-g RNA（intronic polycistronic t RNA-g RNA,in PTG）的策略,进一步优化了d Cas9-VP160转录激活载体,构建单个PolⅡ启动子同时表达sg RNA和d Cas9-VP160的融合基因结构。内含子表达sg RNA的in PTG-d Cas9-VP160系统比常规的Os U3p表达sg RNA的转录激活效率提高了2.3～4.1倍。第二,建立适用于水稻的FnCas12a以及Lb Cas12a高效多位点编辑系统。本研究建立了四种基于Cas12a的多位点编辑载体系统,包括利用Os U3p表达cr RNA的p32Fn和p32Lb,以及内含子表达cr RNA的p33Fn和p33Lb。结合这些载体,我们还设计了利用cr RNA array和PTC（Polycistronic t RNA-cr RNA）同时表达多个cr RNAs的策略实现多位点的编辑。通过在水稻原生质体以及转基因植株中对比不同系统的效率,结果表明,所有系统都能在水稻中实现多位点的编辑,其中Os U3p::cr RNA array-UBI10p::Fn Cas12a表现出最高的多基因编辑效率以及靶片段删除的效率。此外,本研究对比了目前水稻中已建立的基因组编辑系统的效率,包括CRISPR-Cas9、Fn Cas12a、Lb Cas12a以及Cas9-NG。结果表明,CRISPR-Cas9表现出远高于其他的基因编辑效率（92.6%）和双等位基因突变效率（85.1%）,因此,选择CRISPR-Cas9用于构建高通量遗传筛选体系。第三,设计了FLASH基因编辑流水线用于CRISPR文库构建。利用CRISPR进行遗传筛选时往往需要大量的突变植株,过去常采用构建混合型CRISPR文库（pooled CRISPR library）的方式来实现,而该方法需要繁琐的测序来确定每个植株的sg RNA,花费也较多。因此,本研究开发了一种新的阵列式CRISPR文库（arrayed CRISPR library）构建方法,即通过PCR检测不同长度的片段来代替sg RNA鉴定的FLASH（Using PCR fragment-length-tag to proxy sg RNA distinguishing）CRISPR文库构建方法。在FLASH基因编辑流水线中,我们构建了一套12个包含不同长度DNA片段作为标签（FLASH标签）的CRISPR-Cas9载体。当把sg RNA组装到这些载体中后,每组12个载体中的每个sg RNA即与特定的FLASH标签偶联在一起。这样的一组12个载体即可混合转化获得基因编辑植株。由于sg RNA与FLASH标签的偶联关系,利用PCR和常规的凝胶电泳即可简单快速的鉴定出由FLASH标签所代表的sg RNA,进而获得所突变靶基因的信息。利用该方法可以快速构建阵列式CRISPR文库用于不同规模的植物基因编辑。第四,利用FLASH基因编辑流水线,构建了靶向水稻全部1072个RLK基因的阵列式CRISPR文库。以12个Cas9/sg RNA载体为一组,我们将靶向RLK的sg RNA分别克隆到携带FLASH标签的Cas9载体中,全部载体共分为89个转化小组,一次性转化获得5039个T0代转基因株系。通过检测FLASH标签的方法,快速且准确地完成全部植株sg RNA的鉴定。根据检测结果,RLK突变体库覆盖了89%（955/1072）的靶基因,其中74.3%（710/955）的基因有≥3个独立的T0株系。RLK突变体库具有极高的突变效率,在391个随机检测的靶基因中,有92.1%（360/391）发生了编辑,说明FLASH标签也紧密关联了靶基因突变。此外,FLASH基因编辑流水线还允许我们对发生频率较低的T-DNA瞬时表达的意外编辑事件进行追踪。RLK突变体库可用于水稻抗病相关基因的快速筛选,利用稻瘟病菌M.oryzae离体接种,我们从14个候选基因中初步筛选到8个正调控水稻抗病的RLK基因。综上所述,本研究首先优化并比较了用于植物基因组编辑和转录激活的CRISPR-Cas系统。根据比较结果,选择最为高效的CRISPR-Cas9系统,建立了用于水稻阵列式文库筛选的FLASH基因编辑流水线。实践表明,该方法以其高效、灵活等优势能够快速构建各种规模的阵列式CRISPR文库,促使CRISPR筛选成为植物研究的常规方法。本研究所建立的多种CRISPR遗传操作技术以及丰富的RLK突变体资源必将加快作物遗传育种和功能基因组学的发展。
张冬梅[10]（2021）在《硅酸钠诱导马铃薯抗黑痣病基因StWRKY11克隆及载体构建》文中指出马铃薯黑痣病（Rhizoctonia solani Kühn）是内蒙古马铃薯种植区的重要病害之一。目前,随着提倡促进环境友好型农业生产以及减少化学农药的使用,利用矿质营养元素调控植物抗病性的作用已被逐渐重视。其中硅及硅酸盐类诱导植物抗病性已经得到证实。本课题组前期的研究,在室内和室外证实了硅酸钠能诱导马铃薯抗黑痣病,欲进一步从分子生物学角度探索其抗病机制。本试验基于转录组数据分析,筛选出与马铃薯抗黑痣病相关的重要基因StWRKY11进行研究。首先从马铃薯品种大西洋中克隆出StWRKY11基因,分析其核苷酸序列,证实了StWRKY11属于WRKY转录因子,又构建了该基因过表达载体p CAMBIA1302-StWRKY11-GV3101,摸索马铃薯品种大西洋的最优再生体系,对农杆菌介导的StWRKY11基因表达载体遗传转化体系进行研究。1.从马铃薯中提取总RNA,扩增该基因并克隆,构建重组载体。通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及分析。结果表明,从马铃薯大西洋中克隆了阅读框为1005bp的StWRKY11基因,编码334个氨基酸。表达蛋白分子式为C3013H5023N1005O1260S199,含有一个典型的WRKYGQK保守结构域,锌指结构为CX5CX23HXH,属于第二类Ⅱd亚家族。表达的为疏水稳定性蛋白,无跨膜区和信号肽结构域,二级结构元件是a-螺旋、延伸链、β-折叠和无规卷曲,其中无规则卷曲比例最高,达61.68%,共有29个磷酸化位点,可能定位于细胞核内。启动子上游具有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件及与生长发育和激素响应顺式作用调控元件。该基因与马铃薯StWRKY5基因的亲缘关系较近,同源性达到为95%。2.构建了马铃薯品种大西洋脱毒苗茎段和叶片的再生体系。茎段和叶片均可在不同浓度激素6-BA、NAA及GA3配比培养基上形成愈伤组织并能产生不定芽。茎段和叶片愈伤组织最佳诱导培养基分别为MS+0.25 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA和MS+5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA,诱导率分别为96.67%和77.04%,生长量较好,淡绿色,米粒状。茎段和叶片愈伤组织不定芽分化的最佳培养基均为MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+10.0 mg/L GA3,不定芽分化率均可达40%以上,分化出的芽多且较壮。3.将重组克隆载体作为模板,利用In-Fusion方法成功构建p CAMBIA1302-StWRKY11植物过表达载体,并将重组质粒成功转入农杆菌菌株GV3101中。用茎段和叶片作为外植体对构建了马铃薯遗传转化体系,PCR结果显示,农杆菌介导法可成功将基因StWRKY11转入马铃薯品种大西洋中。
二、抗病基因质粒pAHCGG的构建及应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗病基因质粒pAHCGG的构建及应用研究（论文提纲范文）
（1）玉米多重病害抗性位点qLMchr7的图位克隆及功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 自然界中植物病原微生物的多样性及其危害 |
| 1.2.2 植物对抗病原菌的免疫系统 |
| 1.2.3 植物产生的抗病反应与抗病性的联系 |
| 1.2.4 ROS与植物抗病性的联系 |
| 1.2.5 玉米中与LM表型有关的抗病研究 |
| 1.2.6 植物基因克隆的一般方法 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验中所用的植物材料及其来源 |
| 2.1.1 图位克隆材料的来源及其衍生后代 |
| 2.1.2 玉米抗病表型验证材料的来源 |
| 2.1.3 瞬时表达实验所用材料 |
| 2.1.4 重测序所用材料 |
| 2.2 实验中所用菌株 |
| 2.3 实验中所用载体 |
| 2.4 表型调查的方法 |
| 2.5 分子标记开发的方法 |
| 2.6 分子标记的检测、分析、统计以及筛选的方法 |
| 2.7 控制LM表型QTLs图位克隆的方法 |
| 2.7.1 控制LM表型QTLs初定位的方法 |
| 2.7.2 qLMchr7精细定位的方法 |
| 2.7.3 ZmMM1为qLMchr7调控的功能基因验证的方法 |
| 2.8 ZmMM1编码区和qLMchr7重测序以及分析方法 |
| 2.9 ROS积累检测的方法 |
| 2.9.1 DAB染色定性检测ROS积累的方法 |
| 2.9.2 鲁米诺反应(Luciferase assay)定量检测ROS积累的方法 |
| 2.10 克隆构建的一般方法 |
| 2.10.1 扩增候选基因的方法 |
| 2.10.2 DNA纯化方法 |
| 2.10.3 胶回收DNA方法 |
| 2.10.4 克隆载体连接的方法 |
| 2.10.5 表达载体连接的方法 |
| 2.10.6 大肠杆菌转化的方法 |
| 2.10.7 阳性克隆的筛选的方法 |
| 2.10.8 质粒提取的方法 |
| 2.10.9 测序比对并整理的方法 |
| 2.11 烟草瞬时表达的方法 |
| 2.12 玉米原生质体瞬时转化及蛋白提取方法 |
| 2.13 ZmMM1基因功能验证方法 |
| 2.14 qLMchr7调控模式检测的方法 |
| 2.14.1 对ZmMM1编码区段甲基化水平检测的方法 |
| 2.14.2 对ZmMM1转录水平检测的方法 |
| 2.14.3 对ZmMM1蛋白水平检测的方法 |
| 2.14.4 对ZmMM1蛋白是否受到26S蛋白酶体降解检测的方法 |
| 2.14.5 对ZmMM1翻译水平检测的方法 |
| 2.15 qLMchr7元件调控功能的验证方法 |
| 2.16 ZmMM1蛋白进化树构建的方法 |
| 2.17 ZmMM1亚细胞定位方法 |
| 2.18 ZmMM1转录激活能力检测方法 |
| 2.18.1 酵母中证明ZmMM1转录激活能力 |
| 2.18.2 玉米原生质体中证明ZmMM1转录激活能力 |
| 2.19 ZmMM1下游基因筛选方法 |
| 2.19.1 利用DAP-seq筛选下游基因 |
| 2.19.2 利用ChIP-qPCR验证下游候选基因 |
| 2.20 下游候选基因ZmMT3功能验证的方法 |
| 2.20.1 ZmMT3与ZmMM1功能拮抗的验证方法 |
| 2.20.2 ZmMT3在玉米中影响抗性以及PTI过程ROS产生的验证方法 |
| 2.21 RNA-seq数据分析的方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 qLMchr7图位克隆结果 |
| 3.1.1 控制LM表型的QTL初定位结果 |
| 3.1.2 qLMchr7精细定位的结果 |
| 3.1.3 qLMchr7调控ZmMM1的验证 |
| 3.2 qLMchr7调控ZmMM1方式的检测结果 |
| 3.2.1 qLMchr7调控ZmMM1区段的甲基化修饰结果 |
| 3.2.2 qLMchr7调控ZmMM1转录水平的结果 |
| 3.2.3 qLMchr7调控ZmMM1蛋白水平的结果 |
| 3.2.4 qLMchr7调控ZmMM1蛋白降解的结果 |
| 3.2.5 qLMchr7调控ZmMM1的翻译效率的结果 |
| 3.3 qLMchr7功能验证的结果 |
| 3.4 qLMchr7功能位点筛选及验证的结果 |
| 3.5 ZmMM1以及qLMchr7对玉米抗病能力影响的结果 |
| 3.6 qLMchr7~(C117)产生抗病反应的结果 |
| 3.7 ZmMM1蛋白进化树构建的结果 |
| 3.8 ZmMM1蛋白的亚细胞定位结果 |
| 3.9 ZmMM1转录激活能力检测的结果 |
| 3.9.1 ZmMM1在酵母中转录激活能力检测的结果 |
| 3.9.2 ZmMM1在玉米原生质体中转录激活能力检测的结果 |
| 3.10 ZmMM1下游基因筛选以及检测的结果 |
| 3.10.1 ZmMM1下游基因的筛选结果 |
| 3.10.2 ZmMM1下游基因验证的结果 |
| 3.11 ZmMM1在抗病过程中对植物转录组影响的检测结果 |
| 3.12 ZmMM1编码区和qLMchr7重测序分析及检测结果 |
| 3.13 玉米群体中ZmMM1调控元件分析的结果 |
| 3.14 玉米群体中qLMchr7~(C117)对产量影响的结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 关于qLMchr7调控方式的讨论 |
| 4.2 关于ZmMM1基因功能的讨论 |
| 4.3 关于ZmMT3功能的讨论 |
| 4.4 关于qLMchr7应用的讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 使用试剂配方 |
| 附录B 常见实验操作方法 |
| 附录C 数据分析使用代码以及NCBI文件路径 |
| 附录D 实验所用引物序列 |
| 附录E 作者信息 |
| 致谢 |
（2）红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 红三叶主要病虫害、作物白粉病及病原菌鉴定的研究进展 |
| 2.1 红三叶主要病虫害 |
| 2.2 白粉病研究进展 |
| 2.3 病原菌鉴定研究进展 |
| 3 寄主植物-病原菌互作的转录组学研究进展 |
| 3.1 转录组学 |
| 3.2 转录组学在寄主植物与病害研究中的进展 |
| 4 植物抗病机制与GDSL脂肪酶的研究进展 |
| 4.1 作物病害生理生化反应研究进展 |
| 4.2 植物结构抗性研究进展 |
| 4.3 植物内源激素抗病性响应研究进展 |
| 4.4 GDSL脂肪酶基因研究进展 |
| 5 选题依据与意义 |
| 5.1 选题依据 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 5.3 主要技术路线 |
| 第二章 红三叶抗白粉病的生理响应机制 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶白粉菌分离、鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 病害症状观察 |
| 1.3 病原菌形态学观察 |
| 1.4 病原菌rDNA-ITS片段的PCR扩增和序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病害症状与病原菌形态特征观察 |
| 2.2 rDNA ITS片段的扩增与测序 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病生理基础 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 测定方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶的生理生化差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶的生理生化差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×接菌后时间交互作用间红三叶生理生化的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 白粉菌侵染后红三叶内源激素的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测定项目与方法 |
| 1.3 色谱条件及流动相的选择 |
| 1.4 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 标准样品保留时间?回归方程和决定系数 |
| 2.2 单因素处理间各内源激素的差异 |
| 2.3 二因素交互作用间各内源激素的差异 |
| 2.4 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶内源激素的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 红三叶响应白粉菌侵染的结构抗病性 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的细胞结构变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 白粉病不同抗性红三叶叶片显微结构 |
| 2.2 不同红三叶抗性材料叶片组织结构特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 白粉菌侵染后红三叶叶片细胞壁成份变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单因素处理间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.2 二因素交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 2.3 人工接菌×抗病性×浸染时间交互作用间红三叶叶片细胞壁组分的差异 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 红三叶抗白粉病的分子机制及TpGDSL基因的克隆与遗传转化 |
| 前言 |
| 第一节 红三叶抗白粉病的转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料与试验设计 |
| 1.2 测序样品准备和RNA提取 |
| 1.3 建库、测序及信息分析 |
| 1.4 测序数据质控与转录组组装 |
| 1.5 Unigene的注释 |
| 1.6 差异表达基因数字分析 |
| 1.7 基因功能注释及通路富集 |
| 1.8 差异表达基因的qRT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA-seq结果的实时定量PCR验证 |
| 2.2 转录组组装与注释 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 2.4 接种白粉菌后DEGs的GO富集分析 |
| 2.5 接种白粉菌后DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.6 白粉菌侵染红三叶叶片诱导的 DEGs的 Map Man分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 红三叶抗白粉病TpGDSL基因克隆与遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 红三叶TpGDSL基因克隆 |
| 1.2.2 构建表达载体 |
| 1.2.3 红三叶抗白粉病基因TpGDSL遗传转化拟南芥 |
| 1.2.4 拟南芥T_1代阳性植株鉴定 |
| 1.2.5 目的基因生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TpGDSL基因阳性克隆鉴定 |
| 2.2 TpGDSL基因的核苷酸序列分析 |
| 2.3 TpGDSL基因编码蛋白的一级结构分析 |
| 2.4 TpGDSL基因编码蛋白的二级结构分析 |
| 2.5 TpGDSL基因编码蛋白的三级结构分析 |
| 2.6 TpGDSL基因克隆与表达载体构建 |
| 2.7 转基因拟南芥T_1阳性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与研究展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）菜豆普通细菌性疫病抗性候选基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 普通菜豆概述 |
| 1.1.1 普通菜豆概况 |
| 1.1.2 影响普通菜豆生产因素 |
| 1.2 普通细菌性疫病研究进展 |
| 1.2.1 普通细菌性疫病简介 |
| 1.2.2 普通细菌性疫病侵染方式及危害 |
| 1.2.3 普通细菌性疫病抗病基因研究进展 |
| 1.3 病毒诱导的基因沉默 |
| 1.3.1 VIGS作用机理 |
| 1.3.2 VIGS优点及局限性 |
| 1.3.3 VIGS在豆科作物中的应用 |
| 1.4 立题依据与技术路线 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 研究材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 植株材料 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.1.4 试剂耗材与实验仪器 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.1.6 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 普通菜豆基因组DNA提取 |
| 2.2.2 病原菌DNA提取 |
| 2.2.3 普通菜豆叶片RNA提取 |
| 2.2.4 反转录合成c DNA |
| 2.2.5 PCR扩增 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物 |
| 2.2.7 连接转化PCR回收产物 |
| 2.2.8 阳性克隆检测 |
| 2.2.9 质粒提取 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 重组质粒载体构建 |
| 2.2.12 基于VIGS技术的基因沉默和基因过表达接种方法 |
| 2.2.13 CBB接菌及抗性鉴定 |
| 2.2.14 亚细胞定位 |
| 2.2.15 普通菜豆叶片病原菌定殖量测定 |
| 2.2.16 转录组测序与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 候选区段克隆及分析 |
| 3.2 抗性候选基因分析 |
| 3.2.1 候选基因Gene1 分析 |
| 3.2.2 候选基因Gene2 分析 |
| 3.2.3 候选基因Gene3 分析 |
| 3.3 抗性候选基因功能验证 |
| 3.3.1 候选基因沉默 |
| 3.3.2 候选基因过表达 |
| 3.4 Gene1 亚细胞定位 |
| 3.5 抗性基因Gene1 优异等位变异挖掘 |
| 3.5.1 宽叶菜豆种质资源CBB抗性鉴定 |
| 3.5.2 Gene1 序列多样性分析 |
| 3.6 普通菜豆响应CBB侵染转录组分析及候选基因分析 |
| 3.6.1 抗感材料抗性分析 |
| 3.6.2 转录组测序 |
| 3.6.3 差异基因分析 |
| 3.6.4 WGCNA共表达网络分析 |
| 3.6.5 抗性相关基因综合分析 |
| 3.6.6 qRT-PCR验证 |
| 3.6.7 抗性候选基因共表达网络分析 |
| 3.7 讨论 |
| 3.7.1 候选基因在菜豆抗病中的作用 |
| 3.7.2 普通菜豆CBB抗性相关基因 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）谷子和葡萄抗病相关基因的筛选及功能验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物免疫系统介绍 |
| 1.3 基于转录组学研究的抗病基因筛选 |
| 1.3.1 转录组学研究进展 |
| 1.3.2 利用转录组学的抗病基因筛选 |
| 1.4 谷子抗病基因研究现状 |
| 1.5 葡萄灰霉病研究进展 |
| 1.6 基于基因克隆的异源表达分析技术 |
| 1.6.1 基因克隆技术的发展 |
| 1.6.2 异源表达分析在作物功能基因研究中的应用 |
| 1.7 本研究的内容和意义 |
| 第二章 基于转录组测序的谷子抗病基因的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 谷子栽培 |
| 2.2.2 谷子RNA提取与高通量测序 |
| 2.2.3 数据筛选和生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因表达水平分析 |
| 2.3.2 谷子拌菌组差异表达基因(DEGs)的分析 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 第三章 谷子抗病的生理响应和抗病基因的克隆 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 黑粉菌响应基因的筛选 |
| 3.2.4 防御相关酶活性和MDA含量的测定 |
| 3.2.5 表达载体pCambia1300-221-SiLEA14的构建 |
| 3.2.6 农杆菌GV3101介导的浸花法转化拟南芥 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PR基因SiBGL和SiCHI参与谷子对黑粉菌的响应 |
| 3.3.2 谷子与黑粉菌互作过程中ETI被激活 |
| 3.3.3 SiCDPK和SiRbohF参与谷子对黑粉菌的响应 |
| 3.3.4 苯丙烷途径参与谷子对黑穗病的防御 |
| 3.3.5 表达载体pCambia1300-221-SiLEA14的获得 |
| 3.3.6 过表达Si LEA14 拟南芥转基因植株的获得 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 第四章 葡萄抗病相关基因的克隆与异源表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2.3 高通量测序及数据处理 |
| 4.2.4 CTAB法提取基因组DNA |
| 4.2.5 葡萄RNA提取 |
| 4.2.6 基于Gateway技术的载体构建 |
| 4.2.7 转基因拟南芥植株的筛选 |
| 4.2.8 抗病相关酶活性测定 |
| 4.2.9 统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 测序数据分析 |
| 4.3.2 差异表达基因中转录因子的分析 |
| 4.3.3 VvWRKY70启动子分析 |
| 4.3.4 VvWRKY70系统发育树构建 |
| 4.3.5 VvWRKY70蛋白结构域分析 |
| 4.3.6 葡萄叶片总RNA的获得 |
| 4.3.7 Pro_(35s)::VvWRKY70-GFP表达载体的获得 |
| 4.3.8 过表达Vv WRKY70 拟南芥转基因植株的获得 |
| 4.3.9 VvWRKY70在转基因拟南芥植株中的亚细胞定位 |
| 4.3.10 拟南芥过表达VvWRKY70增强了对灰霉菌的抗性 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甜瓜及其病害防治方法 |
| 1.2 病程相关蛋白研究概述 |
| 1.2.1 病程相关蛋白家族 |
| 1.2.2 病程相关蛋白的生物学功能 |
| 1.3 类甜蛋白研究概述 |
| 1.3.1 类甜蛋白及其结构特征 |
| 1.3.2 类甜蛋白的生物学功能 |
| 1.3.3 类甜蛋白的功能研究策略 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 甜瓜类甜蛋白家族的鉴定及表达特性分析 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甜瓜与白粉病菌的培养及接种 |
| 2.2.2 总RNA的提取和反转录 |
| 2.2.3 TLP家族成员的鉴定及序列分析 |
| 2.2.4 基因结构及保守基序分析 |
| 2.2.5 多序列比对及进化关系分析 |
| 2.2.6 染色体定位及基因复制现象分析 |
| 2.2.7 组织特异性分析 |
| 2.2.8 病菌侵染下的表达特性分析 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 TLP家族成员的序列特性 |
| 2.3.2 TLP家族的进化关系 |
| 2.3.3 TLPs的基因结构及保守基序分布 |
| 2.3.4 TLPs的染色体定位及基因复制现象 |
| 2.3.5 TLP家族成员的组织特异性 |
| 2.3.6 病菌侵染下的表达特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 CmTLP17 在烟草中的异源表达及抗病功能研究 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 枯萎病菌的培养 |
| 3.2.2 CmTLP17 的克隆及表达载体的构建 |
| 3.2.3 农杆菌工程菌株的创制 |
| 3.2.4 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.5 转基因烟草植株的检测 |
| 3.2.6 转基因烟草的抗病性鉴定 |
| 3.2.7 组织化学染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CmTLP17 克隆及表达载体的获得 |
| 3.3.2 农杆菌工程菌株的获得 |
| 3.3.3 过表达CmTLP17 烟草植株的获得 |
| 3.3.4 转基因烟草植株的鉴定 |
| 3.3.5 CmTLP17 对烟草抗病性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 CmTLP17 的原核表达及体外抑菌效果研究 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 枯萎病菌的培养 |
| 4.2.2 CmTLP17 蛋白编码序列的克隆 |
| 4.2.3 CmTLP17 克隆及表达载体的构建 |
| 4.2.4 原核表达工程菌株的创制 |
| 4.2.5 融合蛋白的诱导表达及变、复性 |
| 4.2.6 表达蛋白的体外抗菌活性检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CmTLP17 原核表达载体的获得 |
| 4.3.2 融合蛋白最佳诱导表达条件的确定 |
| 4.3.3 可溶性蛋白的获得 |
| 4.3.4 表达蛋白的体外抗菌活性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 实时定量PCR引物 |
| 附录 B 甜瓜TLP家族成员的详细信息 |
| 附录 C 本论文所用培养基及试剂配方 |
| 附录 D CmTLP17 序列全长及测序结果 |
| 附录 E SDS-PAGE电泳流程 |
| 附录 F 本论文所用质粒图谱 |
| 攻读硕士学位期间科研成果情况 |
| 致谢 |
（6）陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.1.1 棉花黄萎病的危害 |
| 1.1.2 棉花黄萎病菌的致病机理 |
| 1.1.3 棉花抗黄萎病机制 |
| 1.2 植物感病基因的研究 |
| 1.2.1 感病基因的定义 |
| 1.2.2 感病基因的发掘 |
| 1.2.3 感病基因的应用 |
| 1.3 基因功能的研究技术 |
| 1.3.1 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.3.2 RACE技术 |
| 1.3.3 亚细胞定位 |
| 1.3.4 基因的过表达技术 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 目的基因的表达模式分析 |
| 2.1 试验材料与试剂 |
| 2.1.1 棉花品种与病菌 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 陆地棉的种植及培养 |
| 2.2.2 病菌的培养及活化 |
| 2.2.3 不同处理的陆地棉取样 |
| 2.2.4 荧光定量引物合成 |
| 2.2.5 不同抗病品种样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.6 陆地棉不同组织样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.7 植物激素处理后样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同抗病品种中目的基因的表达模式 |
| 2.3.2 植物激素处理后的表达模式 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VIGS技术验证基因的抗黄萎病能力 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.1 棉花品种与病菌 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试剂盒与试剂 |
| 3.1.5 试验试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 棉株的种植及培养 |
| 3.2.2 克隆VIGS目的基因片段 |
| 3.2.3 沉默载体构建 |
| 3.2.4 重组VIGS载体转化农杆菌 |
| 3.2.5 棉株的接种 |
| 3.2.6 沉默棉株的目的基因表达量分析 |
| 3.2.7 病菌的活化及接种 |
| 3.2.8 沉默植株的抗病性鉴定 |
| 3.2.9 台盼蓝染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 沉默载体的构建 |
| 3.3.2 VIGS沉默棉株的表型 |
| 3.3.3 目的基因的表达量测定 |
| 3.3.4 沉默植株抗病性鉴定 |
| 3.4 台盼蓝染色 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 候选感黄萎病基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7的全长克隆 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 所需仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 陆地棉86-1 的种植 |
| 4.2.2 RNA的提取 |
| 4.2.3 cDNA的合成 |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 GhBZR1、GhWRKY74 全长克隆 |
| 4.2.6 GhTGA7 全长克隆 |
| 4.2.7 GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因GhBZR1 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.2 基因GhWRKY74 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.3 基因GhTGA7 的克隆及生物信息分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的亚细胞定位分析 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.1.1 植物材料与载体 |
| 5.1.2 仪器设备 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 植物材料的种植 |
| 5.2.2 目的基因的克隆 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体35S::GhX-GFP转化农杆菌 |
| 5.2.5 烟草接种及结果观察 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.3.2 激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 超表达技术研究GhBZR1 基因功能 |
| 6.1 材料于试剂 |
| 6.1.1 植物材料与病菌 |
| 6.1.2 载体与菌株 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 试剂盒与试剂 |
| 6.1.5 试剂的配制 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 GhBZR1 目的片段扩增 |
| 6.2.2 超表达载体构建 |
| 6.2.3 超表达载体pPZP111-eGFP-GhBZR1 转化农杆菌 |
| 6.2.4 拟南芥遗传转化 |
| 6.2.5 阳性苗筛选 |
| 6.2.6 基因GhBZR1 的表达分析 |
| 6.2.7 超表达植物的抗病性鉴定 |
| 6.2.8 转基因拟南芥抗病相关基因的表达 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 基因GhBZR1 超表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因拟南芥的筛选 |
| 6.3.3 超表达拟南芥黄萎病的抗性鉴定 |
| 6.3.4 超表达拟南芥抗性相关基因的表达分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 大麦条纹病害的研究进展 |
| 1.1 大麦条纹病害的发生 |
| 1.1.2 大麦条纹病害的防治 |
| 1.2 大麦条纹病病原菌的研究 |
| 1.2.1 大麦条纹病病原菌的生物学特性 |
| 1.2.2 大麦条纹病病原菌的致病性 |
| 1.3 丝状真菌基因功能的研究方法 |
| 1.3.1 基因敲除技术 |
| 1.3.2 基因干扰技术 |
| 1.3.3 基因的过表达 |
| 1.3.4 农杆菌侵染的转基因技术 |
| 1.3.5 瞬时表达转化体系 |
| 1.3.6 亚细胞定位 |
| 1.4 植物免疫机制研究进展 |
| 1.4.1 病原菌与寄主植物互作模型与假说 |
| 1.4.2 抗病基因(R)与无毒基因(Avr)的互作机理 |
| 1.4.2.1 直接相互作用模式 |
| 1.4.2.2 间接相互作用模式 |
| 1.4.3 病原真菌效应基因研究进展 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 Pgr07060 基因功能的初步分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 目的基因的克隆 |
| 2.1.3 农杆菌瞬时表达载体的构建及转化 |
| 2.1.4 亚细胞定位载体的构建及转化 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 大麦条纹病菌基因Pgr07060的RNA提取及克隆分析 |
| 2.2.2 大麦条纹病菌基因Pgr07060 编码产物的生物信息学分析 |
| 2.2.3 Pgr07060 基因瞬时表达载体的构建 |
| 2.2.4 PVX:Pgr07060 的农杆菌转化及鉴定 |
| 2.2.5 基因Pgr07060 在烟草中的瞬时表达 |
| 2.2.6 亚细胞定位载体的构建 |
| 2.2.7 PCAMBIA1300-GFP:Pgr07060 的农杆菌转化及鉴定 |
| 2.2.8 基因Pgr07060 在本氏烟草中亚细胞定位的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Pgr07060 基因干扰载体的构建及其功能研究 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 基因Pgr07060 干扰片段的克隆分析 |
| 3.2.2 干扰载体p Silent-1:Pgr07060 的构建与鉴定 |
| 3.2.3 干扰转化株的筛选与验证 |
| 3.2.4 营养培养基生长分析 |
| 3.2.5 显微结构观察 |
| 3.2.6 致病性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Pgr07060 基因过表达载体的构建及功能研究 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 过表达载体p BARGPE1:Pgr07060 的构建与验证 |
| 4.2.2 过表达转化株的筛选与验证 |
| 4.2.3 营养培养基生长分析 |
| 4.2.4 显微结构观察 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（8）病毒/类病毒侵染的桃树miRNA分析及其侵染性克隆构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 桃及桃病毒病的发生情况 |
| 1.1.1 桃介绍 |
| 1.1.2 桃病毒病发生概况 |
| 1.2 植物miRNA研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的发现 |
| 1.2.2 miRNA生物合成及作用机制 |
| 1.2.3 miRNA与植物病原侵染 |
| 1.2.4 重要果树病原反应相关miRNA |
| 1.2.5 植物miRNA的鉴定与检测 |
| 1.2.6 植物miRNA靶基因的验证 |
| 1.2.7 植物miRNA功能研究方法 |
| 1.3 植物病毒及类病毒侵染性克隆及其应用 |
| 1.3.1 侵染性克隆及其构建策略 |
| 1.3.2 侵染性克隆技术的应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 病毒/类病毒侵染的桃树miRNA分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 文库构建和测序 |
| 2.2.3 已知miRNA比对 |
| 2.2.4 新miRNA预测 |
| 2.2.5 miRNA差异表达分析 |
| 2.2.6 miRNA靶基因预测 |
| 2.2.7 差异表达miRNA靶基因的GO和 KEGG分析 |
| 2.2.8 miRNA及靶标基因的荧光定量PCR检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 高通量测序及测序数据特征 |
| 2.3.2 已知miRNA鉴定和表达 |
| 2.3.3 新miRNA鉴定和表达 |
| 2.3.4 miRNA差异表达分析 |
| 2.3.5 差异表达miRNA靶基因预测 |
| 2.3.6 差异表达miRNA靶基因富集分析 |
| 2.3.7 部分miRNA及靶标基因的荧光定量PCR |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 NSPaV及 PLMVd侵染性克隆构建及致病性鉴定 |
| 3.1 实验样品 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.3 载体与菌株 |
| 3.4 NSPaV侵染性克隆构建 |
| 3.4.1 植物总RNA提取 |
| 3.4.2 总RNA加 poly(A) |
| 3.4.3 NSPaV的3'、5'端序列扩增 |
| 3.4.4 NSPaV基因组全长扩增 |
| 3.4.5 NSPaV重组质粒构建及农杆菌感受态制备 |
| 3.4.6 接种物制备及农杆菌注射接种 |
| 3.4.7 侵染活性RT-PCR检测 |
| 3.5 PLMVd侵染性克隆构建 |
| 3.5.1 植物总RNA提取 |
| 3.5.2 PLMVd全长扩增 |
| 3.5.3 PLMVd二倍体侵染性克隆制备 |
| 3.5.4 PLMVd体外转录 |
| 3.5.5 体外转录产物接种 |
| 3.5.6 PLMVd探针制备 |
| 3.5.7 Dot blot 检测侵染活性 |
| 3.6 结果与分析 |
| 3.6.1 NSPaV序列扩增 |
| 3.6.2 NSPaV重组质粒构建 |
| 3.6.3 NSPaV侵染性克隆在草本寄主上侵染活性检测 |
| 3.6.4 NSPaV侵染性克隆在桃寄主上侵染活性检测 |
| 3.6.5 PLMVd全长扩增及二倍体侵染性克隆制备 |
| 3.6.6 PLMVd侵染性克隆在草本寄主上侵染活性检测 |
| 3.6.7 PLMVd侵染性克隆在桃寄主上侵染活性检测 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）利用CRISPR技术创建水稻抗病相关突变体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 CRISPR-Cas基因编辑技术的研究进展 |
| 1.1.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas系统的特点与多样性 |
| 1.1.3 已被改造为基因编辑工具的CRISPR-Cas系统 |
| 1.2 CRISPR基因编辑技术在植物中的应用 |
| 1.2.1 植物多位点编辑 |
| 1.2.2 精准基因组编辑 |
| 1.2.3 基因转录调控 |
| 1.2.4 高通量遗传筛选 |
| 1.3 类受体激酶在植物免疫中的作用 |
| 1.3.1 植物类受体激酶概述 |
| 1.3.2 植物免疫系统 |
| 1.3.3 类受体激酶介导的免疫信号传导 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 靶位点的设计 |
| 2.2.3 sgRNA的组装与克隆 |
| 2.2.4 感受态细胞的高通量转化 |
| 2.2.5 水稻原生质体的分离与转化 |
| 2.2.6 水稻遗传转化 |
| 2.2.7 FLASH高通量CRISPR突变体库的构建与检测 |
| 2.2.8 基因表达分析 |
| 2.2.9 总蛋白的提取与Western Blot |
| 2.2.10 水稻叶片接种稻瘟菌 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基于CRISPR-dCas9 的基因转录激活体系的建立 |
| 3.1.1 基于CRISPR-dCas9 转录激活载体的设计 |
| 3.1.2 dCas9-VP160 在水稻原生质体中能有效激活目标基因表达 |
| 3.1.3 以植物源转录激活域以及协同激活结构优化转录激活系统 |
| 3.1.4 利用内含子表达sgRNA优化转录激活系统 |
| 3.1.5 转录激活系统在稳定转化水稻中的效率验证 |
| 3.2 基于CRISPR-Cas12a的水稻基因组编辑体系的建立 |
| 3.2.1 基于FnCas12a和LbCas12a的水稻基因组编辑载体的设计 |
| 3.2.2 在原生质体中验证内含子表达crRNA的可行性 |
| 3.2.3 不同 crRNA表达方式以及不同 Cas12a的编辑效率比较 |
| 3.2.4 内含子表达crRNA array的 Cas12a能实现多基因高效编辑 |
| 3.2.5 稳定转化水稻中不同Cas12a系统编辑效率的比较 |
| 3.3 FLASH基因编辑流水线组装CRISPR文库的设计和构建 |
| 3.3.1 FLASH基因编辑流水线的构想与设计 |
| 3.3.2 FLASH载体系统的可行性验证 |
| 3.3.3 FLASH基因编辑流水线构建CRISPR文库的可行性验证 |
| 3.3.4 三个CRISPR-Cas系统靶向敲除效率的比较 |
| 3.4 利用FLASH基因编辑流水线构建水稻RLK突变体库 |
| 3.4.1 水稻全部RLK基因的sgRNA设计与脱靶预测 |
| 3.4.2 RLK阵列式CRISPR文库的构建与转化 |
| 3.4.3 RLK突变体库sgRNA的快速鉴定 |
| 3.4.4 覆盖12 个靶基因的最佳T_0株系数量 |
| 3.4.5 RLK突变体库中靶向基因编辑情况的检测 |
| 3.4.6 FLASH方法可快速追踪无T-DNA插入的意外编辑事件 |
| 3.4.7 可利用Cas9 脱靶效应构建多基因突变体 |
| 3.4.8 水稻抗病相关RLK基因的快速筛选 |
| 4.讨论 |
| 4.1 CRISPR转录激活系统在植物中的建立及应用前景 |
| 4.2 基于CRISPR-Cas12a的高效多位点编辑系统在植物中的建立 |
| 4.3 FLASH基因编辑流水线的技术总结与应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ 引物信息 |
| 附录 Ⅱ 12个FLASH标签的序列 |
| 附录 Ⅲ RLK基因和gRNA的信息列表 |
| 附录 Ⅳ RLK gRNAs脱靶预测 |
| 附录 Ⅴ RLK转基因株系基因型鉴定的结果列表 |
| 附录 Ⅵ 本研究构建的FLASH载体 |
| 附录 Ⅶ 作者简介及在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）硅酸钠诱导马铃薯抗黑痣病基因StWRKY11克隆及载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马铃薯概述 |
| 1.2 马铃薯黑痣病研究进展 |
| 1.2.1 马铃薯黑痣病概述 |
| 1.2.2 马铃薯黑痣病防治方法 |
| 1.3 诱导抗性 |
| 1.4 诱导抗病基因表达 |
| 1.5 硅增强立枯丝核菌病害抗性研究 |
| 1.5.1 生物系统中硅的概述 |
| 1.5.2 硅提高植物立枯丝核菌病害抗性 |
| 1.5.3 硅提高立枯丝核菌病害抗性机制 |
| 1.6 基于转录组测序马玲薯胁迫的防卫反应 |
| 1.7 转录因子 |
| 1.7.1 WRKY转录因子及抗性机制 |
| 1.7.2 WRKY转录因子的应用 |
| 1.8 植物转基因技术 |
| 1.8.1 农杆菌介导法概述 |
| 1.8.2 马铃薯转基因技术 |
| 1.9 目的意义与技术路线 |
| 2 马铃薯StWRKY11 基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 供试试剂 |
| 2.1.3 抗生素配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验设计 |
| 2.2.2 马铃薯地下茎总RNA提取 |
| 2.2.3 第一链c DNA合成 |
| 2.2.4 马铃薯StWRKY11 基因克隆及测序 |
| 2.2.5 重组质粒的提取 |
| 2.2.6 StWRKY11 基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 StWRKY11 基因扩增检测结果 |
| 2.3.2 重组载体菌液PCR验证 |
| 2.3.3 StWRKY11 基因的生物信息学分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 3 马铃薯品种大西洋再生体系建立 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试管苗扩繁 |
| 3.2.2 诱导愈伤组织形成的培养基筛选 |
| 3.2.3 不定芽分化培养基筛选 |
| 3.2.4 数据统计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同激素配比对马铃薯大西洋愈伤组织形成的影响 |
| 3.3.2 不同激素配比对马铃薯大西洋愈伤组织不定芽分化的影响 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 4 表达载体构建及遗传转化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 供试培养基 |
| 4.1.3 供试试剂 |
| 4.1.4 抗生素配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 表达载体构建 |
| 4.2.2 马铃薯遗传转化体系的建立 |
| 4.2.3 转化马铃薯植株检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pCAMBIA1302—StWRKY11 载体构建 |
| 4.3.2 农杆菌介导的马铃薯StWRKY11 基因的遗传转化 |
| 4.3.3 转基因植株检测 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.4.1 表达载体的选择 |
| 4.4.2 马铃薯转基因体系的建立 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 5.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、抗病基因质粒pAHCGG的构建及应用研究（论文参考文献）
- [1]玉米多重病害抗性位点qLMchr7的图位克隆及功能解析[D]. 王宏泽. 华中农业大学, 2021
- [2]红三叶抗白粉病的生理和分子机制及抗病基因TpGDSL的克隆与遗传转化[D]. 蒲小剑. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]菜豆普通细菌性疫病抗性候选基因功能分析[D]. 杨鹏辉. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]谷子和葡萄抗病相关基因的筛选及功能验证[D]. 刘婧. 山西大学, 2021
- [5]甜瓜TLP家族的鉴定及CmTLP17在烟草抗枯萎病中的应用初探[D]. 刘亚荣. 大连理工大学, 2021(01)
- [6]陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究[D]. 贺浪. 中国农业科学院, 2021(09)
- [7]大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究[D]. 郭铭. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [8]病毒/类病毒侵染的桃树miRNA分析及其侵染性克隆构建[D]. 杨丽娟. 中国农业科学院, 2021(09)
- [9]利用CRISPR技术创建水稻抗病相关突变体的研究[D]. 陈凯园. 华中农业大学, 2021(02)
- [10]硅酸钠诱导马铃薯抗黑痣病基因StWRKY11克隆及载体构建[D]. 张冬梅. 内蒙古农业大学, 2021(02)