一、红曲霉SAGE文库中双标签的制备研究（论文文献综述）
唐利华[1]（2014）在《光诱导香菇菌丝转色形成机理的研究》文中研究表明香菇是目前世界上一种深受消费者喜欢的重要食用菌品种，其在世界范围的生产量和消费量排名仅次于双孢蘑菇之后，是第二大食药用菌品种。香菇栽培周期至少可以分为四个重要阶段，分别为营养菌丝生长阶段、菌丝转色形成阶段、原基形成阶段、子实体生长阶段。香菇菌丝转色形成是原基发生和子实体形成前重要阶段，对香菇的产量和品质具有重要作用，但香菇发育过程中菌丝转色形成的机制还知之甚少，尤其是环境因子比如光对香菇菌丝转色形成的影响还未见报道。为了深入分析和阐明香菇菌丝转色形成的分子机制，本论文从转录组和蛋白质组水平系统分析光诱导香菇菌丝转色形成的机理。这是首次对香菇菌丝转色形成进行系统研究，为这种具有重要商业价值的食用菌的子实体发育的分子机制的深入研究打下一基础，对研究香菇的生长发育及其次级代谢也具有重要意义。本论文从转录组和蛋白质组水平，分析了光对香菇菌丝转色的影响，并挖掘其相应的候选基因和蛋白，解析了香菇菌丝转色形成的机制，主要结果如下：第一、通过在完全避光条件下培养香菇菌丝30天，菌丝发满菌包，并且菌丝均为白色，再通过在两种不同条件下（有光和避光）进行平行培养（后熟），其中在有光条件下，香菇菌丝逐渐形成转色，而在避光条件下，香菇菌丝未发生转色现象，即仍为白色。培养试验结果表明，光对香菇菌丝转色的形成具有重要作用。第二、香菇菌丝经过30天黑暗发菌培养后，菌丝长满菌包，再进行见光和黑暗两种处理进行后续培养以考察转色情况，其中分别对黑暗培养30天，以及后续培养50天两种试验处理的的菌包表层香菇菌丝作为试验样品，其样品编号分别为样品118，313W以及313C。再利用新一代高通量转录组测序技术（RNA-seq）分别对三个试验样品进行测序，共获得了约159.23million reads,通过从头组装得到了31,511unigenes，其中unigenes的平均长度为1,746bp其N50为2,480bp。将得到的unigenes应用BLASTx与NR, SwissProt, COG以及KEGG库进行注释与比对，其中有24,246（76.94%） unigenes有注释结果。通过比较313C/118和313C/313W的表达谱，分别获得3958和5651显着差异表达基因。通过比较和COG库注释等分析，揭示出与光诱导香菇菌丝转色形成相关的候选基因，这些基因编码的蛋白主要包括光感受器（如WC-1, WC-2, phytochrome）,光信号转导途径（如two-component phosphorelay system, mitogen-activated protein kinasepathway），以及色素形成基因（如polyketide synthase, O-methyltransferase, laccase,P450-monooxygenase, oxidoreductase）等，在此基础上，我们初步构建了光诱导菌丝转色的分子模型。同时，应用实时定量PCR技术对转录组数据的可靠性进行了验证。第三、以见光转色的香菇菌丝转色的样品（313C）与避光未转色的香菇菌丝样品（313W）为材料，利用蛋白质组学的手段，即采用蛋白质双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）技术比较分析了两种处理条件下香菇菌丝的蛋白质表达图谱。通过双向电泳分离出700个左右银染的蛋白质点，其中有73个蛋白质点有显着差异。这些蛋白质点经酶解和质谱鉴定，最终鉴定出52个蛋白质，其中有32个蛋白质在样品转色的香菇菌丝中表现为上调，其主要包括核苷二磷酸激酶、锰离子超氧化歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、蛋白酶成分PTS1、热休克蛋白70、20S蛋白酶体亚基、S短链脱氢酶/还原酶SDR、脂肪酶、腺苷激酶、3-异丙基脱氢酶、酮还原酶等；20个蛋白质为下调，主要包括琥珀酸半醛脱氢酶、林可霉素冷凝蛋白LMBA、乙二醛I、天门冬氨酸激酶丝氨酸脱氢酶、增殖相关2G4、三肽肽酶A和碳水化合物结合模块系列13蛋白等。根据其主要功能，可将其分为能量代谢相关酶类、核苷酸的转运和代谢、碳水化合物运输和代谢、脂质转运和代谢、翻译后修饰、蛋白质折叠、伴侣等相关类型。通过蛋白质组初步分析，我们发现由光诱导香菇菌丝转色形成，可能依赖于光信号传导的蛋白。蛋白NDK的显着上调表达，进一步说明涉及光信号转导与调控的蛋白质在光诱导香菇菌丝转色形成过程中起着重要作用。此外，推测其能调节信号介导的色素等相关代谢合成基因的表达，从而完成香菇菌丝的转色。本研究结果为香菇的功能基因组学的深入分析研究奠定了良好基础。第四、通过香菇菌丝的转录组进行SSR分子标记筛选和分析，结果表明，有2474个Unigenes检测出SSRs分子标记位点，总计获得了3017个SSRs分子标记。其中438个Unigenes含有一个以上的SSR位点，205个Unigenes存在于化合物合成相关途径中。另外，三核苷酸重复类型有1333个，占有42.9%，类型最多的重复序列是（GGA）n （6.15%）和（TGG）n （6.0%）。以转录本为基础发展的分子标记将是鉴定与转色农艺性状相关遗传功能的重要资源。
陈周伟[2]（2014）在《基于RNA-seq技术的耐辐射动球菌在辐射胁迫下差异表达基因的筛选和验证》文中研究表明耐辐射动球菌（Kineococcus radiotolerans,K.radiotolerans）是一种从核污染环境中分离出来的可在γ射线、强碱、高盐、干旱、高金属离子浓度、高渗透压及高化学毒性等严酷环境中存活的革兰氏阳性抗辐射菌。K.radiotolerans可应用于环境保护和生物修复等领域,但其分子基础及作用机制尚未明确。通过具高效性和准确性的深度测序（RNA-seq）技术对K.radiotolerans未处理组（Wild-type Sample,WS）和 4.5 kGy 辐照剂量处理组（Radiation-induced Sample,RS）的转录组进行测序,明确该菌在辐射诱导之后相关基因的差异表达情况,初步探索其抗辐射的分子调控机理,并为其调控研究提供基础数据。本研究分别选取WS和RS进行总RNA提取和cDNA文库构建,通过Illumina Hiseq2000测序平台对两个样本的转录组进行测序,利用TopHat软件将测序结果中高质量的有效测序读数与K.radiotolerans全基因组进行匹配,用DEGseq软件计算并分析两个样本中各基因的标准表达量（FPKM值）及表达差异性,以筛选出差异表达基因。利用cuffdiff软件对差异表达基因进行COG功能聚类分析,得到与辐射抗性相关的差异表达基因并通过qRT-PCR进行验证。测序结果显示WS和RS转录组原始总测序读数分别为28,508,412和36,145,816,对原始总reads数进行质量预处理后,分别获得有效测序读数为23,357,920和29,61 1,930。去除rRNA之后的有效reads数与基因组进行匹配,匹配率分别为86.15%和89.13%,符合测序的可靠性要求。通过差异表达分析得出RS样本相对于WS样本而言,显着上.调和下调表达的基因数分别为80个和63个,COG功能聚类分析这143个基因,结果显示有20个与辐射抗性相关的差异表达基因,且均上调,且qRT-PCR验证为阳性。通过差异表达分析和COG功能聚类分析得到K.radiotolerans中具辐射抗性潜在相关的差异表达基因共有20个,其中与DNA修复途径相关的有recA基因、ruvA基因和ruvB基因,与ROS途径相关的有katA基因。本研究为揭示K.radiotolerans的代谢途径及辐射抗性的作用机理奠定了基础。
杨婧[3]（2013）在《短额负蝗三种虫态的比较转录组及线粒体转录组作图研究》文中提出短额负蝗Atractomorpha sinensis I. Bolivar,1905,隶属于直翅目蝗总科锥头蝗科,分布极其广泛,由于成虫和若虫多栖息在茎叶上取食,严重危害禾本科植物的生长发育。目前对于短额负蝗的研究主要集中在形态学、种群遗传多样性、配子发生和线粒体全基因组学等方面,有关短额负蝗的基因组和转录组研究分析未见报道。由于蝗虫基因组巨大,对其进行测序和生物学分析费用昂贵,且需要耗费大量的资源。与基因组相比,蝗虫的转录组规模相对较小,研究可行性较高,并且这类研究可以从不同类型细胞、处于不同发育阶段的生物体等角度对基因表达情况进行研究,同时也反映了研究对象的动态转录水平。本研究利用Illumina HiSeqTM2000测序平台,对短额负蝗若虫、雌性成虫和雄性成虫进行了转录组深度测序,在对测序结果进行拼接的基础上,采用生物信息学分析方法进行了短额负蝗转录组的全局分析。使用软件edgeR对三个样品的差异表达基因进行筛选和功能分析,为短额负蝗的发育和性别调控研究提供了大量信息。最后,通过对短额负蝗的线粒体进行转录组作图研究,获得了大量线粒体转录信息。本研究的主要结果如下：1.短额负蝗若虫、雌性和雄性成虫三个样品的转录组测序共获得20Gb数据。若虫测序获得54,122,927对读序,雌性成虫共得到24,713,322对读序,雄性成虫共得到22,979,536对读序。通过对序列进行序列拼接和组装,最终获得60,382条短额负蝗的Unigene,平均长度为707bp, GC含量为43.02%。采用Trinity软件对Unigene进行可读框预测,共预测得到29,705条CDS序列,平均长度为717bp,即大部分蛋白编码基因编码氨基酸的个数超过了200个。2.对获得的60,382条Unigene进行功能注释分析,使用Blast将序列与Nr、Nt、 SwissProt、KEGG、COG、GO等数据库进行比对注释,发现有27,325个Unigene注释到以上数据库中,占到总数的45%。其中注释到GO数据库中的序列最多,共有14,749条,对其进行了细胞组分、分子功能和生物学过程三个类别的划分。大量基因都参与了分子功能,参与各种连接形式和催化活性的基因数量最多；在细胞组分中,被注释到细胞内的基因个数最多；而在各种生物学过程中,生理过程中注释到的基因个数最多。3.在KEGG分析中,注释到遗传信息过程的基因数目最多,共4,391个,包括基因的复制和修复、RNA转录、蛋白质的翻译和加工修饰等过程,其中参与翻译的基因最多；其次为新陈代谢的基因数量,共有4,003个,包括各种氨基酸代谢、碳水化合物代谢、多糖的生物合成与代谢等；相比而言,注释到与代谢疾病相关的基因数量较少。另外,有81个基因注释到了发育过程中。4.使用edgeR软件对短额负蝗若虫和成虫、雌性成虫和雄性成虫间进行差异表达基因的筛选,在若虫和成虫之间共筛选出9,069个差异表达基因,其中有5,925个基因在若虫中显着上调,3,144个在成虫中表达上调。对差异表达基因进行功能注释及功能分析,其中5,205条差异基因参与了GO分类,细胞组分中注释到了1,200个基因,生物学过程注释到了1,518个基因,2,487个基因被注释到了分子功能中,大部分都集中在各种结合（Binding）和活性（Activity）中。差异表达基因中有2,382个参与了KEGG代谢通路,主要参与了各种代谢途径以及遗传信息的加工过程,尤其是与昆虫激素合成的生物通路相关基因都发生了不同程度的差异表达,表明这些基因在短额负蝗生长发育方面具有重要的作用。5.本研究在短额负蝗雌性成虫和雄性成虫中共筛选出1,879个差异基因,有608个基因在雌虫中上调,1,271个基因在雄虫中上调。其中806个差异基因注释到了GO数据库中,115个注释到相关细胞组分,448个基因参与了各种分子功能,243个基因注释到了生物学过程；193个差异基因参与到KEGG代谢通路中,CYP3A属于CYP450酶系,在雌性成虫中发生上调,推测其可能参与到昆虫性激素的生物合成过程。6.通过短额负蝗全线粒体转录物作图,发现rRNA的转录效率高于蛋白编码基因,说明rRNA在核糖体的组装中起到了重要作用,因此终止因子结合在rRNA的3’端下游以终止转录活动,来维持rRNA的高含量水平。两对重叠基因ATP8/ATP6与ND4/ND4L是由一条双顺反子共同转录而来的。短额负蝗具有5个大的初级转录单元,通过"tRNA间断模型”进一步加工为成熟转录本。各个蛋白编码基因存在异质性表达,可能与转录本的不稳定性和转录后调控机制相关。
王璐[4]（2011）在《农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株》文中认为红曲菌发酵产物中含有一种胆固醇合成抑制剂-Monacolin K,它与土曲霉中发现的lovastatin系同一物质,都具有抑制生物体内胆固醇合成途径中关键酶HMG-CoA还原酶活性的作用,从而调节生物体内异常血脂,由于历史上红曲产品具有可直接食用的特性,因此含Monacolin K的红曲产品更为消费者接受和喜爱。三十年多来,已经发现紫色红曲菌（Monascus purpureus）、发白红曲菌（M. albidus）、丛毛红曲菌（M. pilosus）等可产生Monacolin K,但不同菌种产Monacolin K的性能不同。在长期的研究或生产过程中菌种由于不断的移接传代,而导致生产性能的退化,且与土曲霉发酵产Lovstatin的产率相比,红曲菌Monacolin K产率较低,因此需要持续不断地进行菌种选育获得高产Monacolin K的红曲菌株。为了解红曲菌基因组中Monacolin K合成相关基因,为红曲菌遗传改造奠定基础,并找出更为简便的高产Monacolin K红曲菌种的筛选方法,将分子克隆与原生质体融合育种技术相结合也许是一条可行的途径。本课题的目的是建立根癌农杆菌介导转化红曲菌的方法,将携带遗传标记的T-DNA插入红曲菌基因组中,改变红曲菌遗传信息的排列,影响其生长和代谢,筛选高产Monacolin K突变转化子;从高产Monacolin K红曲菌突变株基因组中,根据已知的T-DNA两端保守序列,扩增出T-DNA插入位点侧翼序列,从而寻找影响Monacolin K合成的带T-DNA标签的突变基因,为研究红曲菌Monacolin K合成功能基因组及代谢调控提供基础信息;通过原生质体融合的方式选育红曲菌Monacolin K高产株并研究适合于遗传改造变异株高产Monacolin K的发酵工艺,为红曲菌工业化生产Monacolin K打下基础。主要研究结果如下:（1）构建了含有gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph和trpC终止子的双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC并转入根癌农杆菌GV3101;利用根癌农杆菌介导转化技术成功将潮霉素抗性基因转入发白红曲菌（M. albidus）9901,实验优化了抗生素浓度,发白红曲菌孢子浓度,根癌农杆菌细胞密度,共培养温度和时间,以及乙酰丁香酮浓度等转化条件,最终转化效率可达520个转化子/106个红曲孢子。对转化子进行潮霉素抗性基因PCR鉴定,结果进一步证实外源T-DNA已整合至转化子的染色体基因组中。在诸多转化子中,通过发酵实验筛选得到了一株比出发菌株发白红曲菌9901高产Monacolin K的T-DNA插入突变转化子H1。采用反向PCR方法对发白红曲菌转化子H1基因组T-DNA插入位点侧翼序列进行克隆,获得了一段0.88 kb的DNA片段,暂命名为mkWL,对DNA片段mkWL进行测序,通过与NCBI公布的丛毛红曲菌Monacolin K合成基因簇比对分析,发现与其中mkH基因（1.46 kb）部分基因序列同源性为97%。由此推断基因mkWL包含发白红曲菌Monacolin K合成关联基因。（2）对烟色红曲菌（M. fumeus） 9908和发白红曲菌转化子H1原生质体制备与再生的条件进行研究,考察了菌龄、渗透压稳定剂、裂解酶组合、酶解时间和再生培养基等条件对这两株红曲菌原生质体制备和再生的影响。将携带潮霉素抗性的转化子H1的原生质体灭活后,与烟色红曲菌9908原生质体融合,以潮霉素抗性作为筛选标记,得到了多株融合子,并对融合子固态发酵产Monacolin K能力进行考察,筛选得到了固态发酵高产Monacolin K的红曲菌融合子HH1,此菌株Monacolin K的产量较亲本烟色红曲菌9908和转化子H1分别提高了404%和27%。（3）对影响融合子HH1固态发酵产Monacolin K的因素进行了单因素考察,根据优化得到的发酵条件,融合子HH1以小米为原料固态发酵20 d后,Monacolin K的产量可达17.50 mg/g。采用Box-Behnken响应面分析法,进一步研究了拌料水加量、拌料水pH和接种量这三个因素对Monacolin K产量的影响,并建立了模型,模型预测的理论值与实验所得的实际值无显着性差异,说明此模型能够较好的模拟发酵实验。本研究克隆得到了发白红曲菌Monacolin K合成相关基因的DNA片段mkWL,并采用根癌农杆菌介导转化和原生质体融合技术筛选到红曲菌Monacolin K高产株,为发白红曲菌基因遗传改造及Monacolin K工业化生产奠定良好基础。
黄晓星[5]（2011）在《银耳密码子偏好性分析及启动子克隆》文中进行了进一步梳理银耳是一种着名的食药用真菌,其菌种生产是无性繁殖,作为生物反应器具有与原核生物、酵母菌一样后代稳定的优点。另外还具有真核生物翻译后加工修饰系统,因此能够较好的表达真核基因。为了提高外源基因在银耳中的表达水平,提供将银耳生物反应器推广到实际生产中的理论依据,本研究从以下两方面开展工作：一是利用先进的生物信息学技术对银耳的密码子偏好性进行分析,以银耳的最优密码子改造外源基因使其能够更好地适应银耳宿主环境实现高效表达;二是采用TAIL-PCR技术克隆银耳的启动子,以提高外源基因的银耳表达效率。具体研究成果如下：1、银耳芽孢cDNA文库的构建以银耳Tr21菌株的芽孢为材料,利用RNAiso Reagent试剂盒地提取银耳芽孢总RNA,Oligotex mRNA Purification Kit精制得到mRNA,用cDNA Synthesis Kit将mRNA反转录合成双链cDNA。通过CHROMA SPIN+TE-1000去短片段的cDNA与载体pBluescript Ⅱ SK（+）连接,电转化（1.5KV,200Ω,25μF）导入宿主细胞大肠杆菌DH10B中,构建了银耳芽孢cDNA文库。利用T7和T3两个引物对随机挑取的16个单菌落进行PCR扩增。结果表明：银耳芽孢cDNA文库的重组率为100%,平均插入片段约为1300bp,文库的库容约为7.5×106 cfu,达到建库要求。2、银耳密码子偏好性分析通过密码子在线分析软件CodonW和CUSP对测序获得的80条蛋白编码序歹（Coding DNA Sequence, CDS）进行分析,统计银耳密码子同义密码子相对使用度（Relative Synonymous Codon Usage, RSCU）和同义密码子相对使用频率（Relative Frequency of Synonymous Codon, RFSC）,确定了银耳蛋白编码基因的18个高频密码子。分析结果还显示,银耳基因的G+C含量为59.02%,其中密码子第三位碱基的G+C含量高达69.72%,说明银耳基因偏爱以G或C结尾的密码子。运用高表达优越密码子分析法确定17个银耳高表达优越密码子,利用CodonW软件统计高、低表达两样本组的总体RSCU值,结果表明高表达样本组的密码子偏好程度高于低表达样本组,推测基因的表达水平是影响银耳密码子偏好程度的一个重要因素。3、银耳启动子的克隆及验证根据密码子偏好性分析结果和银耳芽孢表达谱测序结果,筛选了三个高表达基因（实验编号分别为E02、C02、G06）,在这三个基因的cDNA序列的基础上设计引物,利用热不对称PCR （Thermal Asymmetric Interlaced PCR, TAIL-PCR）技术克隆启动子,构建了以潮霉素转移酶基因hpt为选择标记基因的表达载体（实验编号分别为pBHg-E02、 pBHg-C02、pBHg-G06）。通过冻融法将载体质粒转化到农杆菌感受态细胞中。携带有载体质粒的农杆菌与潮霉素敏感型银耳菌株Tr21-01共培养后,在含有潮霉素的选择培养基上筛选转化子。结果显示：携带有pBHg-G06载体的农杆菌侵染银耳芽孢后得到抗性菌落,经提基因组DNA和PCR验证,重组子确实包含了银耳启动子序列和基因htt,即G06启动子序列和基因htt成功地插入到银耳基因组中。结果说明了实验克隆得到一个银耳启动子。
甘丽萍,席建,徐丽,司马杨虎,徐世清[6]（2010）在《家蚕LongSAGE文库鉴定及延长标签的改进GLGI方法》文中提出结合标签的基因序列延伸（GLGI）是随着基因表达序列标签（SAGE）应运而生的一种鉴定新标签的技术。为了克服该技术操作繁琐、成本高的弊端,根据已经构建的家蚕限性茧色品种的2个LongSAGE文库,选择30个差异表达的标签（tag）进行GLGI延伸。尝试了几个简化,（1）用totalRNA代替mRNA进行dsDNA的合成;（2）调整磁珠吸附DNA的顺序;（3）在PCR反应中用普通的DNA聚合酶代替高保真酶（Pfu）。结果显示,30个标签有27个获得有效扩增,扩增序列真实包括了SAGE标签的17bp序列,3个标签的结果符合NCBI的家蚕数据库已有注释,13个未注释标签经过延长后得到了注释,11个标签序列为待确定的新基因序列。这种简化能够作为家蚕SAGE文库其他tag和新基因研究的有效简化操作体系。与传统的方法相比,可减少成本30%以上,缩短操作时间20%。
王伯华[7]（2010）在《橙色红曲菌中基于pyrG标记的同源转化系统的建立》文中指出本文采用CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌（Monascus aurantiacus）的基因组DNA中克隆得到pyrG基因片段,然后运用PCR法筛选红曲菌Fosmid文库,获得了pyrG基因全长。以橙色红曲菌AS3.4384为出发菌株,经紫外诱变获得尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株,经测序和基因转化试验鉴定出UM28为pyrG缺陷株。对PEG介导的转化方法优化后建立了以pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统,并构建了含有GFP蛋白的表达载体pGFP-pyrG,通过基因转化试验,在红曲菌中以pyrG为筛选标记进行了GFP蛋白的表达。主要研究内容如下：1.根据已报道的真菌乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因（pyrG）的氨基酸序列,采用CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌的基因组DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后运用PCR法筛选红曲菌Fosmid文库,获得了pyrG基因全长（GenBank登录号：CU723506）。经过blastx比较发现,红曲菌pyrG基因与Aspergillus flavus NRRL3357的氨基酸序列同源性最高,达到81%。该基因能够作为筛选标记应用于红曲菌同源转化系统；2.以橙色红曲菌AS3.4384为出发菌株,经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株UM28。扩增其pyrG基因并进行测序,发现UM28的pyrG基因在核苷酸序列+220 bp的位置发生了突变,进而导致氨基酸水平上Pro→Ser的突变,造成了乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的失活。UM28通过基因转化能够接受含有米曲霉pyrG基因的互补质粒恢复野生表型,且回复突变率低于10-,能够用于红曲菌同源转化系统的构建；3.对UM28菌株的原生质体制备、再生和转化方法进行了优化,采用原生质体PEG介导转化将互补质粒pAOP和pMAP分别转入UM28中,能够使其恢复野生表型。建立了以pyrG为筛选标记的红曲菌同源转化系统；4.通过DNA重组技术构建了表达载体pGFP-pyrG,载体中含有pyrG筛选标记和GFP蛋白表达单元。通过基因转化试验,在红曲菌中以pyrG为筛选标记进行了GFP蛋白的表达。
徐驰[8]（2008）在《农杆菌介导的红曲菌M-7转化库中部分突变子的特性研究》文中研究指明本研究以农杆菌介导的红曲菌转化库中的8 132株转化子为材料,通过菌落形态观察结合显微特征分析,筛选获得一批形态特征变化显着的转化子,并将其分为七类。在此基础上,对转化子的主要代谢产物进行了分析,为从基因水平上阐述红曲菌代谢产物的合成调控机理提供了材料。主要研究结果如下。1.农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的扩建参照实验室以前建立的农杆菌介导法转化红色红曲菌（Monascus ruber）M-7的条件:出发菌株M-7在麦芽汁培养基上30℃培养20 d,红曲菌孢子浓度为105个/mL,农杆菌的浓度OD600为0.5,诱导剂AS浓度为80 mmol/L,农杆菌与红曲孢子混合液于30℃共培养3 d,将转化库从5 132转化子扩增至8 132个转化子。2.转化子筛选及形态观察将8 132个转化子分别接种在PDA培养基上,30℃培养15 d。通过菌落形态观察,获得230株在菌落颜色、生长速度和气生菌丝等方面都与出发菌株M-7有明显差异的转化子,并将其分为七类:（1）菌落直较径大,菌落呈年轮状分布;（2）菌落直径较大,菌落颜色较浅,气生菌丝呈从卷毛状;（3）菌落直径较大,菌落颜色较浅,气生菌丝呈流苏状;（4）菌落直径较大,菌落颜色较深,气生菌丝呈从卷毛状;（5）菌落直径较小,菌落平坦,气生菌丝呈从卷毛状;（6）菌落直径较小,菌落中部隆起,气生菌丝较短;（7）菌落直径中等,菌落有扇形分化。从每一类中再挑选一些具有代表性的菌株进行显微形态观察,结果显示,转化子在分生孢子形状、菌丝表面附着物、闭囊壳的数量和形态上也发生较大变化。3.部分转化子的PCR鉴定及稳定性研究从上述230株将转化子中挑选35株接种于不含潮霉素的PDA培养基上,25℃培养7 d,连续转接5代后,再转接到含有50μg/mL潮霉素的PDA平板上,以出发菌株M-7作为对照,观察菌落在抗性培养基上的生长状况并计数。从35株转化子中挑选14株代表菌株,提取基因组并进行PCR鉴定（根据T-DNA上的gus基因设计引物）。结果显示上述14株转化子经过5轮培养后,仍能在含50μg/mL潮霉素的PDA平板上生长,抗性稳定性达88.57%,并且14株转化子的基因组中均有T-DNA插入。4.部分转化子蛋白酶和淀粉酶活的分析采用DNS法、Folin法等方法测定了上述14株转化子固态发酵产物——红曲的淀粉酶活、蛋白酶活,并结合淀粉聚丙烯酰胺凝胶电泳（Starch-PAGE）的方法比较不同转化子淀粉酶组份和活性差异。结果如下:有13株转化子红曲的淀粉酶活高于M-7的淀粉酶活160.45 U/g,其中1067#约为M-7的20倍,达3227.10 U/g;大部分的供试菌株蛋白酶均高于M-7,其中878#的酸性蛋白酶活最高,达1543 U/g,约为M-7的2倍;1067#的中性蛋白酶活最高,达3211 U/g,约为M-7的4倍;2225#的碱性蛋白酶活最高,达1773 U/g,约为M-7的4倍。采用Starch-PAGE能够有效的检测淀粉酶活性组分,结果显示活性组分越多,淀粉酶活力越高。5.部分转化子次生代谢产物的分析采用UV-VIS、TLC、HPLC、ELISA等方法测定了14株转化子红曲的色价、Monacolin K、γ-氨基丁酸和桔霉素的含量。结果表明,与出发菌株相比,突变株产次级代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。14株转化子的红曲色价值均低于出发菌株M-7的色价4350 u/g,其中806#和2553#的色价分别为180 u/g和328u/g,不到M-7的1/10;10株突菌株红曲的Monacolin K含量高于M-7,其中3245#的Monacolin K含量约为M-7的10倍,分别为679.25μg/g和69.75μg/g;GABA含量方面,以178#制备的红曲GABA含量最高,达1.455g/Kg,约为M-7的3倍;由1822#制备的红曲的桔霉素含量最高,为60.01 ng/g,而806#与178#制备的红曲的桔霉素含量在实验条件下未检测到。
万里[9]（2008）在《红色红曲菌M-7紫外诱变突变子特征分析》文中进行了进一步梳理红曲菌（Monascus spp.）是我国传统的食用和药用微生物,在我国已有上千年的应用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类（monacolins）物质、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）、麦角固醇和丰富的水解酶类等,是生产食品发酵剂、着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前,国内外对红曲菌菌种的分类、选育、发酵条件及代谢产物分离纯化的研究相对较多,而有关红曲菌的分子生物学研究才刚刚起步,有关功能基因的研究很少,而关于红曲菌产色素、产孢等相关基因的研究尚未见报道。本研究以紫外线为诱变剂,以红色红曲菌（Monascus ruber）M-7为出发菌株,获得24株稳定的白化子与小菌落等突变株。在此基础上,对突变子的菌落形态、显微结构及其次生代谢产物等进行了分析。本课题为鉴定红曲菌菌落大小、颜色和产孢子等相关基因的研究提供了材料。具体内容如下:1红色红曲菌（Monascus ruber）M-7的紫外诱变对出发菌株M-7进行斜面培养18 d,用无菌水洗下孢子,用玻璃珠打散,稀释至106个/mL,涂布于25 cm×30 cm玻璃板,30 W,40 cm进行30 min紫外照射,避光培养7 d,挑选形态发生变化的突变子。经过多轮诱变共获得26株形态发生显着变化的突变子。突变子经过3代连续培养后,筛选获得24株稳定的突变子,遗传稳定性为92.3%。这些突变子的编号分别为501c、518b、518e、618a、618f、618e、618h、1102a、729b、929b、929h、929j、1102g、929k、729c、501d、929d、929f、929g、421a、421c、426q、618g、1102b。2突变子的形态特征观察25℃,PDA培养出发菌株M-7与筛选到的突变子9 d,按其菌落直径、正反面颜色、气生菌丝形态等特征共分为六大类:Ⅰ.出发菌株M-7;Ⅱ.与出发菌株M-7菌落特征相似的菌株,共7株,分别是1102a、729b、929b、929h、929j、1102g、929k;Ⅲ.小菌落菌株,直径仅1.9 cm左右,分别是501c、518b、518e、618a、618f,618e、618h;Ⅳ.白化子菌株,菌落粉色,共一株,为729c;Ⅴ.绒毡状菌落,共4株,分别是501d、929d、929f、929g;Ⅵ.栗色菌株,共5株,分别是421a、421c、426q、618g、1102b。随后,25℃下用插片法PDA培养9 d对所筛突变子进行显微形态观察。3突变子次生代谢产物的分析从供试菌株制得的红曲粉中分别提取色素、桔霉素、莫呐可啉K、γ-氨基丁酸四种次生代谢产物,检测分析其产量,得出结果如下:501d莫呐可啉K产量最高,达390.77μg/g;618f、929h、929b、929j的monacolin K产量均较低,已低于本实验条件下HPLC的最低检测限。其中有10株突变子monacolin K产量提高。618h的桔霉素产量最高,达40.12μg/g;729c、421a、421c产量低于检测限。518b的γ-氨基丁酸产量最高,达798.25μg/g,426q产量最低,仅20.07μg/g。618h色价最高,达2457 u/g;729c色价最低,为37 u/g。4突变子501d和618h发酵条件初步研究为了更好的了解各突变子的特性,对高产莫呐可啉K突变子501d与高产色素与桔霉素突变子618h进行发酵条件初步研究,包括固态发酵与三角瓶液态发酵。其中,固态发酵条件研究包括培养温度和时间因素;液态摇瓶发酵条件研究包括碳源与初始发酵液pH值两因素。得出结果如下:（1）固态发酵:不同温度培养红曲菌,其次生代谢产物变化较大。在30℃时,桔霉素产量达最高,之后呈下降趋势;25℃时,莫呐可啉K产量最高,之后下降;色价在15～35℃逐渐升高,25℃以后,上升趋势减缓。从8 d～15 d,色价、桔霉素、莫呐可啉K均呈上升趋势,15 d色价与桔霉素、莫呐可啉K产量基本达到最大值,之后变化趋于平缓或降低。（2）三角瓶发酵:甘油为碳源时其色价、莫呐可啉K和桔霉素产量均较高,但以葡萄糖为碳源时,桔霉素产量相对要低,莫呐可啉K与色价均较高。pH值变化对两株突变子色素、桔霉素与莫呐可啉K的产量都有较大的影响。pH值为3时莫呐可啉K与桔霉素产量均极低。桔霉素产量在pH为6时达最高;莫呐可啉K产量在pH为5时最高;色价在pH值为6时达最高。
阮琼芳[10]（2007）在《橙色红曲菌ACS基因和GMC基因缺失菌株的构建及其功能分析》文中认为红曲菌是我国重要的微生物资源，能够产生多种具有生物活性的代谢产物，具有很高的商业价值。但是由于红曲菌产桔霉素问题的存在，对红曲的安全性提出了怀疑。本文采用分子生物学技术，初步研究了酰基辅酶A合成酶（Acyl-CoA synthetase，以下简称ACS）和GMC氧化还原酶（glucose-methanol-choline oxidoreductase，以下简称GMC）编码基因的生物学功能，为阐明桔霉素代谢途径提供理论依据。主要研究内容如下：1 Blast比对分析，预测ACS基因为酰基辅酶A合成酶的编码基因，GMC基因为芳香醇脱氢酶的编码基因，推测ACS和GMC基因可能参与桔霉素生物合成途径。2通过酶切、连接和转化等DNA重组技术，成功构建了置换型打靶载体pACS-HPH和pGMC-HPH，载体中含有潮霉素抗性标记。3采用原生质体PEG介导转化将置换型打靶载体pACS-HPH和pGMC-HPH分别转入橙色红曲菌。AS3．4384中，采用潮霉素抗性筛选和基因组DNA的PCR筛选，分别获得ACS-6和GMC-8红曲菌缺失菌株。4采用HPLC分别检测ACS-6和GMC-8缺失菌株中桔霉素和红曲色素两种次级代谢产物的含量，验证以上两个基因的生物学功能，提示ACS基因参与桔霉素和红曲色素代谢过程中聚酮链骨架及十酰辅酶A的合成，GMC基因参与桔霉素和红曲色素的PKS后修饰过程。
二、红曲霉SAGE文库中双标签的制备研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、红曲霉SAGE文库中双标签的制备研究（论文提纲范文）
（1）光诱导香菇菌丝转色形成机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 香菇 |
| 1.1.1 香菇的生产概述 |
| 1.1.2 香菇的研究概述 |
| 1.2 转录组 |
| 1.2.1 转录组学研究技术 |
| 1.2.2 Illumina技术 |
| 1.3 蛋白质组 |
| 1.3.1 蛋白质组在真菌中的研究进展 |
| 1.3.2 蛋白质组在食用菌的研究进展 |
| 1.4 真菌感光器的研究进展 |
| 1.5 光对真菌次级代谢影响的研究进展 |
| 1.6 本课题研究目的、内容及意义 |
| 第二章 光诱导香菇转色分子机制的转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 |
| 2.2.3 菌丝的色差测定 |
| 2.2.4 RNA 提取和检测 |
| 2.2.5 构建转录组文库并进行测序 |
| 2.2.6 生物信息学分析 |
| 2.2.6.1 测序的原始数据 |
| 2.2.6.2 原始测序数据的处理 |
| 2.2.6.3 测序数据组装拼接 |
| 2.2.6.4 Unigene 的功能注释 |
| 2.2.6.5 Unigene 的 GO 分类 |
| 2.2.6.6 Unigene 的代谢通路分析 |
| 2.2.6.7 预测编码蛋白框（CDS) |
| 2.2.6.8 Unigene 表达量注释 |
| 2.2.6.9 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.6.10 差异基因的 GO 显着性富集分析 |
| 2.2.6.11 差异基因的 Pathway 显着性富集分析 |
| 2.2.7 差异基因的实时定量 PCR 验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 香菇菌丝在不同处理下生长的比较 |
| 2.3.2 菌丝色差值的变化 |
| 2.3.3 RNA 提取和检测 |
| 2.3.4 转录组测序产量分析 |
| 2.3.5 测序数据及其组装的质量分析 |
| 2.3.6 Unigene 注释结果 |
| 2.3.7 Unigene 的 GO 分类 |
| 2.3.8 Unigene 的 GOG 分类 |
| 2.3.9 Unigene 的代谢通路分析 |
| 2.3.10 Unigene 的编码蛋白框的预测 |
| 2.3.11 Unigene 的差异表达分析 |
| 2.3.12 差异表达基因在三个样品间的比较分析 |
| 2.3.13 差异 Unigene 的 GO 注释与功能分析 |
| 2.3.14 差异 Unigene 的 COG 功能分析 |
| 2.3.15 差异 Unigene 的 Pathway 富集分析 |
| 2.3.16 差异 Unigene 的荧光定量 PCR 分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 光诱导香菇转色形成机制的蛋白质组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 供试菌株和培养处理 |
| 3.2.2 主要溶液及其配置 |
| 3.2.3 香菇菌丝蛋白质样品制备 |
| 3.2.4 蛋白质定量 |
| 3.2.5 蛋白质的等电聚焦电泳 |
| 3.2.6 胶条平衡及 SDS-PAGE 电泳 |
| 3.2.7 凝胶染色 |
| 3.2.8 凝胶扫描以及图像分析 |
| 3.2.9 蛋白质的酶解 |
| 3.2.10 本地数据库构建 |
| 3.2.11 差异蛋白质的质谱鉴定及数据库检索 |
| 3.2.12 差异蛋白质 GO 和 Pathway 分析 |
| 3.2.13 蛋白质生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同光照处理下香菇菌丝比较 |
| 3.3.2 不同方法对蛋白质提取的比较分析 |
| 3.3.3 样品电泳的三个重复比较 |
| 3.3.4 蛋白质表达谱分析 |
| 3.3.5 差异蛋白质的质谱鉴定分析 |
| 3.3.6 差异蛋白点的肽质量指纹图谱分析 |
| 3.3.7 差异蛋白质的功能分类 |
| 3.3.8 差异蛋白质的 GO 和 Pathway 分析结果 |
| 3.3.9 差异蛋白质的生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 香菇菌丝总蛋白质的制备 |
| 3.4.2 差异蛋白质的分析 |
| 3.4.3 光诱导香菇菌丝转色形成的蛋白质分析 |
| 3.5 小结与展望 |
| 第四章 基于转录组测序的香菇菌丝 DNA 分子标记的开发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试菌株 |
| 4.2.2 转录组数据来源 |
| 4.2.3 转录组 SSR 的筛选 |
| 4.2.4 基于转录组的 SSR 引物的设计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转录组 SSR 的筛选和分布 |
| 4.3.2 转录组 SSR 引物批量设计 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 总结与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 I 符号中英文注释 |
| 附录 II 实验所使用的主要仪器及设备 |
| 附录ⅲ 样品间（313C/118）显着差异表达基因中上调表达的前 80 个基因列表 |
| 附录ⅳ 样品间（313C/313W）显着差异表达基因中上调表达的前 80 个基因列表 |
| 附录ⅴ 涉及真菌感光器和次级代谢的差异表达基因 |
| 附录ⅵ 候选的部分基因与其他真菌物种比较结果 |
| 附录ⅶ 涉及 MAPK 和双组分系统的候选差异基因（313C/313W）结果 |
| 附录ⅷ 成功鉴定的蛋白列表以及这些蛋白点在不同处理下的表达变化情况 |
| 附录ⅸ 部分差异蛋白质的肽段序列及其 MALDI-TOF-TOF MS 二级质谱图 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间（待）发表的学术论文和奖励 |
（2）基于RNA-seq技术的耐辐射动球菌在辐射胁迫下差异表达基因的筛选和验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 耐辐射动球菌概述 |
| 1.1 耐辐射动球菌的基本特性 |
| 1.2 耐辐射动球菌的全基因组序列 |
| 1.3 耐辐射动球菌辐射抗性研究 |
| 1.4 耐辐射动球菌耐干旱性研究 |
| 1.5 耐辐射动球菌抗氧化能力的研究 |
| 1.5.1 类胡萝卜素 |
| 1.5.2 Mn~(2+)复合物 |
| 1.5.3 超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和调控蛋白 |
| 1.6 耐辐射动球菌研究的应用前景 |
| 2 耐辐射菌属研究进展 |
| 2.1 耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans) |
| 2.2 中度嗜热菌(Deinococcus geothermalis) |
| 2.3 耐辐射红色杆菌(Rubrobacter radiotolerans) |
| 3 转录组学 |
| 3.1 转录组学概述 |
| 3.2 转录组学的研究方法 |
| 3.2.1 基因芯片技术(Microarray) |
| 3.2.1.1 cDNA芯片技术 |
| 3.2.1.2 寡聚核苷酸芯片技术 |
| 3.2.2 基因表达系列分析(SAGE) |
| 3.2.3 大规模平行信号测序技术(MPSS) |
| 3.2.4 表达序列标签(EST)技术 |
| 3.2.5 RNA序列分析技术(RNA-seq) |
| 3.2.5.1 454测序平台 |
| 3.2.5.2 Illumina(Solexa)测序平台 |
| 3.2.5.3 SOLID(Supported oligo ligation detection)测序平台 |
| 3.3 转录组学的研究现状 |
| 4 课题的立题依据及意义 |
| 第二章 转录组样本的制备及RNA测序 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基的配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 建库用到的引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA-seq用的菌体制备 |
| 2.2 总RNA的制备与质量检测 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 核糖体RNA(rRNA)的去除 |
| 2.3 cDNA文库的构建 |
| 2.3.1 去除rRNA后的总RNA片段化 |
| 2.3.2 cDNA第一条链的合成 |
| 2.3.3 cDNA第二条链的合成 |
| 2.3.4 cDNA的末端修复 |
| 2.3.5 在DNA片段的3'端添加'A' |
| 2.3.6 cDNA末端连接 |
| 2.3.7 纯化cDNA模板 |
| 2.3.8 cDNA模板扩增 |
| 2.3.9 割胶回收 |
| 2.4 cDNA文库测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 耐辐射动球菌总RNA的提取 |
| 3.1.1 NanoDrop2000分光光度计检测 |
| 3.1.2 凝胶电泳检测 |
| 3.2 RNA-seq文库制备 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 原始数据处理 |
| 1 原始数据分析 |
| 1.1 原始测序reads质量基本统计 |
| 1.2 reads质量预处理 |
| 1.3 参考基因组匹配 |
| 1.4 基因表达丰度 |
| 1.5 差异表达基因分析 |
| 1.5.1 差异表达基因的COG功能聚类分析 |
| 1.5.2 辐射抗性差异表达基因的KEGG途径分析 |
| 2 RNA测序结果与分析 |
| 2.1 原始测序reads质量基本统计结果 |
| 2.2 reads质量预处理前后数据统计结果 |
| 2.3 参考基因组匹配结果 |
| 2.4 基因表达水平结果 |
| 2.5 差异表达基因分析结果 |
| 2.5.1 COG功能聚类分析 |
| 2.5.2 KEGG途径分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 辐射抗性相关差异表达基因的选择 |
| 2.2 qRT-PCR引物设计 |
| 2.3 总RNA的提取及检测 |
| 2.4 RNA样品中基因组DNA的消除 |
| 2.5 反转录反应 |
| 2.6 qRT-PCR分析辐射抗性相关差异表达基因 |
| 2.7 qRT-PCR数据处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA的检测结果 |
| 3.2 qRT-PCR分析辐射抗性相关差异表达基因 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 论文总结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 主要生化试剂 |
| 附录二 实验用到的仪器设备 |
| 附录三 qRT-PCR引物设计 |
| 附录四 重要试剂配制 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）短额负蝗三种虫态的比较转录组及线粒体转录组作图研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 转录组简介 |
| 1.1.1 转录组 |
| 1.1.2 转录组学 |
| 1.1.3 转录组学技术平台 |
| 1.1.4 转录组学研究现状 |
| 1.2 测序技术进展及其在转录组学中的应用 |
| 1.2.1 传统测序技术 |
| 1.2.2 下一代高通量测序技术 |
| 1.2.3 RNA-Seq技术 |
| 1.3 转录组的生物信息学分析 |
| 1.3.1 数据的组装 |
| 1.3.2 生物信息学分析内容 |
| 1.3.3 线粒体转录组作图研究 |
| 1.4 短额负蝗研究进展 |
| 1.4.1 短额负蝗简介 |
| 1.4.2 短额负蝗研究现状 |
| 1.4.3 蝗虫转录组研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验准备 |
| 2.2.2 短额负蝗总RNA的提取及纯化 |
| 2.2.3 总RNA样品质量检测 |
| 2.2.4 RNA测序文库的构建 |
| 2.2.5 cDNA文库测序 |
| 2.3 生物信息学分析流程 |
| 2.3.1 原始测序数据的储存 |
| 2.3.2 Clean Reads数据的获得 |
| 2.3.3 数据的组装 |
| 2.3.4 Unigene的数据分析 |
| 2.3.5 差异表达基因分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 总RNA的质量检测 |
| 3.1.1 总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.1.2 紫外分光光度计检测 |
| 3.1.3 Agilent 2100 Bioanalyzer检测 |
| 3.2 测序产量统计 |
| 第4章 短额负蝗转录组的全局分析 |
| 4.1 测序数据的组装结果 |
| 4.1.1 短额负蝗转录组测序数据的组装质量统计 |
| 4.1.2 短额负蝗All-Unigene长度分布统计 |
| 4.1.3 All-Unigene预测的CDS的长度分布统计 |
| 4.2 All-Unigene的功能注释 |
| 4.2.1 Nr数据库 |
| 4.2.2 SwissProt数据库 |
| 4.2.3 COG分类 |
| 4.2.4 GO分类 |
| 4.2.5 KEGG分析 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 短额负蝗若虫和雌雄成虫的基因差异表达分析 |
| 5.1 若虫与成虫的基因差异表达分析 |
| 5.1.1 差异表达基因的筛选 |
| 5.1.2 差异基因的GO功能分析 |
| 5.1.3 差异基因的KEGG pathway分析 |
| 5.2 雌性成虫与雄性成虫的基因差异表达分析 |
| 5.2.1 差异表达基因的筛选 |
| 5.2.2 差异基因的GO功能分析 |
| 5.2.3 差异基因的KEGG pathway分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 短额负蝗线粒体的转录组作图研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（4）农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 红曲菌生物学特性 |
| 1.2 红曲菌代谢产物的研究 |
| 1.2.1 Monacolin K |
| 1.2.2 红曲色素 |
| 1.2.3 桔霉素 |
| 1.3 提高红曲中Monacolin K 含量的研究 |
| 1.3.1 高产Monacolin K 红曲菌的选育 |
| 1.3.2 红曲菌发酵产Monacolin K 条件的优化 |
| 1.4 红曲菌遗传代谢的研究 |
| 1.4.1 基因组DNA、RNA 及mRNA 提取方法的研究 |
| 1.4.2 红曲菌基因组文库的构建 |
| 1.4.3 红曲菌遗传转化方法的研究 |
| 1.4.4 根癌农杆菌介导转化丝状真菌的研究 |
| 1.4.5 红曲菌主要代谢产物功能基因的研究 |
| 1.5 立题目的与意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 论文总体策划 |
| 第二章 根癌农杆菌介导转化构建红曲菌潮霉素抗性株 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 试剂配制 |
| 2.2.6 大肠杆菌重组DNA 基本技术 |
| 2.2.7 根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.8 根癌农杆菌介导转化红曲菌步骤 |
| 2.2.9 红曲菌转化子全DNA 的提取 |
| 2.2.10 引物设计及PCR 扩增条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC 的构建 |
| 2.3.2 双元载体导入根癌农杆菌GV3101 |
| 2.3.3 根癌农杆菌GV3101 介导转化发白红曲菌9901 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 红曲菌转化子筛选及插入T-DNA 夹带序列测序分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.2.4 培养基和培养条件 |
| 3.2.5 Monacolin K 含量的测定 |
| 3.2.6 桔霉素的检测 |
| 3.2.7 大肠杆菌重组DNA 基本技术 |
| 3.2.8 反向PCR 克隆转化子T-DNA 插入侧翼序列 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 T-DNA 插入红曲菌突变转化子发酵性能的变化 |
| 3.3.2 T-DNA 插入红曲菌突变子菌落形态特征 |
| 3.3.3 反向PCR 克隆T-DNA 插入位点侧翼序列 |
| 3.3.4 T-DNA 插入位点序列分析比对 |
| 3.3.5 T-DNA 插入红曲菌突变子库的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 种间单亲灭活原生质体融合法选育Monacolin K 高产株 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 试剂与仪器 |
| 4.2.4 原生质体融合的步骤 |
| 4.2.5 融合重组体分子鉴定 |
| 4.2.6 融合子发酵性能的检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 渗透压稳定剂对红曲菌原生质体保持和再生的作用 |
| 4.3.2 新生菌丝有利于原生质体的释放和再生 |
| 4.3.3 破壁条件对红曲菌原生质体制备和再生的影响 |
| 4.3.4 不同再生培养基上红曲菌原生质体的再生率 |
| 4.3.5 原生质体显微形态观察 |
| 4.3.6 重组红曲菌热灭活条件的研究 |
| 4.3.7 以新建标记潮霉素筛选融合子 |
| 4.3.8 融合子Monacolin K 生成能力的考察 |
| 4.3.9 融合子的菌落形态 |
| 4.3.10 红曲菌融合子PCR 验证 |
| 4.3.11 红曲菌融合子稳定性的研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 固态发酵优化提高红曲菌融合子Monacolin K 产率 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 培养基及培养方法 |
| 5.2.5 发酵产物中Monacolin K 和桔霉素的检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 外加氮源对融合子Monacolin K 合成的影响 |
| 5.3.2 小米装料量对融合子产Monacolin K 的影响 |
| 5.3.3 料液比对融合子生长状态与Monacolin K 合成的作用 |
| 5.3.4 拌料水条件与Monacolin K 合成的关系 |
| 5.3.5 无机盐影响Monacolin K 合成的分析 |
| 5.3.6 接种量影响红曲菌融合子的生长及Monacolin K 代谢 |
| 5.3.7 Monacolin K 产量随发酵时间的变化曲线 |
| 5.3.8 红曲菌融合子固态发酵产Monacolin K 响应面法分析 |
| 5.3.9 固态发酵红曲米中桔霉素的检测 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 专业术语中英文缩略对照表 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）银耳密码子偏好性分析及启动子克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 银耳的介绍 |
| 1.1 银耳的分类地位及生物学特性 |
| 1.2 银耳的生活史 |
| 1.3 银耳的营养价值 |
| 1.4 银耳的研究进展 |
| 2 cDNA文库构建 |
| 2.1 cDNA文库的概念与意义 |
| 2.2 构建cDNA文库的过程 |
| 2.3 构建cDNA文库的方法 |
| 2.3.1 固相cDNA文库法 |
| 2.3.2 Oligo-capping法 |
| 2.3.3 SMART法 |
| 3 密码子用法偏性分析 |
| 3.1 密码子使用偏好性 |
| 3.2 密码子使用偏好性的应用 |
| 3.3 密码子偏好性分析方法 |
| 3.3.1 相对同义密码子使用度 |
| 3.3.2 同义密码子相对使用频率 |
| 3.3.3 密码子适应指数 |
| 3.3.4 有效密码子数 |
| 4 食用菌启动子的研究进展 |
| 4.1 启动子的特征 |
| 4.1.1 真核启动子的结构 |
| 4.1.2 增强子 |
| 4.2 应用于食用菌载遗传转化的启动子 |
| 4.3 克隆启动子的方法 |
| 4.3.1 启动子探针质粒载体筛选 |
| 4.3.2 利用PCR技术克隆启动子 |
| 5 食用菌遗传转化的研究 |
| 5.1 遗传转化方法 |
| 5.1.1 CaCl_2-PEG介导的遗传转化 |
| 5.1.2 电激介导的遗传转化 |
| 5.1.3 基因枪遗传转化 |
| 5.1.4 限制性内切酶介导的遗传转化 |
| 5.1.5 农杆菌介导的遗传转化法 |
| 5.2 遗传选择标记 |
| 5.2.1 营养缺陷型标记 |
| 5.2.2 药物抗性标记 |
| 5.3 基因表达产物的检测 |
| 5.3.1 外源基因转录产物的检测 |
| 5.3.2 报告基因的酶法检测 |
| 5.3.3 免疫学检测 |
| 5.3.4 表达产物生物活性检测 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第一章 银耳芽孢cDNA文库的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 Total RNA的提取 |
| 2.2 Poly(A)+RNA的精制 |
| 2.3 cDNA的合成 |
| 2.3.1 cDNA第一条链的合成 |
| 2.3.2 cDNA第二条链的合成 |
| 2.4 粘性末端连接 |
| 2.5 磷酸化 |
| 2.6 限制酶XhoI酶切反应 |
| 2.7 去除短链cDNA |
| 2.8 与载体连接 |
| 2.9 转化到大肠杆菌感受态细胞中 |
| 2.10 插入片段大小的验证 |
| 2.11 库容的计算 |
| 2.12 全长cDNA的测序与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.1.1 总RNA的均一性 |
| 3.1.2 总RNA的完整性 |
| 3.2 mRNA的纯化 |
| 3.3 cDNA的合成 |
| 3.3.1 双链cDNA的合成 |
| 3.3.2 短片段cDNA的去除 |
| 3.4 插入片段大小的验证 |
| 3.5 库容 |
| 3.6 全长cDNA序列分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA质量 |
| 4.2 文库质量 |
| 4.3 cDNA序列分析 |
| 第二章 银耳密码子偏好性分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 银耳芽孢蛋白编码序列的获取 |
| 2.2 高频密码子分析法 |
| 2.2.1 银耳芽孢同义密码子用法分析 |
| 2.2.2 银耳芽孢高频密码子的确定 |
| 2.2.3 银耳芽孢和其他几种生物密码子偏好性比较 |
| 2.3 高表达密码子分析法 |
| 2.3.1 密码子有效数的计算 |
| 2.3.2 同义密码子相对使用度的计算 |
| 2.3.3 高表达优越密码子的确定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 高频密码子分析法 |
| 3.1.1 高频密码子的确定 |
| 3.1.2 银耳与其他生物密码子偏好性比较 |
| 3.1.3 银耳、酿酒酵母与其他生物密码子使用频率比值的比较 |
| 3.2 高表达优越密码子分析法 |
| 3.2.1 高、低表达基因样本组的抽取 |
| 3.2.2 高表达优越密码子的确定 |
| 3.2.3 高、低表达样本组的密码子偏好性的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 高频密码子分析法 |
| 4.2 高表达优越密码子分析法 |
| 第三章 银耳启动子的克隆及功能验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 银耳高表达基因的筛选 |
| 2.2 银耳启动子的克隆 |
| 2.2.1 银耳芽孢总DNA的提取 |
| 2.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆 |
| 2.2.3 目的片段的回收 |
| 2.2.4 目的片段与载体连接 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.6 转化子验证及测序 |
| 2.2.7 序列分析 |
| 2.3 表达载体构建 |
| 2.3.1 质粒提取 |
| 2.3.2 pBHg-E02表达载体构建 |
| 2.3.3 pBHg-G06表达载体构建 |
| 2.3.4 pBHg-C02表达载体构建 |
| 2.4 银耳启动子的验证 |
| 2.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.4.2 冻融法转化农杆菌 |
| 2.4.3 农杆菌菌落PCR |
| 2.4.4 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢 |
| 2.4.5 银耳转化子的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 高表达量基因的筛选 |
| 3.2 银耳启动子的克隆 |
| 3.2.1 银耳芽孢总DNA的提取 |
| 3.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆 |
| 3.2.3 序列分析 |
| 3.3 表达载体构建 |
| 3.3.1 pBHg-E02表达载体构建 |
| 3.3.2 pBHg-G06和pBHg-C02表达载体构建 |
| 3.4 银耳启动子的验证 |
| 3.4.1 重组质粒转化农杆菌 |
| 3.4.2 农杆菌菌落PCR验证 |
| 3.4.3 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢 |
| 3.4.4 银耳转化子验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 高表达基因的筛选 |
| 4.2 银耳启动子克隆 |
| 4.3 启动子序列分析 |
| 4.4 载体构建 |
| 4.5 银耳启动子的验证 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）家蚕LongSAGE文库鉴定及延长标签的改进GLGI方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 生物材料 |
| 1.1.2 LongSAGE标签 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 双链DNA的合成 |
| 1.2.2 标签酶切 |
| 1.2.3 PCR扩增 |
| 1.2.4 DNA克隆、鉴定及测序 |
| 1.2.5 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取及质量测定 |
| 2.2 双链cDNA 合成 |
| 2.3 酶切及接头连接 |
| 2.4 GLGI扩增结果 |
| 2.5 序列分析 |
| 3 讨 论 |
| 3.1 RNA模板的选择 |
| 3.2 磁珠的吸附顺序改变 |
| 3.3 标签的局限性 |
| 3.4 其他改进 |
（7）橙色红曲菌中基于pyrG标记的同源转化系统的建立（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文创新之处 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丝状真菌的转化系统 |
| 1.2 未知基因的克隆策略 |
| 1.3 研究的内容和意义 |
| 第二章 红曲菌pyrG基因片段的克隆 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3. 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 红曲菌pyrG基因全长的获得及序列分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 红曲菌pyrG缺陷株UM28的筛选及鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 红曲菌同源转化系统的建立及GFP蛋白的表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（8）农杆菌介导的红曲菌M-7转化库中部分突变子的特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 红曲与红曲菌 |
| 1.1 红曲 |
| 1.2 红曲菌 |
| 1.2.1 红曲菌的生物学特征 |
| 1.2.2 红曲菌的分类 |
| 2 红曲菌的主要代谢产物 |
| 2.1 酶类活性物质 |
| 2.2 红曲色素 |
| 2.2.1 红曲色素的分类 |
| 2.2.2 红曲色素的应用 |
| 2.3 莫呐可啉K(Monacolin K) |
| 2.3.1 Monacolin K的性质与抑制胆固醇合成的机理 |
| 2.3.2 Monacolin K的检测 |
| 2.3.3 Monacolin K的应用 |
| 2.4 γ-氨基丁酸(GABA) |
| 2.4.1 GABA的性质 |
| 2.4.2 GABA的测定 |
| 2.5 红曲中的桔霉素 |
| 2.5.1 桔霉素的性质 |
| 2.5.2 桔霉素的检测 |
| 2.6 其他活性物质 |
| 3 红曲菌遗传转化研究 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 转化库的扩增、筛选及其遗传稳定性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 引物 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转化库的扩建 |
| 1.2.2 转化子的筛选 |
| 1.2.3 转化子的形态观察及分类 |
| 1.2.4 转化子的遗传稳定性研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转化库的扩增 |
| 2.2 转化子的筛选 |
| 2.3 转化子的形态观察及分类 |
| 2.3.1 转化子的菌落形态观察及分类 |
| 2.3.2 转化子的显微形态观察 |
| 2.4 转化子的稳定性分析 |
| 2.5 转化子的PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 农杆菌介导的红曲菌转化 |
| 3.2 T-DNA的插入对红曲菌形态的影响 |
| 第三章 转化子的蛋白酶活和淀粉酶活的分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 红曲的制备 |
| 1.2.2 固态发酵淀粉酶活的测定 |
| 1.2.3 淀粉酶的性质研究 |
| 1.2.4 固态发酵蛋白酶活的测定 |
| 1.2.5 蛋白酶的性质研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转化子淀粉酶活的测定 |
| 2.2 淀粉酶性质研究 |
| 2.2.1 固态发酵培养基质量变化的测定 |
| 2.2.2 淀粉酶最适反应pH及其酸碱稳定性的变化 |
| 2.2.3 淀粉酶最适反应温度及其稳定性的变化 |
| 2.2.4 Starch-PAGE检测淀粉酶活性组分 |
| 2.3 转化子蛋白酶活的测定 |
| 2.4 蛋白酶性质研究 |
| 2.4.1 蛋白酶最适反应pH及其酸碱稳定性的变化 |
| 2.4.2 蛋白酶最适反应温度及其稳定性的变化 |
| 第四章 转化子的次级代谢产物分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 ELISA检测材料 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 红曲米的制备 |
| 1.2.2 色价的测定 |
| 1.2.3 Monacolin K的测定 |
| 1.2.4 GABA的测定 |
| 1.2.5 桔霉素的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 色价的测定与紫外扫描分析 |
| 2.1.1 色价的测定 |
| 2.1.2 紫外扫描分析 |
| 2.2 Monacolin K的测定分析 |
| 2.2.1 Monacolin K的TLC分析 |
| 2.2.2 Monacolin K的HPLC测定 |
| 2.3 GABA的测定分析 |
| 2.3.1 GABA的TLC分析 |
| 2.3.2 GABA的比色法测定 |
| 2.4 桔霉素的测定分析 |
| 2.4.1 桔霉素的TLC分析 |
| 2.4.2 桔霉素的ELISA测定 |
| 3 讨论 |
| 结论与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 读研期间发表的论文 |
（9）红色红曲菌M-7紫外诱变突变子特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 红曲菌的生物学特性 |
| 2 红曲菌的分类 |
| 3 红曲菌的代谢产物 |
| 3.1 红曲色素 |
| 3.2 莫呐可啉类物质 |
| 3.3 桔霉素 |
| 3.4 γ-氨基丁酸 |
| 3.5 其它代谢产物 |
| 4 红曲菌分子生物学研究 |
| 4.1 红曲菌遗传转化研究 |
| 4.2 基因的功能研究的主要方法 |
| 5 课题研究目的、意义及内容 |
| 5.1 研究目的与意义 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 第二章 紫外诱变诱变突变子的形态观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 红曲菌紫外诱变及突变子稳定性分析 |
| 2.2 红曲菌的形态特征观察 |
| 3 结论 |
| 第三章 突变子代谢产物分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 红曲米的分析比较 |
| 2.2 红曲色素的分析 |
| 2.3 红曲中monacolin K的测定 |
| 2.4 红曲米中GABA含量的测定 |
| 2.5 红曲中桔霉素含量的测定 |
| 3 结论 |
| 第四章 两株突变子发酵条件的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 固态发酵条件的研究 |
| 2.2 三角瓶液态发酵条件的研究 |
| 3 结论 |
| 第五章 突变子特性分析 |
| 1 红曲菌主要代谢关系的研究 |
| 2 红曲菌形态发育与次生代谢产物的关系 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）橙色红曲菌ACS基因和GMC基因缺失菌株的构建及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 基因筛选的主要方法 |
| 1.1.1 抑制消减杂交技术 |
| 1.1.2 基因表达系列分析技术 |
| 1.1.3 文库筛选法 |
| 1.1.4 基因表达谱芯片 |
| 1.1.5 电子克隆 |
| 1.2 基因的功能研究的主要方法 |
| 1.2.1 生物信息学 |
| 1.2.2 基因敲除 |
| 1.2.3 RNA干扰 |
| 1.3 不产桔霉素的红曲菌种选育之进展 |
| 1.3.1 常规法菌种筛选及诱变育种 |
| 1.3.2 构建基因工程菌 |
| 1.4 桔霉素合成途径及相关基因的研究进展 |
| 1.5 桔霉素基因簇及其基因的分析 |
| 1.6 研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 ACS缺失菌株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 酶和生物试剂 |
| 2.1.4 化学试剂、缓冲溶液和培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 打靶载体构建技术路线及打靶载体基因敲除原理图 |
| 2.2.2 引物序列 |
| 2.2.3 菌株的培养 |
| 2.2.4 碱裂解法从E.coli快速小量抽提质粒DNA |
| 2.2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 红曲菌基因组DNA的提取(CTAB法) |
| 2.2.7 ACS基因的克隆 |
| 2.2.8 pACS的鉴定 |
| 2.2.9 打靶载体pACS-HPH的构建 |
| 2.2.10 pACS-HPH的鉴定 |
| 2.2.11 打靶载体pACS-HPH线性化 |
| 2.2.12 打靶载体pACS-HPH的转化 |
| 2.2.13 目的缺失菌株的筛选 |
| 2.2.14 ACS-6缺失菌株次级代谢产物的测定 |
| 2.3.结果 |
| 2.3.1 ACS基因生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 ACS及HPH的制备 |
| 2.3.3 pACS的验证及其方向鉴定 |
| 2.3.4 打靶载体pACS-HPH的验证及其方向鉴定 |
| 2.3.5 打靶载体pACS-HPH的转化 |
| 2.3.6 ACS-6缺失菌株的验证 |
| 2.3.7 ACS-6缺失菌株次级代谢产物的分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GMC缺失菌株的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 打靶载体构建技术路线及打靶载体基因敲除原理图 |
| 3.2.2 引物序列 |
| 3.2.3 菌株的培养 |
| 3.2.4 碱裂解法从E.coli快速小量抽提质粒DNA |
| 3.2.5 感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 红曲菌基因组DNA的提取(CTAB法) |
| 3.2.7 GMC基因的克隆 |
| 3.2.8 pGMC的鉴定 |
| 3.2.9 打靶载体的构建 |
| 3.2.10 pGMC-HPH的鉴定 |
| 3.2.11 打靶载体pGMC-HPH线性化 |
| 3.2.12 打靶载体pGMC-HPH的转化 |
| 3.2.13 目的缺失株的筛选 |
| 3.2.14 GMC-8缺失菌株次级代谢产物的测定 |
| 3.3.结果 |
| 3.3.1 GMC基因生物信息学分析结果 |
| 3.3.2 GMC和HPH基因的制备 |
| 3.3.3 pGMC的验证及其方向鉴定 |
| 3.3.4 打靶载体pGMC-HPH的验证及其方向鉴定 |
| 3.3.5 打靶载体pGMC-HPH的转化 |
| 3.3.6 缺失株GMC-8的验证 |
| 3.3.7 GMC-8缺失菌株次级代谢产物的分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 基因敲除中靶基因——ACS基因与GMC基因的选择 |
| 4.2 基因敲除效率的影响因素 |
| 4.2.1 打靶载体的构建 |
| 4.2.2 打靶载体转化方式 |
| 4.3 基因组DNA的提取 |
| 4.4 同源重组转化子的筛选 |
| 4.5 靶基因ACS和GMC的功能分析 |
| 结论与展望 |
| 主要研究结论 |
| 进一步工作的方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、红曲霉SAGE文库中双标签的制备研究（论文参考文献）
- [1]光诱导香菇菌丝转色形成机理的研究[D]. 唐利华. 上海交通大学, 2014(01)
- [2]基于RNA-seq技术的耐辐射动球菌在辐射胁迫下差异表达基因的筛选和验证[D]. 陈周伟. 浙江理工大学, 2014(05)
- [3]短额负蝗三种虫态的比较转录组及线粒体转录组作图研究[D]. 杨婧. 陕西师范大学, 2013(04)
- [4]农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株[D]. 王璐. 江南大学, 2011(12)
- [5]银耳密码子偏好性分析及启动子克隆[D]. 黄晓星. 福建农林大学, 2011(08)
- [6]家蚕LongSAGE文库鉴定及延长标签的改进GLGI方法[J]. 甘丽萍,席建,徐丽,司马杨虎,徐世清. 中国生物工程杂志, 2010(07)
- [7]橙色红曲菌中基于pyrG标记的同源转化系统的建立[D]. 王伯华. 南昌大学, 2010(12)
- [8]农杆菌介导的红曲菌M-7转化库中部分突变子的特性研究[D]. 徐驰. 华中农业大学, 2008(02)
- [9]红色红曲菌M-7紫外诱变突变子特征分析[D]. 万里. 华中农业大学, 2008(02)
- [10]橙色红曲菌ACS基因和GMC基因缺失菌株的构建及其功能分析[D]. 阮琼芳. 南昌大学, 2007(06)