一、乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异（论文文献综述）
王正[1]（2021）在《肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma、HCC）是全球最多见的恶性肿瘤之一,恶性水平高,发展迅猛。我国是HCC的高发区,目前占世界的55%。由于乙型肝炎病毒的长期感染,我国多半病人在慢性肝炎,肝硬化后发展成HCC。HCC具备起病隐匿、早期诊断困难、预后差、进展快等特点。HCC的死亡率是肿瘤的第二位。因此,探求一种新的有效的生物标志物对HCC的诊断、预后和治疗具有重大意义。层出不穷的证据表明免疫系统在癌症发生和发展过程中起决定性作用。免疫细胞不仅调节机体的抗肿瘤免疫,并且也对肿瘤细胞增殖和转移等病理变化起到重要的调控作用。免疫治疗近年来越发受到重视,特别是随着CTLA-4（细胞毒T淋巴细胞相关抗原4）和PD-1（程序性死亡受体1）抗体取得良好的临床效果。例如,作为抗PD-1单克隆抗体Nivolumab（纳武利尤单抗）可以通过干扰信号通路阻断PD-1,恢复机体的抗癌免疫反应。免疫治疗可为HCC提供一种安全、有效、有前途的治疗方式。但肝脏的免疫耐受性和肿瘤本身的异质性仍然是主要问题。探求新的影响预后以及免疫治疗的免疫靶基因具有特别重要的价值。国内外对免疫相关基因的研究还很局限。尽管HCC研究中测序技术及芯片技术不断提高,仍然有大量HCC中差异表达免疫相关基因的功能调控分子机制不清楚。到目前为止,仍没有筛选到可以用于临床的诊断、预后或治疗靶标的免疫相关基因。DCK（Deoxycytidine kinase,脱氧胞苷激酶）属于DCK/DGK家族,是几种脱氧核苷及其类似物磷酸化所必需的。DCK也是脱氧核糖核苷挽救的关键酶,是脱氧核糖核酸修复过程中的关键酶,对维持正常的DNA代谢具有重要意义。目前研究表明DCK缺乏与对抗病毒和抗癌化疗药物的耐药性有关。同时有研究报道,DCK在乳腺癌、宫颈癌、食管癌等肿瘤的发生发展中起到重要作用。我们通过生物信息分析学分析发现DCK在HCC中高表达,并且与HCC患者生存相关,DCK的异常高表达提示患者预后不良。然而,DCK在HCC中的具体作用机制尚未报道,有待于进一步探讨。目前,关于免疫相关基因在HCC中的研究尚处于起步阶段,探索和发现新的免疫相关基因及其特异性调控机制,可为研究HCC的发病机制提供新的理论依据,同时为发现新的治疗靶点提供理论基础。本文以此为出发点,研究内容如下:一,以TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症和肿瘤基因组图谱）和 ImmPort 数据库（The Immunology Database and Analysis Portal,免疫学数据库和分析门户）为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具备预后价值的免疫相关基因。二,多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况,分析DCK和HCC免疫微环境的关系,检测乙肝相关肝癌及癌旁组织样本中DCK表达,并分析DCK与临床病理参数的关系。三,通过沉默人肝癌细胞系中DCK表达,研究DCK对肝癌细胞系各种恶性生物学行为的影响;通过裸鼠成瘤实验评价DCK对肝癌细胞HepG2体内成瘤能力的影响;初步探讨DCK调控HCC发生进展的分子机制。第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选目的:以TCGA数据库和ImmPort数据库为基础,利用生物信息学分析筛选出HCC组织及癌旁组织间的差异表达免疫相关基因,进一步挖掘对HCC患者具有预后价值的免疫相关基因,并确定在HCC发生发展过程中起关键作用的免疫相关基因。方法:1.应用TCGA数据库、ImmPort数据库筛选HCC组织中差异表达的免疫相关基因。下载TCGA数据库中的HCC患者的基因表达数据及临床数据,在ImmPort数据库中下载1811个免疫相关基因。在R软件中用Wilcoxon检验法检测HCC组织和癌旁组织中差异表达的免疫相关基因,评估差异表达免疫相关基因的潜在生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因。只对随访时间少于2000天的HCC患者进行生存分析。在R软件中分别利用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法查找生存相关的差异表达免疫相关基因,P值小于0.01作为筛选条件,使用两种方法查找后,保留共同存在的有预后价值的差异表达免疫相关基因。3.独立预后因子的筛选。将上一步得到的每一个基因和临床数据（年龄、分级、病理分期、T分期等）一起进行多因素Cox分析,P值小于0.01作为筛选条件,筛选出独立预后免疫相关基因。4.预测分析调控HCC独立预后免疫相关基因的转录因子。为了研究免疫相关基因的调控机制,我们提取了顺反组癌症数据库（Cistromecancer）里的 318 个转录因子（Transcriptionfactors,TFs）进行后续研究。利用TCGA中数据找出差异表达的转录因子,对它们进行生存分析。然后使用R中的cor.test函数得到生存相关的转录因子与独立预后免疫相关基因的相关性。过滤标准为相关系数大于0.5,P值小于0.05。Cytoscape软件用于构建和可视化调控网络。结果:1.HCC组织中差异表达的免疫相关基因结果。从TCGA数据库中下载374例HCC和50例癌旁组织预处理的RNA-Seq-FPKM数据进行下一步分析。HCC组织与癌旁组织相比共有329个免疫相关基因（267个上调,62个下调）差异表达。通过GO和KEGG分析进一步分析了329个差异表达的免疫相关基因的生物学功能。2.筛选与生存相关的差异表达免疫相关基因结果。我们利用差异分析得到的329个差异表达的免疫相关基因进行生存分析。通过原始数据发现随访时间少于2000天的HCC患者共337例。应用单因素Cox分析对337例HCC组织中329个差异免疫相关基因的表达进行检测,共发现64个生存相关的免疫相关基因。采用Kaplan-Meier生存分析方法得到58个生存相关的免疫相关基因。应用韦恩图找到32个共同存在的生存相关的免疫相关基因,均为高风险基因。3.独立预后免疫相关基因筛选结果。将上述得到的32个免疫相关基因进行独立预后分析,得到12个免疫相关基因可以作为独立预后基因。其中,DCK在多种恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的起始和进展。然而DCK在HCC中的具体作用机制尚未阐明,有待于进一步探讨。4.转录因子与独立预后免疫相关基因的调控网络构建。HCC组织中与癌旁组织相比,共有117个转录因子（108个上调,9个下调）差异表达。应用单因素Cox分析和Kaplan-Meier生存分析方法得到27个生存相关的转录因子。根据过滤标准,共鉴定出25个生存相关的转录因子和9个独立预后免疫相关基因,以建立网络。其中,HCFC1调节了大多数独立预后免疫相关基因。我们预测DCK最重要的上游转录因子是HCFC1。结论:1.通过对TCGA和ImmPort数据库分析,得到HCC 12个差异表达的免疫相关基因与预后密切相关并且可以独立预测预后。其中DCK在HCC中的生物学作用尚未明确,可能是HCC的关键免疫相关基因。2.预测出25个转录因子可以调控一个或多个免疫相关基因,其中HCFC1在HCC中有重要的调控作用,初步明确了 HCFC1是DCK最重要的上游调控转录因子。第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析目的:多个公开数据库明确肝癌中DCK的表达情况。探讨DCK和HCC免疫微环境的关系,预测HCC中DCK调控的相关通路。检测乙肝相关肝癌组织中DCK的表达,研究DCK表达与乙肝相关肝癌患者临床病理参数的关系。检测人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK mRNA和蛋白的表达水平。方法:1.通过oncomine数据库、GEPIA网站和ICGC数据库,查询DCK在肝癌组织及对应正常组织中的表达情况。2.利用 TIMER 网站（Tumor Immune Estimation Resource,肿瘤免疫评估资源）调查TCGAHCC患者DCK与HCC免疫微环境的关系;通过GSEA方法预测HCC中DCK调控的相关通路。3.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测53例乙肝相关肝癌肿瘤组织及癌旁组织样本中DCK表达量,分析DCK与临床病理参数的关系。4.实时荧光定量PCR和Western blot分别检测了人不同的肝癌细胞系（HepG2,SKHEP1）和正常肝细胞HL-7702中DCK的表达水平。结果:1.多个数据库结果均显示,DCK在肝癌组织较正常组织高表达。2.DCK表达与HCC免疫微环境中CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞均正相关。DCK可用于评估肿瘤组织中免疫细胞浸润的水平。GSEA显示DCK可以正调控多种通路进而影响HCC的发生发展,包括WNT信号通路,ERBB信号通路等。3.实时荧光定量PCR检测显示,乙肝相关肝癌患者肝癌组织中DCK表达水平较癌旁组织显着升高。DCK的表达与年龄、性别无关,但与肿瘤大小、Edmondson分级、微血管侵犯相关。4.HepG2,SKHEP1中DCK的mRNA和蛋白表达水平均高于正常肝细胞HL-7702。结论:DCK在肝癌组织中呈高表达。DCK表达水平与HCC免疫微环境中免疫细胞正相关,提示DCK可以反映HCC免疫微环境的状况。DCK在乙肝相关肝癌患者癌组织中高表达,且与多种临床病理参数相关。HepG2,SKHEP1中DCK mRNA和蛋白均高表达,可用于后续实验。第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响目的:通过沉默肝癌细胞HepG2,SKHEP1中的DCK表达,检测DCK对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为的影响,然后经过裸鼠成瘤实验进一步验证;初步探讨DCK促进HCC发生进展的分子机制。方法:应用siRNA技术（small interfering RNA,小干扰RNA）沉默DCK在肝癌细胞系中的表达,采用qRT-PCR和Western blot筛选出干扰效率最高的序列。利用CCK-8增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞技术检验DCK基因低表达后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力。裸鼠皮下注射DCK沉默组（siRNA-DCK组）和阴性对照组siRNA（NC组）的肝癌细胞HepG2。4周后处死裸鼠,剥离肿瘤并称量。利用Western blot、细胞免疫荧光检测了肝癌细胞中干扰DCK后,对WNT信号通路主要蛋白水平（Wnt-1,β-catenin,c-myc）的影响。结果:成功筛选出1条siRNA用于后续实验。CCK-8实验发现沉默表达DCK的肝癌细胞系HepG2和SKHEP1的增殖能力显着减弱。细胞划痕实验及Transwell侵袭实验显示沉默表达DCK的肝癌细胞HepG2和SKHEP1细胞的迁移和侵袭能力显着减弱。流式分析显示DCK下调可促进肝癌细胞的凋亡。动物实验结果表明,DCK沉默组肿瘤生长速度缓慢,质量及体积明显减小。抑制DCK表达后WNT信号通路主要蛋白表达降低,这提示DCK异常活化WNT信号通路,使关键信号分子Wnt-1,β-catenin,c-myc表达增加,促进肝癌的恶性进程。结论:体外实验中,沉默DCK基因抑制肝癌细胞HepG2和SKHEP1的增殖、迁移和侵袭能力、促进肝癌细胞的凋亡。动物实验表明,沉默DCK对裸鼠成瘤能力具有显着的抑制作用。DCK可能通过激活WNT信号通路影响肝癌的恶性生物学行为。DCK有望作为HCC患者治疗新的靶标。
冯家立[2]（2021）在《血清甲胎蛋白和异常凝血酶原对肝细胞癌的诊断价值》文中研究指明研究背景原发性肝癌是一种临床常见的恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的主要原因,肝细胞癌约占原发性肝癌的85%～90%[1]。在我国,罹患肝癌的患者5年生存率仅为14.1%,根据欧洲肝脏研究协会（european association for the study of the liver,EASL）和美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Disease,AASLD）的现行指南,对于早期HCC患者采用肝脏切除或移植以及射频消融术等治疗手段,可以将患者5年生存率提高到70%[2-4]。但是,大多数的肝癌患者往往在肝癌的晚期才被发现,治疗手段往往局限于姑息治疗,中位生存率小于一年,因此肝癌的早期诊断十分重要。目前,临床用于原发性肝癌的诊断手段主要有影像学检查和血清生物标志物。这些诊断手段都存在一定的局限性。目前,应用于临床的血清标志物有甲胎蛋白（alpha-Fetoproteins,AFP）和血清维生素K缺乏诱导蛋白（protein induced by vitamin k antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ）。血清AFP检测是最先应用于肝癌检测和诊断的血清标志物,在临床的早期应用中,由于肝癌的早期诊断较少,中晚期肝细胞癌的病例较多,这使得AFP能从更多的肝癌患者中检出浓度升高,导致AFP的灵敏度可达72%～87%[5]。但随着肝癌的诊断技术的发展,越来越多的早期肝癌患者能够被较早的发现,导致AFP在肝细胞癌的诊断价值有所下降。另外,在一些良性肝病和一些胃肠道恶性肿瘤患者中也可见AFP的升高。因此,AASLD和EASL已不再将AFP作为肝细胞癌的诊断和筛查必备指标[6-9];PIVKA-Ⅱ是近几年应用于临床的肝细胞癌血清标志物,表现出良好的应用前景,文献报道,在AFP阴性肝细胞癌患者中,PIVKA-Ⅱ诊断肝细胞癌的ROC曲线下面积可达0.86[10]。因此,PIVKA-Ⅱ似乎表现出比AFP更加优秀的应用前景,但是PIVKA-II是近些年才被批准进入中国市场,基于中国人群的研究数据较少,尽管现有的研究表明其诊断价值优于AFP,但仍需要进一步的研究去证实。AFP尽管有很多的不足与缺陷,联合其他指标进行检测可能是增强其敏感度的手段。因此,PIVKA-Ⅱ与AFP联用诊断肝细胞癌的临床应用价值以及PIVKA-II在AFP阴性肝细胞癌中的应用价值需要进一步的研究。目的分析AFP和PIVKA-II在各组中的表达差异和阳性率差异评价其作为生物标志物的价值,通过ROC曲线评价AFP和PIVKA-II作为生物标志物的诊断HCC的效能以及在AFP阴性肝细胞癌中的应用价值。方法收集患者和体检人群的临床资料,纳入肝细胞癌患者107例（肝细胞癌组）,肝硬化的患者75例（硬化组）,慢性乙型肝炎患者65例（慢性乙型肝炎组）和71例健康体检者（健康对照组）。对各组患者的血清AFP和PIVKA-Ⅱ结果进行记录,并进行统计分析。结果1、各组间AFP和PIVKA-II表达水平及阳性率差异比较:AFP在肝细胞癌组表达水平和阳性率高于其他三组差异具有统计学意义（均p<0.001）;慢性乙型肝炎组和肝硬化组AFP表达水平和阳性率高于健康对照组,差异具有统计学意义（均p<0.05）;PIVKA-II在肝细胞癌组中表达水平和阳性率高于其他三组,差异具有统计学意义（均p<0.001）;在肝硬化、慢性乙型肝炎和健康人群组三组间表达水平和阳性率差异无统计学意义（P>0.05）2.AFP和PIVKA-II单独使用以及联合使用的诊断效能:AFP与PIVKA-II联合使用AUC面积最大（AUC=0.946）,单独使用AFP的AUC面积最低（AUC=0.816）,差异具有统计学意义（p<0.05）。AFP和PIVKA-II联合使用,敏感度可提升到88.79%。3.以临床常用的20 ng/ml和40 m Au/ml分别作为AFP和PIVKA-Ⅱ诊断HCC的临界值进行敏感度特异性分析,单独检测PIVKA-Ⅱ相较于单独检测AFP具有更高的灵敏度和特异性,差异具有统计学意义（p<0.05）;AFP+PIVKA-Ⅱ联合检测,当任意一项指标为阳性时判断为阳性,可以显着提高诊断试验的灵敏度（p<0.05）,当两项指标均为阳性时判断为阳性,可以显着提高诊断试验的特异性（p<0.05）。4.PIVKA-II在AFP阴性肝细胞癌高危人群筛查中的应用价值:PIVKA-II表达水平和阳性率在AFP阴性HCC患者和AFP阳性HCC患者之间均无统计学意义（p>0.05）;PIVKA-II阳性率在AFP阴性HCC组中均高于LC组和CHB组,差异具有统计学意义（均p<0.001）;AFP阴性HCC组PIVKA-II水平明显高于AFP阴性LC组和CHB组,而AFP阴性LC组和AFP阴性CHB组差异无统计学意义（p>0.05）;当PIVKA-II的临界值（Cut-Off值）为53 m Au/ml时,PIVKA-II在区分AFP阴性HCC患者与LC患者和CHB患者的ROC曲线下面积（AUC）为0.942（95%CI:0.885-0.976）,敏感度为85.71%,特异性为98.85%。结论AFP和PIVKA-Ⅱ是诊断HCC有效的肿瘤标志物,PIVKA-Ⅱ灵敏度特异性好于AFP。在日常临床应用中可联合检测AFP和PIVKA-Ⅱ,针对不同人群采用不同的联合检测方案提高诊断试验的灵敏度特异性,减少临床诊断的漏诊率和误诊率。在AFP阴性肝细胞癌诊断的应用中,PIVKA-II表现出良好的应用前景和诊断价值,有利于肝癌高危人群的筛查。
陈霞[3]（2021）在《肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究》文中提出背景及目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种起源于肝实质细胞的原发性恶性肿瘤。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是HCC的主要病因。HCC是世界第五大恶性肿瘤,每年死亡人数在所有恶性肿瘤中排名第二。中国是HCC的高发国家,每年占世界HCC病例和死亡人数的一半以上。近年来,随着影像学、外科学等技术的不断发展,HCC的诊断和治疗取得了很大进展,但仍存在缺乏有效的诊断标志物、术后复发率高、术后生存率低等问题。因此,筛选在肝癌发生发展中起作用的关键分子标志物,对提高肝癌的诊治水平具有重要意义。方法1.从基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载微阵列数据集GSE55092。用生物信息学软件对数据进行分析,寻找差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。并对差异基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析、京都基因与基因百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析、创新通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein interaction,PPI）网络分析。利用Cytoscape软件（Cytoscape＿v3.7.2）中的Centiscape2.2和分子复合物检测（Molecular Complex Detection,MCODE）对关键差异基因进行鉴定。并利用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库验证筛选出的关键差异基因的表达含量及临床意义。2.课题组选取原发性肝癌患者肿瘤组织、癌旁组织、远癌组织样本各5份,采用Affymetrix m RNA-lncRNA基因芯片,分析得到719个差异表达的长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）。根据选择基因间区类型lncRNA和校准p值排序的的筛选标准选择出6个lncRNAs,包括ENST00000514608.1、NONHSAT138156、NONHSAT024276、NONHSAT124357.2、NONHSAT053785和癌症易感候选基因7（cancer susceptibility candidate 7,CASC7）。收集确诊肝癌患者、慢性乙型肝炎患者及正常对照者血清各50例标本,采用微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR,dd PCR）对这6个lncRNAs的表达进行验证,通过比较这些lncRNAs诊断肝癌的临床参数,确定后续继续研究的目标分子。扩大三个组的样本量继续研究目标分子对肝癌的临床价值。结果1.基于GEO数据库的微阵列数据集GSE55092筛选出2264个差异表达的m RNAs,其中764个上调,1500个下调。GO分析表明,这些DEGs与小分子代谢、异型生物质的代谢和细胞氮化物代谢等过程有关。KEGG通路分析显示DEGs与代谢通路、补体和凝血级联反应等相关。疾病与生物功能分析表明,DEGs主要与癌症、机体损伤和异常、胃肠道疾病和肝脏系统等疾病相关。关联度排名前10的基因被确定为关键基因。Cox回归分析显示,这10个基因（CDC20、BUB1B、KIF11、TTK、EZH2、ZWINT、NDC80、TPX2、MELK、KIF20A）均与肝癌患者的总生存率相关。2.对基于新鲜肝癌组织运用表达谱芯片筛选得到的6个lncRNAs进行验证,得到CASC7、NONHSAT053785、NONHSAT024276和NONHSAT138156这4个lncRNAs具有差异表达,其中CASC7诊断肝癌的准确度最高,因此将CASC7作为继续研究的目标分子。已成功建立和优化了dd PCR技术检测肝癌、肝炎和正常对照者血清中CASC7的表达含量。肝癌患者血清中CASC7的表达明显高于慢性乙型肝炎患者（中位数:8.8versus 2.2 copies/μl,p<0.001）和健康对照组（中位数:8.8 versus 3.8 copies/μl,p<0.001）。血清CASC7高表达与肿瘤个数（p=0.005）、肝内转移（p<0.001）、肿瘤大小（p=0.007）和TNM分期（p=0.008）显着相关,其中CASC7区分肝内转移和非肝内转移的ROC曲线下面积为0.811（95%CI:0.714-0.909）。然而,AFP不能区分上述临床病理参数。CASC7与其他临床指标的相关性分析显示,CASC7与癌胚抗原（r=0.322,p=0.004）、碱性磷酸酶（r=0.467,p<0.001）、谷氨酰转肽酶（r=0.29,p=0.009）、乳酸脱氢酶（r=0.275,p=0.014）、白细胞（r=0.296,p=0.008）、血小板（r=0.279,p=0.012）和单核细胞（r=0.295,p=0.008）呈正相关,与胆碱酯酶呈负相关（r=-0.231,p=0.039）。CASC7区分肝癌组与非肝癌组的ROC曲线下面积为0.808（95%CI:0.742-0.874）,cut-off值为7.24 copies/μl,灵敏度为63.8%,特异度为95.2%。结论通过生物信息学分析,确定了与HCC进展相关的关键候选基因,这有助于寻找HCC的生物标志物和治疗靶点。同时基于新鲜肝癌组织样本的表达谱芯片筛选出CASC7,验证得到CASC7在HCC患者血清中显着上调,并与肿瘤数量、肝内转移、肿瘤大小和TNM分期密切相关,可能是一种有前景的诊断生物标志物。
邢昊[4]（2020）在《苯甲酰甘氨酸在原发性肝细胞癌预后评估中的价值及相关机制研究》文中提出研究背景和目的原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第六大最常见的癌症,也是第三大癌症相关死亡病因。我国最新癌症数据表明,HCC的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中分别排名第四和第三位,严重危害了我国人民的生命健康。与其他类型癌症不同的是,HCC显示出强烈的血管侵袭倾向。肿瘤细胞侵入门静脉主干或其分支形成门静脉癌栓,是HCC进展的重要标志。肝切除术是HCC患者获得长期生存的最主要治疗手段,然而术后出现的肿瘤复发制约了手术的疗效,进一步提高肝切除手术疗效的关键有赖于HCC发生发展的机制探索。代谢物是在代谢过程中发生化学转化的小分子,能够直接反映机体细胞代谢的变化。利用代谢组学研究生物系统中所有的小分子代谢物,可以提供生命系统对内源性和外源性因素动态代谢反应的整体信息。本研究探索了基于超高效液相色谱质谱（UPLS-MS）技术的代谢组学检测平台在HCC中的应用,寻找并评估特征性代谢分子对HCC术后预后预测价值,进一步就HCC特征性代谢分子苯甲酰甘氨酸及其关键调控酶在HCC发展中的作用机制进行深入研究。研究第一部分利用代谢组学检测肝癌组织样本的代谢谱特征,对HCC合并门静脉癌栓患者的术后组织样本进行检测,分析发现苯甲酰甘氨酸这一特征性差异代谢物,并利用靶向代谢组学对苯甲酰甘氨酸在不同组织中的含量进行定量验证;研究第二部分评估苯甲酰甘氨酸在HCC术后预后判别上的价值,定量检测术后肝癌组织的苯甲酰甘氨酸含量,分析其含量水平与肿瘤病理特征的相关性。筛选预后相关危险因素,并分别构建总生存期和无复发生存期的列线图预测模型,以实现对HCC术后长期预后的个体化预测;研究第三部分进一步对苯甲酰甘氨酸在HCC发展中的作用机制进行研究,探索苯甲酰甘氨酸在肝癌细胞系中的表达及生物学功能影响,并利用公共数据库数据结合分子生物学研究方法,对苯甲酰甘氨酸及其关键调控酶甘氨酸N乙酰转移酶在HCC发展中的作用机制进行深入探索,以期进一步揭示HCC发生发展的潜在机制,为寻找预后个体化评估标志物和治疗靶点提供理论依据。研究方法研究的第一部分利用UPLS-MS技术平台建立组织样本的代谢谱分析方法,收集50名HCC合并门静脉癌栓患者的手术切除组织样本,利用非靶向代谢组学分析方法对患者的肝癌组织、近端癌旁（距切缘<2cm）、远端癌旁（距切缘≥2cm）及门静脉癌栓组织进行测定。首先,建立正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型,计算模型的解释率和预测率,并通过内部验证的方法检验模型的可靠性和稳定性。其次,根据代谢物筛选条件筛选出在四种组织之间表达差异显着的代谢物,将筛选所得差异代谢物的一级和二级质谱与公共代谢数据库中的谱图进行比对,从而鉴定出差异代谢物的种类。最后,运用靶向代谢组学技术平台在四种组织中定量检测目标代谢物的含量,进一步确认筛选到的差异代谢物在HCC中的变化情况。研究的第二部分,首先结合前述苯甲酰甘氨酸靶向代谢组学检测方法,对426名接受了肝切除治疗的HCC患者术后样本进行检测,定量测定肝癌组织中的苯甲酰甘氨酸含量。利用X-tile软件探索苯甲酰甘氨酸用于预后判断的最佳界值,并分析苯甲酰甘氨酸含量的高低表达与患者病理特征之间的相关关系。按照完全随机原则将全部患者划分为训练集和验证集,训练集数据用于模型变量筛选和模型构建,在验证集中验证模型的预测能力。采用Cox回归分析探索影响HCC患者术后总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的危险因素,将患者组织样本中的苯甲酰甘氨酸含量作为变量纳入至筛选过程中,分别构建预测OS和RFS的列线图预测模型。在训练集和验证集中利用一致性指数及校准曲线评价预测模型的区分度和校准度,采用决策曲线分析评估模型的临床获益。最后根据列线图预测值对患者进行危险分层,并比较分组后患者的预后差异。研究的第三部分,首先利用靶向代谢组学检测苯甲酰甘氨酸在肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达量,并探索苯甲酰甘氨酸对肝癌细胞生物学表型的影响。在公共数据库以及代谢通路数据库进行检索分析,寻找调控苯甲酰甘氨酸的关键酶。通过TCGA公共数据库探索调控苯甲酰甘氨酸关键酶甘氨酸N乙酰转移酶（Glycine Nacyltransferase,GLYAT）在肝细胞癌中的表达情况,并分析其与肿瘤特征、患者预后的关系。进一步探索GLYAT在肝癌细胞系中的功能,利用慢病毒载体构建并筛选GLYAT过表达和敲减细胞系,采用分子功能学实验方法探索GLYAT对肝癌细胞生物学表型的影响以及下游信号通路的调控。在明确作用机制的基础上,进一步利用在体动物模型验证GLYAT对肝癌发生发展的作用。研究结果研究第一部分对50例HCC合并门静脉癌栓患者的四种术后组织样本进行非靶向代谢谱测定。建立OPLS-DA模型后,模型解释率R2Y和预测率Q2分别达到0.726和0.708,内部验证显示模型拟合程度好,表明该模型稳定、有效。通过与公共数据库的代谢谱数据相比对,最终共鉴定出17种在肝癌组织、近端癌旁组织、远端癌旁组织及癌栓组织中表达差异显着的代谢物,分属于氨基酸类、嘌呤类、有机酸类、胆汁酸类、弱酸类、酮类、饱和与不饱和脂肪酸类。代谢通路分析显示差异代谢物主要富集于以下通路:初级胆汁酸生物合成,牛磺酸及亚牛磺酸代谢,嘌呤代谢和苯丙氨酸代谢。本研究进一步将每种差异代谢物在不同组别中的相对含量进行对比后发现,苯甲酰甘氨酸在远端癌旁、近端癌旁、肝癌组织及癌栓组织中的含量逐渐降低。运用靶向代谢组学技术平台定量检测苯甲酰甘氨酸的在远端癌旁组织、近端癌旁组织、肝癌组织及癌栓组织中的含量差异,结果显示苯甲酰甘氨酸含量趋势与前述一致。因此,利用非靶向和靶向代谢组学筛选得到苯甲酰甘氨酸,其是HCC合并门静脉癌栓术后组织中的特征性差异代谢物。第二部分研究共纳入了426名接受肝切除术治疗的HCC患者,采用靶向代谢组学定量检测切除术后肝癌组织中的苯甲酰甘氨酸含量,利用X-tile软件确定了区分苯甲酰甘氨酸高、低表达的最佳界值为0.215 ng/m L。按照完全随机分组原则将所有患者分为训练集（N=286）和验证集（N=140）,在训练集中采用Cox多因素回归分析方法研究训练集中影响HCC患者手术后OS的因素,结果显示苯甲酰甘氨酸低表达是影响HCC患者术后OS的独立危险因素,其他因素还包括术前高AFP水平、最大肿瘤直径、多发肿瘤、大血管侵犯、术中输血;多因素Cox回归分析发现苯甲酰甘氨酸低表达是影响HCC术后RFS的独立危险因素,其他因素还包括Child-Pugh评分、最大肿瘤直径、肿瘤数目、大血管侵犯、切缘≤1公分。将以上Cox多因素回归分析筛选得到的OS和RFS相关危险因素作为预测变量纳入列线图预测模型,从而实现对1、3、5年OS和RFS生存概率的预测。OS列线图预测模型的C-index在训练集和验证集中分别是0.763和0.795,RFS列线图预测模型的C-index在训练集和验证集中分别是0.750和0.765。利用校准曲线在训练集和验证集中分别评价OS和RFS列线图预测模型一致性,结果显示预测结果和实际结果贴合良好,表明预测模型的一致性理想。决策曲线分析结果显示OS和RFS列线图预测模型具有优于BCLC分期和TNM分期的临床获益。第三部分研究首先利用靶向代谢组学检测肝癌细胞系中的苯甲酰甘氨酸含量,结果显示其在肝癌细胞系的表达量低于正常肝细胞系,苯甲酰甘氨酸直接处理肝癌细胞可以抑制其增殖和侵袭迁移能力。通过检索代谢网络数据库和KEGG数据库,显示苯甲酰甘氨酸属于苯丙氨酸代谢通路中的终末产物,其代谢途径单一,由关键酶GLYAT直接调控,苯甲酰甘氨酸水平与GLYAT密切相关。干扰GLYAT后苯甲酰甘氨酸的含量亦降低。基于以上结果,我们推测GLYAT在HCC中可能发挥重要的作用。通过TCGA公共数据库探索GLYAT在肝癌中的表达情况,结果显示肝癌组织中的GLYAT表达量显着低于正常肝组织（P<0.05）。收集67例HCC患者的肝癌组织和癌旁组织,同时收集其中11例HCC合并门静脉侵犯患者的门静脉癌栓组织,进一步在肝细胞癌临床样本中验证GLYAT表达情况。结果表明GLYAT在癌旁组织、肝癌组织和门静脉癌栓组织中表达量逐渐降低,相关性分析显示GLYAT表达与微卫星灶和微血管侵犯的发生相关,表达量越低提示肿瘤的恶性程度越高。多因素Cox回归分析显示GLYAT低表达是总体生存率和无复发生存率的独立危险因素。进一步在肝癌细胞系中进行GLYAT表达量的检测,与正常肝细胞相比,肝癌细胞系中的GLYAT表达量降低。过表达GLYAT能够抑制肝癌细胞的增殖和转移侵袭能力,而敲减GLYAT则增加肝癌细胞的增殖和转移侵袭能力。体内研究亦证实GLYAT表达水平降低可以促进Huh7细胞的皮下成瘤能力,过表达GLYAT后则抑制皮下成瘤能力。进一步检测EMT相关蛋白,结果显示过表达GLYAT使N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低,而E-cadherin的表达上升。在GLYAT敲减组中N-cadherin和Vimentin蛋白表达较对照组升高,而E-cadherin的表达则降低。机制研究部分检测了过表达和敲减GLYAT后多种经典信号通路相关蛋白的表达变化情况。结果显示,过表达GLYAT下调了PI3K、Akt和m TOR的磷酸化水平,进而抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活化,而GLYAT的表达下调则激活PI3K/Akt/m TOR通路。加入m TOR激酶抑制剂PP242处理之后则可以逆转GLYAT敲减后肝细胞癌的恶性表型,抑制GLYAT表达下调引起的细胞侵袭和迁移。以上结果提示GLYAT的表达下调通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,从而促进肝癌细胞中的EMT过程,进而促进肝癌细胞的侵袭和迁移。本部分研究证实GLYAT可能是一种有效的HCC预后生物标志物和调控HCC进展的关键靶点。研究结论综上所述,本研究基于UPLS-MS技术检测平台,建立了稳定的HCC患者术后组织非靶向代谢组学检测分析方法,鉴定出HCC组织样本中特征性差异代谢分子。运用靶向代谢组学定量检测分析苯甲酰甘氨酸在远端癌旁、近端癌旁、肝癌组织及癌栓组织中的表达水平,结果显示苯甲酰甘氨酸含量在上述组织中逐渐降低。第二部分研究基于第一部分所建立的靶向代谢组学分析方法,对426名接受肝切除术患者的组织样本进行苯甲酰甘氨酸定量检测,并确定了苯甲酰甘氨酸用于预后判断的最佳分界值。利用多因素Cox回归分析确定了苯甲酰甘氨酸含量是总生存期和无复发生存期的独立危险因素,且通过构建整合代谢物苯甲酰甘氨酸含量的列线图预测模型,对HCC术后预后实现精准地个体化预测。本研究第三部分对苯甲酰甘氨酸及其关键调控酶GLYAT在HCC发展中的作用机制进行研究。应用分子生物学研究策略探索了GLYAT在HCC中的生物学功能及其在HCC发展中的分子机制,并进一步分析相关信号通路分子变化情况。临床组织样本分析证实GLYAT是一个潜在的HCC预后标志物,GLYAT能够显着抑制HCC肝癌细胞的增殖和迁移,GLYAT的表达下调通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,促进HCC中的EMT过程,提高了肝癌细胞侵袭和迁移能力。因此,HCC特征性代谢分子苯甲酰甘氨酸及其关键调控酶可能具有作为HCC进展生物标志物的潜力,并且可能是未来治疗干预的新途径。
饶春美[5]（2020）在《壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）检测在原发性肝癌、肝硬化中的临床应用》文中进行了进一步梳理原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）是人类十分常见的恶性肿瘤之一,主要包括肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）以及HCC-ICC混合细胞癌三种类型,肝细胞癌占比85%-90%。2015年中国恶性肿瘤流行情况分析数据显示,肝癌发生率高达26.92/10万,在我国恶性肿瘤中位居第四。死亡率为23.72/10万,排我国恶性肿瘤第二位,仅次于肺癌。原发性肝癌发生的主要危险因素有肝炎病毒感染、酒精、摄入食物中的黄曲霉素等。血清标志物检测是早期发现并诊断肝癌的重要手段,近年来基础研究中发现许多与肿瘤发生发展相关的蛋白类标志物,部分已进入临床应用,但是这些新的标志物的应用价值还需要在临床实践中进一步扩大验证。壳多糖酶3样蛋白1（Chitinase 3 like protein 1,CHI3L1）是一种分泌性糖蛋白,表达升高见于多种实体肿瘤和炎症性疾病。本研究通过分析HCC患者组织、外周血中CHI3L1的表达和含量,探索CHI3L1检测在原发性肝癌中的临床应用。第一部分:CHI3L1在肝癌患者组织中的表达我们首先分析了TCGA数据库中50例HCC患者肝癌和配对癌旁组织CHI3L1的表达和预后,发现HCC患者癌组织CHI3L1表达高于癌旁组织（t=2.691,P=0.010）,癌组织CHI3L1高表达与HCC患者预后差相关。本课题进一步研究CHI3L1在肝癌中的表达,通过免疫印迹（Western Blot,WB）实验、反转录·聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）技术、组织芯片免疫组化染色分析HCC患者癌组织和配对癌旁组织CHI3L1的表达,为阐述CHI3L1检测在HCC患者临床应用中的价值提供依据。20例HCC患者癌组织和癌旁组织CHI3L1转录水平（RT-PCR技术）、蛋白水平（WB实验）未见显着差异（P=0.199,0.064）。配对分析组织芯片免疫组化染色结果,发现癌旁组织CHI3L1染色指数高于癌组织（Z=-2.343,P=0.019）,HCC患者中肝癌伴肝硬化组与肝癌不伴肝硬化组癌组织及癌旁组织CHI3L1表达无明显差异（Z=-1.781、-1.030,P=0.075、0.303）。分析病理特征和CHI3L1染色指数间的关系,发现癌旁组织CHI3L1染色指数与肿瘤大小、子灶/卫星灶、微血管侵犯相关（Z=2.387、2.112、2.092,P=0.017、0.035、0.036）。生存分析发现,子灶/卫星灶、微血管侵犯、肿瘤大小、肿瘤分期、甲胎蛋白水平、全血白细胞计数、血浆纤维蛋白原水平与HCC患者的生存预后相关（P=0.012、0.028、0.001、0.039、0.034、0.041、0.037）,另外我们发现,癌旁组织与癌组织CHI3L1染色指数的差值在HCC患者不同预后中表现出明显差异,△CHI3L1（癌旁组织-癌组织）高的患者预后较差（P=0.011）。第二部分:肝硬化、原发性肝癌患者外周血中CHI3L1的改变和临床意义我们检测了肝硬化（Liver cirrhosis,LC）、肝癌患者外周血CHI3L1蛋白水平并分析其在肝癌、肝硬化患者临床管理中的价值。HCC、LC、健康对照（Health control,HC）组CHI3L1蛋白水平中位数（四分位数）分别为118.2（74.9,201.0）μg/L、195.8（103.3,330.4）μg/L、46.8（30.7,66.4）μg/L,三组人群间CHI3L1水平存在显着差异（P<0.001）。LC组患者中,CHI3L1蛋白和肝纤维化四因子指数（Fibrosis 4 score,FIB-4）正相关（r=0.237,P=0.013）,Child-Pugh分级为B和C级的患者CHI3L1水平高于Child-Pugh A级患者（P=0.009）,提示在LC患者中CHI3L1水平和患者肝纤维程度以及肝功能水平相关。与健康对照比较,受试者工作曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析CHI3L1对LC的诊断效能,曲线下面积（Area under the cueve,AUC）为0.934,表明CHI3L1对LC具有较好的诊断效能。将HCC组患者分为肝癌合并肝硬化、肝癌不伴肝硬化两组,CHI3L1水平与HCC是否伴有肝硬化无关（P=0.775）,这与我们第一部分中组织芯片的结果一致。分析HCC组CHI3L1水平与临床实验室指标的相关性,血清CHI3L1水平与无创肝纤维化标志物:透明质酸（Hyaluronic acid,HA）、Ⅲ型前胶原氨基末端肽（TypeⅢprocollagen,PCⅢNP）、Ⅳ型胶原蛋白（TypeⅣcollagen,Ⅳ-C）、FIB-4正相关（r=0.202、0.159、0.299、0.221,P均<0.05）,与ALB负相关（r=-0.326,P<0.001）,与PT正相关（r=0.160,P=0.010）,与AST正相关（r=0.138,P=0.009）。分析CHI3L1和HCC患者病理特征的相关性,发现血清CHI3L1与肿瘤最大径正相关（r=0.284,P<0.001）,中国肝癌分期（China liver cancer staging,CNLC）、TNM分期分层分析均发现肝癌晚期组CHI3L1水平高于早期组,虽然在HCC整体患者中血清CHI3L1水平与微血管侵犯（Microvascular invasion,MVI）未见显着相关,我们发现在AFP阴性的HCC患者中MVI阳性患者CHI3L1水平明显高于MVI阴性患者。检测30例行根治性切除术的HCC患者术后1.5个月时血清指标发现,术后1.5月时血清CHI3L1水平显着高于术前,可能与术后组织修复和肝脏组织再生有关。外周血中LC患者CHI3L1水平高于HCC患者,HCC患者血清CHI3L1水平与肝纤维化标志物、肝功能指标以及肿瘤大小、肿瘤分期有关,检测血清CHI3L1水平有助于HCC患者的临床分层管理。综合以上两个部分,我们发现肝癌组织CHI3L1 m RNA和蛋白水平表达均升高,在肝硬化及肝癌患者外周血中含量也升高。与健康对照相比,外周血CHI3L1检测对肝硬化具有较高的诊断效能。检测外周血CHI3L1有助于HCC患者疾病分层和临床管理。HCC患者癌旁组织伴存不同程度的纤维化和癌前改变可能是目前文献对于HCC、LC报道不一致的影响因素,CHI3L1在临床应用过程中,应考虑肿瘤、炎症、纤维化等多方面因素的影响。
马丽[6]（2020）在《基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究》文中研究说明慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是世界范围内的重要公共卫生问题,中医药对CHB的防治已显示其独特优势,进一步提高中医药防治能力,深入阐述CHB的证候生物学基础,似为其主要一环。四川地区CHB常见的中医证候为脾胃湿热证与肝郁脾虚证,课题组前期从mi RNA对上述两证候的生物学基础进行了初步研究。有文献表明DNA甲基化参与CHB的发生发展,且DNA甲基化与中医证候的形成在理论上似有契合之处,此或许能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证生物学基础的研究提供新的思路。目的:本研究基于前期相关mi RNA研究,多维度综合观察CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化水平的差异表达,探讨上述两证候的生物学基础是否是通过DNA甲基化与mi RNA相互调控,影响表观遗传,进而调节基因表达,形成不同的证候,以期初步证实DNA甲基化的差异表达是否为CHB证候差异的主要表观遗传机制之一,为上述两种CHB中医证候的客观化与规范化提供部分实证依据。方法:1.招募CHB脾胃湿热证（Spleen-stomach damp heat syndrome,SSDHS）患者7例SSDHS组),肝郁脾虚证（Liver depression and spleen deficiency syndrome,LDSDS）患者7例（LDSDS组）和健康志愿者6例（健康对照组（Healthy control,HC））。2.采集所有受试者清晨空腹、无菌环境下外周静脉血,检测各组间肝功能相关指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量。3.用ELISA法检测各组间DNA甲基化相关蛋白DNMT1、Me CP2的表达水平及HBV相关蛋白P53、E-cad、P16的表达水平。4.及时分离外周静脉血血清,提取DNA,用Illumina Bead Array TM Infinium850K甲基化芯片检测各组间DNA甲基化差异表达的情况,对差异甲基化位点相关基因进行GO功能富集和KEGG pathway富集分析。5.利用Target Scan7.2与miRDB数据库对不同中医证候中部分相同mi RNAs靶基因进行预测,采用Cytoscape3.6软件构建DNA甲基化基因与mi RNAs预测靶基因共表达网络图。结果:1.SSDHS、LDSDS组分别与HC组相比,在DNMT1、p16表达水平、性别、年龄、病程、生化指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量检测结果方面均无显着性差异（P>0.05）;E-cad表达水平均有显着性差异（P<0.05）,Me CP2、P53表达水平在SSDHS组中无显着性差异（P>0.05）,在LDSDS组中有显着性差异（P<0.05）。2.Illumina Bead Array TM Infinium 850K甲基化芯片检测结果显示CHB患者组与HC组有7868个显着差异甲基化位点,其中高甲基化位点2310个,低甲基化位点5558个;经过筛选高甲基化差异程度最高的位点为cg03278611位于基因NLGN4Y,低甲基化差异程度最高的位点为cg03670113位于基因TAZ;差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、脂肪颗粒、各种酶等;KEGG pathway主要富集在类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等。3.SSDHS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg21898358位于基因LILRA3,低甲基化差异程度最高的位点为cg09323788位于基因CHTF18,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在T细胞共刺激、Rho蛋白信号转导、Rho GTPases相关的功能等;KEGG pathway主要富集在ABC转运蛋白、AMPK信号通路及肿瘤相关通路;LDSDS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg09857096位于基因BMPR1B,低甲基化差异程度最高的位点为cg09972436位于基因LCE3C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在树突棘、丝氨酸/苏氨酸激酶、Rac GTPase等;KEGG pathway主要富集在苯丙氨酸代谢、氮代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路;SSDHS组与LDSDS组间最显着的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2,最显着的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在肌动蛋白相关细胞及组织,KEGG pathway主要富集在Erb B信号通路及代谢通路等。4.SSDHS、LDSDS组差异甲基化位点相关基因分别与mi R-122-5p、mi R-1228-3p、mi R-191-3p预测靶基因进行对比分析:两证候差异甲基化位点相关基因与mi R-122-5p预测靶基因均有6个基因重合,其中SSDHS组独有基因为RIMS1,LDSDS组独有基因为SLC41A1;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有21个基因重合,该组独有基因为OTUB、AMPH、SEMA3C、ZC3H12B、PCGF3、JAKMIP3,LDSDS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有17个基因重合,该组独有基因为ARID1B、NUDT7;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-191-3p预测靶基因有2个基因重合,该组独有基因为MPP7、LDSDS组差异甲基化基因与mi R-191-3p预测靶基因有3个基因重合,该组独有基因为SPTB2、CCNY。结论:1.Me CP2、P53可能通过影响DNA甲基化修饰参与CHB肝郁脾虚证的形成;E-cad可能是CHB脾胃湿热证或肝郁脾虚证形成的物质基础之一。2.CHB患者存在DNA甲基化的差异表达,具体机制可能与NLGN4Y、TAZ等基因的甲基化及蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等有关。3.CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证均存在DNA甲基化的差异表达,同时分别具有各自特有的DNA甲基化谱。LILRA3、CHTF18等基因的甲基化及T细胞共刺激诱导肝脏炎症等,可能是CHB脾胃湿热证的分子生物学基础;BMPR1B、LCE3C等基因的甲基化及树突棘的改变和物质代谢异常等,可能是CHB肝郁脾虚证的分子生物学基础,提示DNA甲基化可能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证差异的表观遗传机制之一。4.不同证候出现部分相同mi RNA的原因可能与其影响不同靶基因甲基化水平的差异性有关,具体调控机制尚需进一步研究证实。
丁文斌[7]（2020）在《乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究》文中研究表明乙型肝炎病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作为乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反转录模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻译模板,在HBV的生命周期中发挥了重要作用[1-3]。近年来相关研究发现慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循环血中可以稳定的检测到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循环中;在长期服用核苷类似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治疗,血清HBV DNA水平在临床上为阴性（即未检出）的CHB患者中,其血清pg RNA表达水平不但与肝内pg RNA水平呈正相关关系,还可以反映出CHB患者肝脏的炎症和纤维化程度[4,5]。此外,还有许多研究提出血清pg RNA可以作为一种潜在的生物学标志物,用于评价NAs抗病毒治疗效果,检测NAs治疗中的病毒突变以及指导NAs治疗的安全停药[6-10]。然而,pg RNA在HBV相关肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生及进展过程中发挥了何种作用尚不明确。此外,相关研究报道α干扰素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的转录,且在HBV相关HCC行根治性手术的患者中,术后IFN-α-2a辅助治疗能够降低他们HCC的复发率并提高总体生存率,但具体作用机制仍不明确[11-13]。在本研究中,我们首先探索了pg RNA在HBV相关HCC发生和进展中的作用及机制。其次,我们探索了干扰IFN-α-2a除了直接抗肿瘤作用外,能否通过抑制pg RNA发挥预防HBV相关HCC发生和进展的作用。本研究分为以下两个部分。本研究的第一部分中,我们首先从本中心临床样本库中选取了136例术前服用NAs药物抗病毒治疗至少48周,血清HBV DNA阴性的慢乙肝肝癌患者,对其术前的血清,术中切除的肝癌及癌旁组织中pg RNA的表达量进行检测。结果显示癌旁组织中pg RNA的表达高于癌组织,且血清pg RNA表达与癌旁组织pg RNA表达呈正相关关系（r=0.63,p<0.001）。接下来我们根据患者血清pg RNA的表达水平,使用中位数法把患者分为血清pg RNA高表达组和血清pg RNA低表达组,然后对其基本临床病理学信息进行分析和比较。结果显示血清pg RNA高表达不但与更低的肿瘤分化程度（p=0.014）,更严重的肝脏炎症程度（p=0.006）,纤维化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相关,而且还与HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）阳性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相关。此外,血清pg RNA高表达在患者的总生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累计复发率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表达是肝癌患者手术后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌复发的独立危险因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。对临床数据的分析提示pg RNA可能在HCC发生和进展中发挥了重要作用。接下来我们通过体内体外等功能实验进一步探索pg RNA在肝癌发生和进展中的作用。我们使用pg RNA特异性短发卡RNA（sh-RNA）成功构建了稳定干扰pg RNA的Hep G2.2.15肝癌细胞系。同时,我们使用pg RNA全长过表达质粒成功在肝癌细胞Hep G2.2.15和Huh7中过表达了pg RNA并挑取了稳定过表达单克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,细胞流式,成球及体内和体外绝对稀释等实验表明敲低pg RNA的表达能够抑制细胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌细胞的抗细胞凋亡能力,同时抑制肝癌细胞的干细胞特性（简称干性）和成瘤能力;而在肝癌细胞中过表达pg RNA后,肝癌细胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力进一步增强。体内外功能实验结果进一步证明了pg RNA与HCC的发生及进展密切相关。在探索pg RNA促进HBV相关HCC发生和进展的机制研究过程中,通过RNA pull-down实验[14],银染实验和蛋白质谱分析,我们发现pg RNA可与一个经典的促癌分子胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接结合并相互调节。接下来,我们又通过RNA pull-down和蛋白免疫印迹（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等实验进一步验证了pg RNA与IGF2BP3的直接相互结合作用,且两者结合后pg RNA的稳定性得到增强。接下来,通过一系列的实验和生物信息学预测分析,我们发现pg RNA通过海绵样吸附mi RNA-let-7e-5p,在转录后修饰水平上调IGF2BP3的表达。此外,通过细胞功能的加减法实验,我们发现过表达pg RNA对肝癌增殖能力和干性的促进作用可以被进一步干扰IGF2BP3所阻断。总之,我们的研究发现在CHB患者体内,pg RNA与IGF2BP3之间存在相互调节作用。一方面,pg RNA与IGF2BP3直接结合,且两者结合后pg RNA的稳定性会升高;另一方面,pg RNA可通过海绵样吸附作用,隔离IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的稳定性,从而在转录后修饰水平上调IGF2BP3蛋白的表达。综上所述,我们第一部分部分的研究发现pg RNA-IGF2BP3信号轴在HBV相关HCC发生和进展过程中发挥了重要作用。本研究的第二部分中,我们探索IFN-α-2a能否通过抑制HBV-pg RNA,进而抑制HBV相关HCC的发生和进展。我们使用IFN-α-2a处理Hep G2.2.15肝癌细胞不同的时间段后,对pg RNA和IGF2BP3的表达变化进行检测。结果显示,当我们使用IFN-α-2a处理细胞0-24 h时,pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表达从处理4 h后开始明显下降,但IGF2BP3蛋白水平未明显变化。接下来,我们使用IFN-α-2a处理细胞更长的时间（0-7天）,结果显示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表达水平从处理4 h起开始明显下降,IGF2BP3蛋白水平从处理24 h后开始明显下降。此外,当我们用IFN-α-2a处理不表达pg RNA但遗传背景与Hep G2.2.15相同的Hep G2细胞相同时间后,IGF2BP3无论在m RNA还是蛋白水平均未发生明显变化。这些结果提示IFN-α-2a无法直接下调IGF2BP3的表达,而是通过抑制pg RNA进而下调IGF2BP3的表达,发挥抑制HCC进展的作用。接下来,我们通过体内体外细胞功能加减法实验进一步验证IFN-α-2a是否通过抑制pg RNA发挥抑制HCC发生和复发的作用。首先,我们使用IFN-α-2a和等体积生理盐水分别处理pg RNA过表达单克隆和对应的阴性对照单克隆细胞。结果显示pg RNA的过表达可以在一定程度上逆转IFN-α-2a对肝癌细胞增殖能力和干性的抑制作用。接下来,我们使用pg RNA过表达单克隆和对应阴性对照单克隆细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等体积生理盐水分别处理相应的裸鼠。结果显示过表达pg RNA后可以部分逆转IFN-α-2a对皮下荷瘤生长的抑制作用。综上,这些结果提示IFN-α-2a除了直接抗肿瘤生长作用外,在HBV相关HCC中还可以通过阻断pg RNA-IGF2BP3轴从而抑制肝癌细胞的增殖能力和干性,最终发挥抑制HCC进展的作用。相关研究已发现IFN-α-2a可以抑制pg RNA的转录[15]。此外,最近的研究也发现在HBV pg RNA的5’和3’末端茎环结构上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,且m6A修饰程度增强后,HBV的所有转录本（包括pg RNA）的稳定性及相应的翻译产物会被下调[16]。因此,我们接下来探索IFN-α-2a处理对pg RNA稳定性及其m6A修饰的影响。通过放线菌素D（Actinomycin D）转录抑制实验并进一步计算pg RNA半衰期,我们发现经IFN-α-2a处理48 h后,pg RNA的稳定性明显下调。接下来我们通过基因特异性m6A q PCR,进一步验证IFN-α-2a处理对pg RNA的m6A修饰的影响。结果显示,IFN-α-2a处理能够明显增加pg RNA的m6A修饰水平。同时我们也检测了经IFN-α-2a处理后,m6A修饰过程中三个重要蛋白甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表达变化[17]。结果显示,经IFN-α-2a处理的Hep G2.2.15细胞中METTL3和METTL14的表达明显升高,而FTO的表达明显下降。提示IFN-α-2a可能通过上调肝癌细胞中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达同时下调去甲基酶FTO的表达,进而增加pg RNA的m6A修饰水平。综上所述,我们该部分的研究发现IFN-α-2a除了直接的抗肿瘤作用外,在HBV相关HCC中还可以通过增加HBV-pg RNA的m6A修饰水平,促进pg RNA的降解,从而抑制pg RNA-IGF2BP3信号轴,发挥预防HCC发展的作用。
钟蓝海[8]（2020）在《134序列相似的家庭成员B在肝细胞癌中的表达、意义及作用》文中进行了进一步梳理目的 FAM134B基因产物是一种在细胞中介导内质网自噬的蛋白,目前的研究从多方面展示了其功能,其功能及表现具有组织器官特异性、疾病特异性,在感觉神经性疾病、血管性疾病、病毒性疾病及肿瘤性疾病中均起到一定的作用,在不同肿瘤中表现出不同的特性,如在食管癌中表现促癌基因作用,而在结直肠癌及乳腺癌中表现出抑癌基因的作用,但在肝细胞癌中的作用鲜见研究。本文将展开FAM134B在肝细胞癌中的表达情况、与临床参数的关系,对预后的影响,研究体外FAM134B过表达模型对肝癌细胞系增殖、迁徙、侵袭、凋亡功能等生物学功能的影响,探索其相关基因存在的主要功能,以期明确其在肝细胞癌中起到的作用,为肝细胞癌的早期诊断和治疗靶点探索提供新的思路。方法 首先采用免疫组化及蛋白质免疫印迹检测患者肿瘤组织及正常肝组织中FAM134B蛋白层面的表达情况,分析TCGA数据库中肝细胞癌患者转录及临床信息数据,分析FAM134B在基因层面的表达水平,并分析FAM134B水平高低与临床病理参数的相关性和对患者预后的影响。构建FAM134B在肝癌细胞的过表达模型,观测FAM134B过表达对细胞增殖、迁徙、侵袭、凋亡功能等生物学功能的影响,并在最后通过GO和KEGG富集分析FAM134B相关基因的信息。结果 FAM134B蛋白主要定位于细胞质。与正常肝组织相比,肝癌组织中FAM134B蛋白表达更低。在基因水平,与正常肝组织相比FAM134B在肝细胞癌组织中水平也更低。FAM134B低水平组患者年龄更小、更易为亚洲人种、肿瘤分化程度更低、更易伴有肝硬化以及甲胎蛋白升高更多,同时,低水平患者预后更差,其中FAM134B水平、T分期、年龄、病理分级、乙型肝炎指标是肝细胞癌预后的独立危险因素。过表达FAM134B模型可以抑制离体肝癌细胞系细胞生物学活性,并促进肝癌细胞的凋亡。GO富集提示FAM134B在肝脏相关基因主要富集在RNA多聚腺苷酸聚合尾结合、核糖核蛋白复合体、细胞器膜和端粒酶复合物上,KEGG提示它们主要富集在生物代谢途径、抗生素生物合成途径、碳代谢途径、核糖体、药物代谢酶及核糖体生物合成途径等,多于蛋白合成分解相关。结论 FAM134B在肝细胞癌中低表达,这种低表达与患者多种恶性表型相关,低表达患者预后更差,且FAM134B水平是肝癌患者预后的独立危险因素。FAM134B对离体肝癌细胞的生物学活性具有抑制作用,可以促进其凋亡。FAM134B相关基因多富集在与蛋白代谢相关途径上。总之FAM134B有希望成为肝细胞癌新的早期诊断指标和治疗靶点。
王彩娥[9]（2020）在《STAT4基因多态性通过调控CYP2E1参与肝癌发生发展》文中指出肝癌,主要指肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是目前世界上常见的恶性肿瘤之一,具有高发生率、高死亡率等特点,严重威胁着人类的生命和健康。HCC的发病除与慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染、致癌物质和代谢性疾病等外在因素有关外,还与基因多态性这一内在因素有关,其中基因多态性可参与介导HCC的发生发展。信号转导与转录激活因子4（signal transducer and activator of transcription 4,STAT4）,可被IL-12激活,调控T细胞和NK细胞释放炎症介质,在细胞因子诱导的细胞分化、增殖、侵袭和转移等过程发挥重要的生物学功能,参与炎症、免疫和肿瘤等多种病理生理过程。尽管有文献报道STAT4 rs7574865基因多态性与HCC的易感性存在一定的相关性,但仍缺乏STAT4基因多态性影响HCC发生发展机制及预后的研究。CYP2E1是细胞色素P450酶家族的重要成员,其不仅参与约6%临床药物的代谢和前致癌物的代谢,还与炎症反应有关,有研究报道,CYP2E1参与肝纤维化、肝癌和其他肿瘤的发生发展。本室前期研究已证实CYP2E1的先天活性增高与大鼠肝癌的发生率具有相关性。另有研究显示,STAT1、STAT3可调控CYP2E1的表达、转录和翻译后的修饰,但STAT4是否可以通过调节CYP2E1参与HCC的发生发展尚不清楚。蛋白质是生物体活动的基础,其结构和功能的改变可直接影响机体的生理变化。蛋白质组学是以全部蛋白质为对象,对蛋白质进行定量和定性分析,从而进一步揭示蛋白质的功能,因此,通过蛋白质组学技术寻找和发现参与调节肝癌发生过程的蛋白和通路。本研究以STAT4、CYP2E1为研究对象,拟阐明STAT4基因多态性通过调控CYP2E1参与引起HCC相关蛋白质组学改变及可能的分子机制。STAT4基因多态性对HCC易感性及预后影响的研究全基因组关联研究（Genome-wide association study,GWAS）和Meta分析结果发现,STAT4 rs7574865位点突变与HBV感染的HCC易感性有明显相关性;STAT4在肺癌、胃腺癌和结肠癌等肿瘤组织中高表达,提示肿瘤的发生与STAT4的表达密切相关。尽管有文献报道STAT4 rs7574865基因多态性与HCC的易感性存在一定的相关性,但STAT4基因多态性对HCC易感性机制及预后的研究仍较少。本研究收集了500例HBV-HCC住院患者（HCC组）与500例健康人（Con组）的血液标本,通过Sequenom Mass Array法对STAT4 rs7574865进行单核苷酸多态性检测分型,证实STAT4位点rs7574865基因多态性（T>G）与HBV-HCC的易感性密切相关,携带GG基因型会增加HBV-HCC的患病风险;我们又检测了血液标本中STAT4的量,发现在HCC组中STAT4含量高于Con组（P<0.05）,携带GG基因型的STAT4含量明显高于携带GT、TT和GT+TT基因型（P<0.05）,而对照组中,各基因型之间STAT4的表达水平无明显变化（P值均大于0.05）,这提示了STAT4基因多态性仅影响HCC中STAT4的含量,不影响健康人群中STAT4的含量。影响HCC患者预后因素不仅与肿瘤自身的特点（如肿瘤数量、大小、周围是否浸润和转移）、临床指标和病理分级等有关,还与基因位点突变有关。至于STAT4基因多态性是否影响HCC的预后。我们又通过电话和门诊等方式随访了314名HBV-HCC患者的术后生存期,历时42-56个月,进一步研究了STAT4基因多态性与HBV-HCC患者术后生存期的关系,结果发现,携带GG基因型且STAT4含量高的HCC患者生存时间也明显缩短(Plog-rank<0.05),预后差。这也提示STAT4基因多态性影响外周血中STAT4的量进而影响HCC患者的预后。总之,STAT4基因多态性可能引起HCC患者外周血中STAT4量的改变从而影响HCC的发生发展,对其进行检测可能对肝癌的早期诊断和预后评价具有一定意义。STAT4通过调控CYP2E1参与HCC中发生发展的初步机制探讨本研究收集了人正常肝组织标本和肝癌肝纤维化组织标本各42例,再次在人肝组织进行证实,发现携带GG基因型的HCC组中STAT4含量高,死亡风险增加,预后差（P<0.05）,提示人肝组织中STAT4 rs7574865 GG型可能影响HCC的预后,这和人血清的实验结果一致。本研究结果还发现,STAT4高组的CYP2E1酶动力学参数(Vmax和Clint)明显高于STAT4低组,提示STAT4与CYP2E1的活性呈正相关。通过一系列细胞实验证实,STAT4沉默可促进细胞的凋亡,使G1/0期和G2/M期细胞含量显着升高,而S期细胞含量显着降低,抑制了细胞的侵袭迁移;q PCR和Western blot显示STAT4沉默时STAT4和CYP2E1表达降低;双荧光素酶报告基因检测显示,STAT4可能调节CYP2E1启动子区域影响转录后翻译的功能。因此,STAT4可能通过调控CYP2E1的启动子区域参与肝癌的发生发展,这为寻找HCC新的治疗靶点提供了一定的理论依据,并为肝癌早预防、早诊断、早治疗提供了新思路。基于蛋白质组学探究STAT4调控CYP2E1参与肝癌发生发展蛋白质是生物体活动的基础,主要参与基因调节、细胞代谢和信号传导等过程。蛋白质组是指一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。近年来,随着蛋白质组学的飞速发展,从整体、动态、全面角度分析蛋白质的组成成分和表达水平等,进而发现与疾病相关的蛋白质成为一种新的研究思路。因此,蛋白质组学方法有助于阐明STAT4基因多态性影响肝癌发生发展的信号通路及可能分子机制。本实验室前期用label-free法鉴定分析出1360个差异蛋白,选取了34例正常肝组织标本和42例HCC患者肝纤维化组织标本,采用Label-free定量进行鉴定。将STAT4蛋白表达中位数分为高低两组,鉴定筛选出差异蛋白273个,其中上调蛋白175个,下调蛋白98个。以差异显着程度为标准,P<0.01、0.01≤P<0.03和0.03≤P<0.05的差异蛋白数量分别为63、115和95个。筛选与STAT4表达有直接关联的差异蛋白。HCC组差异蛋白与STAT4表达亚组筛选的差异蛋白相交,交集蛋白共104个。按照功能归类,有18个差异蛋白纳入。STAT4高表达亚组中为上调蛋白,从中筛选出同时满足与CYP2E1活性相关且具有促癌作用的差异蛋白1个,即纤维介素（FGL2）蛋白。与STAT4相关的这273个差异蛋白,通过差异蛋白的功能注释富集分析等探索其所涉及到的细胞组分、分子特征以及生物学过程;此外,还通过KEGG通路富集探究肝癌肝纤维化组织蛋白质组的通路调节,发现其主要与免疫、CYP450药物代谢和炎症等相关的信号通路有关。为进一步分析CYP2E1和FGL2的关系,我们通过人肝组织和动物模型探究CYP2E1影响FGL2表达,以及对HCC患者预后的影响。蛋白质组学数据显示,以人正常肝组织作为对照,肝癌肝纤维化组织中FGL2表达增加（P<0.0001）,且该结果也通过Western blot进行了验证（P<0.05）。提示FGL2升高可能与HCC的发生有关。在肝癌肝纤维化组织中,以STAT4蛋白表达量中位数为界点,分为高低两组,STAT4高表达组FGL2表达增加（P=0.0004）,提示FGL2表达增加可能与HCC中STAT4高表达有关。Kaplan-Meier生存曲线显示,FGL2高表达组HCC患者的生存时间明显缩短,预后差(Plog-rank=0.009),提示FGL2可能影响肝癌患者的预后,促进肝癌的发展。ROC曲线下面积为0.760（P<0.0001）,提示该蛋白可能具有一定HCC诊断的临床预测价值。在肝癌肝纤维化组中,分别以CYP2E1酶动力学参数Vmax和Clint中位数为界点分为高低两组,蛋白质组学数据显示,与Vmax和Clint低组相比,Vmax和Clint高组FGL2高表达（P<0.05）;Western blot检测结果也显示,Vmax和Clint高时肝癌肝纤维化组FGL2表达增加（P<0.05）,提示CYP2E1的活性与FGL2表达呈正相关。我们构建了H22细胞肝脏原位抑制瘤模型,BALB/c小鼠随机分为假手术组、H22细胞原位移植瘤（模型组）和CYP2E1特异性抑制剂SMI 12（干预组）,去探讨使用CYP2E1抑制剂后FGL2的变化。结果发现FGL2在模型组高于假手术组,干预组低于模型组,Western blot结果也显示CYP2E1活性高FGL2表达增加;构建cyp2e1基因敲除鼠模型,结果发现cyp2e1-/-纯合型（KO）大鼠FGL2表达降低,提示CYP2E1可能上调FGL2的表达。因此,探究STAT4基因多态性通过调控CYP2E1引起HCC相关蛋白质组学改变及可能的分子机制,这为HCC早预防和有效治疗提供了新思路、作用靶点和基础理论支持。结论1.STAT4基因多态性可引起STAT4含量改变从而影响HCC发生发展。2.STAT4通过调节CYP2E1参与HCC发生发展。3.CYP2E1调节肝癌患者FGL2的表达,且FGL2高表达患者预后差,死亡风险增加。4.STAT4基因多态性影响HCC的发生发展,其作用机制可能与STAT4调控CYP2E1进而影响FGL2的表达有关。
杨帅[10]（2020）在《通过生物信息学方法探索HBV相关性肝细胞癌的关键基因》文中研究表明目的:HBV相关性HCC为我国主要的原发性肝癌类型,其在我国的发病率及致死率均居世界范围内榜首,但慢性HBV感染进展为HCC的分子机制仍未完全明确,该研究旨在鉴定与HCC相关的关键基因。方法:通过对多个基因表达谱数据集进行综合分析,筛选肝细胞癌和癌旁肝组织样品之间差异表达的基因。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络、GO和KEGG富集等分析,确定了可能与肝细胞癌的发病机制、诊断和预后有关的生物标志物。结果:我们鉴定了 2个基因模块:包含11个上调关键基因MCODE1和10个下调的关键基因MCODE2,MCODE1包含CCNB1、CCNB2、CDC20、MAD2L1、BUB1B、NUF2、ZWINT、BUB1、BIRC5、CENPF、CENPK;MCODE2 包含以下基因:CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A43、CYP26A1、CYP2B6、CYP39A1,这些基因可能与HCC的发病机理密切相关,通过生存分析发现CCNB1、CDC20、MAD2L1、ZWINT、BIRC5、CYP2E1、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19可能作为HCC患者预后生物标志物。CCNB1、CDC20、MAD2L1、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 在 HCC 组织与癌旁组织基因表达差异与免疫组化特征具有一致性,将有望成为HCC的病理诊断标志物。结论:通过综合生物信息学研究发现肝细胞周期、有丝分裂过程、多种物质代谢失衡可能在HBV相关性肝细胞癌的发生发展中起重要作用。CCNB1、CDC20、MAD2L1、CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19将有望成为HCC的诊断、预后预测和分子靶向治疗的生物学标志物。
二、乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异（论文提纲范文）
（1）肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞癌候选免疫相关基因的筛选 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 附图表 |
| 第二部分 DCK在肝癌中的表达及与乙肝相关肝癌患者病理参数的相关分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 附图表 |
| 第三部分 DCK对肝癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表的目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（2）血清甲胎蛋白和异常凝血酶原对肝细胞癌的诊断价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 肝细胞癌组纳入及排除标准 |
| 1.2 肝硬化组纳入及排除标准 |
| 1.3 慢性乙型肝炎组纳入及排除标准 |
| 1.4 健康人群组纳入及排除标准 |
| 2 仪器与试剂 |
| 2.1 血液标本的采集、处理及保存条件 |
| 2.2 血清AFP和 PIVKA-II的检测设备及试剂 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 研究对象的一般资料 |
| 4.2 各组AFP和 PIVKA-Ⅱ水平比较 |
| 4.3 各组AFP和 PIVKA-Ⅱ阳性率比较 |
| 4.4 血清AFP和 PIVKA-Ⅱ单独及联合检测诊断HCC的 ROC-AUC比较 |
| 4.5 AFP与 PIVKA-Ⅱ联合诊断的效能 |
| 4.6 AFP阴性 HCC与 AFP阳性 HCC患者AFP和 PIVKA-II水平及阳性率比较 |
| 4.7 AFP 阴性 HCC 组和AFP 阴性 LC 组以及CHB组之间表达水平和阳性率比较 |
| 4.8 PIVKA-II在 AFP阴性肝癌高危人群筛查中的应用价值 |
| 5 讨论 |
| 5.1 AFP和 PIVKA-II在 HCC 组、LC 组和 CHB组患者之间的表达差异 |
| 5.2 血清AFP和 PIVKA-Ⅱ单独及联合检测的诊断价值 |
| 5.3 PIVKA-II在 AFP阴性肝细胞癌诊断中的价值 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1:综述 原发性肝癌血清诊断标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2:攻读硕士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 基于GEO数据库芯片筛选肝癌相关的分子标记物 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 LncRNA CASC7 在肝癌患者血清中的临床价值研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌相关分子标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）苯甲酰甘氨酸在原发性肝细胞癌预后评估中的价值及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 基于UPLS-MS技术在原发性肝细胞癌组织中的代谢组学研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 特征性代谢分子苯甲酰甘氨酸在肝切除术后预后预测价值评估 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 苯甲酰甘氨酸及其关键调控酶在肝癌发展中的作用机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝细胞癌代谢组学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）检测在原发性肝癌、肝硬化中的临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文中常用缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 CHI3L1在肝癌患者组织中的表达 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 CHI3L1在肝硬化、原发性肝癌患者外周血中的改变和临床意义 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 研究工作小结 |
| 综述 YKL-40作为肿瘤标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
（6）基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 文献研究一 慢性乙型肝炎中医证候客观化规范化研究概述 |
| 1 中医对CHB病名的认识 |
| 1.1 肝着 |
| 1.2 肝毒 |
| 1.3 胁痞 |
| 1.4 异湿 |
| 2 中医对CHB病因病机的认识 |
| 2.1 湿热疫毒是本病的始动因素 |
| 2.2 毒损肝络是本病的病机关键 |
| 2.3 正气之盛虚决定本病的转归及预后 |
| 2.4 发则有证可辨,伏则无机可循为本病的发病特点 |
| 3 CHB中医证候分型指南与标准 |
| 4 影响CHB中医证候分布的相关因素 |
| 4.1 不同地域的CHB证候分布具有差异性 |
| 4.2 体质类型与CHB证候分布具有相关性 |
| 4.3 情志及生存质量的改变是部分CHB证候分布的易感性因素 |
| 5 中医证候的客观化规范化研究 |
| 5.1 肝功能指标 |
| 5.2 肝组织病理分级分期 |
| 5.3 肝脏硬度及肝纤维化值 |
| 5.4 细胞因子及免疫蛋白 |
| 5.5 HBV基因型 |
| 5.6 基因组学 |
| 5.7 转录组学 |
| 5.8 蛋白组学 |
| 5.9 代谢组学 |
| 6 小结 |
| 文献研究二 DNA甲基化在中医证候的应用研究 |
| 1 DNA甲基化概述 |
| 2 DNA甲基化在CHB发病机制中的作用 |
| 2.1 DNA甲基化与HBV |
| 2.2 Cp G岛与HBV基因型 |
| 2.3 DNMTs与 HBV |
| 2.4 甲基化相关蛋白与CHB |
| 3 DNA甲基化在中医证候的应用 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化及HBV相关蛋白的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规检测方法 |
| 2.2 ELISA检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般资料收集结果 |
| 3.2 乙肝两对半定性检测结果 |
| 3.3 生化指标检测结果 |
| 3.4 HBV定性定量检测结果 |
| 3.5 DNA甲基化及HBV相关蛋白检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医证候与DNMT1间关系的探讨 |
| 4.2 中医证候与MeCP2间关系的探讨 |
| 4.3 中医证候与P53间关系的探讨 |
| 4.4 中医证候与E-cad间关系的探讨 |
| 4.5 中医证候与P16间关系的探讨 |
| 5 小结 |
| 实验二 慢性乙型肝炎全基因组DNA甲基化的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集 |
| 2 方法 |
| 2.1 Infinium Human Methylation850K甲基化芯片简介 |
| 2.2 DNA抽提 |
| 2.3 DNA样本质检 |
| 2.4 DNA甲基化芯片实验流程 |
| 2.5 DNA甲基化芯片数据分析流程 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNA样本质检结果 |
| 3.2 实验质控结果 |
| 3.3 样本beta值密度曲线 |
| 3.4 数据归一化 |
| 3.5 差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.6 GO功能富集结果 |
| 3.7 KEGG pathway富集结果 |
| 3.8 差异甲基化区域结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 差异甲基化位点结果分析 |
| 4.2 差异甲基化位点相关基因GO功能富集结果分析 |
| 4.3 差异甲基化位点相关基因KEGG pathway富集分析 |
| 5 小结 |
| 实验三 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.2 不同中医证候GO功能富集结果 |
| 3.3 不同中医证候KEGG pathway富集结果 |
| 3.4 不同证候差异甲基化区域分布结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脾胃湿热证与肝郁脾虚证是四川地区CHB常见的中医证候 |
| 4.2 中医证候与DNA甲基化在理论上有共通之处 |
| 4.3 不同中医证候差异甲基化表达分析 |
| 5 小结 |
| 实验四 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化与mi RNA联合分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候中4条相同miRNA靶基因预测结果 |
| 3.2 不同中医证候差异甲基化位点相关基因筛选结果 |
| 3.3 miRNA预测靶基因与差异甲基化位点相关基因联合分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mi RNA与 DNA甲基化间存在相互调控关系 |
| 4.2 miR-122-5p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.3 miR-1228-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.4 miR-191-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中药干预DNA甲基化修饰的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通过与IGF2BP3相互调控,促进HBV相关HCC的发生和进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分 IFN-α-2a通过增加pgRNA的m6A修饰降低其稳定性,阻断pg RNA-IGF2BP3 信号轴,抑制HCC的进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒前基因组 RNA 在乙肝相关疾病发病机制及临床应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（8）134序列相似的家庭成员B在肝细胞癌中的表达、意义及作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 肝细胞癌中FAM134B的表达及对临床的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 收集肝细胞癌与正常肝组织 |
| 1.1.2 TCGA数据库数据筛选及整理 |
| 1.1.3 实验试剂及材料 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂配置 |
| 1.1.6 组织取材及石蜡切片 |
| 1.1.7 免疫组织化学染色实验 |
| 1.1.8 蛋白质印迹试验 |
| 1.1.9 作图软件及统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 免疫组织化学染色结果 |
| 1.2.2 蛋白质印迹法测定肝细胞癌FAM134B蛋白水平表达差异情况 |
| 1.2.3 FAM134B基因水平表达差异 |
| 1.2.4 FAM134B基因水平与肝细胞肝癌临床病理特征之间的关系 |
| 1.2.5 FAM134B基因表达水平与肝细胞癌患者预后之间的联系 |
| 1.2.6 肝细胞癌患者Cox回归分析 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 FAM134B对肝癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂及材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 细胞培养 |
| 2.1.4 细胞转染 |
| 2.1.5 细胞生长曲线绘制 |
| 2.1.6 细胞划痕实验检测HepG2细胞迁徙能力 |
| 2.1.7 Transwell侵袭实验检测侵袭能力 |
| 2.1.8 CCK8法测定HepG2细胞活力改变 |
| 2.1.9 细胞凋亡水平检测 |
| 2.1.10 作图软件及统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.2 细胞划痕实验 |
| 2.2.3 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.4 CCK8法测定细胞活力 |
| 2.2.5 检测细胞凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 FAM134B相关基因的富集分析 |
| 3.1 研究方法 |
| 3.1.1 数据库数据筛选分析 |
| 3.1.2 数据可视化及统计 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 GO富集分析 |
| 3.2.2 KEGG富集分析 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 FAM134B在人类疾病中的作用及研究现状 |
| 引言 |
| 1.FAM134B的生理学及内质网自噬 |
| 2.FAM134B在病毒性疾病中的应用 |
| 3.FAM134B在ⅡB型遗传性感觉和自主神经病变中的应用 |
| 4.FAM134B在癌症中的作用 |
| 5.FAM134B与其他疾病 |
| 6.未来展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）STAT4基因多态性通过调控CYP2E1参与肝癌发生发展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 STAT4 基因多态性对HCC易感性及预后的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 STAT4 基因多态性与HCC易感性研究 |
| 3.2 STAT4 基因多态性对HCC患者预后的影响 |
| 3.3 STAT4 基因多态性联合预后风险因素对HCC患者预后的影响 |
| 3.4 STAT4 基因多态性对亚组HCC患者预后的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 STAT4 调控CYP2E1 参与肝癌发生发展的机制初步探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 肝组织标本的收集 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 STAT4 含量与CYP2E1 之间的关系研究 |
| 3.2 STAT4 si RNA时 L02、Hep G2 细胞的转染率 |
| 3.3 STAT4、CYP2E1在L02和Hep G2 细胞的表达 |
| 3.4 荧光显微镜观察细胞的凋亡形态学变化 |
| 3.5 细胞的凋亡 |
| 3.6 细胞生长周期 |
| 3.7 Transwell实验检测迁移及侵袭 |
| 3.8 双荧光素酶报告基因检测STAT4 调节CYP2E1 启动子区域 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于蛋白质组学探究STAT4 调控CYP2E1 参与肝癌发生发展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 STAT4与HCC蛋白质组学的研究 |
| 3.2 FGL2与CYP2E1 代谢活性的相关性 |
| 3.3 FGL2在H22细胞原位移植瘤肝组织的表达 |
| 3.4 cyp2e1 基因敲除鼠PCR鉴定 |
| 3.5 CYP2E1 调节FGL2 的表达 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝癌机制的研究进展 |
| 1 炎症 |
| 2 免疫 |
| 3 基因多态性 |
| 4 细胞信号与转录激活因子 |
| 5 细胞色素P450代谢酶 |
| 6 微环境 |
| 7 其他代谢 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）通过生物信息学方法探索HBV相关性肝细胞癌的关键基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 有丝分裂阻滞缺陷蛋白2与肿瘤相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者肝硬化组织与癌组织蛋白质组的差异（论文参考文献）
- [1]肝细胞癌免疫相关基因的生物信息学筛选及DCK在肝细胞癌中的生物学功能研究[D]. 王正. 山东大学, 2021(11)
- [2]血清甲胎蛋白和异常凝血酶原对肝细胞癌的诊断价值[D]. 冯家立. 湖北中医药大学, 2021(09)
- [3]肝细胞癌分子标记物筛选及lncRNA CASC7对肝细胞癌的诊断价值研究[D]. 陈霞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]苯甲酰甘氨酸在原发性肝细胞癌预后评估中的价值及相关机制研究[D]. 邢昊. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [5]壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）检测在原发性肝癌、肝硬化中的临床应用[D]. 饶春美. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [6]基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究[D]. 马丽. 成都中医药大学, 2020(01)
- [7]乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究[D]. 丁文斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [8]134序列相似的家庭成员B在肝细胞癌中的表达、意义及作用[D]. 钟蓝海. 南方医科大学, 2020
- [9]STAT4基因多态性通过调控CYP2E1参与肝癌发生发展[D]. 王彩娥. 郑州大学, 2020(02)
- [10]通过生物信息学方法探索HBV相关性肝细胞癌的关键基因[D]. 杨帅. 川北医学院, 2020(04)