一、人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析（论文文献综述）
黄炼[1]（2021）在《调控奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的miRNAs功能验证》文中认为羊奶含有丰富的短中链脂肪酸与不饱和脂肪酸,该特性构成羊奶独特的营养保健功效,在婴幼儿、老年、恢复期病人以及肠道不适人群的营养保健中发挥着重要作用。山羊乳腺作为重要的泌乳器官,乳汁中脂肪酸的成分及含量主要受到乳腺组织中脂肪酸代谢的调控。Micro RNA（miRNA）作为一种重要的表观调控因子参与脂质及蛋白质合成以及新陈代谢乃至于肿瘤发生发展等多方面作用。miRNA通过影响脂肪酸代谢关键基因的表达调控乳腺组织的脂肪酸代谢过程,其具体的调控机制对于深入解析羊奶脂肪酸代谢的分子机制具有重要意义。因此,利用先进手段探究miRNA在乳腺脂肪酸代谢中的功能对于全面揭示miRNA调控羊奶脂肪酸代谢的分子机理具有重要意义。CRISPR/Cas9系统因其设计简便、编辑效率高与脱靶频率低等特点被广泛运用于高通量与多重基因编辑中,近年来在非编码RNA研究领域取得了巨大的进展。本研究在分析泌乳中期乳腺组织14个乳脂代谢相关miRNAs及其宿主基因表达水平与乳中脂肪酸成分相关性的基础上,选取与乳中短链及长链脂肪酸含量显着相关的两个促进乳脂合成的miR-145与miR-24以及一个抑制乳脂合成的miR-130b。通过CRISPR/Cas9技术敲除miRNAs以探究miRNAs敲除对乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。验证山羊乳腺上皮细胞中miRNAs调控脂肪酸代谢的靶基因,分析miRNAs通过靶基因影响乳腺脂肪酸代谢的分子机制。研究主要结果如下所示:1.山羊乳脂代谢相关miRNAs及其宿主基因表达水平与羊奶脂肪酸成分的相关性分析泌乳中期14个乳脂代谢相关miRNAs表达水平与乳中脂肪酸成分的相关性分析表明,miR-145、miR-30e、miR-24和miR-130b等四个miRNAs与羊乳中C6-C10脂肪酸含量具有负相关关系。14个miRNAs除miR-15a、miR-17以及miR-135b之外均与乳中长链脂肪酸含量显着相关。超长链脂肪酸中,仅有miR-148a与C20:4n6、miR-130b与C24:1n9存在显着相关。宿主基因表达水平与乳中脂肪酸成分的相关性分析表明,miRNA宿主基因中,NFYC与C18:0、CTDSPL与C14:0、CTDSP1与C18:0、NR6A1与C13:0以及PANK2与C21:0脂肪酸含量显着相关。结果表明,miRNAs与乳中短链及长链脂肪酸成分相关。2.miR-145通过INSIG1基因调控山羊乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-145。通过在pre-miR-145基因组序列的Drosha酶的加工位点附近缺失一个核苷酸,影响miRNA的生物合成过程从而抑制成熟miR-145-5p与3p表达。miR-145敲除通过促进靶基因INSIG1 m RNA与蛋白质表达并抑制脂肪酸代谢关键基因表达从而抑制细胞中的甘油三酯与胆固醇合成并上调C17:0、C18:0、C18:2、C20与C22多不饱和脂肪酸且下调C16:0与C18:1脂肪酸含量。此外,利用si RNA在miR-145敲除细胞中干扰INSIG1基因表达,甘油三酯与胆固醇含量均上调,且脂肪酸含量也发生相应改变。结果表明,山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-145通过上调靶基因INSIG1并抑制脂肪酸代谢相关基因表达继而抑制细胞中的甘油三酯与胆固醇合成并影响脂肪酸组成。3.miR-24靶向INSIG1与FASN基因调控乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢山羊乳腺上皮细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除两条sg RNAs靶向位点间的66个核苷酸,从而导致miRNA的生物合成过程受阻并抑制成熟miR-24表达。miR-24敲除促进靶基因FASN与INSIG1表达并抑制脂肪酸代谢关键基因表达从而抑制脂滴、甘油三酯与胆固醇合成并上调C17:0、C18:0、C18:2与C20多不饱和脂肪酸含量。通过在miR-24敲除细胞中干扰FASN与INSIG1表达,发现干扰FASN基因表达进一步抑制甘油三酯合成,而干扰INSIG1基因表达恢复敲除细胞中脂滴、甘油三酯、胆固醇以及C16:0、C16:1与C18:0脂肪酸含量。总之,山羊乳腺上皮细胞中敲除miR-24主要通过靶向INSIG1基因抑制脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并调控脂肪酸组成。4.miR-130b靶向PGC1α基因并影响乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢利用双sgRNAs介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统在山羊乳腺上皮细胞中敲除pre-miR-130b的43个核苷酸,pri-miR-130b表达水平上升而pre-miR-130b表达水平下降,表明pri-miRNA的Drosha酶的加工过程得到了抑制。miR-130b敲除通过上调靶基因PGC1α与脂肪酸代谢关键基因的表达促进细胞中脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并下调C16、C18、C20与C22脂肪酸且上调C17:0脂肪酸含量。总之,在山羊乳腺上皮细胞中敲除miR-130b通过靶向PGC1α基因并促进脂肪酸代谢关键基因表达进而促进脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并影响脂肪酸组成。综上所述,利用CRISPR/Cas9技术敲除pre-miRNA基因组序列,通过影响miRNA的生物合成过程抑制成熟miRNA表达并调控靶基因与脂肪酸代谢关键基因的表达进而调节脂滴、甘油三酯与胆固醇合成并影响C18:0、C18:2与C20多不饱和脂肪酸含量。本研究为阐明miRNA调控羊奶脂肪酸代谢的分子机制提供了理论依据,为miRNA转基因奶山羊制备提供研究基础。
罗丽娟[2]（2019）在《PKM2通过Ectosome形式外泌的分子机制研究》文中研究说明肿瘤细胞通过释放携带含有蛋白质、RNA、DNA、脂质等内含物的胞外囊泡与周围细胞实现交流。微囊泡（Ectosome）是一种以出芽形式外泌的胞外囊泡。PKM2是调节糖酵解的关键限速酶,并且在肿瘤细胞中高表达,是肿瘤细胞代谢的主要调节因子。近年来多数研究都集中在细胞内的PKM2对肿瘤细胞的调控作用。然而,关于肿瘤细胞分泌携带PKM2的胞外囊泡的研究却少有报道。我们实验室他人研究发现,SUMOylation促进PKM2从胞浆定位到质膜。但是,定位到质膜PKM2是否能外泌并不清楚,为此,本文开展了相关机制的研究。本文研究发现,在肝癌细胞中,PKM2的SUMOylation促进PKM2进入ectosomes 依赖于抑制蛋白结构域蛋白 1（arrestin domain-containing protein 1,ARRDC1）。SUMOylation促进PKM2定位质膜,并且PKM2的C结构域与位于质膜上的蛋白ARRDC1相互作用,在ARRDC1帮助下促进PKM2进入ectosomes,然而ARRDC1F88L突变体不能定位质膜则不能促进PKM2进入ectosomes。并且ARRDC1不会影响PKM2发生SUMOylation,也不会影响SUMOylation诱导的PKM2转运到质膜过程。综上所述,我们发现了在肝癌中高表达的PKM2不仅在细胞内具有重要代谢调控作用,还能进入微囊泡被运输出去发挥功能。本研究拓展了PKM2在肝癌细胞中的功能,可能为临床诊断和治疗肝癌提供新思路和新靶点。
刘春亮[3]（2017）在《β3GnT8及其催化合成的多聚乳糖胺结构在肝癌恶性生物学表型中的作用研究》文中提出第一部分:β3GnT8及其相关基因,多聚乳糖胺在肝癌中的差异表达分析目的:分析在肝癌细胞和肝癌组织中,β3GnT8及其相关基因,多聚乳糖胺的差异性表达。方法:（1）qPCR检测人正常肝脏细胞株Lo2和QSG7701,人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1 和 HepG2 中 β3GnT1～β3GnT8 基因,O-糖基化起始酶ppGalNAcT1 和 ppGalNAcT2,GlcNAcβ1,6 分支 N-糖链关键酶 GnTV 的 mRNA 表达水平;（2）western blot检测人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1和HepG2中β3GnT8蛋白表达;（3）qPCR检测临床病人肝癌组织和癌旁组织样本中β3GnT2、β3GnT8、GnTV和c-jun的mRNA表达;（4）免疫组织化学检测人肝癌组织和癌旁组织中β3GnT8、GnTV和c-jun的蛋白表达以及多聚乳糖胺结构表达水平。结果:（1）肝癌细胞株β3GnT8的表达水平高于正常细胞;β3GnT2与β3GnT8的表达趋势未见关联性;c-jun、GnTV的表达与β3GnT8在肝癌细胞株中的表达趋势基本一致;（2）肝癌组织中β3GnT8表达水平高于癌旁组织,GnTV、c-Jun和多聚乳糖胺表达趋势与β3GnT8表达趋势一致。结论:肝癌细胞中β3GnT8及其相关基因的差异化表达,提示可以利用几株肝癌细胞进行β3GnT8的功能研究,肝癌中c-jun和β3GnT8表达的一致性可初步推测在肝癌中β3GnT8可能受到c-jun的转录调控。第二部分:β3GnT8表达对肝细胞癌恶性生物学表型及其糖基化的影响目的:通过改变β3GnT8表达研究该基因对肝癌恶性生物学表型的影响,并对其控制合成的多聚乳糖胺结构、CD147蛋白糖基化和肝癌细胞糖链结构进行分析。方法:（1）慢病毒构建SK-Hep-1和SMMC7721细胞β3GnT8过表达细胞株;（2）利用β3GnT8RNA干扰载体下调HeβG2、SK-Hep-1和SMMC7721中β3GnT8的表达;（3）免疫共沉淀（Co-IP）检测肝癌细胞中CD147和β3GnT8的蛋白质相互作用;（4）lectin blot及western blot检测肝癌细胞中β3GnT8过表达细胞及下调表达后多聚乳糖胺水平和CD147糖基化水平;（5）体外transwell实验检测β3GnT8表达改变后对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响,体内裸鼠成瘤实验验证β3GnT8表达促进肝癌细胞成瘤能力;（6）凝集素芯片分析β3GnT8过表达对肝癌细胞中特征性糖链表达的影响;（7）MALDI-TOF质谱分析β3GnT8表达对肝癌细胞中N-糖链结构的影响。结果:（1）过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞多聚乳糖胺的表达、CD147糖基化水平;（2）过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞侵袭迁移能力,β3GnT8的表达可促进肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力;（3）β3GnT8与糖蛋白CD147在蛋白水平有相互结合作用,β3GnT8的表达可以促进高糖型CD147的表达;（4）凝集素结果显示β3GnT8的表达可增加肝癌细胞中LEL所识别的多聚乳糖胺结构,同时唾液酸化、岩藻糖修饰和N-聚糖的结构也相应增多;（5）质谱结果显示β3GnT8的表达在促进肝癌细胞恶性发展的同时N-糖基化程度也加强,同时可以促进潜在N-聚糖分支结构多聚乳糖胺的延伸。结论:β3GnT8的表达可以促进肝癌细胞的侵袭、迁移和成瘤性等恶性生物学表型;且能够促进糖蛋白CD147上糖基化水平以及细胞中多聚乳糖胺的表达丰度,CD147蛋白N-聚糖多聚乳糖胺结构的合成可能是受到β3GnT8的催化;β3GnT8可能是通过调控多聚乳糖胺结构的合成以及CD147糖基化水平来实现对肝癌细胞恶性表型的影响。第三部分:c-Jun对β3GnT8的转录调控研究目的:借助染色质免疫共沉淀和基因共转染技术研究转录因子c-Jun对β3GnT8基因表达的转录调控作用。方法:（1）染色质免疫共沉淀检测HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株中c-jun与β3GnT8的相互作用;（2）构建过表达及干扰c-jun的HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株;（3）过表达及干扰c-jun表达后检测β3GnT8、多聚乳糖胺、CD147糖基化、细胞侵袭及迁移能力;（4）过表达β3GnT8肝癌细胞株共转染c-jun干扰载体后检测细胞侵袭迁移能力和CD147糖基化及多聚乳糖胺表达变化。结果:（1）染色质免疫共沉淀结果显示,SK-Hep-1和HepG2细胞中转录因子c-Jun结合到β3GnT8基因的promoter区;（2）过表达及干扰c-jun能够调控β3GnT8的表达、CD147糖基化和多聚乳糖胺表达水平;上调及干扰c-jun可分别提高和降低肝癌细胞侵袭迁移能力;（3）共转染实验表明过表达β3GnT8稳转细胞转染c-jun干扰载体后会降低自身的表达水平,同时也降低了多聚乳糖胺、CD147糖基化水平和细胞侵袭迁移能力也。结论:（1）转录因子c-Jun可调控肝癌细胞的侵袭迁移能力;（2）转录因子c-Jun可调控β3GnT8表达,结合β3GnT8在肝癌中作用及c-Jun对肝癌细胞的侵袭迁移能力调控作用,可推断c-Jun调控肝癌细胞侵袭迁移可通过调控β3GnT8基因的表达,进一步通过多聚乳糖胺及CD147糖基化途径进行。
王永,陈晓鹏[4]（2012）在《克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析》文中研究表明目的:克隆猿猴病毒40（simian virus 40,SV40）增强子序列,修饰人乙酰肝素酶（heparanase,HPSE）基因核心启动子,并分析其活性。方法:PCR扩增SV40增强子序列并测序鉴定,酶切连接插入到pEGFP-HPSEp中指定克隆位点构建重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh。将原质粒、重组质粒和阳性对照质粒分别转染肝癌细胞（HepG2）、喉癌上皮细胞（Hep2）和慢性白血病细胞（K562）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析各质粒促转录活性。结果:扩增的SV40增强子序列长度为237 bp,序列分析与GeneBank收录一致。重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh经酶切和测序鉴定与预期结果一致,SV40增强子序列插入到指定克隆位点。荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-HPSEp-SV40enh的HepG2、Hep2和K562细胞均有较强荧光表达;转染pEGFP-HPSEp的细胞荧光强度均较弱。流式细胞术检测表明,pEGFP-HPSEp-SV40enh在HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.7%、6.0%和5.5%,pEGFP-HPSEp转染率分别为4.8%、13.4%和7.7%,两者比值均小于1。结论:成功克隆了SV40增强子序列并构建了重组质粒pEGFP-HPSEp-SV40enh,SV40增强子可以初步提高HPSE启动子的活性。
林月霞,吴志坚,袁茵,董斌,田素娟[5]（2011）在《人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达》文中认为目的构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况。方法以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基因,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定。用脂质体lipefectmine2000为介导转染至293T细胞中,观察该基因在293T细胞中的表达情况。结果经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1/HPA基因在771 bp处碱基c突变成t;在919 bp处碱基a突变成g,两处突变均为同义突变。该基因转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下可见转染的293T细胞有绿色荧光蛋白表达。结论成功构建人乙酰肝素酶基因的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,并在人293T细胞中成功表达。
汪勤俭[6]（2009）在《《第三军医大学学报》2009年第31卷总目次》文中研究表明
陈泓[7]（2008）在《乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究》文中认为卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时己属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式,发现更新更好的化疗药物,增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。所以,寻找新的诊断方法和新的治疗手段是目前卵巢癌研究的重点。作为一种与粘附和渗出等肿瘤浸润转移必须过程密切相关的物质,乙酰肝素酶（HPSE）在卵巢癌的浸润转移中起着举足轻重的作用。本课题通过一系列体外实验,对HPSE在卵巢癌浸润转移过程中的作用及其机制做了深入的研究,并且构建了HPSE基因慢病毒表达和RNAi载体,为今后的基因靶向治疗奠定了基础。乙酰肝素酶基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究目的:了解乙酰肝素酶对卵巢癌细胞功能的影响,分析HPSE在卵巢癌浸润转移过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建HPSE基因真核表达载体后,将其转染无HPSE基因表达的卵巢癌细胞株A2780,G418筛选后经RT-PCR及western-blot鉴定确认获得稳定转染的HPSE/A2780细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、黏附能力、细胞侵袭转移能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达HPSE蛋白的卵巢癌细胞株。流式细胞仪对细胞检测结果显示A2780-HPSE组处于增殖状态（S+G2+M）的细胞为46.5%,G1期为53.5%,对照组则相应为54.5%和45.6%,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。HPSE组和对照组的生长曲线几近重合。两组的克隆形成率差异无统计学意义。A2780细胞在转染前后粘附率分别为0.5183±0.0796和0.7283±0.08931,比较有统计学意义（p=0.002）。Transwell小室实验发现转染HPSE基因后的A2780细胞的侵袭能力明显提高,与对照组比较有统计学意义（p=0.003）。而其迁移能力未受影响（p=0.618）。结论:细胞功能实验结果表明,HPSE能够增强卵巢癌A2780细胞的侵袭能力,降低其黏附能力;对增殖能力和迁移能力均无影响。RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外体实验研究目的:通过构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞,检测其对HPSE基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,反面验证HPSE基因的功能。方法:针对HPSE mRNA的不同区域构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳转细胞株,western-blot检验HPSE蛋白受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达株western-blot检验其HPSE蛋白表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,p=0.059,比较无统计学意义。侵袭能力实验中,干扰组吸光值为0.5697±0.106,对照组为0.8097±0.333,干扰组与对照组相比无统计学意义（p=0.233）。细胞粘附能力检测,干扰组0.7533±0.07685,对照组0.5833±0.11994,两者相比有统计学意义（p=0.015）。侵袭能力实验干扰组为0.69±0.085,对照组为1.091±0.277,两者相比有统计学意义（p=0.015）。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,使卵巢癌细胞侵袭和黏附能力降低。HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建目的:采用第二代和第三代慢病毒载体,分别构建HPSE基因的慢病毒表达载体和shRNA慢病毒干扰载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法:首先扩增HPSE全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序BLAST检索,并将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48小时后提取mRNA,RT-PCR检验HPSE基因表达情况。其次,选取干扰效果最佳的siRNA,设计shRNA结构,退火反应形成双链后与慢病毒载体pSico连接并送测序。结果:重组慢病毒质粒HPSE-pWPI测序结果经BLAST,与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。重组慢病毒干扰载体pSico/HPSE测序结果与设计的shRNA序列完全一致。结论:成功的构建了HPSE基因的重组慢病毒系统和慢病毒干扰系统。为今后的HPSE靶向治疗奠定了基础。
朱辉[8]（2006）在《食管癌前病变及癌演进过程中乙酰肝素酶及其抑制剂作用的研究》文中进行了进一步梳理食管癌为我国常见的恶性肿瘤之一。近年来,尽管手术、放疗、化疗等综合治疗使食管癌的术后生存得到了很大的改善,但远达不到理想的程度。临床上,多数食管癌患者就诊时即已为中、晚期。由于有术后转移和复发,术后五年生存率一直较低。肿瘤侵袭转移必须突破细胞外基质（ECM）和血管内皮下基膜（BM）屏障,硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）是细胞外基质和血管基膜的主要成分。乙酰肝素酶（Hpa）是一种葡萄糖醛酸内切酶,也是目前发现的唯一可以降解HSPG的酶,它通过切断硫酸乙酰肝素蛋白多糖侧链（HS）以降解细胞外基质和血管基膜,并且能释放和活化HSPG结合型的生长因子（如bFGF,VEGF等）诱导血管生成,从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。随着Hpa与肿瘤侵袭转移关系研究的深入进行,Hpa将成为肿瘤治疗的新靶点。本课题从五个方面针对Hpa和食管鳞癌的关系进行系统研究:1.Hpa在食管鳞状细胞癌中的表达和与临床病理特征的关系;2.Hpa在正常食管上皮、食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌中表达情况研究;3.人工合成针对Hpa基因启动子区的反义寡合苷酸（Hpa ASODN）脂质体法转染体外培养的人食管鳞癌细胞TE-13,观察转染后细胞Hpa基因和蛋白表达和食管癌细胞侵袭力的变化;4.研究Hpa抑制剂PI-88对TE-13细胞增殖和Hpa基因和蛋白表达的影响,并且联合应用PI-88与Hpa ASODN观察对食管癌细胞侵袭力的影响;5.应用PI-88和Hpa ASODN观察对TE-13细胞体内生长、Hpa表达和肿瘤血管生成的影响。探讨Hpa在食管癌发生发展中的作用,为以Hpa为靶的食管癌治疗奠定理论基础。第一部分乙酰肝素酶在食管鳞状细胞癌组织中的表达与意义目的:对食管鳞癌患者术后癌组织标本中Hpa的表达状况进行研究,分析Hpa表达与食管鳞癌临床病理因素的关系。
田志宏[9]（2005）在《Hpa和b-FGF在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义》文中指出目的: 原发性肝细胞肝癌（ primary hepatocellular carcinoma,PHCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,侵袭力强,易早期发生肝内转移,而且手术治疗后复发率较高。研究资料表明,肝癌侵袭转移机制是由于肿瘤细胞突破了细胞外基质（extracellular matrix,ECM）和血管基底膜以及肿瘤新生血管的形成。近年来,对肿瘤生物学特性进行了更为广泛深入的研究, 其中对乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b-FGF）与肿瘤微血管形成关系的研究成为新的热点。Hpa 是一种内切糖苷酶,可以破坏ECM和基底膜的完整性,从而有利于肿瘤细胞穿越ECM 和血管壁,促进其侵袭和转移。b-FGF 是成纤维细胞生长因子家族中的一员,被认为是极有活性的血管生成因子之一。研究表明,b-FGF 与肿瘤的关系特别是与肿瘤血管生成的关系密切。本实验通过对Hpa、b-FGF 的蛋白水平表达和微血管密度（microvessel density,MVD）的检测,探讨二者与PHCC 发生和侵袭转移关系,并分析其作为PHCC 侵袭转移预测指标的价值,为通过干预肿瘤细胞侵袭ECM 和基底膜及血管生成来治疗肿瘤,预防复发转移,评估预后提供理论基础和实验依据。方法: 选用45 例PHCC 癌组织和23 例癌旁组织标本,
郑壬鸿,王为忠,梁克明[10]（2004）在《人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析》文中指出目的 :研究乙酰肝素酶在人肝癌细胞生长和转移中的作用 ,并自人肝癌组织中克隆该酶cDNA全长编码片段 .方法 :提取人肝癌细胞总RNA ,以RT PCR方法获取了乙酰肝素酶cDNA片段 ,将其与pGEM TEasy载体连接 ,进行克隆及酶切鉴定 .结果 :序列分析表明 ,与GenBank中的人乙酰肝素酶全长cDNA序列比较 ,仅 1 6个碱基不同 ,同源性为0 .991 .结论 :自人肝癌组织中成功克隆了乙酰肝素酶cDNA全长编码片段 .
二、人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）调控奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的miRNAs功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 羊奶脂肪酸的营养价值 |
| 1.2 乳腺脂肪酸代谢 |
| 1.2.1 脂肪酸的从头合成 |
| 1.2.2 脂肪酸的去饱和与延伸 |
| 1.2.3 脂肪酸的摄取、转运及活化 |
| 1.2.4 脂肪酸的氧化 |
| 1.2.5 甘油三酯(TAG)合成与脂滴分泌 |
| 1.3 Micro RNA(miRNA)的合成及作用机制 |
| 1.3.1 miRNA生物合成过程 |
| 1.3.2 miRNA的作用方式 |
| 1.3.3 miRNA在乳腺脂代谢中的功能 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas9 系统的发现与发展 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 系统的DNA双链断裂修复机制 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 系统在miRNAs功能研究中的应用 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9 系统在细胞水平miRNAs功能研究中的应用 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9 系统在活体水平miRNAs功能研究中的应用 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 山羊乳脂代谢相关miRNAs及其宿主基因表达水平与羊奶脂肪酸成分的相关性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料及主要仪器 |
| 2.1.2 试验动物及样品采集 |
| 2.1.3 总RNA提取及反转录荧光定量PCR检测 |
| 2.1.4 羊奶脂肪酸成分分析 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乳腺组织中乳脂代谢相关miRNAs与羊奶脂肪酸成分相关性分析 |
| 2.2.2 乳腺组织中乳脂代谢相关miRNAs宿主基因表达水平与羊奶脂肪酸成分相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-145 通过INSIG1 基因调控山羊乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 3.1.2 细胞培养与处理 |
| 3.1.3 Cas9-sgRNA载体构建 |
| 3.1.4 载体或siRNA转染GMEC细胞,提取基因组DNA并进行T7EN1 分析 |
| 3.1.5 GMEC单克隆鉴定及脱靶效应分析 |
| 3.1.6 分离RNA并进行RT-qPCR检测 |
| 3.1.7 蛋白提取与Western blot分析 |
| 3.1.8 细胞总甘油三酯和总胆固醇测定 |
| 3.1.9 细胞脂肪酸提取及分析 |
| 3.1.10 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 sgRNAs敲除效率分析及单克隆筛选 |
| 3.2.2 山羊乳腺上皮细胞sgRNA1的脱靶效应分析 |
| 3.2.3 miR-145敲除抑制pri-miRNA成熟且促进靶基因INSIG1 表达 |
| 3.2.4 miR-145敲除抑制甘油三酯、胆固醇合成并影响脂肪酸含量 |
| 3.2.5 miR-145敲除影响脂肪酸代谢关键基因表达 |
| 3.2.6 miR-145 通过INSIG1 基因调节细胞中的脂肪酸代谢 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-24靶向INSIG1与FASN基因调控乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 4.1.2 细胞培养与处理 |
| 4.1.3 Cas9-sgRNAs载体构建 |
| 4.1.4 载体或siRNA转染GMEC细胞,提取基因组DNA并进行T7EN1 分析 |
| 4.1.5 sgRNAs在GMEC单克隆中的脱靶效应分析 |
| 4.1.6 分离RNA并进行RT-qPCR检测 |
| 4.1.7 蛋白质提取与Western blot分析 |
| 4.1.8 细胞内脂滴、甘油三酯和胆固醇测定 |
| 4.1.9 细胞脂肪酸提取及分析 |
| 4.1.10 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 miR-24敲除细胞中基因编辑效率及序列分析 |
| 4.2.2 sgRNAs在山羊乳腺上皮细胞中的脱靶效应分析 |
| 4.2.3 miR-24敲除抑制pri-miRNA成熟且促进靶基因INSIG1与FASN表达 |
| 4.2.4 miR-24敲除抑制脂滴、甘油三酯合成与胆固醇的合成并影响脂肪酸含量 |
| 4.2.5 miR-24敲除影响脂肪酸代谢关键基因表达 |
| 4.2.6 miR-24通过INSIG1基因上调脂滴、甘油三酯及胆固醇含量并影响脂肪酸组成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-130b靶向PGC1α基因并调控乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 5.1.2 细胞培养与处理 |
| 5.1.3 Cas9-sgRNAs载体构建 |
| 5.1.4 载体或siRNA转染GMEC细胞,提取基因组DNA并进行T7EN1 分析 |
| 5.1.5 sgRNAs在GMEC单克隆中的脱靶效应分析 |
| 5.1.6 分离RNA并进行RT-qPCR检测 |
| 5.1.7 蛋白质提取与Western blot分析 |
| 5.1.8 细胞内脂滴、甘油三酯和胆固醇测定 |
| 5.1.9 细胞脂肪酸提取及分析 |
| 5.1.10 数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 miR-130b敲除细胞中基因编辑效率及序列分析 |
| 5.2.2 sgRNAs在山羊乳腺上皮细胞中的脱靶效应分析 |
| 5.2.3 miR-130b敲除抑制pri-miRNA成熟且促进靶基因PGC1α表达 |
| 5.2.4 miR-130b敲除促进脂滴、甘油三酯与胆固醇合成并影响脂肪酸含量 |
| 5.2.5 miR-130b敲除影响脂肪酸代谢关键基因表达 |
| 5.2.6 miR-130b敲除细胞中干扰PGC1α基因促进脂滴、甘油三酯、胆固醇合成并影响脂肪酸含量 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 存在的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）PKM2通过Ectosome形式外泌的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 肝细胞癌 |
| 1.1 诱发肝癌因素 |
| 1.1.1 病毒诱导肝癌发生 |
| 1.1.2 酒精诱导肝癌的发生 |
| 1.1.3 黄曲霉B1诱导肝癌的发生 |
| 1.2 肝癌发生机制 |
| 1.2.1 VEGF受体信号通路 |
| 1.2.2 Wnt/β-Catenin通路 |
| 1.2.3 PI3K/AKT/mTOR通路 |
| 1.2.4 EGFR、IGF和HGF/c-MET通路 |
| 1.3 肝癌治疗策略 |
| 2 PKM2 |
| 2.1 PKM2的结构 |
| 2.2 PKM2与肝癌 |
| 2.2.1 PKM2在肝癌中的表达 |
| 2.2.2 PKM2与肝癌的相关信号通路 |
| 3 SUMO修饰信号通路 |
| 3.1 SUMO蛋白家族 |
| 3.2 E1激活酶 |
| 3.3 E2结合酶 |
| 3.4 E3连接酶 |
| 3.5 SUMO化和去SUMO化过程 |
| 3.6 SUMO化功能 |
| 4 胞外囊泡 |
| 4.1 细胞囊泡生物起源 |
| 4.1.1 Exosome的生物起源 |
| 4.1.2 Ectosome生物起源 |
| 4.2 胞外囊泡内含物 |
| 4.2.1 内含物-蛋白 |
| 4.2.2 内含物-RNA |
| 4.2.3 内含物-DNA |
| 4.3 运输必需内体分选复合物(ESCRT) |
| 4.3.1 ESCRT参与调控MVB出芽 |
| 4.3.2 ESCRT参与调控HIV出芽 |
| 4.3.3 ESCRT参与调控ARMM出芽 |
| 4.4 ARRDC1调节微囊泡的形成 |
| 4.5 EVs在癌症中的功能 |
| 4.5.1 肿瘤-基质细胞的交流 |
| 4.5.2 基质-肿瘤细胞间的交流 |
| 4.5.3 肿瘤-肿瘤之间的交流 |
| 4.6 EVs和疾病 |
| 4.6.1 EVs在疾病中的作用 |
| 4.6.2 EVs生物标志物和治疗剂 |
| 5 本课题研究目的、思路及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 抗体和试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 质粒载体及菌株 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子克隆 |
| 2.1.1 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.1.2 质粒转化 |
| 2.1.3 质粒提取 |
| 2.1.4 表达质粒的构建 |
| 2.2 细胞实验 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.3 蛋白提取与Western Blot |
| 2.4 免疫共沉淀 |
| 2.5 Ectosomes提取 |
| 2.6 细胞免疫荧光观察 |
| 2.7 细胞膜蛋白的提取 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 PKM2的SUMOylation促进PKM2进入ectosomes |
| 2 ARRDC1对PKM2外泌起着关键的调控作用 |
| 2.1 ARRDC1与PKM2结合 |
| 2.2 ARRDC1促进PKM2进入ectosomes |
| 2.3 ARRDC1~(F88L)突变体不能促进PKM2外泌 |
| 2.4 ARRDC1~(F88L)突变体不影响与PKM2的结合 |
| 3 ARRDC1影响PKM2的SUMOylation以及SUMOylation促进PKM2定位质膜过程 |
| 3.1 ARRDC1不影响PKM2的SUMOylation |
| 3.2 ARRDC1不影响PKM2定位质膜 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）β3GnT8及其催化合成的多聚乳糖胺结构在肝癌恶性生物学表型中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 β3GnT8及其相关基因,多聚乳糖胺在肝癌中的表达差异分析 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 β3GnT8表达对肝细胞癌恶性生物学表型及其糖基化的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 c-Jun对β3GnT8的转录调控研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文及专利 |
| 本课题受资助情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株、主要试剂和仪器 |
| 1.2 SV40增强子的引物设计 |
| 1.3 SV40增强子PCR扩增与纯化 |
| 1.4 SV40增强子的鉴定和序列分析 |
| 1.5 构建重组质粒pEGFP- HPSEp- SV40enh |
| 1.6 重组质粒载体pEGFP- HPSEp- SV40enh的真核表达与功能鉴定 |
| 2 结 果 |
| 2.1 SV40增强子PCR扩增 |
| 2.2 SV40增强子的测序鉴定 |
| 2.3 EcoRⅠ和SalⅠ双酶切 |
| 2.4 重组质粒pEGFP- HPSEp- SV40enh单酶切鉴定 |
| 2.5 重组质粒pEGFP- HPSEp- SV40enh的测序鉴定 |
| 2.6 重组质粒pEGFP- HPSEp- SV40enh在人肿瘤细胞中的促转录活性 |
| 3 讨 论 |
（7）乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断治疗进展(文献综述) |
| 1.卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要步骤 |
| 1.1 原发恶性肿瘤的浸润 |
| 1.1.1 细胞的转化和肿瘤细胞的增殖 |
| 1.1.2 肿瘤细胞的分离 |
| 1.1.3 粘附并破坏细胞外基质和基底膜 |
| 1.1.4 肿瘤细胞运动 |
| 1.2.恶性肿瘤细胞的迁移 |
| 1.2.1 恶性肿瘤细胞粘附到脉管基底膜 |
| 1.2.2 穿过脉管壁进入循环系统 |
| 1.3 恶性肿瘤细胞的转移 |
| 1.3.1 逃脱免疫监视在循环系统中生长 |
| 1.3.2 锚定粘附并破坏脉管壁 |
| 1.3.2.1 锚定粘附 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞逸出循环系统 |
| 1.3.3 转移灶的形成 |
| 1.3.4 转移的休眠 |
| 1.3.5 肿瘤转移的器官选择性 |
| 2 卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要途径 |
| 2.1 腹腔种植 |
| 2.2 淋巴转移 |
| 2.2.1 卵巢的淋巴系统 |
| 2.2.2 恶性卵巢肿瘤的淋巴转移机制 |
| 2.2.3 卵巢恶性肿瘤的淋巴转移规律 |
| 2.3 影响卵巢肿瘤淋巴结转移的相关因素 |
| 2.3.1 临床期别 |
| 2.3.2 病理分型 |
| 2.3.3 细胞分化程度 |
| 2.3.4 原发病灶大小 |
| 2.3.5 腹水性状 |
| 3 卵巢恶性肿瘤浸润转移主要分子机理 |
| 3.1 基因调控与卵巢恶性肿瘤的浸润转移 |
| 3.1.1 肿瘤转移基因 |
| 3.1.2 肿瘤转移抑制基因 |
| 3.2 黏附因子与卵巢恶性肿瘤的浸润转移 |
| 3.2.1 钙粘蛋白家族 |
| 3.2.2 整合素 |
| 3.2.3 免疫球蛋白超家族 |
| 3.2.4 选择素家族 |
| 3.2.5 CD44 |
| 3.3 血管的生成与卵巢恶性肿瘤的浸润转移 |
| 3.3.1 血管内皮生长因子 |
| 3.3.2 碱性成纤维细胞生长因子 |
| 3.4 蛋白溶解酶与卵巢恶性肿瘤 |
| 3.4.1 基质金属蛋白酶 |
| 3.4.2 纤维蛋白溶解酶及其调节因子 |
| 3.4.3 组织蛋白酶 |
| 3.4.4 乙酰肝素酶 |
| 4 卵巢恶性肿瘤浸润转移的临床表现及特点 |
| 4.1 盆、腹腔种植转移 |
| 4.1.1 子宫及附件 |
| 4.1.2 腹膜 |
| 4.1.3 肠道 |
| 4.1.4 肝、脾 |
| 4.1.5 大网膜 |
| 4.2 淋巴结转移 |
| 5 卵巢恶性肿瘤浸润转移的物理诊断 |
| 5.1 超声检查在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值 |
| 5.2 CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值 |
| 5.3 MRI在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值 |
| 5.4 PET-CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值 |
| 5.4.1 PET-CT的原理 |
| 5.4.2 PET-CT与卵巢恶性肿瘤浸润转移的诊断 |
| 6 卵巢恶性肿瘤浸润转移的分子诊断 |
| 6.1 卵巢恶性肿瘤浸润转移的基因诊断 |
| 6.1.1 C-erbB-2 |
| 6.1.2 nm23基因 |
| 6.1.3 p53基因 |
| 6.2 肿瘤标志物 |
| 6.2.1 肿瘤相关抗原 |
| 6.2.2 激肽释放酶家族 |
| 7 卵巢恶性肿瘤浸润转移的治疗 |
| 7.1 手术 |
| 7.1.1 原发卵巢恶性肿瘤FIGO分期 |
| 7.1.2 术后残余灶与预后的关系 |
| 7.1.3 大网膜切除术在卵巢癌治疗中的价值 |
| 7.1.3.1 卵巢癌大网膜转移的发生率 |
| 7.1.3.2 卵巢癌大王膜切除与预后的关系 |
| 7.1.3.3 大网膜切除范围 |
| 7.1.4 腹后腔淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 7.1.4.1 卵巢癌腹后腔淋巴结转移率 |
| 7.1.4.2 卵巢癌腹后腔淋巴结转移与预后 |
| 7.1.4.3 腹后腔淋巴结清扫的意义 |
| 7.1.5 阑尾切除在卵巢癌治疗中的意义 |
| 7.1.5.1 卵巢癌阑尾转移率 |
| 7.1.5.2 卵巢癌阑尾切除与预后 |
| 7.1.6 脾等远处转移灶切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 7.1.6.1 脾切除术 |
| 7.1.6.2 横膈膜手术 |
| 7.1.6.3 卵巢癌肠道转移瘤手术 |
| 7.2 卵巢癌的化学治疗 |
| 7.2.1 晚期卵巢癌化疗的适应症 |
| 7.2.1.1 先期化疗 |
| 7.2.1.2 术后化疗 |
| 7.2.1.3 腹腔化疗 |
| 7.2.2 化疗药物、方案及途径 |
| 7.2.2.1 化疗药物 |
| 7.2.2.2 化疗方案及给药途径 |
| 7.3 晚期卵巢癌化疗前瞻性多中心随机的临床验证 |
| 7.3.1 铂类+紫杉醇 |
| 7.3.2 多西紫杉醇与紫杉醇 |
| 7.3.3 表柔比星 |
| 7.3.4 拓扑替肯 |
| 7.4 晚期卵巢癌的靶向治疗 |
| 7.4.1 抗体介导的靶向治疗 |
| 7.4.2 信号传导通路抑制剂 |
| 7.4.3 酪氨酸激酶抑制剂 |
| 7.4.4 抗血管生成药物 |
| 7.4.5 基因治疗 |
| 7.4.5.1 多重耐药基因 |
| 7.4.5.2 启动子 |
| 7.4.5.3 抑癌基因 |
| 7.4.5.4 分子化疗 |
| 7.4.6 光动力学治疗 |
| 8 乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的作用 |
| 8.1 乙酰肝素酶的分子结构 |
| 8.1.1 HPSE基因结构及定位 |
| 8.1.2 HPSE蛋白质结构 |
| 8.2 乙酰肝素酶的主要生物学作用 |
| 8.2.1 细胞外基质的结构 |
| 8.2.2 HPSE的生物学功能 |
| 8.3 乙酰肝素酶的分子调节机制 |
| 8.3.1 细胞因子调节 |
| 8.3.2 启动子去甲基化 |
| 8.3.3 转录因子调控 |
| 8.3.4 微环境的PH值 |
| 8.3.5 HSPG内化调控 |
| 8.3.6 激素 |
| 8.4 乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的生物学作用 |
| 8.4.1 HPSE在各种恶性肿瘤的表达情况 |
| 8.4.2 HPSE在肿瘤浸润转移中的作用 |
| 9 乙酰肝素酶在卵巢癌浸润转移中的作用机理 |
| 9.1 HPSE在卵巢癌中的表达 |
| 9.2 HPSE表达与卵巢癌组织学类型和组织分化的关系 |
| 9.3 HPSE在卵巢癌浸润转移中可能的作用机理 |
| 9.3.1 HPSE降解细胞外基质 |
| 9.3.2 HPSE促进卵巢癌血管生成 |
| 10 本研究的目的和意义 |
| 第二章 乙酰肝素酶基因全长扩增和真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 标本 |
| 1.1.2 质粒与菌株 |
| 1.1.3 主要试剂及配制 |
| 1.1.3.1 试剂 |
| 1.1.3.2 试剂的配制 |
| 1.1.4 仪器 |
| 1.1.5 器具的处理 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.1 HPSE引物 |
| 1.2.2 内参基因β-actin引物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 卵巢癌组织总RNA的提取 |
| 1.3.2 cDNA第一链的合成 |
| 1.3.3 HPSE全长扩增 |
| 1.3.4 PCR产物的纯化与回收 |
| 1.3.5 感受态大肠杆菌的制备 |
| 1.3.6 PCR产物的酶切反应及回收 |
| 1.3.7 质粒的制备 |
| 1.3.8 目的基因与载体的连接 |
| 1.3.9 连接产物转化感受态大肠杆菌 |
| 1.3.10 挑选阳性克隆 |
| 1.3.11 质粒的快速提取 |
| 1.3.12 PCR鉴定 |
| 1.3.13 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 1.3.14 重组质粒测序 |
| 1.3.15 测序结果的序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 卵巢癌组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.2 β-actin内参检测cDNAPCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.3 HPSE全长扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.4 HPSE全长PCR产物测序结果 |
| 2.5 携带HPSE基因的pcDNA3.1与原质粒pcDNA3.1琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.6 重组质粒HPSE-pcDNA3.1的PCR鉴定及酶切鉴定结果 |
| 2.7 携带HPSE基因的pcDNA.1测序结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HPSE基因的结构特点及测序结果分析 |
| 3.2 pcDNA3.1载体选择的意义 |
| 3.3 HPSE-pcDNA3.1真核载体构建的意义 |
| 第三章 乙酰肝素酶介导的卵巢癌上皮细胞系浸润转移体外实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、菌株与细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂及配制 |
| 1.1.2.1 试齐 |
| 1.1.2.2 试剂的配制 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 转染细胞系的选择 |
| 1.3.2 脂质体介导的HPSE-pcDNA3.1质粒的转染 |
| 1.3.3 携带HPSE基因的A2780细胞的筛选 |
| 1.3.4 携带HPSE基因的A2780细胞的克隆 |
| 1.3.5 RT-PCR检测转染后A2780细胞的HPSEmRNA表达 |
| 1.3.6 western-blot检测HPSE蛋白表达 |
| 1.3.7 细胞生物学特性实验 |
| 1.3.7.1 细胞生长曲线测定(MTT法) |
| 1.3.7.2 流式细胞仪检测细胞生长周期变化 |
| 1.3.7.3 细胞集落形成实验 |
| 1.3.7.4 细胞体外迁移能力测定 |
| 1.3.7.5 细胞体外侵袭能力测定 |
| 1.3.7.6 细胞体外黏附能力测定 |
| 1.3.8 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况 |
| 2.2 转染条件的确定 |
| 2.3 绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1阳性对照结果 |
| 2.4 筛选A2780细胞的G418浓度的确定 |
| 2.5 G418筛选结果 |
| 2.6 筛选出的A2780细胞RT-PCR检测HPSE表达情况 |
| 2.7 筛选出的A2780细胞western-blot检测HPSE蛋白表达结果 |
| 2.8 筛选出的A2780细胞流式细胞仪检测细胞生长周期结果 |
| 2.9 细胞集落形成实验结果 |
| 2.10 筛选出的A2780细胞生长曲线结果 |
| 2.11 细胞体外迁移能力的测定结果 |
| 2.12 细胞体外侵袭能力测定结果 |
| 2.13 细胞体外黏附能力测定结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株 |
| 1.1.2 主要试剂及配制 |
| 1.1.3 引物的设计与合成 |
| 1.1.4 shRNA载体的设计与合成 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转染细胞系的选择 |
| 1.2.2 脂质体介导的shRNA载体转染SKOV3细胞 |
| 1.2.3 对HPSE沉默效果最佳的shRNA的筛选 |
| 1.2.3.1 转染后SKOV3细胞总RNA提取 |
| 1.2.3.2 SYBR GREE1实时定量PCR检测六种干扰载体转染SKOV3细胞后HPSE基因表达 |
| 1.2.4 转染shRNA载体的SKOV3细胞的筛选 |
| 1.2.5 筛选出的SKOV3细胞的克隆 |
| 1.2.6 western-blot检测HPSE蛋白表达 |
| 1.2.7 细胞生物学特性实验 |
| 1.2.7.1 细胞生长曲线测定(MTT法) |
| 1.2.7.2 细胞集落形成实验 |
| 1.2.7.3 细胞体外迁移能力测定 |
| 1.2.7.4 细胞体外侵袭能力测定 |
| 1.2.7.5 细胞体外黏附能力测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况 |
| 2.2 shRNA转染SKOV3细胞48小时后在荧光显微镜下结果 |
| 2.3 构建好的GADPH-pTG-T质粒测序结果 |
| 2.4 不同shRNA干扰载体对SKOV3细胞HPSE抑制效果的检测结果 |
| 2.5 标准品QRT-PCR扩增标准曲线结果 |
| 2.6 标准品测定的实时荧光扩增融解曲线结果 |
| 2.7 转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达情况结果 |
| 2.8 转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达的结果统计学分析结果 |
| 2.9 转染后SKOV3细胞筛选后14天结果 |
| 2.10 western-blot检测HPSE蛋白表达结果 |
| 2.11 细胞生长曲线结果 |
| 2.12 细胞集落形成实验结果 |
| 2.13 细胞体外迁移能力的测定结果 |
| 2.14 细胞体外侵袭能力测定结果 |
| 2.15 细胞体外黏附能力测定结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株、细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 HPSE引物的的设计与合成 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 HPSE慢病毒表达系统的构建 |
| 1.3.1.1 HPSE全长的扩增 |
| 1.3.1.2 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.3.1.3 SpeI酶切PCR产物及回收 |
| 1.3.1.4 PCR产物磷酸化 |
| 1.3.1.5 载体的准备 |
| 1.3.1.6 HPSE与pWPI的连接 |
| 1.3.1.7 连接产物转化大肠杆菌HB101_ |
| 1.3.1.8 挑选阳性克隆 |
| 1.3.1.9 质粒DNA的提取 |
| 1.3.1.10 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.3.1.11 重组质粒的测序 |
| 1.3.1.12 测序结果分析 |
| 1.3.1.13 HPSE-pWPI转染293T |
| 1.3.1.14 转染后mRNA提取并转录为cDNA |
| 1.3.1.15 HPSE-pWPI转染的293THPSE表达 |
| 1.3.2 HPSE RNAi慢病毒载体的构建 |
| 1.3.2.1 shRNA的设计 |
| 1.3.2.2 插入片段的退火 |
| 1.3.2.3 HpaI和XhoI双酶切pSico |
| 1.3.2.4 连接反应 |
| 1.3.2.5 连接产物转化大肠杆菌 |
| 1.3.2.6 挑选阳性克隆 |
| 1.3.2.7 质粒DNA的提取 |
| 1.3.2.8 重组质粒的测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 HPSE全长扩增产物电泳结果 |
| 2.2 HPSE和pWPI连接产物转化大肠杆菌后涂板生长结果 |
| 2.3 阳性克隆提取的质粒电泳结果 |
| 2.4 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 2.5 重组质粒的测序结果 |
| 2.6 HPSE-pWPI转染293T结果 |
| 2.7 HPSE-pWPI转染后HPSE表达结果 |
| 2.8 RNAi重组质粒提取结果 |
| 2.9 RNAi重组质粒测序结果 |
| 3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
（8）食管癌前病变及癌演进过程中乙酰肝素酶及其抑制剂作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 食管癌前病变及癌演进过程中乙酰肝素酶及其抑制剂作用的研究 |
| 引言 |
| 第一部分 乙酰肝素酶在食管鳞状细胞癌组织中的表达与意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶在食管鳞癌演发过程中的表达意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙酰肝素酶反义寡核苷酸沉默乙酰肝素酶抑制食管鳞癌细胞株TE-13 侵袭能力 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Hpa抑制剂PI-88抑制人食管鳞癌细胞株TE-13侵袭的体外研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 乙酰肝素酶抑制剂对裸鼠人食管鳞癌移植瘤的体内抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 综述一 乙酰肝素酶与肿瘤关系研究进展 |
| 综述二 乙酰肝素酶抑制剂——PI-88 研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Hpa和b-FGF在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 Hpa和b-FGF在原发性肝癌中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Hpa 和b-FGF 与肿瘤侵袭转移的关系 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
四、人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]调控奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的miRNAs功能验证[D]. 黄炼. 西北农林科技大学, 2021
- [2]PKM2通过Ectosome形式外泌的分子机制研究[D]. 罗丽娟. 厦门大学, 2019(09)
- [3]β3GnT8及其催化合成的多聚乳糖胺结构在肝癌恶性生物学表型中的作用研究[D]. 刘春亮. 苏州大学, 2017(01)
- [4]克隆猿猴病毒40增强子修饰人乙酰肝素酶基因核心启动子及活性分析[J]. 王永,陈晓鹏. 东南大学学报(医学版), 2012(01)
- [5]人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达[J]. 林月霞,吴志坚,袁茵,董斌,田素娟. 广东药学院学报, 2011(04)
- [6]《第三军医大学学报》2009年第31卷总目次[J]. 汪勤俭. 第三军医大学学报, 2009(24)
- [7]乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究[D]. 陈泓. 广西医科大学, 2008(10)
- [8]食管癌前病变及癌演进过程中乙酰肝素酶及其抑制剂作用的研究[D]. 朱辉. 河北医科大学, 2006(11)
- [9]Hpa和b-FGF在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义[D]. 田志宏. 河北医科大学, 2005(06)
- [10]人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析[J]. 郑壬鸿,王为忠,梁克明. 第四军医大学学报, 2004(01)