一、RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析（论文文献综述）
张德荣[1]（2019）在《脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究》文中指出脂肪性状作为绵羊肉品质最重要的一个经济性状,在绵羊体内维持着正常生命活动以及在生理代谢中发挥着重要的作用。作为含量最高、唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子,脂联素在体内参与调节脂肪与糖代谢、维持能量平衡及抵抗胰岛素、抗消炎反应等生理过程。目前,有关绵羊脂联素及其受体基因在脂肪分化过程中作用的报道较少。本研究以兰州大尾羊为研究对象,利用RACE技术首次克隆了绵羊脂联素及其受体基因的全长c DNA序列,运用实时荧光定量PCR技术（q PCR）分析了绵羊脂联素基因、脂联素受体1和脂联素受体2基因在绵羊15种组织的表达规律;分离培养绵羊肌内、皮下和内脏组织的前脂肪细胞,研究了前体脂肪细胞在分化过程中脂联素及其受体、生脂基因脂蛋白脂肪酶（LPL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）、脂肪酸合成酶（FAS）及过氧化物激活酶增值物受体α/γ（PPARα/γ）的表达;运用过表达和si RNA技术分析了脂联素受体对肌内前体脂肪细胞生脂的影响及相关生脂基因表达影响;应用pull-down技术和质谱分析,初步筛选出了与脂联素受体蛋白互作的蛋白,以期阐明绵羊脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理,为现代肉羊育种体系中优良性状的筛选与利用提供理论依据。研究结果表明:1.应用RACE技术首次克隆出绵羊脂联素2010bp（KJ159213）、脂联素受体1基因2035bp（KJ159212）和脂联素受体2基因1809bp（KF921623）全长c DNA;q PCR研究了三种基因在绵羊肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、皮下脂肪、内脏脂肪、肌肉、卵巢、睾丸、大肠、小肠、间脑、瘤胃和皱胃15种组织中的特异性表达,APN肌肉组织中表达最高,心脏和皱胃表达量次之;Adipo R1在皮下组织和内脏脂肪组织中的表达量最高,其次是脾脏、心脏、小肠;Adipo R2在皮下组织和内脏组织中表达量最高,在其他组织中表达量均很低,几乎不表达。2.应用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得绵羊肝脏和皮下组织前体脂肪细胞,并用DMEM/F12+胰岛素（5μg/m L）+转铁蛋白（50μg/m L）+亚硒酸钠（5ng/m L）+氢化可的松（50ng/m L）将其诱导11天后能分化为内脏和皮下脂肪细胞;应用II型胶原酶消化法和差速贴壁法分离获得绵羊背最长肌肌内前体脂肪细胞,被DMEM/F12+IBMX（0.5 mmol/L）+DEX（1μmol/L）+Insulin（10 mg/L）诱导10 d后分化为肌内脂肪细胞。3种前体脂肪细胞分化过程中脂肪生成量逐渐增加,生长曲线均呈“S”型,第39 d为指数生长期。绵羊内脏和皮下前体脂肪细胞中LPL和PPARγ分化第7d和11d显着高于第3d（p<0.05）,FAS基因第7天最高;脂联素及其受体基因在两种细胞中的表达水平差异不显着（p>0.05）,但三个基因之间Adipo R2表达量最高（35.27）,Adipo R1居中（5.24）,APN最低（0.60）。类似地,绵羊肌内脂肪细胞中Adipo R2表达量极显着高于Adipo R1和APN（p<0.01）,表达趋势也与3基因在内脏脂肪组织和皮下脂肪组织中相类似,但表达水平有所下降。LPL、PPARγ和FAS在肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式与内脏和皮下前体脂肪细胞相一致,表明Adipo Rs、LPL和PPARγ是脂肪细胞分化的早期标记基因。3.Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,能通过调节激素敏感性脂肪酶（HSL）和过氧化物激活酶增值物受体γ（PPARγ）表达在脂肪生成中起重要作用。（1）诱导分化后第7天,肌内前体脂肪细胞中的HSL和Adipo R1的m RNA表达水平降低,其余标志基因的m RNA表达增加,但对Adipo R2表达无显着影响;（2）过表达Adipo R1可显着降低肌肉前体脂肪细胞沉积,过表达Adipo R2对其脂肪沉积无显着影响。过表达Adipo R1后可增加HSL的表达,降低PPARγ表达,不影响FAS和PPARα的表达,而Adipo R2基因过表达后,对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达没有影响;（3）Adipo R1基因沉默,肌内前体脂肪细胞的体积增大,脂肪沉积含量增加,极显着地降低肌内前体脂肪细胞中HSL的表达,增加PPARγ表达,对FAS和PPARα表达无影响;Adipo R2基因沉默后,对肌内前体脂肪细胞体积与脂肪沉积含量没有显着影响,同时对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达也无影响;4.运用Pull-down技术和质谱分析表明,在绵羊内脏脂肪中L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase）和1-型长链脂酰辅酶A合成酶（Acyl-Co A synthetase long chain family member-1）能与Adipo R1互作;尾部脂肪中1-型长链脂酰辅酶A合成酶（Acyl-Co A synthetase long chain family member-1）能与Adipo R2互作,为进一步研究脂联素受体功能奠定了基础。综上所述,综上所述,Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,通过调节激素敏感性脂肪酶（HSL）和过氧化物激活酶增值物受体γ（PPARγ）的表达在脂肪生成中起重要作用,可作为重要遗传标记基因应用肉羊育种实践。
王艳凤[2]（2015）在《伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析》文中提出旋毛虫病是由旋毛虫属（Trichinella spp.）线虫引起对人类健康构成巨大威胁的食源性人兽共患寄生虫病。据目前统计，在世界范围内约有1000多万人被感染，在我国该病仍有发生。在旋毛虫中已报道十二个种中，伪旋毛虫是唯一一种既可以感染哺乳动物也可以感染鸟类的虫种，感染宿主范围广，具有异于其它种的特殊感染特点。丝氨酸蛋白酶抑制剂是能够抑制丝氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂超家族，参与调控凝集、炎症和凋亡等生理过程，广泛存在于哺乳动物、植物、蠕虫、昆虫、微生物乃至某些病毒之中。伪旋毛虫的肌幼虫由于无包囊保护，更容易受到宿主免疫攻击，但是伪旋毛虫却能成功寄生于宿主肌细胞内，造成整个肌细胞感染引发强烈炎症。因此，伪旋毛虫必然产生更强的免疫抑制来逃避宿主的攻击。迄今为止伪旋毛虫免疫逃逸相关分子的调控机制仍然未知，研究伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在免疫调节过程中的作用具有极其重要的意义。首先，本研究根据GenBank中伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（Trichinellapseadospiralis serine proteinase inhibitor, Tp-Serpin）基因序列设计特异性引物，RT-PCR克隆得到Tp-Serpin基因，构建重组表达质粒pET-28a-Tp-Serpin。转化大肠埃希菌中，通过优化表达纯化条件获得高纯度的可溶性重组蛋白，利用生物化学方法即底物特异性反应对其抑制宿主的丝氨酸蛋白酶活性进行分析。研究发现rTp-Serpin对小鼠肥大细胞糜蛋白酶，人中性粒细胞弹性蛋白酶以及猪胰脏弹性蛋白酶均有明显的抑制作用。我们推测伪旋毛虫通过分泌Serpin来抵抗源自宿主肠道消化酶对其损伤，发挥抗炎作用，逃避宿主免疫攻击而达到长期寄生。其次，通过rTp-Serpin重组蛋白与J774A.1小鼠巨噬细胞的共培养并经脂多糖（LPS）刺激，通过采用CCK-8、SYBR Green I实时荧光定量PCR、ELISA分析rTp-Serpin对Toll样受体介导的对巨噬细胞活性的影响。结果表明，rTp-Serpin降低了LPS刺激的巨噬细胞分泌促炎性细胞因子及效应分子iNOS的表达，促进抗炎性细胞因子及替代性活化的巨噬细胞（AAM）标记物Arg1分泌表达。另外我们通过Western blot技术检测rTp-Serpin对JAK2/STAT3信号通路的磷酸化情况，结果表明，JAK2/STAT3信号通路可能介导rTp-Serpin诱导巨噬细胞向AAM型转化，发挥抗炎功效。我们推测伪旋毛虫可以通过丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制炎症反应，诱导巨噬细胞向可替代激活表型转换。最后，利用半定量RT-PCR技术对Tp-Serpin抗原基因在伪旋毛虫不同发育时期中的转录水平进行鉴定。制备不同感染时期的裸虫切片，利用特异性多克隆抗体，采用Western blot、免疫组织化学技术对Tp-Serpin抗原基因在伪旋毛虫生活史中的表达特性进行鉴定，探讨此抗原基因作为伪旋毛虫诊断抗原的可能性，为深入研究伪旋毛虫宿主入侵、免疫逃避及发育机制奠定了基础。半定量RT-PCR结果显示，Tp-Serpin基因在伪旋毛虫各个时期均有表达。Western blot分析显示抗rTp-Serpin血清能够识别伪旋毛虫虫体粗抗原而与ES产物反应较弱，此外免疫组化结果表明，Tp-Serpin蛋白主要分布于虫体表皮，由此推测Tp-Serpin蛋白很可能是一种由虫体表皮细胞合成分泌的功能蛋白，发挥细胞外作用，从而能够抵抗宿主肠道环境中消化酶对虫体的损伤，参与抗炎及逃避宿主对虫体的免疫效应，达到在宿主体内的长期寄生。
柯野[3]（2013）在《霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究》文中研究指明霉菌是我国传统豆类发酵食品的主要生产菌种，有着悠久的应用历史。由于长期受到环境条件（高蛋白培养基）的驯化，这些霉菌具有分泌多种胞外蛋白酶的能力；这些胞外蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力，特别对大豆蛋白而言，水解产物无苦味且水解程度高。目前，国内外学者对霉菌的研究主要集中于优化固体（或者液体）发酵条件来提高霉菌蛋白酶的产量或对酶学性质的研究；而对霉菌蛋白酶基因的克隆表达方面的研究鲜有报道。鉴于此，本课题对几种霉菌蛋白酶基因进行了克隆表达、定点突变和水解大豆分离蛋白等方面的研究。利用RACE和PCR技术从Actinomucor elegans、Rhizopus chinensis、Aspergillus niger和Aspergillus oryzae等几种霉菌中克隆获得3个新氨肽酶基因（GenBank登录号分别为HQ825158、JQ657815和JQ657814，下同）、2个新丝氨酸蛋白酶基因（GU356536和JF922913）；进一步获得4个丝氨酸蛋白酶基因（L19059、XM001391433、XM001824768和XM001820092）、5个酸性蛋白酶基因（XM001399818、XM001401056、D13894、AB090877和AB044079）和1个中性蛋白酶基因（AF099904）。本试验共克隆获得15个蛋白酶基因。根据生物信息学的理论和方法，对这些蛋白酶基因进行了较全面的预测和分析。结果表明，这些蛋白酶基因的密码子偏好性均不相同，并且编码的氨基酸残基长度也不一致。6种丝氨酸蛋白酶属于蛋白酶K家族，亲缘关系较近；以蛋白酶K晶体结构（PDBcode:1IC6A）作为模板进行同源建模分析可知：这些蛋白酶分子内均无二硫键，具有1个Ca2+结合位点；蛋白酶之间以及与蛋白酶K在底物结合区域、氢键、盐键和二硫键等方面均存在差异，这些差异可能是这些酶具有独特水解作用的原因。5种酸性蛋白酶属于酸性蛋白酶Asp家族，是胞外蛋白酶，亲缘关系较近；以Aspergillopepsin I晶体结构（PDB code:1IBQ B）作为模板进行同源建模可知：蛋白酶分子内均有1个二硫键，具有1个Zn2+结合位点。蛋白酶之间在活性位点的溶剂可及表面积、氢键、盐键、底物结合区域和ψ-loop结构等方面均存在差异，这些差异可能使这些蛋白酶具有独特的酶学性质。对中性蛋白酶和氨肽酶的功能位点、Motif结构和进化关系进行了分析；由于中性蛋白酶和氨肽酶未具有较为适合的同源建模模板，因此未能构建模拟出二级结构和三级结构的模型。分别将A. elegans、R. chinensis的Alp基因、A.niger的AlpI基因、A. oryzae的AlpII基因和A. elegansAmp基因克隆至表达载体pET-22b（+）上，转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达；结果表明这些蛋白酶基因均被诱导表达出未有活性的重组蛋白酶。将蛋白酶基因克隆至表达载体pPIC9K上，电转整合至毕赤酵母Km71菌株的基因组上进行诱导表达。结果表明只有A.niger的AlpI基因、A.oryzae的AlpII基因和NpI基因能成功表达。进一步分别对3种重组蛋白酶进行了分离纯化和酶学性质研究。结果表明：重组黑曲霉AlpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达到4050U/mL，该酶最适反应pH值和温度分别为8.0-9.0和45℃，在pH为6.0-9.0和温度低于40℃时具有较好的热稳定性，PMSF完全抑制酶活，Ca2+、Mn2+和K+对酶具有促进作用，Zn2+、Fe2+和Mg2+都具有抑制作用。重组米曲霉AlpII在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达4100U/mL；该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5-9.5和50℃，在pH值为6.0-10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性；PMSF完全抑制酶活；Ca2+和Mg2+具有促进酶的作用，Zn2+、Fe2+和Mn2+具有轻微的抑制作用。重组米曲霉NpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达43101U/mL；该酶最适反应pH和温度分别为8.0和55℃，在pH为5.0-9.0和45℃以下具有较好的稳定性，EDTA强烈抑制酶活，Cu2+和Zn2+能显着的抑制酶活。为了提高重组蛋白酶的热稳定性利于工业的开发利用，采用定点突变技术来增加蛋白酶的二硫键。结果表明：重组米曲霉AlpII的突变酶G33C-S126C（将33位点和126位点氨基酸G和S突变为C）提高了热稳定性；但是突变酶I179C-T253C的热稳定性发生了降低；突变酶G33C-S126C-179C-T253C不能被表达。重组黑曲霉AlpI的3种突变酶（G34C-S127C、I180C-T254C和G34C-S127C-180C-T254C），均不能在毕赤酵母KM71菌株中成功表达。对米曲霉NpI的“HExxH19aaE”Motif结构中的活性位点（H429、H433和E453）进行一系列的突变，结果表明该3个位点对NpI非常重要，进一步说明该酶属于锌蛋白酶家族。以大豆蛋白为底物，考察了重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力。结果表明重组米曲霉ApII最佳温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、10.0、1-1.5h和1000U/g，此时大豆分离蛋白水解度为15.8%。重组黑曲霉ApI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为40℃、10.0、1h和1000U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为15.6%。重组米曲霉NpI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、8.0、1-1.5h和1500U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为16.4%。
王玮[4]（2011）在《骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究》文中研究表明体细胞核移植技术和转基因技术的发展为转基因动物新品种的培育提供了新的技术平台。卵泡抑制素（follistatin, FST）具有促进肌肉生长和增加肌肉力量的功能,是近几年高产肉量家畜研究和治疗肌肉萎缩的热点基因。本研究通过将体细胞核移植技术和转基因技术相结合,定向培育高产肉量转FST基因绵羊。实验构建了骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因真核表达载体,得到其稳定转染的蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系,以稳定转染外源基因的细胞为核供体,以成熟的绵羊卵母细胞为受体,通过体细胞核移植技术制备转基因胚胎,经胚胎移植制备转基因蒙古绵羊。1.骨骼肌特异表达卵泡抑制素真核表达载体的构建通过RT-PCR方法克隆得到FST基因cDNA序列。酶切含有猪α-actin 5’端调控区的骨骼肌特异启动子骨架载体,得到pCCDS,连接FST cDNA和pCCDS,构建成骨骼肌特异表达FST的真核表达载体pCFCDS,酶切和PCR鉴定构建的载体；连接FST基因cDNA与人工合成肌肉特异启动子SP片段,得到中间载体p19T-SPF,酶切p19T-SPF得到目的片段SPF,连接SPF片段与骨架载体pCDsReD2,构建成骨骼肌特异表达FST基因真核表达载体pSPFCDS,酶切及PCR鉴定载体。2.表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞利用脂质体介导法分别将骨骼肌特异表达载体pCFCDS和pSPFCDS转入蒙古绵羊胎儿成纤维细胞中,通过G418和红色荧光蛋白双筛选标记筛选得到稳定转染外源基因的转基因细胞克隆。扩大培养转基因细胞后,对其进行外源基因PCR鉴定,选取阳性克隆绘制生长曲线并分析其染色体数目。经鉴定,筛选出的细胞稳定表达目的基因,生长曲线与染色体数目基本正常,可以作为后续工作中体细胞核移植的核供体细胞。3.转基因胚胎的制备与转基因绵羊的生产绵羊卵母细胞经体外成熟培养后,通过显微操作去除其细胞核与第一极体,注射入稳定转染pCFCDS或pSPFCDS载体的转基因细胞,电融合后经5μM IA23187 5min+2mM 6-DMAP 4hr激活方法激活重构胚,重构胚在体外发育到4-8细胞期时通过胚胎移植方法移入同期发情的受体母羊输卵管。绵羊卵母细胞体外培养成熟率为67%,融合率为78.2%,重构胚卵裂率为68.6%,八细胞率为83.9%,囊胚率发育为22%。实验共移植87只受体母羊,怀孕14只,怀孕率为16.1%,顺利出生5只,经PCR鉴定5只均有外源目的基因的整合,RT-PCR结果表明外源目的基因在转基因蒙古绵羊骨骼肌中特异转录。
崔凯[5]（2011）在《慢病毒介导人CCL21基因转染对胰腺癌细胞（PANC-1）作用的实验研究》文中指出胰腺癌（pancreas cancer）是恶性程度较高的肿瘤之一,其发病率呈上升趋势。大多数胰腺癌患者出现症状就诊时已属中晚期,即使手术治疗,预后亦较差,且其具有周围血管浸润和嗜神经生长特性,早期诊断率较低,易于转移,其分化程度和淋巴转移直接影响患者的预后,因此,对于深入研究胰腺癌的治疗意义重大。趋化因子（chemokine）是一类结构同源、功能相似的细胞因子超家族,其作用是启动并调节特异性细胞在体内迁移与定位,其中部分细胞正是机体抗肿瘤免疫的效应细胞。次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid tissue chemokine,SLC）属于CC亚族趋化因子,即CCL21,通过趋化、介导免疫细胞产生抗肿瘤免疫应答,发挥抗肿瘤免疫效应,但其又具有双向效应,可促进肿瘤细胞分泌蛋白水解酶,加快肿瘤细胞的侵袭转移,导致肿瘤进展。慢病毒（Lentivirus）载体是一类重组反转录病毒载体,由慢病毒经过改造而成,具有更高的生物安全性和外源基因的表达效率,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较稳定的表达,其感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒,安全性好。慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多的载体。目的本课题研究通过克隆人的CCL21基因,构建pEASY-T1 simple-CCL21质粒,经序列测定后进一步构建人CCL21基因慢病毒表达载体,稳定转染Real-time PCR筛选出的高表达CCR7的胰腺癌细胞株PANC-1,观察细胞生物学行为的变化,进一步通过PCR基因芯片检测目的基因转染后细胞内信号通路中某些基因的变化,探讨人CCL21基因转染对胰腺癌的作用。方法1.利用基因克隆技术克隆出人CCL21基因,连接在pEASY-T1 simple cloning vector上,构建成pEASY-T1 simple-CCL21质粒,再进行序列测定;2.利用基因重组技术将人CCL21基因连接慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,进行病毒包装,滴度测定后浓缩纯化;3.利用Real-time PCR从培养的5种人胰腺癌细胞株（AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990）中筛选出高表达CCR7的细胞株;4.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CCL21重组慢病毒载体转染PANC-1细胞株,分为阳性实验组、阴性对照组、空白对照组,利用PCR、Western blot技术进行验证,观察转染后PANC-1细胞株生物学行为的变化。5.采用RT2ProfilerTMPCR芯片检测与肿瘤侵袭转移、血管生成、凋亡、黏附、细胞周期、信号转导等有关因子的84个基因,深入分析基因变化趋势,Western blot验证,探讨人CCL21基因对PANC-1细胞株侵袭转移的作用。实验结果均采用SPSS16.0统计软件进行t检验和单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.克隆出人CCL21基因,成功构建pEASY-T1 simple-CCL21质粒,测序结果显示与人类基因库中CCL21基因序列完全一致;2.成功构建慢病毒载体质粒PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CCL21,经病毒包装后得到携带hCCL21的成熟的重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21,浓缩后病毒滴度达到1.25×108TU/ml;3.从5种人胰腺癌细胞株（AsPC-1,BxPC-3,CFPAC-1,PANC-1,SW1990）中筛选出高表达CCR7的细胞株PANC-1;4.重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21成功转染胰腺癌细胞株PANC-1,并稳定表达,但PANC-1细胞生物学行为无明显变化;5.通过RT2ProfilerTMPCR芯片筛选出8个明显变化基因,其中上调基因2个,分别为:ATM,BRCA1;下调基因6个,分别为:AKT1,CASP8,FOS,IL8,ITGA2,JUN;根据基因功能不同分类,其中与凋亡有关基因为CASP8;与信号转导与转录有关基因为AKT1,FOS,JUN;与细胞周期有关基因为ATM,BRCA1;与血管生成有关基因为IL8;与粘附作用有关基因为ITGA2;此外,MMP-9基因变化低于2倍,阳性实验组比空白对照组、阴性对照组分别上调1.40倍,1.31倍,而TIMP1基因阳性实验组比空白对照组、阴性对照组分别下调1.01倍,1.02倍,Western blot检测结果显示阳性实验组MMP-9的表达量比阴性对照、空白对照组增加。结论本课题研究,利用基因克隆技术成功克隆出人CCL21基因,采用基因重组技术成功构建CCL21重组慢病毒载体,包装成熟的重组慢病毒颗粒Lenti-hCCL21稳定转染高表达CCR7的胰腺癌细胞株PANC-1,但转染后的PANC-1细胞其生物学行为未发生明显变化,进一步通过RT2ProfilerTMPCR芯片筛选出与肿瘤侵袭转移、血管生成、凋亡、黏附、细胞周期、信号转导等相关明显变化的基因,表明hCCL21基因稳定转染胰腺癌细胞株PANC-1引起了胞内信号转导通路中某些基因的变化;其中MMP-9基因上调与TIMP1基因下调表明Lenti-hCCL21转染胰腺癌细胞株PANC-1可能增强其侵袭转移能力,为进一步研究体内实验奠定基础。
曾媛琴[6]（2010）在《家蚕（Bombyx mori）耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析》文中认为氟中毒是严重危害人体健康的主要地方病之一,该病危害严重,不仅能够造成氟斑牙、氟骨症等硬组织的广泛损伤,还可引起全身软组织不同程度的广泛损害。阐明氟中毒致病机制,是当今研究的热点问题之一。细胞色素P450酶系也就是多功能氧化酶（MFO）,是所有需氧生物体都存在的代谢酶系。细胞色素P450基因由35亿年前的一个共同祖先进化而成,是最古老和最庞大的超基因家族之一。它对代谢与转化内源物质和活化与降解外源化合物进行催化和调控。昆虫中的细胞色素P450酶系作用涉及生长、发育、取食等过程,其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对有毒物质的耐受性。家蚕(Bombyx mori是鳞翅目昆虫的模式生物,鳞翅目是昆虫中的第二大目。本研究基于家蚕基因组精细图和EST、全基因组基因芯片数据,对家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6ul和Bmcyp6a8基因进行了克隆和生物信息学研究。本论文的主要研究结果如下：1.家蚕耐氟性研究分析研究了家蚕添氟方法及桑叶氟浓度检测方法。桑叶用200ug/mLNaF浸渍15分钟,自然晾干。将桑叶研磨,加入1mol/L的HCl浸泡1小时（轻微震荡）,pH5-6的TISAB缓冲液定容至50ml,氟离子选择电极检测氟浓度,能够精细地检测出桑叶的氟浓度值。筛选了家蚕耐氟性品种T6和敏感性品种734,检测出耐氟阈值200ug/mL。用200 ug/mL的NaF浸渍桑叶15min,4龄起蚕开始饲喂家蚕,发现耐氟性品种T6虽然体重增长速率低于清水对照组,但是仍然能够一直稳步成长至上蔟：而同时同等条件喂养的734却体重增长异常缓慢,至4龄后期,渐渐死亡,最终不能进入眠期,全部死亡。检测了NaF对家蚕食桑量的影响。相对于对照组,T6和734的添氟组食桑量都有所减少,但是734食桑量减少量异常,严重影响了正常生长；检测了NaF对家蚕蚕沙量的影响。统计显示,添氟组蚕沙量明显低于对照组。除了食桑量减少造成的蚕沙量减少,NaF造成家蚕排泄困难。检测了氟中毒家蚕体内氟含量和各组织的氟含量。统计显示耐氟品种T6和敏感品种734的蚕沙氟含量一直上升；敏感品种734排氟量在到达36ug后就直线下降,一直在36ug徘徊；T6排氟量到达233ug后开始下降。分析显示氟排泄是家蚕耐氟性的一种重要途径。检测了氟中毒家蚕T6各组织的氟含量,包括头、血液、表皮,中肠、马氏管、丝腺、精巢（卵巢）,发现头部组织和马氏管中氟离子含量最高。头部组织对氟化钠的不敏感性与氟代谢相配合是家蚕耐氟性另一重要途径。检测了氟中毒家蚕蛾期和蚕卵的氟含量,发现蛾的氟含量约等于5龄7天的氟含量。检测了家蚕添氟组与对照组的乙酰胆碱酯酶含量和活性变化。结果显示,与对照组相比,添氟组头部酶原蛋白含量明显升高,乙酰胆碱酯酶活性呈规律性的明显降低。分析显示,家蚕乙酰胆碱酯酶是家蚕耐氟性的重要靶标之一。乙酰胆碱酯酶酶原蛋白量的增加弥补了活性的缺失,可能是耐氟品种头部组织对氟不敏感性的原因。2.家蚕细胞色素P450第六家族基因的克隆及功能研究采用生物信息学方法获得与果蝇cyp6ul基因同源的家蚕cyp6ul基因序列,实验结果表明,该基因ORF为1476 bp,编码491个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.15 kD,等电点为9.23。（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明：Bmcyp6ul基因与蜜蜂同源基因cyp6AS13的相似性为56%：与拟南芥cyp72A82的相似性为48%；与人的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明,Bmcyp6ul基因在家蚕5龄第3天幼虫组织表达量很低,只在精巢组织稍有表达,推测该基因具有功能特异性。依据家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,RT-PCR克隆了家蚕Bmcyp6a8基因。结果表明,该基因ORF为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61.52kD,等电点为8.17,只有1个内含子。生物信息学分析显示,该基因位于第16号染色体,与野蚕cyp6AE8的相似性较高,同源性为93%,与棉铃虫的同源性为57%,与人的cyp3A43的同源性为33%。GenBank登录号为：GQ241737。从NCBI上下载人、果蝇、蜜蜂、斑马鱼、线虫的基因组与Bmcyp6a8进行比对,发现同源性基因全部是P450基因,构建进化树,Bmcyp6a8与蜜蜂第六家族基因聚集成簇。芯片表达图谱显示,Bmcyp6a8基因具有功能特异性。
宫伟娜[7]（2009）在《低温胁迫过程中入侵植物紫茎泽兰热激蛋白基因的作用》文中指出紫茎泽兰（Ageratina adenophora）是一种外来入侵杂草,分布于我国西南部,危害严重。紫茎泽兰喜温暖湿润的环境,但其适应能力极强,可对生存地的纬度或海拔等环境梯度作出适应成为紫茎泽兰成功入侵的主要原因。但目前对紫茎泽兰低温适应性以及入侵扩张的分子机理方面的相关研究较少,因此入侵物种的分子机理研究已经成为生物学界关注的热点。热激蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs）是原核和真核生物在应激状态下被诱导表达的一类具有重要生理功能的高度保守多肽类蛋白质,是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成,它们以分子伴侣的形式减轻逆境胁迫引起的伤害。本研究针对紫茎泽兰的低温反应采集高海拔的紫茎泽兰种群,通过模拟自然条件的实验方法鉴定紫茎泽兰高海拔种群的耐寒性,通过测定生理生化指标分析明确高海拔紫茎泽兰种群在低温胁迫过程中的耐性强弱。重点采用了分子生物学手段研究紫茎泽兰在高温与低温逆境下四种分子量（hsp17.6、hsp60、hsp70和hsp90）热激蛋白基因表达特性及其在紫茎泽兰低温胁迫过程中的作用。采用人工模拟气候鉴定了采自四川和云南的高海拔紫茎泽兰种群对低温的不同适应性,从生理生化角度表明紫茎泽兰种群在入侵我国过程中对温度表现出的适应性差异。结果表明丙二醛（MDA）、可溶性糖、抗氧化酶指标（SOD、CAT、APX）在低温下均出现不同程度的升高,不同种群指标变化幅度说明紫茎泽兰高海拔种群对低温适应性存在差异,其中采自四川西昌的磨盘山和泸山的种群耐寒性最强,西昌的大青山种群和云南的龙陵种群则为低温敏感种群,从而为干扰或是抑制其保护机制来降低其适应能力提供思路,控制其进一步向北部地区扩散。根据植物热激蛋白高度的保守性对紫茎泽兰的hsp17.6、hsp60、hsp70和hsp90的全长进行同源克隆,命名为Aahsp17.6、Aahsp60、Aahs70和Aahsp90。序列全长分别为691、1581、2074和2094bp,登陆Genebank注册号为EU209067、EU209068、EU209069和EU209070。运用生物信息学软件对这四个热激蛋白的氨基酸序列同源性以及结构的分析充分表明了所克隆的hsps编码的氨基酸是属于热激蛋白家族的。进化树分析结果表明在进化上这四类HSPs与拟南芥、烟草、番茄的HSPs表现较近的遗传距离。半定量PCR结果显示紫茎泽兰的四个热激蛋白基因中Aahsp17.6、Aahsp60、Aahs70和Aahsp90均在幼苗茎、叶中的表达受热激的诱导,该基因的表达在植物器官中可能具有普遍性。Northern杂交检测到在高、低温逆境下紫茎泽兰的这四类热激蛋白在mRNA水平上发生明显的变化。一般需要适当时间达到转录的最高水平和最大表达量的恢复才达到最大表达量,而且高温胁迫下并不是在胁迫过程中或胁迫刚结束时即消失,合成还会持续在恢复后的一段时间内,并且紫茎泽兰Aahsp70和Aahsp90对高温和低温的表达模式相似,二者协同表达。Southern结果显示Aahsp17.6和Aahsp60为单拷贝,Aahsp70和Aahsp90为3-4个拷贝数。通过分析异源表达的紫茎泽兰的HSPs在高温和低温下对大肠杆菌生存能力的影响,初步研究在高温和低温条件下紫茎泽兰Aahsp17.6、Aahsp60、Aahsp70和Aahsp90基因在活体中的功能。用pET-30a表达载体与Aahsp17.6、Aahsp60、Aahsp70和Aahsp90基因进行重组并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。高温处理后,重组细胞的存活力较对照相比有明显的提高;并且对热激后的重组菌的可溶性蛋白SDS-PAGE检测表明热激蛋白的表达延缓了可溶性蛋白的降解。在4°C处理8d后,重组细胞的存活力较对照相比有明显的提高。据此推测这四个热激蛋白对低温条件下保护大肠杆菌的功能。采用染色体步移方法的两个技术获得紫茎泽兰hsp90长864bp的启动子序列（GenBank No. FJ434253）和hsp17.6长1485bp的启动子序列（GenBank No. FJ434252）,序列分析得出两个启动子的序列均含有HSPs特异应答元件HSE（nGAAn）以及其它保守的启动子元件。在紫茎泽兰hsp90和hsp17.6启动子中分别存在2个重复以上的,尤其是hsp17.6启动子序列中存在10个此类的重复,因而在响应温度等胁迫时可以快速的与HSF结合,激活hsp基因的表达。通过体外实验检测了紫茎泽兰HSP17.6和HSP17.7的重组蛋白作为分子伴侣对柠檬酸合酶（CS）的热聚集和热降解的抑制作用。对异源表达的重组蛋白进行Ni-NTA柱纯化后,从1L的菌液中得到浓度为33.6mg的HSP17.6和20.2mg的HSP17.7重组蛋白。体外实验表明HSP17.6与HSP17.7均可减慢45°C处理下CS的热变性,抑制热聚集的最佳比例为HSP17.6/HSP17.7-to-CS为5:1,说明紫茎泽兰的sHSPs具有分子伴侣的活性。此外HSP17.6与HSP17.7均加速热变性CS的复性,38°C处理后的CS活性仅为12%,处理60min后恢复到25°C,加入纯化的重组蛋白后CS活性可以恢复到60%以上。两种sHSPs进行等比例混合后检测其保护功能也被观察到。根据紫茎泽兰的HSP17.6和HSP17.7体外分子伴侣功能推测其在低温胁迫下保护了功能蛋白的活性进而增强了低温适应能力。将Aahsp17.6定向克隆于带有组成性表达启动子CaMV35S和NPTⅡ基因（带有卡那霉素抗性基因）的植物表达载体pBI121中,冻融法转化农杆菌LBA4404,利用叶圆盘法对番茄进行Ti质粒介导的遗传转化,PCR与Sourthern杂交鉴定出阳性转基因植株。在低温处理下,转基因植株小苗表现出明显优于野生型植株的耐寒性状。转基因植株MDA含量明显低于野生型植株,可溶性糖的含量比野生型植株高出0.5倍,但测定的SOD的活性没有显着差异。结果说明sHSPs提高了植物的耐寒性。在本研究中紫茎泽兰高海拔种群低温适应性的差异为紫茎泽兰在我国的适应性进化提供了参考价值。对于紫茎泽兰而言,其体内HSPs的多样性、基因结构的特点可能是其对温度逆境尤其是低温的适应能力的重要内在因素,因而对紫茎泽兰sHSP或是其它分子量HSPs的研究提供了紫茎泽兰面临温度胁迫时内在基因表达变化的一个线索,有利于从分子水平解释紫茎泽兰对温度逆境的适应性。
王金香[8]（2009）在《ABA诱导的玉米（Zea mays L.）MAPK基因克隆、表达分析、定位及功能研究》文中指出在植物生长过程中,脱落酸（ABA）是一种重要的调节因子。从脱落酸的产生到激发生理反应要经过一系列相互紧密联系的级联环节。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞生命活动的许多过程中都起着重要的调节作用,并在细胞信号转导中处于核心地位。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）是真核细胞中普遍存在的信号组分,由逆境胁迫、细胞因子、植物激素、生长因子等诱导,并在植物信号中发挥重要的作用。因此,揭示脱落酸信号转导过程中相关MAPK的生理功能具有重要科学意义。本实验室前期研究发现,ABA能诱导玉米46 kD MAPK的激活。为了对46 kDMAPK进行身份的鉴定和分析它在ABA信号中的功能,我们以ABA处理的玉米（Zea mays L.,cv.Nongda 108）幼苗的RNA为模板,根据MAPK的保守序列及部分纯化蛋白的氨基酸片段,设计合成简并引物,通过RT-PCR方法克隆了两条中间保守区序列。两对简并引物分别是CGCYTAYGGVATCGTYTGCTC和GTDACVACRTAYTCMGTCAT（对应于MAPK的保守区域GAYGIVCS和MTEYVVTRW）,AARATHGCNAANGCNTTYGA和GTDACVACRTAYTCMGTCAT（对应于p46MAPK纯化蛋白的肽段KIANAFD和MTEYVVTRW）。经过DNA序列测定和NCBI Blast在线分析,两条序列都与MAPK基因有很高的同源性。利用RACE和RT-PCR的方法进一步克隆了两条MAPK基因的全长cDNA:ZmMPK3（GenBank登录号：EU130900）,基因全长1520 bp,编码区长1131 bp,经过软件分析,ZmMPK3基因编码376个氨基酸组成的多肽,推测分子量是43.5 kD,其氨基酸序列和水稻OsBIMKl.玉米ZmMPK4.拟南芥AtMPK3分别有87.5%、85.5%和70.7%的同源性；第二条基因为p46MAPK基因既ZmMPK5基因,基因编码区全长1200 bp,编码399个氨基酸多肽,ZmMPK5基因编码的氨基酸序列与烟草NtSIPK同源性最高为85.5%、其次是AtMPK6同源性为84%。两种基因具有典型的MAPK特征：含有一个ATP结合位点、11个相对保守的区域、一个催化环、一个TEY的磷酸化基序和一个CD结构域。两种MAPK都属于A类MAPK。为了进一步对其功能进行研究,通过RT-PCR方法,从玉米幼苗总RNA中扩增ZmMPK3和ZmMPK5完整的基因编码区。利用DNA重组技术,将两个目的基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了全长基因的原核表达载体pGEX-ZmMPK3/ZmMPK5.将原核表达载体转化大肠杆菌BL-21菌株,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达SDS-PAGE电泳发现,带有目的基因的菌体表达出了分子量约71 kD的GST-MAPK融合蛋白。可溶性分析结果表明,GST-ZmMPK3融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中,而GST-ZmMPK5以可溶的形式存在于上清中。用激酶溶液测活的方法分析表明体外表达的两种MAPK都没有激酶活性。选取两个MAPK的特异性片段制备抗体,证明ZmMPK3c抗体、ZmMPK5c抗体分别对ZmMPK3、ZmMPK5具有免疫的专一性。用半定量及定量RT-PCR方法和免疫共沉淀凝胶激酶（IP）分析表明,ABA和H202诱导的p46MAPK就是ZmMPK5。4种信号分子（ABA、ETH、SA及H202）和多种环境胁迫因子在不同程度上对两种MAPK从转录水平和激酶水平上产生调控作用。其中IP实验表明,ABA和H202都能诱导ZmMPK3、ZmMPK5的激活。利用基因重组技术,将两种MAPK全长基因插入到植物瞬间表达载体pXZP008上,将表达载体用PEG融合法转化玉米原生质体,以增强型黄色荧光蛋白YFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜观察蛋白在细胞中的定位。结果表明：ZmMPK3主要定位于细胞核,还有少量存在于细胞质中,可以清晰显示细胞骨架的结构；ZmMPK5主要定位于细胞核,另外也有少量定位于细胞质和细胞膜上。将重组质粒pXZMPK3转化玉米原生质体,进行ZmMPK3过表达实验,检测ZmMPK3对原生质体抗氧化基因的表达和抗氧化酶活性的影响,对ZmMPK3进行功能分析。结果表明ZmMPK3过表达对CAT1基因转录没有影响,但上调了细胞中SOD4、cAPX基因表达,同时提高SOD和cAPX酶的活性。因此在"ABA-MAPK-抗氧化反应”信号途径上ZmMPK3参与了ABA诱导的玉米叶片中的抗氧化防护反应。
崔淑娟[9]（2009）在《甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化》文中研究表明甲型流感病毒严重危害人类健康,由于其变异引发的大流行对人类造成严重威胁,近年来人感染禽流感病毒（H5N1）和甲型H1N1流感的流行,进一步提示加强甲型流感病毒的研究和控制的重要性。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒编码的糖蛋白,变异性强,根据抗原性不同可进一步分为16个HA亚型（H1-H16）和9个NA亚型（N1-N9）。尽管HA和NA是流感病毒主要的免疫原,但由于HA和NA的变异性强,亚型众多,而目前甲型流感病毒16个HA和9个NA不同亚型之间的免疫交叉关系尚未系统研究,对流感病毒亚型特异性免疫检测技术的建立和疫苗的研发提出了严峻的考验。为此,本研究对甲型流感病毒16个亚型的HAl和9个亚型NA的交叉反应性进行了研究,以期阐明其免疫反应特征,为甲型流感病毒免疫检测技术和通用疫苗的研制提供可行性的理论依据。另一方面,近年来反向遗传系统的发明为人工改造甲型流感病毒和研发疫苗提供了关键技术平台,但现有系统的拯救效率有待提高,本研究拟通过对甲型流流感病毒反向遗传系统的转录／表达载体的改建提高其拯救效率。一、甲型流感病毒HA和NA血清学交叉反应特征研究对本实验选取的甲型流感病毒16个亚型的HA基因和9个亚型的NA基因的序列进行了分析,结果表明,16个HA和9个NA的核苷酸与氨基酸序列的进化树都主要向两个趋势进化,16个HA核苷酸序列之间的同源率在28%-76.7%之间,其氨基酸序列之间的同源率在36.2%-78.5%之间,9个NA亚型核苷酸序列之间的同源率在43.1%-70.4%之间,其氨基酸序列之间的同源率在37.9%66.6%之间。尽管16个HA和9个NA基因的预测B细胞线性表位分布区域一致,但其具体表位组成却存在差异,这些信息为进行各亚型之间的血清学交叉反应以及确定亚型特异性表位序列提供研究方向,进而为研究HA和NA的结构与功能、免疫识别、构建HA和NA的突变体以及选择表达新型HA和NA分子、研发诊断和基因工程疫苗奠定了基础。随后将PCR扩增的经密码子优化的16个HA1和9个NA基因克隆到改建的gp67-pFastBac1载体中,获得了25个重组杆状病毒。将重组杆状病毒分别感染Sf9细胞,分别收取上清和细胞用抗6×His抗体进行Western blot分析。结果表明,16个HA1和9个NA基因的表达产物分子质量分别约为52.5kD与71.6kD,与预期相符,并且16个HA1和9个NA基因还呈分泌性表达。其中H5-HA1和H9-HA1经Ni柱纯化后的纯度达90%左右,回收率分别为0.5%和0.9%。同时,将16个亚型的HA和9个亚型的NA基因克隆到5型重组腺病毒载体中,得到了25个重组腺病毒。分别将25个重组腺病毒通过滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,制备了相应亚型的抗体,三次免疫后ELISA检测阳转率为100%,ELISA检测的抗体效价约为1：6400左右。利用杆状病毒系统表达的各个亚型的目的蛋白作为抗原,利用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠制备的血清作为抗体,通过ELISA方法确定16个HA亚型及9个NA亚型之间的血清学交叉反应关系。结果表明,HAl和NA各亚型之间的交叉反应关系错综复杂,H2、H5、H7亚型与其他亚型之间的交叉反应弱,而H6、H12、H16与其他亚型之间的交叉反应强。N1、N2亚型与其他亚型之间的交叉反应强,HA1和NA各亚型之间的交叉反应结果与其序列分析的结果存在一定的差异。二、甲型流感病毒反向遗传系统的优化利用RT-PCR的方法扩增了甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）毒株8个基因片断,克隆入pIVVII载体中,其中在PB1片段中引入了3个沉默突变标签。将8个功能质粒共转染293T和MDCK混合培养细胞,利用细胞病变、RT-PCR、电镜技术等证明该系统可成功拯救甲型流感病毒。为提高甲型流感病毒的拯救效率,用人工合成的SCPI启动子[1]插入PIVVII载体,构建出pIVVS质粒,再将A/PR/8/34（H1N1）的8个基因片断克隆入pIVVS载体中,把优化后的8个功能质粒共转染293T和MDCK混合细胞,在共转染后的24h、48h、72h及96h分别收获转染细胞的上清和细胞,通过EGFP表达量、NP表达的时相变化以及血凝试验鉴定两个包装系统的拯救效率。结果表明,优化后系统不同时间点的EGFP表达量、NP表达量及血凝效价均高于未优化系统,说明利用高强度的SCPI启动子可有效提高甲型流感病毒的包装效率,为改进甲型流感病毒疫苗的研发系统奠定了基础。
王静[10]（2009）在《猪Lipin和FIT基因的克隆与组织分布》文中指出脂肪诱导转录物（FIT）和Lipin都是与脂肪代谢有关的基因,FIT是对脂肪组装成脂滴起关键作用的基因,是内质网膜蛋白,参与脂类代谢的氧化作用。Lipin是一种关键的脂肪调节酶,作为蛋白质在哺乳动物细胞中调节脂肪代谢。为了研究Lipin和FIT蛋白的生物学功能,本试验以EST片段为基础,利用同源序列克隆原理设计引物,对猪各种组织提取的总RNA进行RT-PCR,通过RT-PCR技术克隆得到FIT（FIT1和FIT2）和Lipin（Lipin1,2和3）的cDNA序列,利用生物信息学工具预测其相关生物学性质,并对其组织进行分布初探,试验分两个系列。一、猪Lipin蛋白家族的克隆和组织分布Lipin1基因包含一个完整的开放阅读框架（open reading frame, ORF）为2-2686bp,全长为2692bp,由894个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为189个,碱性氨基酸为122个,分子量为98.91kDa,等电点为6.40。结构域预测含有LNS2结构域,位置在678-834aa,核定位NLS预测含有“KKRRKRRRK”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin1基因与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为82.8%、85.0%、82.8%,预测的氨基酸序列与小鼠、人和大鼠的同源性分别为88.8%、89.9%和88.7%。Lipin2基因全长为2693bp,ORF为11-2686bp,由891个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为190个,碱性氨基酸为126个,分子量为98.89kDa,等电点为5.32。LNS2结构域位置在680-836aa,核定位NLS预测含有“KKKKRRRKK”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin2基因与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为83.0%、86.7%、82.9%,预测的氨基酸序列的同源性分别为87.4%、90.3%和87.4%。Lipin3基因变体1全长为2872bp,ORF为149-2728bp,由859个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为165个,碱性氨基酸为105个,分子量为93.59kDa,等电点为5.42。LNS2结构域位置在648-804aa,核定位NLS预测含有“KKKRRRRKPRRKE”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin3基因变体1与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为75.6%、83.4%、78.6%,预测的氨基酸序列的同源性分别为75.9%、81.6%和77.4%。变体2全长为2848bp,ORF为149-2704bp,由851个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为163个,碱性氨基酸为104个,分子量为92.74kDa,等电点为5.42。LNS2结构域位置在640-796aa,核定位NLS预测含有“KKKRRRRKPRRKE”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,变体2与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为75.6%、83.2%、78.5%,预测的氨基酸序列的同源性分别为76%、80.9%和77.4%。组织分布结果显示:Lipin1在脾、肺、肾、膀胱、大脑、小脑、胃、空肠、肌肉和脂肪等多种组织中都有分布,而Lipin2和Lipin3仅在脾、肺、回肠和肌肉中有分布。二、猪FIT蛋白家族的克隆和组织分布利用同源序列克隆原理设计克隆引物,对猪各种组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化Ecol.JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析,克隆的猪FIT1基因包含完整的开放阅读框架,长为1310bp,ORF为400-1272bp,编码290个氨基酸,其中酸性氨基酸为22个,碱性氨基酸为39个,分子量为32.17kDa,等电点为10.47,信号肽为135aa,含有6个跨膜结构域。猪FIT1的核酸序列与人、牛、大鼠和小鼠的同源性分别为92.1%、93.2%、87.4%和88.1%,氨基酸序列的同源性分别为97.2%、96.6%、94.8%和95.5% ,为进一步研究FIT1的生物学功能奠定了基础。克隆的猪FIT2基因包含完整的开放阅读框架,长为1776bp,ORF为82-870bp,编码262个氨基酸,其中酸性氨基酸为28个,碱性氨基酸为31个,分子量为29.64kDa,等电点为8.91,信号肽为130aa,含有4个跨膜结构域。FIT2的核酸序列与小鼠、大鼠和人的同源性分别为85.0%、85.7%和88.1%,氨基酸序列的同源性分别为87.4%、87.4%和92.0%,为进一步研究FIT2的生物学功能奠定了基础。组织分布结果显示:FIT1主要在肌肉和脂肪组织有分布,其它组织分布量太低,而FIT2在心、肝、脾、肾、大脑、小脑、空肠、回肠、甲状腺、肌肉和脂肪等组织都有分布。
二、RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析（论文提纲范文）
（1）脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脂联素 |
| 1.2 脂联素受体(Adiponectin Receptor) |
| 1.3 脂联素及其受体在畜禽业的研究进展 |
| 1.4 脂联素及其受体信号传导 |
| 1.5 目的及意义 |
| 第二章 绵羊脂联素及其受体基因全长c DNA基因克隆及其组织特异性表达研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 数据分析 |
| 2.2.1 信息学分析 |
| 2.2.2 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RNA完整性检测 |
| 2.3.2 PCR克隆 |
| 2.3.3 脂联素及其受体基因结构分析 |
| 2.3.4 绵羊APN,AdipoR1和AdipoR2 基因组织特异表达研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 绵羊肌内、内脏及皮下前体脂肪细胞分离培养及诱导分化研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 前体脂肪细胞的形态学观察 |
| 3.3.2 前体脂肪细胞的生长曲线 |
| 3.3.3 前体脂肪细胞的诱导分化 |
| 3.3.4 前体脂肪细胞在分化期细胞内脂肪含量的变化 |
| 3.3.5 前体脂肪细胞诱导分化过程中标志基因的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 前体脂肪细胞体外分离培养体系构建 |
| 3.4.2 前体脂肪细胞生长特性 |
| 3.4.3 前体脂肪细胞增殖分化 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 绵羊脂联素受体对肌内前体脂肪细胞分化的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肌内前体脂肪细胞的形态学观察 |
| 4.3.2 肌内前体脂肪细胞的生长曲线 |
| 4.3.3 肌内前体脂肪细胞诱导分化 |
| 4.3.4 脂联素受体1和2 的载体构建与验证 |
| 4.3.5 重组脂联素受体1 和受体2 转染 |
| 4.3.6 肌内前体脂肪细胞标志基因的表达 |
| 4.3.7 脂联素受体基因的沉默表达 |
| 4.3.8 脂联素受体基因的过表达 |
| 4.3.9 重组脂联素受体沉默表达和过表达对标志基因的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 4.6.1 重组脂联素受体基因与标志生脂基因的表达 |
| 4.6.2 重组脂联受体基因沉默对脂肪沉积效果 |
| 4.6.3 重组脂联受体基因过表达对脂肪沉积效果 |
| 4.6.4 重组脂联素受体基因沉默表达对标志基因分化的影响 |
| 4.6.5 重组脂联素受体基因过表达对标志基因分化的影响 |
| 第五章 绵羊脂联素受体蛋白表达纯化与互作蛋白的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒和菌株 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 小量表达SDS-PAGE检测 |
| 5.2.2 大量表达SDS-PAGE检测 |
| 5.2.3 脂肪组织总蛋白提取 |
| 5.2.4 重组蛋白纯化和复性检测 |
| 5.2.5 重组蛋白复性验证 |
| 5.2.6 重组蛋白捕获 |
| 5.2.7 蛋白检测 |
| 5.2.8 抗体检测 |
| 5.2.9 蛋白挂柱率检测 |
| 5.2.10 蛋白互作效应检测 |
| 5.2.11 质谱鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 5.4.1 重组脂联素受体蛋白 |
| 5.4.2 脂肪组织总蛋白获取 |
| 5.4.3 互作蛋白诱饵钓取 |
| 5.4.4 互作蛋白筛选 |
| 结论 |
| 创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构及功能 |
| 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂种类多样性 |
| 3 蠕虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 4 其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 Tp-Serpin基因的原核表达及与宿主丝氨酸蛋白酶相互作用的体外研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 Tp-Serpin 重组蛋白对巨噬细胞功能调节的体外研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Tp-Serpin 基因的转录及表达特性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 微生物源蛋白酶的分类与来源 |
| 1.1.1 天冬氨酸蛋白酶 |
| 1.1.2 半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.1.3 丝氨酸蛋白酶 |
| 1.1.4 金属蛋白酶 |
| 1.2 微生物蛋白酶的生产 |
| 1.2.1 产蛋白酶菌株的分离 |
| 1.2.2 产蛋白酶菌株的培养 |
| 1.2.3 产蛋白酶菌株的发酵 |
| 1.2.3.1 液体发酵 |
| 1.2.3.2 固体发酵 |
| 1.3 微生物蛋白酶的分离纯化 |
| 1.4 提高蛋白酶产量的传统方法 |
| 1.4.1 自然选育 |
| 1.4.2 诱变育种 |
| 1.4.3 体内基因重组育种 |
| 1.5 微生物蛋白酶的基因工程 |
| 1.6 微生物蛋白酶的蛋白酶工程 |
| 1.6.1 微生物蛋白酶工程的理性设计 |
| 1.6.2 微生物蛋白酶工程的定向进化 |
| 1.6.3 高通量筛选的定向进化 |
| 1.7 蛋白酶对大豆蛋白水解的开发应用 |
| 1.8 本课题的研究意义和主要研究内容 |
| 1.8.1 本课题的研究意义 |
| 1.8.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 几种霉菌蛋白酶基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 试验菌株与载体 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的引物 |
| 2.1.1.4 培养基 |
| 2.1.1.5 主要仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 霉菌菌株的活化和培养 |
| 2.1.2.2 霉菌菌丝体 RNA 的提取和检测 |
| 2.1.2.3 反转录 cDNA 第一链的合成 |
| 2.1.2.4 未报道的丝氨酸蛋白酶基因的克隆 |
| 2.1.2.5 未报道的氨肽酶基因的克隆 |
| 2.1.2.6 已报道的蛋白酶基因的克隆 |
| 2.1.2.7 对蛋白酶基因的核苷酸序列的分析 |
| 2.1.2.8 密码子使用的偏好性 |
| 2.1.2.9 蛋白酶序列的基本性质分析 |
| 2.1.2.10 蛋白酶 Motif、功能位点和结构功能域的预测 |
| 2.1.2.11 蛋白酶氨基酸序列分子进化分析 |
| 2.1.2.12 蛋白酶的同源建模、二级结构和三级结构分析 |
| 2.1.2.13 氢键数和盐键数的预测 |
| 2.1.2.14 蛋白酶的溶剂可及表面积的预测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 霉菌蛋白酶基因的克隆结果 |
| 2.2.1.1 霉菌菌丝体 RNA 的提取结果 |
| 2.2.1.2 未报道的丝氨酸蛋白酶基因和氨肽酶基因的克隆结果 |
| 2.2.1.3 已报道的蛋白酶基因的克隆结果 |
| 2.2.2 霉菌蛋白酶基因的序列分析 |
| 2.2.2.1 丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析 |
| 2.2.2.2 酸性蛋白酶的生物信息学分析 |
| 2.2.2.3 中性蛋白酶的生物信息学分析 |
| 2.2.2.4 氨肽酶的生物信息学分析 |
| 2.3 小结 |
| 2.3.1 几种霉菌蛋白酶基因的克隆结果 |
| 2.3.2 对克隆获得的蛋白酶基因的序列分析结果 |
| 第三章 蛋白酶基因的异源表达及酶学性质的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.1.2 酶与主要试剂 |
| 3.1.1.3 克隆霉菌蛋白酶基因的表达引物 |
| 3.1.1.4 主要仪器 |
| 3.1.1.5 培养基及储液 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 |
| 3.1.2.3 重组蛋白酶的酶活测定 |
| 3.1.2.4 重组蛋白酶的 SDS-PAGE 电泳鉴定 |
| 3.1.2.5 重组蛋白酶的 InVision~(TM)His-tag In-gel Stain 染色鉴定 |
| 3.1.2.6 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析 |
| 3.1.2.7 重组蛋白酶的纯化 |
| 3.1.2.8 重组蛋白酶的酶谱试验 |
| 3.1.2.9 重组蛋白酶的酶学性质研究 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达结果 |
| 3.2.1.1 蛋白酶基因在大肠杆菌中表达的表达载体构建结果 |
| 3.2.1.2 蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达结果 |
| 3.2.1.3 从包涵体中纯化溶解重组蛋白酶的结果 |
| 3.2.2 蛋白酶基因在毕赤酵母的诱导表达结果 |
| 3.2.2.1 蛋白酶基因在毕赤酵母中表达的表达载体构建 |
| 3.2.2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 |
| 3.2.2.3 重组毕赤酵母菌株诱导表达重组蛋白酶的结果 |
| 3.2.2.4 重组毕赤酵母菌株诱导表达发酵液酶活的结果 |
| 3.2.2.5 重组毕赤酵母工程菌的遗传稳定性分析 |
| 3.2.2.6 重组米曲霉 AlpII 的纯化及酶学性质结果 |
| 3.2.2.7 重组黑曲霉 AlpI 的纯化及酶学性质结果 |
| 3.2.2.8 重组米曲霉 NpI 的纯化及酶学性质结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 表达系统的选择 |
| 3.3.2 重组蛋白酶的表达量 |
| 3.3.3 重组蛋白酶的纯化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 重组蛋白酶分子的定点突变 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.1.2 酶与主要试剂 |
| 4.1.1.3 定点突变引物 |
| 4.1.1.4 主要仪器 |
| 4.1.1.5 培养基及储液 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 重组蛋白酶突变位点的确定 |
| 4.1.2.2 定点突变的方法 |
| 4.1.2.3 含突变位点的蛋白基因在毕赤酵母中的表达 |
| 4.1.2.4 含突变位点的重组蛋白酶的纯化和性质研究 |
| 4.1.2.5 突变后重组蛋白酶的结构预测分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重组米曲霉 AlpII 的定点突变结果 |
| 4.2.1.1 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的确定 |
| 4.2.1.2 米曲霉 AlpII 二硫键突变位点的测序结果 |
| 4.2.1.3 突变的米曲霉 AlpII 在毕赤酵母中的表达及纯化结果 |
| 4.2.1.4 突变的重组米曲霉 AlpII 的酶学性质 |
| 4.2.1.5 突变重组米曲霉 AlpII 的结构分析结果 |
| 4.2.2 重组黑曲霉 AlpI 的定点突变结果 |
| 4.2.2.1 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的确定 |
| 4.2.2.2 黑曲霉 AlpI 二硫键突变位点的测序鉴定结果 |
| 4.2.2.3 突变的黑曲霉 AlpI 在毕赤酵母中的表达结果 |
| 4.2.2.4 突变的重组黑曲霉 AlpI 的结构分析 |
| 4.2.3 重组米曲霉 NpI 的定点突变结果 |
| 4.2.3.1 米曲霉 NpI 基因的定点突变位点的确定 |
| 4.2.3.2 米曲霉 NpI 基因的定点突变的测序结果 |
| 4.2.3.3 突变的米曲霉 NpI 在毕赤酵母中的表达结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 3 种重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 大豆分离蛋白水解度的测定-甲醛滴定法 |
| 5.1.3 重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解 |
| 5.1.3.1 对大豆分离蛋白的水解试验过程 |
| 5.1.3.2 温度对大豆分离蛋白水解度的影响 |
| 5.1.3.3 pH 对大豆分离蛋白水解度的影响 |
| 5.1.3.4 水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响 |
| 5.1.3.5 加酶量对大豆分离蛋白水解度的影响 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组米曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 |
| 5.3.1.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.1.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.1.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.1.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.2 重组黑曲霉碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 |
| 5.3.2.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.2.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.2.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.2.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.3 重组米曲霉中性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果 |
| 5.3.3.1 温度对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.3.2 pH 对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.3.3 水解时间对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.3.3.4 加酶量对大豆分离蛋白水解效果的影响结果 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 实验研究 |
| 第一章 骨骼肌特异表达FST基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒载体 |
| 1.2 主要实验材料、试剂与耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 FST基因cDNA的克隆与序列分析 |
| 2.2 骨骼肌特异表达载体pCFCDS的构建 |
| 2.3 骨骼肌特异表达载体pSPFCDS的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 FST基因cDNA基因克隆与序列分析 |
| 3.2 骨骼肌特异表达载体pCFCDS的构建 |
| 3.3 骨骼肌特异表达载体pSPFCDS的构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 绵羊转基因细胞系的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 活体实验材料 |
| 1.3 主要试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代蒙古绵羊胎儿成纤维细胞分离与体外培养 |
| 2.2 蒙古绵羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存 |
| 2.3 蒙古绵羊胎儿成纤维细胞的解冻复苏培养 |
| 2.4 绵羊胎儿成纤维细胞克隆生长曲线测定 |
| 2.5 绵羊胎儿成纤维细胞染色体数目分析 |
| 2.6 蒙古绵羊胎儿成纤维细胞的转染与筛选 |
| 2.7 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 蒙古绵羊胎儿成纤维细胞的转染与筛选 |
| 3.2 转基因绵羊成纤维细胞的转基因鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 转基因胚胎的制备与转基因绵羊的生产 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 试剂及耗材 |
| 1.4 实验所需溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 卵丘-卵母细胞复合体的采集和卵母细胞的体外成熟 |
| 2.2 绵羊卵母细胞的体细胞核移植 |
| 2.3 受体母羊的同期发情处理 |
| 2.4 转基因克隆胚胎的移植 |
| 2.5 转基因绵羊的接生 |
| 2.6 转基因绵羊的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 转基因克隆胚胎的发育 |
| 3.2 受体母羊的同期发情处理 |
| 3.3 转基因克隆胚胎的移植及产羔 |
| 3.4 转基因绵羊的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 图版 |
| 第二部分 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间论文发表情况 |
（5）慢病毒介导人CCL21基因转染对胰腺癌细胞（PANC-1）作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 第一部分 人 CCL21 基因克隆及其序列分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CCL21 重组慢病毒载体的构建及序列分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Real-time PCR筛选CCR7高表达的胰腺癌细胞株 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CCL21 重组慢病毒载体转染PANC-1 细胞株及对其生物学行为的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 Real-time PCR芯片检测CCL21基因细胞转染后相关基因的变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（6）家蚕（Bombyx mori）耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 氟与氟污染 |
| 1.2 氟中毒 |
| 1.2.1 动物氟中毒 |
| 1.2.2 人氟中毒 |
| 1.2.2.1 人类氟中毒机制研究 |
| 1.2.2.2 人类耐氟基因相关研究 |
| 1.3 家蚕耐氟性研究 |
| 1.3.1 耐氟生理生化研究 |
| 1.3.2 耐氟性指标研究进展 |
| 1.3.3 耐氟基因研究进展 |
| 1.4 细胞色素P450解毒酶研究 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 氟离子含量检测方法研究 |
| 3.1 氟离子的检测方法 |
| 3.1.1 标准曲线法 |
| 3.1.2 标准加入法 |
| 3.2 氟离子选择电极法的原理 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.1.1 桑叶 |
| 3.3.1.2 仪器和设备 |
| 3.3.1.3 主要试剂及配置 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.2.1 总离子强度缓冲液配置 |
| 3.3.2.2 绘制标准曲线 |
| 3.3.2.3 加入不同量盐酸检测氟离子 |
| 3.3.2.4 不同的晾干时间处理桑叶 |
| 3.3.2.5 不同的浸泡时间处理桑叶 |
| 3.3.2.6 不同的浸提方式处理桑叶 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 总离子强度缓冲液 |
| 3.4.2 绘制标准曲线 |
| 3.4.3 不同盐酸量对氟离子检测的影响 |
| 3.4.4 不同晾干时间 |
| 3.4.5 不同浸泡时间 |
| 3.4.6 不同浸提方式 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 氟化物对家蚕生长发育影响研究 |
| 4.1 氟化物对家蚕体重增长影响 |
| 4.1.1 材料和方法 |
| 4.1.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.2 实验方法 |
| 4.1.2 结果与分析 |
| 4.1.2.1 四龄期体重增长变化分析结果 |
| 4.1.2.2 五龄期体重变化分析结果 |
| 4.1.3 讨论 |
| 4.1.3.1 氟影响家蚕的体重增长 |
| 4.1.3.2 不同品系耐受性不同 |
| 4.1.3.3 龄期不同,氟伤害存在差异 |
| 4.2 氟化物对家蚕健康性影响研究 |
| 4.2.1 材料和方法 |
| 4.2.1.1 实验材料 |
| 4.2.1.2 实验方法 |
| 4.2.2 结果与分析 |
| 4.2.2.1 家蚕死亡体表特征 |
| 4.2.2.2 四龄氟中毒死亡率分析 |
| 4.2.2.3 五龄氟中毒死亡率分析 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.2.3.1 氟中毒生理特征 |
| 4.2.3.2 氟中毒伤害程度与品种耐氟性相关 |
| 4.2.3.4 氟中毒家蚕个体的自身调节 |
| 4.3 氟化物对家蚕食桑量影响研究 |
| 4.3.1 材料与方法 |
| 4.3.1.1 实验材料 |
| 4.3.1.2 实验方法 |
| 4.3.2 实验结果 |
| 4.3.2.1 氟化物对四龄家蚕食桑量的影响 |
| 4.3.2.2 氟化物对五龄家蚕食桑量的影响 |
| 4.3.3 讨论 |
| 4.3.3.1 氟化物影响家蚕食桑量 |
| 4.3.3.2 氟化物影响家蚕食桑量因品种而异 |
| 4.3.3.3 氟化物对家蚕食桑量的影响因龄期而异 |
| 4.4 氟化物对家蚕蚕沙量影响 |
| 4.4.1 材料与方法 |
| 4.4.1.1 材料 |
| 4.4.1.2 实验方法 |
| 4.4.2 结果与分析 |
| 4.4.2.1 氟化物对4龄家蚕蚕沙量的影响 |
| 4.4.2.2 氟化物对5龄家蚕蚕沙量的影响 |
| 4.4.3 讨论 |
| 4.5 家蚕耐氟与敏感品种乙酰胆碱酯酶的比较研究 |
| 4.5.1 材料与方法 |
| 4.5.1.1 材料 |
| 4.5.1.2 测定方法 |
| 4.5.2 结果与分析 |
| 4.5.2.1 蛋白质标准曲线 |
| 4.5.2.2 家蚕乙酰胆碱酯酶酶原蛋白的测定 |
| 4.5.2.3 家蚕乙酰胆碱酯酶活性检测 |
| 4.5.3 讨论 |
| 第五章 氟离子在家蚕体内代谢研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.1.1 实验材料 |
| 5.1.1.2 仪器和设备 |
| 5.1.1.3 主要试剂及配置 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 养蚕 |
| 5.1.2.2 样品处理 |
| 5.1.2.3 氟含量检测 |
| 5.1.2.4 计算排氟量 |
| 5.1.2.5 计算体内氟含量 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 蚕沙氟浓度的检测 |
| 5.2.1.1 蚕沙氟浓度数据对比 |
| 5.2.1.2 4龄排氟量计算 |
| 5.2.1.3 5龄排氟量计算 |
| 5.2.1.4 家蚕体内氟积累量的比较 |
| 5.2.2 每天添氟蚕体氟浓度检测 |
| 5.2.3 一次性添氟蚕体氟浓度检测 |
| 5.2.4 每天添氟蚕体组织氟浓度检测 |
| 5.2.5 每天添氟T6蚕卵氟浓度检测 |
| 5.2.6 每天添氟T6蚕蛾氟含量检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 蚕沙氟浓度的比较 |
| 5.3.2 家蚕体内氟累积的差异 |
| 5.3.3 每天添氟蚕体组织氟浓度 |
| 5.3.4 一次性添氟蚕体氟浓度 |
| 第六章 家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6ul的克隆及序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.1.1 家蚕品种 |
| 6.1.1.2 试剂配制 |
| 6.1.1.3 仪器 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 RNA的抽提 |
| 6.1.2.2 RNA的检测 |
| 6.1.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 6.1.2.4 引物设计和PCR反应 |
| 6.1.2.5 胶回收 |
| 6.1.2.6 连接 |
| 6.1.2.7 转化 |
| 6.1.2.8 转化大肠杆菌 |
| 6.1.2.9 筛选克隆产物 |
| 6.1.2.10 摇菌测序 |
| 6.1.2.11 克隆基因的序列分析 |
| 6.1.2.12 家蚕cyp6uI基因及其横向同源基因芯片表达谱分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 家蚕cyp6ul基因片段的获得 |
| 6.2.1.1 家蚕精巢组织RNA提取后反转录,A3 PCR验证 |
| 6.2.1.2 家蚕cyp6ul基因片段的获得 |
| 6.2.1.3 家蚕cyp6ul基因片段的转化 |
| 6.2.2 家蚕cyp6ul序列信息学分析 |
| 6.2.2.1 家蚕cyp6ul基因的核苷酸序列及蛋白质序列分析 |
| 6.2.2.2 家蚕cyp6ul核苷酸序列的同源性比对分析 |
| 6.2.2.3 家蚕cyp6ul基因功能分析 |
| 6.2.2.4 家蚕cyp6ul基因及其横向同源基因芯片表达谱分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 家蚕基因Bmcyp6a8的克隆及序列与表达分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.I 材料与主要试剂 |
| 7.1.1.1 实验材料 |
| 7.1.1.2 试剂与药品 |
| 7.1.1.3 仪器 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.2.1 RNA的抽提 |
| 7.1.2.2 RNA的检测 |
| 7.1.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 7.1.2.4 引物设计和PCR反应 |
| 7.1.2.5 胶回收 |
| 7.1.2.6 连接 |
| 7.1.2.7 转化 |
| 7.1.2.8 转化大肠杆菌 |
| 7.1.2.9 筛选克隆产物 |
| 7.1.2.10 家蚕cyp6a8基因序列分析 |
| 7.1.2.11 家蚕cyp6a8基因及其横向同源基因芯片表达谱分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 家蚕cyp6a8基因的克隆 |
| 7.2.2 家蚕cyp6a8基因的序列分析 |
| 7.2.3 家蚕cyp6a8基因的同源性分析 |
| 7.2.4 家蚕cyp6a8基因及其横向同源基因芯片表达谱分析 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 综合和结论 |
| 论文的创新 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表文章及参加课题情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）低温胁迫过程中入侵植物紫茎泽兰热激蛋白基因的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 外来生物入侵 |
| 1.2 外来入侵生物适应性的重要意义 |
| 1.2.1 外来入侵生物的适应性 |
| 1.2.2 外来入侵生物生态适应性的作用机制－表型可塑性 |
| 1.2.3 表型可塑性在外来植物入侵过程中的适应作用 |
| 1.2.4 外来入侵生物的适应性进化 |
| 1.2.5 增强竞争力的进化假说 |
| 1.2.6 外来入侵生物适应性的主要研究方法 |
| 1.3 生态适应性的分子机理研究 |
| 1.3.1 生态适应与生态进化的耦合过程 |
| 1.3.2 特异蛋白 |
| 1.3.3 诱导表达的基因 |
| 1.4 紫茎泽兰的危害与入侵机制 |
| 1.4.1 紫茎泽兰的危害 |
| 1.4.2 紫茎泽兰对温度的生态适应机制 |
| 1.4.3 紫茎泽兰入侵扩张的分子机理 |
| 1.5 热激蛋白在植物温度胁迫适应性方面的研究意义 |
| 1.5.1 热激蛋白的定义 |
| 1.5.2 热激蛋白的分类和定位 |
| 1.5.3 热激蛋白的特征 |
| 1.5.4 热激蛋白基因表达的调控 |
| 1.5.5 热激蛋白的生物学功能 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 低温胁迫下紫茎泽兰高海拔种群的生理生化分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料的收集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物材料的培养 |
| 2.2.2 低温处理 |
| 2.2.3 耐寒性生理生化指标的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 紫茎泽兰种群的采集与扩繁 |
| 2.3.2 高海拔种群紫茎泽兰低温处理下受害症状 |
| 2.3.3 低温处理后各种群生理指标的变化 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 紫茎泽兰热激蛋白基因的克隆与序列分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料和菌种载体 |
| 3.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 3.1.3 试剂盒与其它 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA 提取 |
| 3.2.2 cDNA 的合成 |
| 3.2.3 引物设计与合成 |
| 3.2.4 PCR 扩增目的基因片段 |
| 3.2.5 目的基因的回收与连接 |
| 3.2.6 E.coli Top10 感受态细胞制备及转化 |
| 3.2.7 SDS 碱裂解法小量制备质粒DNA 与重组子筛选 |
| 3.2.8 RACE 方法获得目的基因全长序列 |
| 3.2.9 全长基因序列的获得与分析 |
| 3.2.10 全长基因蛋白序列的结构、进化分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 热激蛋白基因的全长序列获得结果 |
| 3.3.2 序列分析 |
| 3.3.3 运用生物信息软件进行蛋白结构与功能预测 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 紫茎泽兰热激蛋白基因温度逆境下的表达动态分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种载体 |
| 4.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 4.1.3 试剂盒与其它 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 半定量PCR 验证 |
| 4.2.2 Northern 杂交分析热激蛋白温度逆境下的表达模式 |
| 4.2.3 Southern 杂交 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 紫茎泽兰HSPs 基因的表达组织特异性分析 |
| 4.3.2 HSPs 基因在温度逆境下的表达动态 |
| 4.3.3 HSPs 基因家族分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 紫茎泽兰 HSPS 的原核表达和功能分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株载体 |
| 5.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 5.1.3 试剂盒和其它材料 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 原核表达载体pET-30a-Aahsps 的构建 |
| 5.2.2 重组pET-30a-Aahsps 的诱导表达 |
| 5.2.3 大肠杆菌细胞活力实验 |
| 5.2.4 大肠杆菌可溶性蛋白分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 原核表达SDS-PAGE 分析 |
| 5.3.2 Aahsps 的转入对大肠杆菌在适温(37°C)条件下的生长没有影响 |
| 5.3.3 异源表达Aahsps 提高大肠杆菌的耐热性 |
| 5.3.4 低温条件下Aahsps 的表达对大肠杆菌的保护作用 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 紫茎泽兰 HSP90 和 HSP17.6 基因启动子的克隆及其序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 DNA 提取 |
| 6.1.3 染色体步行法克隆hsp90 启动子 |
| 6.1.4 TAIL-PCR 克隆紫茎泽兰hsp17.6 基因的启动子 |
| 6.1.5 hsp90 和hsp17.6 启动子的突变表达载体的构建 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 紫茎泽兰hsp90 启动子克隆 |
| 6.2.2 紫茎泽兰hsp17.6 启动子克隆 |
| 6.2.3 hsp90 和hsp17.6 启动子序列的分析 |
| 6.2.4 hsp90 和hsp17.6 启动子的突变表达载体的构建 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 紫茎泽兰sHSPs 的理化性质分析 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 菌株载体 |
| 7.1.2 工具酶和生化试剂 |
| 7.1.3 试剂盒和其它材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 大肠杆菌表达载体pET-30a-hsp17.6 和pET-30a-hsp17.7 的构建 |
| 7.2.2 重组pET-30a-hsp17.6 和pET-30a-Ahsp17.7 的诱导表达 |
| 7.2.3 重组pET-30a-hsp17.6 和pET-30a-hsp17.7 的纯化 |
| 7.2.4 分子伴侣活性测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 紫茎泽兰HSP17.6 和HSP17.7 的蛋白序列的比对分析 |
| 7.3.2 利用融合蛋白表达载体获得高纯度的纯化sHSPs |
| 7.3.3 HSP17.6 和HSP17.7 可减缓CS 的热变性 |
| 7.3.4 HSP17.6 和HSP17.7 促进热变性的CS 复性 |
| 7.4 小结与讨论 |
| 第八章 转 Aahsp17.6 基因植物耐寒性分析 |
| 8.1 实验材料 |
| 8.1.1 植物材料 |
| 8.1.2 菌种和质粒 |
| 8.1.3 酶及化学试剂 |
| 8.1.4 培养基 |
| 8.1.5 主要仪器设备 |
| 8.2 实验方法 |
| 8.2.1 叶绿体sHSP 植物表达框架的构建及农杆菌的转化 |
| 8.2.2 根癌农杆菌Ti 质粒介导的植物遗传转化 |
| 8.2.3 转基因植物的分子鉴定 |
| 8.2.4 指标测定 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 植物双元表达载体的构建 |
| 8.3.2 抗生素浓度的筛选 |
| 8.3.3 转基因番茄的获得 |
| 8.3.4 转基因番茄的鉴定 |
| 8.3.5 转Aahsp17.6 基因番茄的耐寒性分析 |
| 8.4 小结与讨论 |
| 第九章 结论与展望 |
| 9.1 本文结论 |
| 9.2 本研究创新点 |
| 9.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）ABA诱导的玉米（Zea mays L.）MAPK基因克隆、表达分析、定位及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 ABA与植物抗氧化防护的关系 |
| 1.1 植物对环境胁迫的响应 |
| 1.2 ABA对植物抗氧化防护的调控 |
| 2 ABA信号转导机理 |
| 2.1 ABA诱导ROS的产生 |
| 2.2 Ca~(2+)参与了细胞中ABA信号转导 |
| 2.3 蛋白质可逆磷酸化作用 |
| 3 促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)研究 |
| 3.1 MAPK级联系统 |
| 3.2 MAPK结构和生化特性 |
| 3.3 动物及酵母中的MAPK分类及功能研究 |
| 3.4 植物体中的MAPK分类 |
| 3.5 MAPK活性的调控 |
| 3.6 MAPK与细胞骨架蛋白的相互作用 |
| 3.7 MAPK在细胞中的定位 |
| 3.8 MAPK在生物体的功能 |
| 3.9 MAPK基因克隆 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 主要研究内容 |
| 第二章 ABA诱导的玉米MAPK(ZmMPK3、p46MAPK)基因克隆及其序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 玉米中MAPK全长基因的克隆策略 |
| 1.3 玉米幼苗总RNA提取 |
| 1.4 RNA产率和质量鉴定 |
| 1.5 电泳检查RNA完整性 |
| 1.6 cDNA第一条链的合成(RNA反转录cDNA) |
| 1.7 MAPK保守序列的扩增 |
| 1.8 PCR产物的纯化与回收 |
| 1.9 目的片段和载体的连接 |
| 1.10 重组质粒的转化 |
| 1.11 重组质粒的鉴定 |
| 1.12 MAPK 5’端基因的克隆[5’-RACE(5'Rapid Amplification of cDNA Ends)] |
| 1.13 MAPK 3’端基因的克隆[3’-RACE(3'rapid amplification of cDNA ends)] |
| 1.14 MAPK全长基因的克隆 |
| 1.15 基因序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的质量检测结果 |
| 2.2 玉米MAPK保守片段的扩增 |
| 2.3 ZmMPK3基因的克隆 |
| 2.4 p46MAPK基因的克隆 |
| 2.5 玉米两种MAPK:ZmMPK3和ZmMPK5的生物信息学分析 |
| 2.6 玉米两种MAPK系统进化树分析 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ZmMPK3和ZmMPK5的原核表达、活性检测及抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 原核表达载体pET-MAPK和pGEX-MAPK的构建 |
| 1.3 His-tag-MAPK融合蛋白的原核表达 |
| 1.4 His-tag-MAPK融合蛋白的检测 |
| 1.5 GST-MAPK融合蛋白的原核表达及检测 |
| 1.6 细菌的裂解和包涵体的制备 |
| 1.7 融合蛋白的亲和纯化 |
| 1.8 体外表达的MAPK融合蛋白激酶活性的检测 |
| 1.9 抗体的制备 |
| 1.10 SDS-PAGE和Western-Blot |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原核表达载体pET-MAPK和pGEX-MAPK的构建 |
| 2.2 His-tag-MAPK融合蛋白的诱导表达 |
| 2.3 GST-MAPK融合蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.4 原核表达蛋白的激酶活性检测 |
| 2.5 抗体的专一性检测 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 第四章 多种非生物胁迫对ZmMPK3和ZmMPK5转录水平和激酶水平的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 植物激素及非生物胁迫处理 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 RNA提取及反转录cDNA |
| 1.5 荧光定量RT-PCR |
| 1.6 粗酶液提取 |
| 1.7 SDS-PAGE和Western-Blot |
| 1.8 免疫共沉淀凝胶激酶分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ZmMPK3和ZmMPK5组织特异性表达分析 |
| 2.2 多种胁迫对ZmMPK3在mRNA水平、蛋白水平及激酶活性的调控 |
| 2.3 非生物胁迫对ZmMPK5在转录水平及激酶活性的诱导 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 第五章 ZmMPK3和ZmMPK5的亚细胞定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 瞬间表达载体pXZMPK3和pXZMPK5的构建 |
| 1.3 玉米原生质体的分离 |
| 1.4 质粒提取 |
| 1.5 PEG融合法转化玉米原生质体 |
| 1.6 显微镜观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 瞬间表达载体pXZMPK3和pXZMPK5的构建 |
| 2.2 玉米原生质体的分离 |
| 2.3 ZmMPK3和ZmMPK5在玉米原生质体的亚细胞定位 |
| 2.4 玉米原生质体瞬间表达载体的转化效率 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 第六章 ZmMPK3对玉米抗氧化防护的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 ABA处理实验 |
| 1.3 玉米原生质体的提取、表达载体的转化和培养 |
| 1.4 原生质体RNA的提取 |
| 1.5 原生质体蛋白的提取 |
| 1.6 RT-PCR引物设计 |
| 1.7 抗氧化酶活性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ABA对ZmMPK3和ZmMPK5的激活及对抗氧化基因表达的影响 |
| 2.2 ZmMPK3过表达对玉米原生质体抗氧化防护的影响 |
| 3 小结 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 1 研究小结 |
| 2 创新之处 |
| 3 存在的问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（9）甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 甲型流感病毒各亚型HA和NA之间的血清学交叉反应特征研究 |
| 第一章 甲型流感病毒各亚型HA和NA基因序列分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 甲型流感病毒各亚型HA1基因和NA基因的杆状病毒表达载体构建、表达以及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 甲型流感病毒各亚型HA基因和NA基因的重组腺病毒载体构建、包装、以及抗体制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 甲型流感病毒HA和NA的血清学交叉反应特征的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第二部分 甲型流感病毒反向遗传系统的建立及优化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| References |
| 致谢 |
（10）猪Lipin和FIT基因的克隆与组织分布（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪Lipin 基因的研究进展 |
| 1.1.1 磷脂酸磷酸酶在脂类代谢中的作用 |
| 1.1.2 Lipin 基因的相关信息 |
| 1.1.3 Lipin 基因的组织表达 |
| 1.1.4 展望 |
| 1.2 FIT 基因的研究进展 |
| 1.2.1 FIT 是内质网驻足的膜蛋白 |
| 1.2.2 FIT 介导脂滴积聚 |
| 1.2.3 FIT 蛋白的结构 |
| 1.2.4 FIT 蛋白的表达 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 猪Lipin 基因的克隆与组织分布 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 仪器与试剂 |
| 3.1.3 Lipin 基因的克隆 |
| 3.1.3.1 引物设计与合成 |
| 3.1.3.2 组织中总RNA 的提取 |
| 3.1.3.3 RT-PCR 扩增 |
| 3.1.3.4 DNA 序列测定 |
| 3.1.3.5 DNA 序列分析 |
| 3.1.4 组织分布的特异性 |
| 3.2 猪FIT 基因的克隆与组织分布 |
| 3.2.1 样品采集 |
| 3.2.2 仪器与试剂 |
| 3.2.3 FIT 基因的克隆 |
| 3.2.3.1 FIT1 基因的克隆 |
| 3.2.3.1.1 FIT1 基因引物设计与合成 |
| 3.2.3.1.2 组织中总RNA 的提取 |
| 3.2.3.1.3 逆转录 |
| 3.2.3.1.4 猪FIT1 部分cDNA 的扩增 |
| 3.2.3.1.5 猪FIT1 基因3’非编码区扩增 |
| 3.2.3.1.6 DNA 序列测定 |
| 3.2.3.1.7 DNA 序列分析 |
| 3.2.3.2 FIT2 基因的克隆 |
| 3.2.3.2.1 FIT2 基因引物设计与合成 |
| 3.2.3.2.2 组织中总RNA 的提取 |
| 3.2.3.2.3 逆转录 |
| 3.2.3.2.4 猪FIT2 部分cDNA 的扩增 |
| 3.2.3.2.5 猪FIT2 基因3’非编码区扩增 |
| 3.2.3.2.6 DNA 序列测定 |
| 3.2.3.2.7 DNA 序列分析 |
| 3.2.4 FIT1 和FIT2 组织分布的特异性 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 猪Lipin 基因的克隆与组织分布 |
| 4.1.1 克隆与序列分析 |
| 4.1.2 猪 Lipin 基因的组织分布 |
| 4.2 猪FIT 基因的克隆与组织分布 |
| 4.2.1 克隆与序列分析 |
| 4.2.2 猪FIT基因的组织分布( |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 猪Lipin 基因的克隆与组织分布 |
| 5.1.2 猪FIT 基因的克隆与组织分布 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文及在 GenBank 上注册的基因号 |
四、RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析（论文参考文献）
- [1]脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究[D]. 张德荣. 甘肃农业大学, 2019
- [2]伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫免疫逃逸中的功能分析[D]. 王艳凤. 吉林大学, 2015(08)
- [3]霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究[D]. 柯野. 华南理工大学, 2013(05)
- [4]骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究[D]. 王玮. 内蒙古大学, 2011(10)
- [5]慢病毒介导人CCL21基因转染对胰腺癌细胞（PANC-1）作用的实验研究[D]. 崔凯. 济南大学, 2011(11)
- [6]家蚕（Bombyx mori）耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析[D]. 曾媛琴. 西南大学, 2010(08)
- [7]低温胁迫过程中入侵植物紫茎泽兰热激蛋白基因的作用[D]. 宫伟娜. 中国农业科学院, 2009(04)
- [8]ABA诱导的玉米（Zea mays L.）MAPK基因克隆、表达分析、定位及功能研究[D]. 王金香. 南京农业大学, 2009(06)
- [9]甲型流感病毒亚型间血清学交叉反应特征研究及反向遗传系统的优化[D]. 崔淑娟. 北京协和医学院, 2009(01)
- [10]猪Lipin和FIT基因的克隆与组织分布[D]. 王静. 河南农业大学, 2009(06)