一、大鼠急性弥漫性脑损伤后血脑屏障通透性的变化（论文文献综述）
张伟[1]（2021）在《参附汤对脑缺血后血脑屏障保护的协同增效作用以及机制研究》文中研究表明背景:脑卒中在中医学上又称为中风,是全球首要致残因素,也是我国首位致死因素,其中缺血性脑卒中的发病率占卒中总数的86%。针对如此高发病率和高死亡率的疾病,目前国际公认的治疗方法是静脉溶栓和/或血管内治疗,但是其只有3-4.5小时的治疗时间窗,限制了疾病的治疗。研究证明,血脑屏障（Blood-brainbarrier,BBB）作为脑组织和血液之间的屏障,通过维持其结构和功能的完整性,对缺血性脑卒中的治疗有着重要作用。参附汤作为益气温阳固脱的代表方剂,在中国古代就有用参附汤治疗中风的记载,《冯氏锦囊·杂症》中记载:证见中风,手撒口开,遗尿,参附汤用之。目前有研究显示人参和附子中的活性单体对脑缺血后的BBB有保护作用,但是参附汤相比人参和附子单味中药对BBB的保护是否有协同增效作用,是否可以通过脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation,FAO）机制发挥作用,目前有一定的研究空间。目的:为探讨参附汤对脑缺血后BBB的保护是否有协同增效作用,本课题首先通过体内实验从小鼠BBB渗透性和紧密连接蛋白的表达方面进行验证;然后通过体外实验,构建体外BBB模型,进一步观察参附汤含药血清对氧糖剥夺再复氧（OGD/R）后BBB渗透的影响;最后通过体内实验初步从FAO过程的限速酶肉碱棕榈油转移酶IA（CPT1A）表达方面研究参附汤的作用机制。本课题基于古方的临床运用基础,通过实验探索益气温阳方剂参附汤对脑缺血再灌注损伤后BBB的保护是否有协同增效作用,以及具体的作用机制。方法:（1）建立小鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注[MCAO（I/R）]模型和分组:建模在显微镜辅助下进行,分离小鼠颈部肌肉后,将线栓从颈外动脉插入,经颈内动脉进入大脑前动脉,阻断来自栓塞一侧的大脑前动脉的血供,同时阻塞接受后交通动脉血供的颈内动脉颅内段,缺血1小时后拔栓再灌注。将所有小鼠分为5组:SHAM组、MCAO组、MCAO+红参组（HS组）、MCAO+附子组（FZ组）和MCAO+参附组（SF组）。（2）体内实验探索红参和附子单味中药对脑缺血再灌注损伤后的BBB通透性和紧密连接蛋白的影响,以及红参和附子配伍后的参附汤与各单味药比较是否具有协同增效作用:对MCAO造模后15分钟的小鼠,进行对应药物灌胃处理,即HS组进行单味红参灌胃,FZ组进行单味附子灌胃,SF组进行参附汤灌胃。通过免疫荧光法检测免疫球蛋白（IgG）、微管相关蛋白2（MAP2）和闭合蛋白-5（Claudin-5）表达;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测紧密连接蛋白Claudin-5、咬合蛋白（Occludin）和闭合小环蛋白1（ZO-1）的表达。（3）体外实验进一步确认参附汤对BBB通透性的影响:用脑微血管内皮细胞（bEnd.3）建立体外BBB单层培养模型。用从动物体内提取且经过灭菌处理的参附汤含药血清,于造模第三天对模型进行预处理,将造模完成的BBB模型放入低氧仓进行1小时的氧糖剥夺（OGD）,再经过2小时复氧处理,模拟脑缺血再灌注损伤,复氧时用参附汤含药血清对损伤的体外BBB模型进行干预治疗。用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）作为荧光探针,检测BBB的通透性。（4）研究FAO机制在参附汤保护缺血性中风后BBB中的作用:具体造模、分组和给药方式与体内实验同,用免疫荧光技术和蛋白印迹技术检测FAO的速率控制酶CPT1A的表达,通过CPT1A表达分析给药组和模型组,以及不同给药组之间的表达差别。判断参附汤在FAO过程中是否有协同增效作用。结果:（1）建立小鼠MCAO（I/R）模型和分组:建模以后用激光散斑成像技术和Longa评分法评价建模成功与否,最终纳入实验组的所有MCAO模型均符合标准,证明动物造模成功。分组为SHAM组、MCAO组、MCAO+红参组（HS组）、MCAO+附子组（FZ组）和MCAO+参附组（SF组）共五组,每组10只。（2）体内实验探索红参和附子单味中药对脑缺血再灌注损伤后的BBB通透性和紧密连接蛋白的影响,以及参附汤的协同增效作用:与SHAM组相比,其余四组均有较明显的IgG表达,说明造模后存在BBB通透性增加现象。与MCAO组相比,给药组（HS组、FZ组和SF组）的IgG渗透明显降低（P<0.01）,且差异具有统计学意义。但是就目前数据而言,无法确定参附汤干预治疗的脑缺血后BBB保护作用是否优于单独的红参或附子用药,需要进一步检测。下面从紧密连接蛋白Claudin-5的荧光表达上进一步分析差异,结果显示所有经过MCAO（I/R）方式造模的组别中Claudin-5表达水平均低于SHAM组,说明造模后出现BBB的损伤。与MCAO组相比较,所有给药组（HS组、FZ组和SF组）的Claudin-5的表达水平均有较大程度提高（P<0.01）,差异具有统计学意义。进一步通过分析SF组与HS组、FZ组的差异,发现参附汤用药对紧密连接蛋白Claudin-5的表达高于红参和附子单独用药的表达（P<0.01）,差异具有统计学意义。进一步通过WB技术检测紧密蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-5的表达。实验结果显示,HS组和FZ组的Occludin表达与MCAO组的差异无统计学意义,但是SF组Occludin的表达明显高于MCAO组,效果较突出（P<0.01）,差异具有统计学意义。在Claudin-5的表达上,HS组与FZ组与MCAO模型组的差异无统计学意义,但SF组的表达比MCAO组强（P<0.05）,且差异具有统计学意义。SF组的ZO-1表达明显高于MCAO组（P<0.01）,差异具有统计学意义。与Occludin和Claudin-5表达相同,HS组和FZ组与MCAO组相比无明显差异。（3）体外实验进一步确认参附汤对BBB通透性的影响:实验发现BBB的跨膜电阻大约在建模的第三天增加明显,建模的第5-6天达到最高峰,提示建模成功。在电阻达到峰值时,进一步通过4h渗漏实验发现,4h后小室内外液面下降小于0.1 mm,进一步证实体外BBB模型建成。进一步检测FITC-dextran急性期的渗漏情况,结果显示参附汤含药血清干预对OGD/R造成的BBB损伤有所降低,提示参附汤的BBB保护作用。进一步论证发现,参附汤血清干预的各组均比OGD模型组的FITC-dextran 的渗透率低（P<0.05）,且差异具有统计学意义,其中以 20%高剂量参附汤血清组的作用最显着（P<0.01）,统计学差异明显。进一步分析不同浓度参附汤血清组之间的差异,发现5%参附汤血清组和10%参附汤血清组与20%参附汤血清组相比无明显区别,差异无统计学意义。但是20%参附汤血清组的渗透率比5%参附汤血清组和10%参附汤血清组的低（P<0.05）,差异有统计学意义。判断20%浓度的参附汤对OGD处理的体外BBB保护作用更强。但鉴于附子有一定毒副作用,参附汤含药血清的浓度与BBB保护程度之间的关系有待进一步商榷。（4）研究FAO机制在参附汤保护缺血性中风后BBB中的作用:免疫荧光检测结果显示,HS组、FZ组和SF组的CPT1A表达均高于MCAO组（P<0.01）,差异具有统计学意义。进一步论证给药组之间是否有差异,将HS组和FZ组分别与SF组进行比较,发现SF组的CPT1A表达明显高于其他两组（P<0.01）,差异具有统计学意义。证明在FAO的过程中,红参与附子协同作用的效果优于其单独作用的效果。WB结果显示,通过MCAO造模后,血管内皮细胞的FAO水平降低,除SHAM组以外,各组的CPT1A表达均有所降低。但是与MCAO组相比,给药处理的HS组、FZ组和SF组的CPT1A表达水平有所提升（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论:1、研究发现参附汤对脑缺血再灌注损伤后的BBB具有保护作用,参附汤与方中各个单味药相比具有协同增效作用。2、初步作用机制的研究结果显示,SF组能够增加FAO限速酶CPT1A的表达,且与各个单味药比较具有协同增效作用,说明参附汤对BBB的保护可能是通过FAO机制,但是具体上下游通路有待进一步探究。
蒋鸿雁[2]（2021）在《大麻二酚（CBD）改善脑损伤血脑屏障渗透性的研究》文中认为[目的]1.探索创伤性脑损伤（TBI）致伤后8 h、24 h、2d、3d、5 d、7 d大鼠脑组织含水量情况,确定脑水肿的高峰期;2.探索大麻二酚（CBD）梯度剂量（5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg）对TBI大鼠的干预作用,确定CBD最佳干预剂量;3.探索CBD最佳干预剂量对TBI大鼠血脑屏障（BBB）渗透性的改善作用。[方法]（1）采用“改良Feeney自由落体撞击法,建立大鼠TBI模型”,随机分为TBI 致伤后 8h、24h、2d、3d、5d、7d 组,同时设置 Sham 组（n=3）,通过计算干/湿重比值,确定脑水肿发生的高峰期。（2）脑水肿发生的高峰期确定为 TBI 后 24 h,设置 Sham 组、TBI+vehicle 组、TBI+CBD 5 mg/kg 组、TBI+CBD 10 mg/kg 组和 TBI+CBD 20 mg/kg 组（n=3）[CBD 30 mg/kg 因有致死情况而被剔除],通过行为学、形态学、分子生物学和ELISA实验,探索CBD最佳干预剂量。（3）CBD最佳干预剂量确定为10 mg/kg,设置Sham组、TBI+vehicle组、TBI+CBD 10mg/kg组（n=3）,通过形态学、分子生物学和伊文思蓝染色实验,探索CBD 10 mg/kg对TBI后BBB渗透性的改善作用。[结果]1 探索TBI后脑水肿高峰期干/湿重比结果显示:与Sham组相比,TBI致伤后随时间点推移（8 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d）大鼠脑组织含水量呈现出上升趋势,均有统计学差异（P<0.05）。其中TBI后24 h的脑组织含水量达到高峰。2 探索CBD最佳干预剂量2.1 改良神经功能缺损评分（mNSS）（1）与Sham组相比,TBI组大鼠mNSS评分明显增高（P<0.01）;（2）与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组的mNSS评分最低（P<0.05）。2.2 ELISA实验（S100-β为脑损伤标记物）（1）与Sham组相比,TBI组S100-β含量明显增加（P<0.001）;（2）与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组S100-β含量最低（P<0.001）。2.3干/湿重比（1）Sham组大鼠的左侧脑组织（损伤对侧）和右侧脑组织（损伤侧）含水量无明显变化;（2）TBI组损伤侧脑组织含水量较损伤对侧增加（P<0.05）;（3）在大鼠右侧（损伤侧）脑组织中:①与Sham组相比,TBI组脑组织含水量增多（P<0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10mg/kg组脑组织含水量最低（P<0.05）。2.4 HE染色（大鼠损伤侧皮质区）（1）Sham组神经元形态正常,着色均匀,细胞结构完整,轮廓清晰,胞质丰富,胞核清晰、核大而圆、位于细胞中央,核仁明显;（2）与Sham组相比,TBI组神经元出现病理学变化,即细胞肿胀,细胞核深染,轮廓不清,胞质溶解,出现空泡;（3）与TBI组相比,CBD 5 mg/kg干预组仍有神经元胞体肿胀,细胞核深染,胞质溶解等病理学改变,CBD 10 mg/kg与CBD 20 mg/kg干预组神经元胞体仍有轻度肿胀。2.5 尼氏染色（大鼠损伤侧皮质区）（1）Sham组神经元形态正常,细胞轮廓清晰,尼氏体丰富,染色均匀,细胞核染成淡紫色、呈圆形、位于细胞中央,核仁明显;（2）与Sham组相比,TBI组神经元的细胞核和核仁消失,胞体浓缩呈三角形,出现大量的固缩性坏死（P<0.01）;（3）与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组的固缩性坏死神经元数量最少（P<0.01）。2.6 免疫荧光单标染色（大鼠损伤侧皮质区）（1）星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性细胞的形态学变化:①Sham组GFAP阳性表达的星形胶质细胞胞体较小、突起呈细长状;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞胞体变大、突起增多和变粗,呈激活状态;③与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 5 mg/kg组星形胶质细胞的激活状态出现减弱,CBD 10 mg/kg组星形胶质细胞激活状态减弱明显,CBD 20 mg/kg干预组星形胶质细胞形态变化和CBD 10 mg/kg干预组近似。2)对GFAP阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组GFAP的荧光强度较Sham组增强（P<0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组GFAP的荧光强度较TBI组明显减弱（P<0.05）。（2）水通道蛋白AQP4。1)AQP4阳性表达的形态学变化:①Sham组AQP4阳性表达在细胞膜上,呈中空小管状结构;②与Sham组相比,TBI组AQP4阳性表达的形态变化不大;③与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,AQP4阳性表达的形态仍呈中空小管状。2)对AQP4阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组AQP4的荧光强度较Sham组增强（P<0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组AQP4的荧光强度较TBI组明显减弱（P<0.05）。2.7 Western blotting实验（大鼠损伤侧皮质区）（1）GFAP、AQP4、TNF-α和IL-1β的蛋白表达:①与Sham组相比,TBI组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达升高（P<0.05）,AQP4的蛋白表达变化不具有统计学意义（P>0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,除了 TNF-α的蛋白外,CBD 10 mg/kg组GFAP、AQP4和IL-1β的蛋白表达最低（P<0.05）。（2）Claudin-5 和 Occludin 的蛋白表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的蛋白表达变化无明显差异（P>0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,Claudin-5和Occludin的蛋白表达变化无明显差异（P>0.05）。2.8 RT-PCR实验（大鼠损伤侧皮质区）（1）GFAP、AQP4、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 GFAP、AQP4、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达升高（P<0.05）;②与 TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,除了 TNF-α的mRNA外,CBD 10 mg/kg组GFAP、AQP4 和 IL-1β 的 mRNA 表达最低（P<0.05）。（2）Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的mRNA表达降低（P<0.05）;②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg 组 Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达最高（P<0.05）。3 探索CBD对BBB渗透性的改善3.1 免疫荧光单标染色（大鼠损伤侧皮质区）（1）星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性表达的星形胶质细胞形态学变化:①Sham组星形胶质细胞胞体小、突起细长、突起末端的足板贴附在血管壁上;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞呈激活状态,胞体大、突起增多、突起末端的足板肿胀,贴附在血管处有断裂;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组星形胶质细胞的激活状态减弱。2)对GFAP阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组GFAP荧光强度较Sham组增强（P<0.05）;②CBD 10 mg/kg干预组GFAP荧光强度较TBI组减弱（P<0.05）。（2）紧密连接蛋白Claudin-5。1)Claudin-5阳性表达的形态学变化:①Sham组Claudin-5的阳性表达的形态多呈线条状;②与Sham组相比,TBI组Claudin-5阳性表达的线条状发生断裂,多呈点状;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5阳性表达的形态有所恢复,接近正常的线条状。2)对Claudin-5阳性表达的平均荧光强度进行定量分析发现:①TBI组Claudin-5荧光强度较Sham组明显减弱（P<0.01）;②CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5荧光强度较TBI组明显增加（P<0.05）。（3）紧密连接蛋白Occludin。1)Occludin阳性表达的形态学变化:①Sham组Occludin的阳性表达出现在细胞之间呈线条状;②与Sham组相比,TBI组Occludin阳性表达的形态发生改变,线条状不再连续,呈断裂或点状;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Occludin阳性表达的形态有所恢复。2)对Occludin阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组Occludin荧光强度较Sham组明显减弱（P<0.01）;②CBD 10 mg/kg干预组Occludin荧光强度较TBI组增加（P<0.05）。3.2 免疫荧光双标染色（大鼠损伤侧皮质区）（1）星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性细胞的形态学变化:①在Sham组中,血管处GFAP 阳性表达的星形胶质细胞胞体小、突起细长、突起末端的足板贴附在血管壁上;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞呈激活状态,胞体大,突起增多,突起末端的足板肿胀,贴附在血管处出现断裂;③与TBI组相比,CBD 10mg/kg干预组星形胶质细胞的激活状态减弱。（2）水通道蛋白AQP4。1)AQP4阳性表达的形态学变化:①Sham组AQP4阳性表达在细胞膜上,呈中空小管状结构;②与Sham组相比,TBI组AQP4阳性表达的形态变化不大;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组AQP4阳性表达的形态仍呈中空小管状。（3）对GFAP与AQP4 阳性共表达的平均荧光强度进行定量分析:①在Sham组中,GFAP（绿色）与AQP4（红色）存在共表达（黄色）;②TBI组GFAP与AQP4共表达荧光强度较Sham组增强（P<0.01）;③CBD 10 mg/kg干预组GFAP与AQP4共表达荧光强度较TBI组减弱（P<0.05）。3.3 Western blotting实验（大鼠损伤侧皮质区）（1）GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达:①与Sham组相比,TBI组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达明显增加（P<0.05）;②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）Claudin-5 和 Occludin 的蛋白表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的蛋白表达明显降低（P<0.05）;②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5与Occludin的蛋白表达增加（P<0.05）。3.4 RT-PCR实验（大鼠损伤侧皮质区）（1）GFAP、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组GFAP、TNF-α和IL-1 β的mRNA表达显着增加（P<0.05）;②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg 干预组 GFAP、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达明显下降（P<0.05）。（2）Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5的mRNA表达无明显差异（P>0.05）,Occludin的mRNA表达出现下降（P<0.05）;②与 TBI 组相比,CBD 10 mg/kg 干预组 Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA表达显着上升（P<0.05）。3.5伊文思蓝示踪（EB）染色（大鼠损伤侧皮质）（1）对脑组织外观观察:Control组未见蓝染;Sham组出现少许蓝染;TBI组蓝染明显;CBD 10 mg/kg干预组蓝染明显;（2）对损伤侧皮质区脑组织EB含量进行检测:①与Control组相比,Sham组的EB含量稍微有升高,但是无统计学意义（P>0.05）;②与Sham组相比,TBI组的EB含量明显升高（P<0.01）;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组的EB含量明显下降（P<0.05）。[结论]1.TBI大鼠的脑水肿高峰期发生在TBI致伤后24 h;2.在CBD梯度剂量中,CBD 10 mg/kg为本实验的最佳干预剂量;3.CBD 10 mg/kg能改善TBI大鼠神经功能缺损,减弱星形胶质细胞激活和增加紧密连接蛋白表达,从而改善BBB结构完整性和渗透性,减轻TBI后继发性脑水肿。
康晓文[3]（2021）在《“醒脑开窍”针法对脑缺血损伤血脑屏障通透性的调控作用及对ICAM-1、MMPs-9表达的影响》文中研究说明目的:观察“醒脑开窍”针法对脑缺血损伤后血脑屏障通透性的调控作用,并探讨其作用机制,为“醒脑开窍”针法治疗脑血管病提供理论依据。方法:SPF级雄性SD大鼠88只,按体重随机分为空白组（N=8）,假手术组（N=8）,模型组（N=24）,中风膏组（N=24）,针刺+中风膏组（N=24）,除空白组和假手术组外,其它3组每组组内再进一步分为4h,3d和15d三个亚组,每个亚组8只。空白组不予处理,假手术组予以生理盐水灌胃,2次/日,中风膏组予以中风膏混悬液灌胃,2次/日,针刺+中风膏组在中风膏灌胃的基础上予以“醒脑开窍”针法,1次/日。干预后通过Zea-longa评分方法检测各组实验大鼠的神经功能缺损评分;采用伊文斯蓝测定法评价各组实验大鼠的血脑屏障通透性;用实时定量聚合酶链反应检测缺血脑组织ICAM-1、MMPs-9的基因相对表达。结果:1.大鼠神经功能缺损评分缺血再灌注4h:与空白组和假手术组比较,模型组、中风膏组和针刺+中风膏组神经功能缺损评分均上升（P<0.05）;缺血再灌注3d:与模型组相比,中风膏组神经功能缺损评分几乎无变化,针刺+中风膏组神经功能缺损评分降低（P>0.05）;缺血再灌注15d:与模型组相比,中风膏组和针刺+中风膏组神经功能缺损评分均降低（P<0.05）。其中,针刺+中风膏组比中风膏组下降更显着（P>0.05）。与4 h、3d相比:针刺+中风膏组15d神经功能缺损评分显着降低（P<0.05）。2.大鼠EB含量测定缺血再灌注4h:与空白组和假手术组比较,模型组、中风膏组和针刺+中风膏组EB含量均上升（P<0.05）;缺血再灌注3d:与模型组相比,中风膏组、针刺+中风膏组的EB含量均降低（P<0.05）,中风膏组与针刺+中风膏组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）;缺血再灌注15d:与模型组相比,中风膏组、针刺+中风膏组EB含量均降低（P<0.05）。其中,针刺+中风膏组的EB含量高于中风膏组（P<0.05）。与4h相比:针刺+中风膏组3d时EB含量增高,15d时EB含量降低。3.大鼠脑组织ICAM-1mRNA的含量测定缺血再灌注4h:与空白组和假手术组比较,模型组、中风膏组和针刺+中风膏组的ICAM-1mRNA含量均上升（P<0.05）;缺血再灌注3d:与模型组相比,中风膏组、针刺+中风膏组的ICAM-1mRNA含量均降低（P>0.05）,中风膏组与针刺+中风膏组相比较无统计学差异（P>0.05）;缺血再灌注15d:与模型组相比,中风膏组和针刺+中风膏组ICAM-1mRNA含量均降低（P<0.05）。其中,针刺+中风膏组比中风膏组ICAM-1mRNA含量下降更显着（P<0.05）。针刺+中风膏组ICAM-1mRNA含量在4h、3d、15d各个时相依次降低。4.大鼠脑组织MMPs-9含量检测缺血再灌注4h:与空白组和假手术组比较,模型组、中风膏组和针刺+中风膏组MMPs-9含量均上升（P<0.05）;缺血再灌注3d:与模型组相比,中风膏组、针刺+中风膏组MMPs-9含量均下降（P<0.05）,中风膏组与针刺+中风膏组比较差异无统计学差异（P>0.05）;缺血再灌注15d:与模型组相比,中风膏组和针刺+中风膏组MMPs-9含量均降低（P<0.05）。其中,针刺+中风膏组比中风膏组下降更显着（P<0.05）。与4h相比:针刺+中风膏组3d时MMPs-9含量增高,15d时MMPs-9含量降低。结论:1.“醒脑开窍”针法对脑缺血损伤血脑屏障通透性具有双向调控作用。在脑缺血再灌注3d时“醒脑开窍”针法可以降低血脑屏障的通透性,在15d时“醒脑开窍”针法可以增加血脑屏障的通透性。2.此种双向调控作用可能是通过针刺调节缺血再灌注大鼠脑组织中ICAM-1含量和MMPs-9含量来实现的。
田方泽[4]（2020）在《通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究》文中研究表明缺血性脑卒中是全球高发病率和高死亡率的主要疾病之一。脑水肿是缺血性脑卒中最大的并发症之一,是大面积缺血性脑卒中患者急性期恶化和死亡的主要原因。星形胶质细胞是脑水肿的重要参与细胞,其与脑血管功能变化,与水转运蛋白的活性改变密切相关,且在脑水肿的稳态中起到重要的作用。高迁移率组1（High-mobility group box 1,HMGB1）/Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）通路作为炎性的标志性通路,在缺血性脑卒中早期脑水肿的病程发展中起了十分重要的作用。HMGB1是炎症级联反应的有效诱导物,主要在胶质细胞上表达,引起神经水肿和诱导巨噬细胞合成肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白介素-6（inter-leukin-6,IL-6）、白介素 1β（inter-leukin-β,IL-1β）,导致炎症细胞的聚集和渗透,同时诱发炎症和一系列继发性组织损伤。因此,在缺血性脑水肿的研究中,星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路对AQP4和血脑屏障的影响具有重要的意义。通络清脑方（Tong LuoQingNao,TLQN）是本实验室前期研究用来治疗缺血性脑卒中急性期脑水肿的中药新药,其主要由三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins,PNS）、栀子苷（Geniposide,GE）,黄芩苷（Baicalin,BA）三类有效成分组成,对脑缺血的炎性反应有明显的抑制作用,具有缓解脑水肿,能降低水通道蛋白（Aquaporin-4,AQP4）的表达的作用。本课题研究TLQN及其有效组分对星形胶质细胞HMGB1/TLR4炎性通路对AQP4和血脑屏障影响,从而探寻TLQN抑制缺血性卒中脑水肿的作用机制。第一部分通络清脑方对缺血再灌注大鼠脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响目的:应用大鼠脑缺血再灌注模型,观察TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响和对星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及血脑屏障的影响。方法:线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组（Sham）,再灌注组（Cerebralischemia-reperfusion,CIR）,通络清脑方（TLQN）42mg/kg 组（其中黄芩苷:栀子苷:三七总皂苷=1:12:6）,三七总皂苷（PNS）13.3mg/kg组、栀子苷+黄芩苷（BA+GE）26.5mg/kg+2.2mg/kg组,手术当天给药,尾静脉注射给药2d,1次/d。设立再灌注24h、48h为观察期。1.通过体重、神经功能评分、脑干湿重和功能性核磁共振的方法;观察TLQN对脑缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响;2.采用生化法检测CIR大鼠脑缺血侧皮层和血液中IL-6,IL-1β,TNF-α浓度含量;3.采用Western Blot和免疫荧光的方法,检测TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠24h,48h皮层AQP4、HMGB1、TLR4、NF-κB、p-NF-κB表达及蛋白水平的变化。4.采用透射电镜和免疫组化的方法,检测TLQN及有效组分对缺血再灌注大鼠细胞肿胀及血脑屏障的影响。结果:1.体重和神经功能评分结果显示,再灌注大鼠出现明显的神经功能缺损症状,TLQN组大鼠神经功能缺损评分在24h,48h明显降低（P<0.05）,PNS组和BA+GE组在48h大鼠神经功能缺损评分出现明显降低（P<0.05）。2.脑含水量结果显示:与Sham组相比,缺血再灌注24 h大鼠,脑含水量明显增加（P<0.05）;TLQN组大鼠24 h后脑含水量明显降低（P<0.05）;再灌注48 h后,TLQN、BA+GE组和PNS组脑含水量明显降低（P<0.05）。核磁共振结果显示:再灌注24h后CIR大鼠大脑海马、胼胝体和前皮层三个区域ADC信号明显降低（P<0.01）,TLQN组、PNS组和BA+GE组大鼠前皮层和胼胝体ADC明显高于CIR组（P<0.05）,而海马区域有上升趋势（P>0.05）。3.生化检测显示,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显下降（P<0.05）4.免疫荧光结果与Western-Blots相似,与Sham组相比,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度明显升高（P<0.01）,GFAP激活（P<0.01）,并且HMGB1、TLR4、p-NF-κB也明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度显着降低（P<0.05）;GFAP明显收到抑制（P<0.05）,HMGB1、TLR4、p-NF-κB 含量也明显下调（P<0.05）5.透射电镜、GFAP的周长、和免疫组化Claudin-5的检测中显示,TLQN、PNS和BA+GE对缺血再灌注大鼠内皮细胞星形胶质细胞肿胀有明显的缓解作用,并且能够改善血脑屏障的紧密连接使其屏障功能得以修复。第二部分通络清脑方及其有效成分对氧糖剥夺/再复氧（Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion,OGD/R）星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响目的:应用离体培养人脑星形胶质细胞与星形胶质细胞/微血管内皮细胞共培养实验方法,观察TLQN及单体对OGD/R损伤星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及内皮细胞紧密连接的影响。方法:1.使用正常的星形胶质细胞检测TLQN及其各有效成分（PNS、BA、GE）的药物毒性浓度,以备后续的药效实验做基础。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。2.构建OGD/R细胞模型,氧糖剥夺6h/复氧复糖12h（OGD/R6/12）,星形胶质细胞分为正常（Control）组和OGD/R组,药物组（TLQN、PNS、BA、GE）分别在2.5～50 μg/ml进行干预,探索TLQN及单体对OGD/R损伤的星形胶质细胞的药效及给药浓度。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。3.采用生化法检测细胞培养有液IL-6,IL-1β,TNF-α的含量;Western Blot、免疫细胞荧光法检测细胞GFAP、AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB表达的变化。4.采用免疫荧光和透射电镜技术,在HA/BMECs共培养体系中发现,检测OGD/R后HA细胞的培养液可降低BMECs细胞的存活率,降低细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1和影响细胞内部的影响。结果:1.通过药物毒性结合药效学实验可以看出,TLQN及其有效成分PNS、BA、GE在2.5～50μg/ml浓度内无明显毒性。2.与 OGD/R 后的 HA 细胞对比,TLQN（5μg/mL）和 PNS（10 μg/mL）干预后,细胞活力明显增强（P<0.05）且作用最佳,能够明显改善细胞状态。3.免疫荧光结果与Western-Blots结果相似:1)与Control组相比,OGD/R组HA细胞AQP4浓度明显升高（P<0.01）,,并且HMGB1、TLR4、p-NF-KB也明显上升（P<0.01）;给予 TLQN（5mg/kg）和 PNS（10mg/kg）干预后,HA 细胞 AQP4 浓度显着降低（P<0.05）;HMGB1、TLR4、p-NF-κB含量也明显下调（P<0.01）,且加入丙酮酸乙酯（EP）后,抑制了 OGD/R 组 HA 细胞 AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB 的表达。4.CCK8结果显示,GD/R后HA细胞外液对BMECs的存活率有显着的降低（P<0.05）;免疫荧光结果显示,BMECs细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1有明显的下降。在TLQN和PNS干预之后,BMECs的存活率上升,细胞间的Claudin-5、ZO-1的数量增加,上述结果与EP干预后的结果有一致的趋势,表明TLQN具有通过星形胶质细胞抑制内皮细胞损伤的功能。结论:通过体内和体外实验研究表明,基于“神经血管单元”理论,通络清脑可以减轻缺血再灌注大鼠急性期脑水肿,尤其是皮层水肿的作用。其机制是通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路抑制AQP4表达和星形胶质细胞肿胀,同时减少水肿相关炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,;通络清脑方通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路增加内皮细胞的紧密连接程度,改善血脑屏障功能。其作用的有效组分是活血组（三七总皂苷）。
陈鹏[5]（2020）在《碱性成纤维细胞生长因子对颅脑创伤合并腹腔高压后血脑屏障的保护作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:腹腔高压症（intra-abdominal hypertension,IAH）指腹内压（intra-abdominal pressure,IAP）持续或反复病理性上升≥12mmHg。腹腔间隙综合征（abdominal compartment syndrome,ACS）则是指IAP持续≥20mmHg,并伴有新的器官功能障碍或失调。IAH/ACS分为原发性和继发性,原发性IAH/ACS的病因主要是腹腔/盆腔原发性疾病或直接损伤,继发性IAH/ACS的病因主要是全身炎症反应综合征、失血性休克、大面积烧伤等。继发性IAH/ACS大都具有低血容量需要大量液体复苏的特征,病理过程包括缺血再灌注损伤,炎症因子释放,毛细血管通透性增高、液体渗漏、组织脏器水肿等。IAH/ACS不仅导致腹腔内脏器损害,还可导致胸腔、颅腔远处脏器损害,如导致颅内压升高引起继发性脑损伤,具体机制可能与血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）破坏有关。临床上常见创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）合并休克的多发伤患者,复苏后引起IAH/ACS,两者互相影响加重脑损伤,导致预后不佳。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）有广泛的生物学效应,它有助于血管形成、创伤愈合、组织修复、神经生长等。有研究发现在脑出血模型中,bFGF可与成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFRs）结合,上调紧密连接（tight junctions,TJ）和粘附连接（adheren junctions,AJ）蛋白表达,保护血脑屏障,但具体机制不清楚。TBI合并IAH/ACS对血脑屏障的影响研究很少,本实验希望了解TBI合并IAH后对血脑屏障、颅内压的影响,探寻bFGF对损伤后血脑屏障的作用,并揭示其中的作用机制。我们拟使用“皮质控制损伤”模拟TBI及“失血性休克大量液体复苏联合腹腔注氮气模拟继发性IAH/ACS”的大鼠作为动物模型进行体内实验,以及体外培养人脑微血管内皮细胞进行糖氧剥离诱导实验。具体包括以下研究:实验一,继发性IAH/ACS模型建立及对血脑屏障影响;实验二,TBI合并IAH对血脑屏障影响及bFGF的作用及机制研究;实验三,bFGF对人脑微血管内皮细胞糖氧剥离后渗透性及凋亡的作用及机制研究。此研究将有助于揭示TBI合并继发性IAH破坏血脑屏障,升高颅内压的过程,并为bFGF治疗血脑屏障损伤提供理论基础。主要实验方法与实验步骤:1.继发性IAH/ACS模型建立及对血脑屏障影响通过失血性休克大量液体复苏联合腹腔注氮气建立继发性IAH/ACS大鼠模型,观察不同腹内压（IAP12mmHg,20mmHg）对颅内压、脑组织大体形态,脑MRI,脑含水量,血脑屏障渗透性的影响,用Western blotting和PCR检测损伤后模型血脑屏障表达ZO-1、β-catenin、MMP2、IL-1β等指标,评估不同IAP对血脑屏障的损伤程度及其影响颅内压的病理过程。2.TBI合并IAH对血脑屏障影响及bFGF的作用及机制研究在前述建立的继发性IAH基础上利用可控皮质打击法建立大鼠中型颅脑创伤模型。分为control组,combined（TBI+IAH）组,combined+bFGF组,combined+bFGF+PD173074组,combined+bFGF+PD98059组。观察各组损伤后对颅内压、脑含水量及血脑屏障渗透性的影响,用免疫荧光、Western blotting和PCR检测损伤后各组血脑屏障表达FGFR1/p-FGFR1、ZO-1、Claudin-5,Occludin、β-catenin、MMP9、MMP12、L-1β和TNF-α等指标。探讨bFGF对TBI合并IAH后血脑屏障的保护作用以及作用机制,包括结合的受体及激活下游信号通路,为临床治疗提供实验参考。3.bFGF改善人脑微血管内皮细胞糖氧剥离（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）后渗透性及凋亡的作用及机制研究利用人脑微血管内皮细胞（HBMECs）进行体外实验。分组为control组,OGD/R组,OGD/R+bFGF组,OGD/R+bFGF+PD173074组,OGD/R+bFGF+PD98059组。观察各组OGD/R对HBMECs渗透性、凋亡、活力的影响,用免疫荧光,Western blotting和PCR检测损伤后各组HBMECs表达FGFR1/p-FGFR1、FGFR2/p-FGFR2、ERK/p-ERK、ZO-1、Claudin-5、Occludin、β-catenin、MMP2、MMP9、BAX、Bcl-2和Caspase-3等指标,观察bFGF对HBMECs在OGD/R后的渗透性、凋亡、活力影响及作用机制。主要研究结果:1.成功建立继发性IAH/ACS大鼠模型,发现IAH/ACS能引起血脑屏障损伤,导致颅内压升高。通过失血性休克大鼠大量液体复苏联合腹腔注氮气建立继发性IAH/ACS大鼠模型,ACS模型较IAH模型死亡率更高。IAH组与ACS组均引起颅内压增高,脑水肿及脑含水量增加,血脑屏障渗透性增加,血脑屏障表达特异TJ（ZO1）、AJ（β-catenin）下降,MMP2表达增强,引起血脑屏障破坏的炎症因子（IL-1β）增强。而导致颅内压增高及血脑屏障破坏方面两组间并无明显差异。2.bFGF可减轻TBI合并IAH后的血脑屏障破坏,降低颅内压,其作用机制可能是与BMECs上FGFR1结合,激活下游ERK通路完成。TBI合并IAH导致颅内压增高,脑含水量及血脑屏障渗透性增加。构成血脑屏障的BMECs表达p-FGFR1,p-ERK发生改变。给予bFGF激活p-FGFR1及下游p-ERK,上调AJ（ZO-1、Claudin-5、Occludin）、TJ（β-catenin）,下调MMP（MMP9、MMP12）,IL-1β,从而降低脑含水量,血脑屏障渗透性及颅内压。给予FGFR1拮抗剂（PD173074）,ERK拮抗剂（PD98059）可以逆转bFGF的保护作用。3.bFGF改善人脑微血管内皮细胞糖氧剥离（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）后渗透性及凋亡,机制是与HBMECs上FGFR1结合,激活下游ERK通路完成。在OGD/R损伤导致HBMECs渗透性和凋亡增强,而对活力影响不大。OGD/R后HBMECs表达p-FGFR1,p-ERK发生改变,而p-FGFR2无变化。给予bFGF激活p-FGFR1及下游p-ERK,上调AJ（ZO-1、Claudin-5、Occludin）、TJ（β-catenin）,Bcl-2,下调MMP（MMP2、MMP9）、BAX、Caspase-3,从而降低HBMECs渗透性及凋亡细胞数。给予FGFR1拮抗剂（PD173074）,ERK拮抗剂（PD98059）可以逆转bFGF的保护作用。结论:1.成功构建动物模型（大鼠）,揭示了不同腹腔内压与颅内压的关系以及IAH/ACS可能通过血脑屏障破坏引起脑水肿、导致颅内压增高的病理过程。以与人类基因同源性的大鼠为动物模型,具有体积小,操作简单,花费少,实验试剂易制备或获得,可用于继发性IAH/ACS病理生理的相关研究。2.TBI合并IAH导致血脑屏障破坏,脑水肿,引起颅内压升高。bFGF能通过上调血脑屏障紧密连接,粘附连接相关蛋白,降低MMP及炎症因子而保护血脑屏障,减轻脑水及降低颅内压。其保护机制可能是通过与BMECs上FGFR1结合激活下游ERK信号通路发挥作用;3.体外培养HBMECs在OGD/R条件下渗透性及凋亡增强,bFGF通过与FGFR1结合激活ERK通路,上调AJ、TJ、MMP及凋亡蛋白（Bcl-2,BAX,Caspase-3）,降低HBMECs的渗透性和减少凋亡数量,对HBMECs损伤有保护功能。
梁华[6]（2020）在《大鼠脑缺血再灌注损伤后Netrin-1对血脑屏障通透性的作用机制》文中指出目的:通过分析大鼠脑缺血再灌注后相关蛋白的时相性变化及Netrin-1对血脑屏障是否具有保护作用,为临床上治疗急性缺血性卒中相关疾病提供实验室的科学依据。方法:成年SD大鼠36只,随机将大鼠分为6组,每组6只,分为假手术组和MCAO12h组、MCAO24h组、MCAO48h组、PBS组和NT-1组。参照改良Longa的方法建立右侧大脑中动脉阻断（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）的模型（阻断2h）,造模后通过Zea-Longa法对动物中枢神经系统功能行为学进行评分,HE染色评估鉴定脑缺血组织模型,根据脑组织标本的损伤情况鉴定脑缺血模型,只打开颈动脉鞘不做颈动脉阻断缺血处理的为假手术组即Sham组,MCAO组为分别在缺血再灌注后12小时、24小时、48小时采集脑组织标本,PBS组与NT-1组在建立模型成功后立即注射等体积的PBS或Netrin-1溶液,24小时后立即采集脑组织标本。通过Zea-Longa法对大鼠中枢神经的功能进行行为学评分,干湿重法检测脑组织的含水量,Western blot检测脑组织标本中缺血梗死区Occludin、Claudin-5、ZO-1及Caspase-3表达的水平。免疫荧光检测脑组织标本中缺血梗死区Occludin、Albumin表达与分布。结果:脑组织样本含水量,与假手术组样本相比,MCAO12h、24h、48h均呈现递增趋势;NT-1组较MCAO24h组下降。神经行为学评分,与MCAO24h组相比,NT-1组较下降。与假手术组样本相比,MCAO24h组Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表达显着下降,Caspase-3蛋白表达显着上升,建模成功后随时间变化Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表达均开始下降,48h达到最低值,Caspase-3开始上升,48h达到最高值;NT-1样本组与假手术组比较,Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表达有所下降,但与MCAO24h组相比,下降程度不及MCAO24h明显,同样NT-1样本组的Caspase-3蛋白表达较假手术组有所上升但与MCAO24h组相比,上升程度不及MCAO24h明显。在免疫荧光方面,与假手术组相比,MCAO组Occludin明显下降,Albumin明显上升,NT-1组较假手术组下降及上升数量少于MCAO组。结论:脑缺血再灌注损伤后Occludin、Claudin-5和ZO-1呈下降趋势,Caspase-3明显上升;Netrin-1对脑缺血再灌注损伤血脑屏障通透性具有保护作用。
杨梦晨[7]（2020）在《SEMA3A在颅脑创伤后继发性损伤中的作用及机制研究》文中研究说明研究目的:创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）是全球性的致死率和致残率都极高的一种疾病,除原发的机械性损伤外,其继发损伤可带来包括脑水肿、神经凋亡、神经炎症等一些列病理损害,进一步加剧原发损伤所造成的患者神经功能障碍甚至死亡。但目前在临床上尚缺乏有效的治疗手段,亟需对其发生发展机制进行进一步的探索。Semaphorin 3A（SEMA3A）作为semaphorin家族中的一类膜相关的蛋白,在神经系统中参与神经网络的构建。有关研究报道显示SEMA3A可影响血管的通透性,但其在创伤性脑损伤中的作用尚不得而知。本课题组在以往研究的基础上探究SEMA3A在创伤性脑损伤后血脑屏障破坏,神经凋亡方面的作用,更进一步研究其miRNA的调控机制,为寻求创伤性脑损伤的治疗提供新的靶点和依据。方法:1.使用控制性皮层打击装置（Cortical control impact,CCI）及成年雄性C57/BL6J小鼠制作小鼠脑创伤模型,在损伤周期中提取脑组织,并同时设立假手术组。通过Western blot检测SEMA3A及其相关受体的表达变化。并通过免疫荧光法检测SEMA3A在TBI后的表达区域。2.在脑组织中转染siRNA-SEMA3A或侧脑室注射SEMA3A重组蛋白在体内降低或增加SEMA3A的表达水平,通过m NSS改良神经功能评分评估创伤后的神经功能预后,并使用平衡梁行走实验（Beam walking test）对运动功能进行检测。使用伊文思蓝渗漏实验检测血脑屏障破坏情况。通过脑组织含水量评估脑组织水肿发生情况。最后通过Western blot检测血脑屏障连接蛋白表达。3.通过b End.3细胞系在体外建立血脑屏障模型。使用糖氧剥夺损伤（Oxygen-glucose deprivation,OGD）在体外建立脑外伤模型。使用Western blot检测OGD损伤后SEMA3A及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1的表达变化。再通过转染si RNA-SEMA3A或加入SEMA3A重组蛋白在体外降低或增加SEMA3A的表达水平。通过transwell-dextran渗漏实验检测内皮屏障的破坏情况,以及探针跳跃式离子电导显微镜（HPICM）观察干预后内皮屏障的形态变化。最后通过Western blot检测内皮细胞中血脑屏障连接蛋白表达。4.使用qRT-PCR检测TBI后损伤周期及假手术组小鼠脑组织,以及体外OGD处理后的b End.3细胞和对照组的miRNA-30b-5p的表达水平。再通过agomir或antagomir在体内过表或敲低miRNA-30b-5p的表达水平,通过mimic或inhibitor在体外过表或敲低miRNA-30b-5p的表达水平,使用Western blot检测SEMA3A表达变化。通过双荧光素酶标记法（Luciferase）验证SEMA3A和miRNA-30b-5p的结合靶点。最后通过脑组织含水量检测、m NSS改良神经功能评分和平衡梁行走实验评价miRNA-30b-5p对TBI小鼠神经功能预后的影响。5.通过TUNEL检测试剂盒对神经元细胞凋亡情况进行检测。再通过Western blot对切割的caspase-9和caspase-3进行检测。最后再对通过agomir增加miRNA-30b-5p表达的TBI小鼠脑组织中切割的caspase-9和caspase-3进行检测,探究miRNA-30b-5p对TBI后SEMA3A造成的神经元凋亡的影响。结果:1.（1）TBI后,SEMA3A蛋白及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1在脑外伤后1天开始升高,并在TBI后第3天达到高峰。（2）TBI后脑组织中SEMA3A集中分布于创伤灶周围的脑血管上。2.（1）SEMA3A可加重TBI后的神经功能障碍,而降低脑组织中SEMA3A的表达后可显着改善TBI后的神经功能预后。（2）降低SEMA3A表达可显着减少TBI后的血脑屏障破坏并改善脑组织水肿。（3）降低SEMA3A表达可降低TBI后连接蛋白VE-Cadherin的磷酸化。3.（1）OGD损伤可诱发内皮细胞中SEMA3A及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1的分泌。（2）降低SEMA3A表达可改善OGD引起的细胞屏障渗漏。（3）SEMA3A可增大内皮屏障细胞间缝隙,而降低SEMA3A表达可改善OGD引起的内皮细胞间缝隙及数量。（4）降低SEMA3A表达可降低OGD引起的连接蛋白VE-Cadherin的磷酸化。4.（1）TBI后miRNA-30b-5p的表达水平在损伤后第1天开始下降,在损伤后第7天达到谷底,在体内过表达miRNA-30b-5p可降低TBI后SEMA3A的表达水平。（2）OGD损伤后miRNA-30b-5p的表达水平较对照组显着下降,且在内皮细胞中过表达miRNA-30b-5p后可降低OGD引起的SEMA3A表达升高。（3）miRNA-30b-5p可与SEMA3A的3’UTR区域结合,具有靶向关系。（4）增加miRNA-30b-5p的表达水平可显着改善TBI小鼠的神经功能预后,并减轻脑组织水肿。5.（1）降低SEMA3A蛋白表达水平可显着减少TBI后的TUNEL阳性神经元细胞数量。（2）降低SEMA3A蛋白表达水平可显着降低TBI后切割的caspase-9和caspase-3表达。（3）miRNA-30b-5p可显着改善SEMA3A造成的TBI后切割的caspase-9和caspase-3表达表达升高。结论:1.TBI后SEMA3A及其相关受体的表达水平显着升高,并集中表达于创伤灶周围。2.降低SEMA3A蛋白表达水平可显着改善TBI小鼠的血脑屏障破坏、脑组织水肿及神经功能障碍。3.OGD可造成b End.3内皮细胞系中SEMA3A及其相关受体表达升高,降低SEMA3A蛋白表达水平可显着改善OGD造成的内皮细胞屏障破坏,减少渗漏。4.在体内的TBI损伤及体外的OGD损伤后miRNA-30b-5p的表达水平显着降低,且miRNA-30b-5p可通过与SEMA3A的3’UTR区域结合降低SEMA3A的表达。5.SEMA3A蛋白可通过caspase-9/caspase-3通路促进TBI后神经元凋亡,且增加miRNA-30b-5p可显着改善这一情况。
张新昌[8]（2020）在《针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:目前脑梗死最有效治疗方法是超早期溶栓,但须在4.5h时间窗内实施,否则极易破坏血脑屏障（BBB）而出现脑水肿及颅内溶栓出血性转化等并发症,导致死亡率增高,如能探寻到延长时间窗的方法,将会为患者赢得更多救治机会。针刺治疗脑梗死的疗效公认,然而早期针刺能否提高溶栓安全性,进而延长脑梗死溶栓时间窗,目前尚不明确。因此,本研究首先明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应,其次从细胞与分子水平探讨针刺提高脑梗死溶栓安全性、延长溶栓时间窗的作用机制。方法:本研究采用“醒脑开窍”针刺法,以改良的自体血栓栓塞性脑缺血模型为研究对象,rtPA为静脉溶栓手段。实验一:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、4.5h溶栓组、6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组、针刺+9h溶栓组。观察针刺干预对各组大鼠梗死体积、神经行为学评分、BBB通透性、颅内溶栓出血性转化及脑水肿的影响,以明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应。实验二:将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、6h溶栓组、针刺+6h溶栓组。采用Western blot、免疫荧光（IF）检测ERK1/2信号通路指标（MEK1/2、ERK1/2）、跨膜蛋白（Claudin5）、胞浆黏附蛋白（ZO-1）、细胞骨架蛋白（MAP-2）以及MMP9的蛋白表达;采用 Real time-PCR、Western blot 检测 NF-κB p65 的 mRNA 及蛋白表达;使用透射电镜观察各组BBB超微结构的变化;采用ELISA法检测缺血脑组织中炎症因子（TNF-α、IL-1β）的含量。实验三:将SD大鼠随机分为假手术组、6h溶栓组、6h溶栓组+ERK1/2信号通路抑制剂（U0126）组。采用Western blot检测ERK1/2、MMP9、NF-κB p65的蛋白表达变化。通过实验二、三,明确针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的作用机制。结果:1、各组大鼠神经行为学评分的比较治疗后24h评分,与模型组相比,4.5h溶栓组神经行为学评分降低,差异有统计学意义（P<0.01）。时间窗外溶栓组（6h溶栓组、9h溶栓组）与模型组相比,神经行为学评分差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组、6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组神经行为学评分均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。表明针刺可改善时间窗外溶栓大鼠的神经行为学评分。2、各组大鼠脑梗死体积的比较与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑梗死体积显着减小（P<0.01）;6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+9h溶栓组比模型组脑梗死体积显着增大（P<0.01,P<0.05）;针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,梗死体积显着减小（P<0.01）。表明针刺可减小时间窗外溶栓大鼠的脑梗死体积。3、各组大鼠脑出血性转化的比较与模型组相比较,6h溶栓组、9h溶栓组、针刺+9h溶栓组血红蛋白含量均显着升高（P<0.01）,说明超时间窗外溶栓会显着增加出血性转化风险。针刺+6h溶栓与6h溶栓比,血红蛋白含量降低（P<0.05）。表明针刺可降低时间窗外单纯溶栓大鼠的脑出血性转化。4、各组大鼠BBB通透性的比较与模型组相比,时间窗内4.5h溶栓组Evans blue（EB）含量降低;时间窗外6h、9h溶栓组EB含量增加,其差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组EB含量降低;针刺+9h溶栓组EB含量增加,其差异均具有统计学意义（P<0.01）。针刺+6h溶栓与6h溶栓比,EB含量降低（P<0.05）。表明针刺可降低时间窗外单纯溶栓大鼠的BBB通透性。5、各组大鼠脑含水量的比较与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑含水量均显着降低（P<0.01）;时间窗外6h溶栓组、9h溶栓组脑含水量显着增加（P<0.01）。针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,脑含水量显着降低（P<0.01）。表明针刺可降低时间窗外溶栓大鼠的脑含水量。6、各组大鼠BBB超微结构的改变透射电镜显示:模型组BBB超微结构内皮细胞及基底膜明显肿胀变形且不规则,内皮细胞层间连接疏松,紧密连接遭到破坏。6h溶栓组BBB脑微血管内皮细胞及基底膜肿胀变形进一步加重,大量空泡及胞饮小泡形成,紧密连接断裂,BBB超微结构严重破坏。针刺+6h溶栓组BBB超微结构破坏减轻,其内皮细胞及基底膜肿胀减轻,形态有规则基本连续完整,紧密连接破坏明显减轻,表明针刺可改善脑梗死溶栓大鼠BBB超微结构的破坏。7、针刺对脑梗死溶栓大鼠ERK1/2信号通路的作用WB、IF结果显示:模型组与假手术比,p-MEK1/2/t-MEK1/2、p-ERK1/2/t-ERK1/2均显着增加（P<0.01）;针刺+6h溶栓组分别与6h溶栓组、模型组相比,p-MEK1/2/t-MEK1/2、p-ERK1/2/t-ERK1/2均显着降低（P<0.0 1）。表明针刺可抑制时间窗外溶栓大鼠E Rκ1/2信号通路的激活。8、各组大鼠MMP9的表达比较WB、IF结果显示:与假手术相比,模型组MMP9表达增加（P<0.01）;6h溶栓组与模型组比,MMP9进一步增加（P<0.05）;针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,MMP9表达显着降低（P<0.01）。提示针刺可下调时间窗外溶栓大鼠MMP9的蛋白表达。9、各组大鼠ZO-1、Claudin5、MAP-2的表达比较WB、IF结果显示:与假手术相比,模型组ZO-1、Claudin5、MAP-2蛋白表达均降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;6h溶栓组与模型组比,ZO-1、Claudin5、MAP-2的表达进一步降低（P<0.05）;针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,ZO-1、Claudin5、MAP-2蛋白表达增加,差异具有统计学意义（P<0.05;P<0.01）。提示针刺可上调时间窗外溶栓大鼠ZO-1、Claudin5、MAP-2 的蛋白表达。10、各组大鼠NF-κB p65的表达比较WB、RT-PCR结果显示:与假手术相比,模型组NF-κB p65mRNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;6h溶栓组与模型组比,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平进一步升高（P<0.01）;针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平均显着降低（P<0.01）。表明针刺可下调时间窗外溶栓大鼠NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平。11、各组大鼠TNF-α和IL-1β的含量比较ELISA结果显示:与假手术相比,模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1 β含量显着升高（P<0.01）;6h溶栓组与模型组比,TNF-α、IL-1β含量进一步升高（P<0.01）;针刺+6h溶栓组分别与模型组、6h溶栓组相比,TNF-α、IL-1 β含量显着降低（P<0.01）。表明针刺可降低时间窗外溶栓大鼠脑组织炎症因子TNF-α和IL-1 β的含量。12、ERK1/2信号通路对MMP9、NF-κB p65表达的影响WB结果显示:与假手术相比,6h溶栓组p-ERK1/2、MMP9、p-NF-κB p65表达均显着增加,差异具有统计学意义（P<0.01）;与6h溶栓组比,6h溶栓+U0126组大鼠p-ERK1/2、MMP9、p-NF-κB p65表达均显着降低（P<0.01）。表明ERK1/2信号通路位于MMP9、NF-κB p65的上游,能够调控其蛋白表达水平。结论:1、针刺及时介入,能够减轻溶栓并发症,提高溶栓安全性,发挥延长脑梗死溶栓时间窗的效应,本实验研究表明,针刺可延长该安全时间窗至6h。2、针刺能够抑制ERK1/2信号通路的激活,进而下调MMP9以及NF-κB p65的表达,上调大鼠血脑屏障结构相关蛋白（Claudin5、ZO-1、MAP-2）的表达,并降低脑组织中炎症因子（TNF-α、IL-1 β）的含量,改善血脑屏障的破坏,表明针刺是通过调控ERK1/2信号通路来实现延长脑梗死溶栓时间窗效应的。
许二妮[9]（2020）在《腺苷预处理对急性脑梗死大鼠血脑屏障和AQP4表达的影响》文中指出背景缺血性脑卒中严重危害患者的健康,且呈低龄化趋势,已成为一大社会问题。脑组织发生缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）后最常见的一种病理现象即是脑水肿。众多危重患者是否可以化险为夷,关键是看能否度过脑水肿期。脑水肿的发生多半原因在于血脑屏障（blood brain barrier,BBB）受损,因此减轻脑水肿关键在于减轻BBB的损伤。人体内源性核苷有很多种,腺苷（adenosine,Ado）即是其中一种,它广泛分布于组织细胞内,对身体的很多系统都有生理上的影响。已有研究表明腺苷预处理具有神经保护作用,但国内外文献关于腺苷预处理对脑缺血再灌注（Cerebral ischemia reperfusion,CIR）损伤后脑组织BBB功能的影响方面尚未有报道,故从BBB角度探讨腺苷预处理对脑组织的作用显得非常有意义,同时为腺苷预处理用于缺血性脑血管病的治疗提供更多的理论依据。目的通过观察腺苷预处理对梗死区周边脑组织BBB通透性和AQP4表达的影响,从BBB角度探讨腺苷预处理对脑组织的保护作用及其可能的机制。方法（1）健康雄性SD（Sprague-Dewley）大鼠120只,随机分为假手术组（F组）、模型组（IR组）、腺苷预处理组（AP组）,每组各40只。依术后处死动物时间的不同,每组再分为4个亚组:6h、24h、48h和72h组（F6、24、48、72h,IR6、24、48、72h,AP6、24、48、72h）,每个亚组10只动物,其中随机5只用于EB渗出量的测定,剩余5只用于制备脑组织切片,测定AQP4的表达及用于HE染色。腺苷注射液1.5mg/kg（生理盐水稀释至2ml）于造模前3d腹腔注射于AP组,每日1次,连续3d;F、IR组于术前3d腹腔注射生理盐水2ml,每日1次,共3次。（2）F组大鼠只暴露左侧颈总动脉而不结扎,IR组和AP组分别制备大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）,手术大鼠于2h拔出栓线1cm实现脑组织再灌注,进行神经症状评分检验造模是否成功,后断头取脑。HE染色法观察大鼠脑组织形态学的变化;伊文思蓝（evans blue,EB）渗透法分析BBB通透性变化;免疫组化检测不同时间点梗死灶周围AQP4蛋白的表达。结果（1）梗死区周边脑组织病理变化:除F组外,其余组随着CIR时间的延长,梗死区周围脑组织水肿、核固缩、神经细胞变性、坏死、胶质细胞增生等越来越重;AP组大鼠与IR组相比,再灌注不同时间点,梗死区周边脑组织病理变化明显减轻。（2）BBB通透性:IR组和AP组均与F组相比,EB渗出明显较多,差异具有统计学意义（P<0.05）;随着CIR时间的延长,IR组和AP组EB渗出均逐渐增多,再灌注48h时达到峰值,后开始下降但仍高于正常水平;AP组大鼠与IR组相比,再灌注不同时间点,梗死区周边脑组织EB渗出明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）AQP4蛋白表达:IR组和AP组均与F组相比,AQP4表达明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;随着CIR时间的延长,IR组和AP组AQP4表达均逐渐升高,于48h达高峰,再灌注72h时仍处于高峰;AP组大鼠与IR组相比,再灌注不同时间点,梗死区周边脑组织AQP4表达明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）大鼠脑缺血再灌注损伤后各时间点梗死区周围脑组织BBB通透性变化与AQP4表达变化呈显着正相关（r=0.898,P<0.001）。结论（1）腺苷预处理可改善大鼠梗死区周边脑组织病理形态学变化及BBB通透性。（2）腺苷预处理可下调大鼠梗死区周边脑组织AQP4的表达。（3）腺苷预处理可能通过调节AQP4的表达,改善BBB通透性,从而减轻脑水肿,起到保护脑组织的作用。
廖帅[10]（2020）在《亚低温对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织钙调蛋白、水通道蛋白-4的表达及脑水肿的影响》文中研究说明目的:创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是一种高发病率的外伤性疾病,而颅脑损伤后继发性脑损伤如钙信号系统激活,神经细胞凋亡,脑水肿等均是颅脑损伤病情加重的重要因素。其综合治疗措施一直是神经外科研究的重要方向。亚低温（mild hypotherm ia）治疗是一种针对创伤性颅脑损伤的有效脑保护措施。本实验通过研究亚低温治疗对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织钙调蛋白（Calmodulin,CAM）、水通道蛋白-4（Aquaporin-4,AQP-4）的表达及脑水肿的影响,探讨颅脑损伤及亚低温治疗的相关机制,为亚低温治疗颅脑损伤进一步提供理论支持。方法:选取72只健康成年SD（Sprague-Dawley）大鼠,雌雄不限,体重270-300g,均由西南医科大学动物实验中心提供,标准条件饲养。随机分为假手术组（仅开骨窗,不打击,37℃）、常温组（开骨窗后打击制作颅脑损伤模型,37℃）及亚低温组[开骨窗后打击制作颅脑损伤模型,（32±0.5）℃并持续6h],每组24只。使用控制性皮层损伤（controlled cortical impact,CCI）颅脑创伤仪建立大鼠颅脑损伤模型,使用冰床、冰水浸浴及乙醇擦拭等方式制作亚低温治疗模型。各组于颅脑损伤后取6、12、24、48h四个时间点,各个时间点取6只大鼠行头颅MRI检查脑水肿程度及范围后断头处死取脑组织,分别采用荧光定量PCR法、免疫组化法和蛋白免疫印迹法（western-blot）检测各组大鼠脑组织的中CAM mRNA和蛋白表达情况,采用免疫组化法检测24h常温组和亚低温组大鼠脑组织中AQP-4表达情况。结果:1.通过荧光定量PCR法可知:亚低温组、常温组各时间点CAM mRNA表达较同时间点假手术组增加,差异有统计学意义（P<0.001）;6、12、24h亚低温组CAM mRNA表达较同时间点常温组减少,差异有统计学意义（P<0.001）,48h亚低温组CAM mRNA表达较48h常温组差异无统计学意义（P>0.05）。2.通过western-blot法可知:亚低温组、常温组各时间点CAM表达相对于同时间点假手术组增加,差异有统计学意义（P<0.001）;亚低温组各时间点CAM表达较同时间点常温组减少,差异具有统计学意义（P<0.001）。3.通过免疫组化法可知:亚低温组、常温组CAM表达相对于假手术组增加,差异有统计学意义（P<0.001）;亚低温组CAM表达较常温组减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;24h亚低温组AQP-4表达较24h常温组减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.通过头颅M RI可知:亚低温组、常温组相对于假手术组脑水肿显着,脑组织水肿区体积明显增加;亚低温组脑组织水肿区体积相对于常温组减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.颅脑损伤后大鼠脑组织CAM表达增加,可能与继发性脑损伤机制有关。2.采取亚低温措施可以减弱大鼠颅脑损伤后脑组织CAM与AQP-4表达,提示亚低温可能通过抑制CAM及AQP-4表达,从而抑制钙信号系统激活及脑水肿等继发性脑损伤机制,发挥脑保护作用。3.采取亚低温措施可以减轻颅脑损伤后大鼠脑水肿程度,发挥脑保护作用
二、大鼠急性弥漫性脑损伤后血脑屏障通透性的变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠急性弥漫性脑损伤后血脑屏障通透性的变化（论文提纲范文）
（1）参附汤对脑缺血后血脑屏障保护的协同增效作用以及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 中医药对缺血性中风后血脑屏障保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 参附汤对缺血性中风后血脑屏障保护的协同增效作用研究 |
| 一 通过体内实验探讨参附汤协同增效作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 二 体外实验验证参附汤的血脑屏障保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 FAO机制在参附汤保护缺血性中风后血脑屏障中的作用研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）大麻二酚（CBD）改善脑损伤血脑屏障渗透性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 大麻二酚在医学上的应用前景 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）“醒脑开窍”针法对脑缺血损伤血脑屏障通透性的调控作用及对ICAM-1、MMPs-9表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及饲养条件 |
| 1.2 实验药物及给药方法 |
| 1.3 主要仪器、试剂及其配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.3 实验模型的制备 |
| 2.4 模型评定标准 |
| 2.5 脑组织病理标本的制作 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计处理 |
| 2.8 技术路线图 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠神经功能缺损评分 |
| 3.2 大鼠EB定量结果分析 |
| 3.3 RT-qPCR检测不同时相ICAM-1mRNA、MMPs-9mRNA的实验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医病名及发病机制 |
| 4.2 西医发病机制 |
| 4.3 血脑屏障的生理病理变化 |
| 4.4 .针刺对血脑屏障的调控作用 |
| 4.5 醒脑开窍针法在治疗缺血性脑卒中的作用 |
| 4.6 中风膏对治疗缺血性脑卒中的作用 |
| 4.7 实验结果分析 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 文献综述 缺血性脑卒中时血脑屏障变化及其影响因素 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间获得的科研成果 |
（4）通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 高迁移率组1(HMGB1)在缺血性中风及其相关疾病研究进展 |
| References |
| 综述二 星形胶质细胞维持大脑中水平衡的作用 |
| References |
| 综述三 神经血管单元在缺血性脑水肿中作用机制和中药对其治疗的研究进展 |
| References |
| 前言 |
| 第一部分 通络清脑方对缺血再灌注大鼠皮层脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响 |
| 第一节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠急性期水肿的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠24h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠48h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第四节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠血脑屏障保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 通络清脑方及其有效成分对OGD/R星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响 |
| 第一节 通络清脑方及其有效成分对OGD/R损伤的星形胶质细胞的保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA细胞HMGB1/TLR4/NF-κB通路及水肿相关炎性相关因子的作用机制研究 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA和BMECs细胞共培养紧密连接的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二部分 小结 |
| 结语 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 通络醒脑方主要成分的含量测定 |
（5）碱性成纤维细胞生长因子对颅脑创伤合并腹腔高压后血脑屏障的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 腹腔高压后破坏血脑屏障,引起颅内压增高的作用观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 颅脑创伤合并腹腔高压后对血脑屏障影响及碱性成纤维细胞生长因子的作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 碱性成纤维细胞生长因子改善人脑微血管内皮细胞糖氧剥离后渗透性及凋亡的作用及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 腹腔高压对远处脏器影响研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述 颅脑创伤和血脑屏障关系概述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）大鼠脑缺血再灌注损伤后Netrin-1对血脑屏障通透性的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词 |
| 前言(Introduction) |
| 实验材料及方法 |
| 1.实验主要材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.MCAO组大鼠模型鉴定 |
| 二.时相性变化的结果 |
| 2.1 干湿重法检测脑含水量的时相性变化 |
| 2.2 Western blot技术检测Occludin、Claudin-5、ZO-1和Caspase-3 蛋白时相性的表达 |
| 三.Netrin-1 对脑保护作用的结果 |
| 3.1 MCAO组及对照组大鼠模型鉴定 |
| 3.2 神经行为学评分及死亡率 |
| 3.3 干湿重法测脑含水量的变化 |
| 3.4 Western blot技术检测使用Netrin-1后Occludin、Claudin-5、ZO-1和Caspase-3各蛋白 |
| 3.5 免疫荧光检测细胞的表达情况 |
| 3.6 脑组织含水量与Occludin、Claudin-5、ZO-1 各蛋白的相关性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 缺血性脑卒中研究的研究进展 |
| 1.卒中的分类 |
| 2.危险因素 |
| 3.缺血性脑卒中的实验模型 |
| 4.目前缺血性卒中的治疗方法 |
| 5.再生疗法 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）SEMA3A在颅脑创伤后继发性损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、创伤性脑损伤后 SEMA3A及其相关受体在脑组织中的表达及分布 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 1.1.2 实验试剂及材料 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 创伤性脑损伤后脑组织中SEMA3A蛋白水平变化 |
| 1.2.2 创伤性脑损伤后脑组织中SEMA3A的相应受体表达水平变化 |
| 1.2.3 创伤性脑损伤后脑组织中SEMA3A蛋白在脑组织中的分布情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、SEMA3A加重TBI后继发性血脑屏障破坏及神经功能改变 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂及材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SEMA3A对创伤性脑损伤后的神经功能障碍的影响 |
| 2.2.2 SEMA3A对TBI后血脑屏障破坏的影响 |
| 2.2.3 SEMA3A对TBI后脑组织水肿的影响 |
| 2.2.4 SEMA3A对TBI后胞间连接蛋白的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、抑制SEMA3A表达可减轻缺氧缺血造成的BBB损伤 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验试剂及材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 糖氧剥夺损伤后SEMA3A及其相关受体的表达变化 |
| 3.2.2 体外糖氧剥夺损伤后SEMA3A对内皮屏障的破坏作用 |
| 3.2.3 SEMA3A在糖氧剥夺破坏内皮屏障作用中的形态学观察 |
| 3.2.4 SEMA3A对糖氧剥夺损伤后内皮细胞黏蛋白磷酸化的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、miRNA-30b-5p抑制TBI后 SEMA3A表达并改善TBI后神经功能障碍 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 4.1.2 实验试剂及材料 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计学方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 miRNA-30b-5p在TBI小鼠的损伤周期中的表达变化 |
| 4.2.2 体外OGD模型下miRNA-30b-5p在损伤后的表达变化 |
| 4.2.3 损伤后miRNA-30b-5p对 SEMA3A表达的调控 |
| 4.2.4 miRNA-30b-5p通过结合Sema3a基因的3’UTR区域下调其表达 |
| 4.2.5 体内实验证明miRNA-30b-5p可改善TBI后的神经功能障碍 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、SEMA3A在 TBI后神经元细胞凋亡中的作用 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 5.1.2 实验试剂及材料 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.1.4 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 SEMA3A通过caspase-9/caspase-3通路促进TBI后神经元细胞凋亡 |
| 5.2.2 miRNA-30b-5p可抑制SEM3A造成的TBI后细胞凋亡 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 Semaphorin信号在神经系统发育中的作用机制 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、急性脑梗死概述 |
| 1、流行病学 |
| 2、病因及发病机制 |
| 3、溶栓疗法及局限性 |
| 二、血脑屏障破坏是脑梗死溶栓并发症的病理基础 |
| 1、血脑屏障结构 |
| 2、血脑屏障破坏与溶栓并发症 |
| 三、调控ERK1/2信号通路是治疗脑梗死的关键路径 |
| 1、ERK1/2信号通路 |
| 2、ERK1/2信号通路与脑梗死 |
| 四、中医对脑梗死的认识及针刺治疗概况 |
| 1、病名溯源 |
| 2、病因病机 |
| 3、古代针灸治疗 |
| 4、现代针灸治疗方法及机制 |
| 五、本研究科学假说 |
| 第二部分 针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应研究 |
| 一、材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 主要仪器及设备 |
| 3. 主要试剂 |
| 二、方法 |
| 1. 动物分组 |
| 2. 改良的大鼠自体血栓栓塞性模型制备 |
| 3. 激光多普勒血流仪监测脑血流量 |
| 4. 神经行为学评分 |
| 5. 干预方法 |
| 6. 脑梗死体积测定 |
| 7. 脑含水量的测定 |
| 8. BBB通透性的测定 |
| 9. 溶栓后脑出血性转化的测定 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、结果与分析 |
| 1. 模型制备过程中的脑血流量变化 |
| 2. 各组大鼠神经行为学评分的比较 |
| 3. 各组大鼠脑梗死体积的比较 |
| 4. 各组大鼠脑出血性转化的比较 |
| 5. 各自大鼠BBB通透性的比较 |
| 6. 各组大鼠脑含水量的比较 |
| 四、本章小结 |
| 第三部分 针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的机制研究 |
| 一、材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 主要仪器及设备 |
| 3. 主要试剂 |
| 二、方法 |
| 1. 动物分组及干预方法 |
| 2. 侧脑室注射 |
| 3. 改良的大鼠自体血栓栓塞性模型制备 |
| 4. 激光多普勒血流仪监测脑血流量 |
| 5. Western Blot检测 |
| 6. Real-time PCR检测 |
| 7. ELISA检测 |
| 8. 免疫荧光检测 |
| 9. 透射电镜观察血脑屏障超微结构 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、结果与分析 |
| 1. 各组大鼠BBB超微结构的改变 |
| 2. 针刺对脑梗死溶栓大鼠ERK1/2信号通路的作用 |
| 3. 各组大鼠MMP9的表达比较 |
| 4. 各组大鼠ZO-1的表达比较 |
| 5. 各组大鼠Claudin5的表达比较 |
| 6. 各组大鼠MAP-2的表达比较 |
| 7. 各组大鼠NF-κB p65的表达比较 |
| 8. 各组大鼠TNF-α和IL-1β的含量比较 |
| 9. ERK1/2信号通路对脑梗死溶栓大鼠MMP9表达的影响 |
| 10. ERK1/2信号通路对脑梗死溶栓大鼠NF-κB p65表达的影响 |
| 四、本章小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 一、动物模型的制备与评价 |
| 二、针刺方案选择 |
| 三、针灸延长脑梗死溶栓时间窗的效应探讨 |
| 四、针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗机制探讨 |
| 五、本研究的创新性 |
| 六、不足与展望 |
| 第五部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）腺苷预处理对急性脑梗死大鼠血脑屏障和AQP4表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 5 小结与展望 |
| 6 创新之处和不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述:血脑屏障在缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）亚低温对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织钙调蛋白、水通道蛋白-4的表达及脑水肿的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 亚低温神经保护作用机制 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、大鼠急性弥漫性脑损伤后血脑屏障通透性的变化（论文参考文献）
- [1]参附汤对脑缺血后血脑屏障保护的协同增效作用以及机制研究[D]. 张伟. 北京中医药大学, 2021(08)
- [2]大麻二酚（CBD）改善脑损伤血脑屏障渗透性的研究[D]. 蒋鸿雁. 昆明医科大学, 2021
- [3]“醒脑开窍”针法对脑缺血损伤血脑屏障通透性的调控作用及对ICAM-1、MMPs-9表达的影响[D]. 康晓文. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [4]通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究[D]. 田方泽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]碱性成纤维细胞生长因子对颅脑创伤合并腹腔高压后血脑屏障的保护作用及机制研究[D]. 陈鹏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [6]大鼠脑缺血再灌注损伤后Netrin-1对血脑屏障通透性的作用机制[D]. 梁华. 石河子大学, 2020(08)
- [7]SEMA3A在颅脑创伤后继发性损伤中的作用及机制研究[D]. 杨梦晨. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]针刺调控ERK1/2信号通路延长脑梗死溶栓时间窗的实验研究[D]. 张新昌. 南京中医药大学, 2020(01)
- [9]腺苷预处理对急性脑梗死大鼠血脑屏障和AQP4表达的影响[D]. 许二妮. 新乡医学院, 2020(12)
- [10]亚低温对创伤性颅脑损伤大鼠脑组织钙调蛋白、水通道蛋白-4的表达及脑水肿的影响[D]. 廖帅. 西南医科大学, 2020(10)