一、一次性骨髓定量抽吸器及临床应用（论文文献综述）
贵州省医疗保障局[1]（2021）在《省医疗保障局关于公布2021年第一批新增、修订医疗服务价格项目的通知》文中认为黔医保发[2021]31号各市（自治州）医疗保障局、省属医疗机构:按照《中共中央国务院关于深化医疗保障制度改革的意见》（中发[2020]5号）、《中共贵州省委贵州省人民政府关于深化医疗保障制度改革的实施意见》（黔党发[2020]26号）文件精神,根据《省医疗保障局关于新增医疗服务价格项目工作的通知》（黔医保发[2019]57号）工作部署,经省人民政府同意,决定公布2021年第一批新增、修订医疗服务价格项目。现将有关事项通知如下:
黄锦[2]（2021）在《PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究》文中研究表明目的:骨髓抑制是肿瘤化疗常见副作用之一,最先表现为白细胞减少症,诱发感染严重限制了化疗药的临床应用。临床研究发现针灸可有效改善化疗致白细胞减少症,但作用机制尚未完全阐明。本研究基于前期已建立的电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症效应平台,以交感神经修复为切入点,探讨交感神经释放垂体腺苷酸环化酶激活肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）作用于PAC1受体介导电针促进化疗后骨髓造血恢复的作用机制,并在肺癌化疗小鼠模型中验证电针改善造血功能的效应,为针刺在肿瘤化疗中“减毒增效”的作用提供科学依据,促进临床应用和推广。方法:研究内容一PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究实验一电针改善顺铂致小鼠骨髓造血功能低下的治疗效应研究复制前期效应平台,将雄性Balb/c小鼠随机分为对照组（Veh组）、化疗组（Cis组）、化疗加电针组（EA组）。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,一周2次,共2周。电针干预与化疗药同一天开始,选穴为双侧足三里、三阴交穴,一周3次,共2周。动态观察各组小鼠体重变化。通过对胫骨骨髓进行苏木素&伊红（Hematoxylin&Eosin,H&E）染色观察电针对化疗所致骨髓萎缩的影响。通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）及其亚群的数量变化,包括HSPCs、长期造血干细胞（Long-term HSCs,LT-HSCs）、短期造血干细胞（Short-term HSCs,ST-H SCs）、多能祖细胞（Multipotent progenitors,MPPs）、淋系祖细胞（Common lymphoid progenitors,CLPs）、髓系祖细胞（Common myeloid progenitors,CMPs）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（Granulocyte-macrophage progenitors,GMPs）、巨核/红系祖细胞（Megakar yocytic/erythroid progenitors,MEPs）,观察电针对化疗后骨髓造血功能的影响。实验二电针促进顺铂小鼠骨髓交感神经修复和PACAP分泌的作用研究通过胫骨骨髓交感神经纤维酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,Th）免疫荧光染色探讨交感神经分布,定量逆转录PCR（Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测骨髓内神经营养因子家族如神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）的基因含量,明确电针对化疗后骨髓交感神经损伤的修复作用。最后,通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测骨髓内PACAP蛋白含量,明确电针对骨髓PACAP含量的调节作用。实验三PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究在电针治疗顺铂小鼠的同时,分别给予高、低剂量PAC1拮抗剂（PACAP6-38）。首先,通过热板实验动态观察各组小鼠热痛潜伏时间的变化,明确电针及其拮抗剂对外周神经损伤的影响。其次,利用普通血常规检测外周血细胞数量（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,观察PAC1拮抗剂对电针改善白细胞减少症的影响。最后,通过流式细胞术检测骨髓造血干祖细胞及其亚群数量,以及碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色观察骨髓各细胞周期（G0/G1、S、G2/M、S+G2/M）数量的变化,明确PACAP/PAC1受体介导电针改善骨髓造血的作用。实验四外源性PAC1激动剂改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用研究利用高、低剂量PAC1激动剂（PACAP1-38）干预化疗小鼠,动态观察PAC1激动剂对化疗小鼠热痛潜伏时间、外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、骨髓造血干祖细胞及其亚群和细胞周期数量的变化,明确PAC1激动剂对化疗小鼠外周神经损伤、骨髓造血功能低下和白细胞减少症的影响。研究内容二电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究实验五电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究建立Lewis肺癌荷瘤小鼠,随机分为肿瘤组（T组）、肿瘤+化疗组（TC组）、肿瘤+化疗+电针组（EA组）,化疗药顺铂剂量选用5mg/kg,每周2次,共2周,电针干预方式同实验一。通过游标卡尺动态观察小鼠肿瘤体积,取材后检测瘤体组织重量和面积,明确电针联合化疗对肿瘤生长的影响。通过普通血常规检测外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,进一步利用流式细胞术检测白细胞亚群数量（中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞）,观察电针对肺癌顺铂小鼠外周血白细胞的影响。为了进一步明确电针对肺癌顺铂小鼠骨髓造血功能的影响,通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期数量的变化。结果:1.电针可改善化疗导致的骨髓萎缩,提高化疗小鼠骨髓多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）的数量。电针治疗14天可改善化疗导致的小鼠体重减轻。胫骨骨髓HE染色发现化疗后小鼠骨髓组织骨髓细胞排列稀疏,可见大量空腔,骨髓细胞密度下降,电针治疗可见骨髓细胞呈密集分布。半定量分析发现电针可增加化疗小鼠的骨髓细胞密度,具有统计学差异。流式细胞结果发现化疗导致骨髓HSPCs、MPPs、CMPs、GMPs和MEPs的数量下降,电针治疗可提高MPPs和CMPs的数量,且HSPCs的数量较化疗组升高62%,MEPs的数量升高59%,但无统计学差异。2.电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变和上调骨髓PACAP蛋白含量,可能与促进骨髓神经营养相关因子Ngf和Bdnf的基因表达有关。骨髓内交感神经纤维Th免疫荧光染色结果及半定量分析发现,化疗干预后骨髓Th阳性表达下降,电针治疗后交感神经纤维分布增多,表明电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变。化疗后骨髓内Ngf、Bdnf基因含量、PACAP蛋白含量均下降,电针治疗均可上调Ngf、Bdnf基因含量及PACAP蛋白含量。3.高剂量PAC1拮抗剂可减弱电针改善顺铂小鼠热痛迟钝,拮抗电针增加顺铂小鼠外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量及G2/M增殖期的骨髓细胞数量的作用。电针治疗14天,化疗小鼠热痛潜伏时间明显延长,电针可缩短化疗小鼠热痛潜伏时间,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针治疗作用。外周血白细胞亚群数量结果发现,化疗后小鼠白细胞和淋巴细胞数量下降,电针治疗可提高白细胞和淋巴细胞的数量,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针的治疗作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群数量结果发现,化疗干预后MPPs、CMPs和MEPs数量下降,电针治疗可提高化疗小鼠HSPCs和MPPs的数量,而高、低剂量PAC1拮抗剂使电针上升HSPCs数量的效应消失,高剂量PAC1拮抗剂小鼠MPPs的数量较电针组下降。此外,化疗可导致骨髓G2/M期细胞数量下降,相反,电针治疗可提高G2/M增殖期的细胞数量,高、低剂量PAC1拮抗剂均可拮抗电针治疗作用。4.高剂量PAC1激动剂可改善化疗导致的热痛迟钝,提高外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量和G2/M增殖期的骨髓细胞数量。电针治疗第14天,高、低剂量PAC1激动剂可缩短化疗小鼠的热痛潜伏时间。高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠白细胞数量,对淋巴细胞无改善作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果表明,高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠HSPCs的数量,高、低剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠MPPs和G2/M增殖期的细胞数量。5.电针联合化疗可抑制肺癌小鼠的肿瘤生长,电针治疗可提高肺癌化疗小鼠的外周血中性粒细胞数量、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）和巨核/红系祖细胞（MEPs）的数量,增加骨髓S增殖期的细胞数量。皮下Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤种植后第14天到第21天,与肿瘤组相比,单纯化疗与电针联合化疗治疗均可抑制肿瘤生长,且这两种干预方式均可降低瘤体重量和瘤体面积。普通血常规和流式细胞分析结果均发现,化疗导致小鼠外周血中性粒细胞下降,电针治疗可提高中性粒细胞的数量。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果发现,化疗后小鼠MPPs和GMPs的数量下调,S增殖期的细胞数量下降,电针治疗可提高MPP s、HSPCs、CMPs和MEPs的数量以及S增殖期的细胞数量。电针组小鼠骨髓GMPs数量虽较化疗组小鼠升高60%,但无统计学差异。结论:1.电针可修复化疗损伤的骨髓交感神经,通过PACAP/PAC1受体促进造血干祖细胞增殖,改善顺铂致小鼠白细胞减少症。2.电针可改善肺癌小鼠化疗后骨髓造血功能低下和白细胞减少症。
胡海峰[3]（2021）在《骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究》文中指出目的:骨折是常见的创伤性疾病,并且随着老龄化程度的加深,骨折的患病率逐渐上升,大约10%的骨折病例中会出现骨延迟愈合甚至骨不连等并发症。临床上对于此类并发症早有治疗手段,但是并没有统一的标准并且治疗效果个体差异很大。自体和血管化骨移植已被用于治疗骨折延迟愈合以及骨不连,但是治疗成本高在很大程度上限制了其应用,并且治疗效果因人而异。同时这类治疗方式恢复时间长、治疗成本高也是其临床广泛应用受限的因素。目前,骨组织修复及自愈的机制尚未得到完全的揭示,越来越多的研究重点转向有促进组织修复及再生能力的干细胞来源的囊泡上,囊泡是细胞内储存、运输以及消化产物及代谢废物的中间体,其中的miRNA作为一种良好的生物标志物在疾病进展及疾病治疗中发挥了巨大的作用,引起了极大的关注,本研究的目的首先培养骨髓间充质干细胞、分离鉴定其胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）、采用小鼠作为研究动物构建骨折模型用于后续研究,然后探讨骨折动物模型在来源于骨髓间充质干细胞分泌的囊泡（bone extracellular vesicles,B-EVs）刺激下差异表达的miRNA,并对其在骨折中的作用机制展开研究,以期为骨折的愈合及治疗提供更多帮助。方法:一、胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.研究使用C57BL/6小鼠以及实验室改造完成并正常繁育饲养的C57BL/6 CD9-/-遗传型小鼠进行构建骨折模型;所用细胞为小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）。2.从培养4-6代的BMSCs中提取B-EVs,通过透射电镜、Western Blot以及纳米粒径分析仪鉴定E-BVs的形态、特异性蛋白（CD11b、CD 45、CD29以及CD90）的表达情况以及粒径大小;3.野生型（wild type,WT）和CD9-/-C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三点弯曲产生横向股骨干骨折,在建模结束后的0、1、2、3、4周,对小鼠骨折模型骨愈合情况进行分析,通过高分辨SKYSCAN进行活体显微影像学分析、计算机断层扫描骨密度等进行分析,验证小鼠骨折模型。二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.分组:使用第一章构建的小鼠模型进行研究,对小鼠进行进一步的分组,分别为WT+NC组（GW4869干预后,EV-NC注射的WT小鼠）、WT+EVs组（注射B-EVs的WT小鼠）、WT+EVs-Mock组（注射B-EVs的WT小鼠预先转染miR-335抑制剂NC）、WT+EVs-Inhibitor组（WT小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor）;CD9-/-小鼠分别分为:CD9-/-+NC组（CD9-/-小鼠注射GW4869干预后的EV-NC）、CD9-/-+B-EVs组（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+EVs-Mock组（CD9-/-小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor NC）、CD9-/-+EVs-Inhibitor组（CD9-/-小鼠注射B-EVs前转染miR-335抑制剂）。2.EVs的注射时间及剂量:各组小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100μL或外泌体抑制剂GW4869作用下的EV-NC 100μL;3.使用p CDH质粒通过慢病毒转染建立过表达miR-335-inhibtor和EVs-Inhibitor的稳定骨细胞系;4.骨折建模后2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨,将组织在4%缓冲多聚甲醛中固定48 h,随后用缓冲EDTA进行脱钙处理。5.免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2,BMP2）;6.RT-q PCR检测差异表达miRNA的表达水平;7.放射免疫沉淀试验分析提取总蛋白;8.微阵列检测差异表达3只WT+PBS治疗的小鼠和3只WT+B-EV治疗的小鼠miRNA;9.通过SPSS21.0进行统计分析。Kolmogorov—Smirnov检验数据是否呈正态分布。测量数据以平均值±标准差表示。两组间比较应用t检验,多组采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）,ANOVA分析后成对比较采用Tukey多重比较检验。三、microRNA-335通过囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway,Wnt/β-catenin）促进骨折恢复:1.MTT检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63的活力;2.Tunel及Alizarin red检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63细胞凋亡,未分化的ADSCs（无细胞外钙沉积）呈微红色,而ADSC来源的成骨细胞（有细胞外沉积）呈亮橙红色;3.碱性磷酸酶染色检测培养小鼠骨细胞,使用AP染色液进行染色,使用光学显微镜对红染细胞集落与无色集落进行计数,荧光显微镜下观察细胞;4.依据Lipofectamine 2000的说明书,将质粒分别与mimic NC或mimic miR-335共转染HEK293T细胞。使用Dual-Glo?双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-335和Vapb之间的结合关系;5.RNA pull down检测蛋白作用关系,使用识别RBP的一抗来检测目标RBP与适当的第二抗体一起孵育以识别第一抗体,并使用增强型化学发光检测信号;结果:一、EV的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.首先我们对购买的鼠BMSCs细胞进行鉴定,荧光显微镜分析成骨细胞标志酶及流式细胞分析特异性抗体均证实了细胞的正确性;2.BM-MSCs细胞中提取EVs,通过纳米粒径分析、透射电镜分析及Western Blot分析结果证明分离得到的B-EVs的正确性,可以用于本研究;3.两组小鼠在建模前即可检测时,野生型小鼠的体重和骨密度无显着差异,CD9-/-小鼠胫骨生长板的宽度显着减少,野生型小鼠在骨折后2周通过骨痂形成表现出软骨内骨化,3周时骨愈合明显,与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠表现出骨折愈合的显着延迟。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率为25%,明显低于野生型小鼠,表明与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠的愈合能力下降;二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.HE染色显示B-EV处理促进了骨组织的形成,甲苯胺蓝染色显示B-EV处理增加了软骨组织,BMP2免疫组化显示B-EV处理促进了成骨细胞的分化和骨折的恢复;EVs对CD9-/-小鼠的治疗作用明显低于WT小鼠;2.与WT小鼠相比,EV处理后的CD9-/-小鼠软骨组织中73个miRNA下调,104个miRNA上调,挑选差异表达最显着的miR-335、miR-136、miR-125a、miR-217、miR-487a、miR-339、miR-298和miR-133a进行后续实验;3.EvimiRNA在线预测网站上分析miR-335的分布,结果发现,miR-335在骨髓间充质干细胞中含量丰富,我们推测miR-335可能在骨折的修复中发挥作用。4.外泌体抑制剂GW4869对B-EVs的分泌无明显影响;5.HE染色、甲苯胺蓝染色及BMP2免疫组化结果显示B-EV中miR-335对小鼠骨折恢复具有促进作用;三、microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复:1.MTT方法检测了成骨细胞MC3T3和MG63细胞的增殖率,结果发现EVs的处理促进了细胞增殖。TUNEL染色结果显示,EV处理可抑制细胞凋亡;2.F-actin的免疫荧光染色观察了MC3T3和MG63细胞的细胞粘附,发现B-EV处理对细胞粘附无明显影响;3.人I型胶原蛋白（Human type I collagen,ColⅠ）的免疫荧光染色证明B-EVs促进ColⅠ表达,与茜素红染色结果一致。RT-q PCR和western blot分析验证B-EV处理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平;4.RT-q PCR显示EVs-Inhibitor处理后miR-335表达明显下降,并伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加。而且,ALP、茜素红和ColⅠ免疫荧光染色发现,B-EVs携带的miR-335的干预部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用;5.囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长,因此我们重点研究了Vapb,HEK293T细胞中的双荧光素酶报告基因检测显示miR-335可以靶向Vapb;6.RT-q PCR和western blot分析检测小鼠和细胞中Vapb水平。结果显示,EV处理抑制了Vapb水平,而miR-335抑制可以缓解Vapb的抑制;7.miRwalk、Target Scan、EvimcrRNA和Starbase的网站上预测并筛选了miR-335的7个靶基因（SMARCA2、Vapb、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2）,通过文献调研,我们发现囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长。使用RT-PCR和western blot鉴定过表达Vapb细胞的构建情况,RT-q PCR显示,转染后细胞中Vapb mRNA的表达明显增加,使用western blot在蛋白中观测到了相似结果;MTT检测细胞活力及TUNEL染色检测细胞凋亡的结果表明,过表达Vapb细胞的细胞伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加,表明Vapb过表达诱导细胞凋亡;Vapb过表达部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用。8.过表达Vapb可逆转EVs对Wnt和β-catenin蛋白表达的促进。提示EVs中靶向Vapb的miR-335可能与Wnt和β-catenin通路有关。结论:1.本研究成功的构建野生型小鼠及CD-9-小鼠骨折模型并从骨髓间充质干细胞中成功分离得到囊泡,其有助于小鼠骨折的愈合。2.骨髓间充质干细胞来源囊泡中miR-335促进成骨细胞分化及骨组织生成。3.miR-335靶向Vapb,囊泡干预组的细胞中过表达Vapb抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱了囊泡促进成骨细胞分化作用。4.髓间充质干细胞来源囊泡中的miR-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折愈合。本研究可能为骨折治疗提供见解。
董曦文[4]（2021）在《牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究》文中研究表明椎间盘退变（IVDD）及类风湿关节炎（RA）是常见的慢性骨关节疾病。二者发病率高,治疗难度大,复发率高,给患者身体健康及生活质量带来较大威胁,为国家社会造成重大经济负担。在两者发病过程中,炎症免疫反应均发挥作用:免疫豁免丧失后,抗原物质暴露并被机体免疫系统识别,激活免疫级联反应,引起免疫病理损伤。间充质干细胞是干细胞疗法中最常见的细胞类型,具有治疗潜力大、免疫原性低、应用范围广的特点。作为间充质干细胞的重要组成类型,牙髓干细胞（DPSCs）具有较强的自我更新能力、突出的免疫调控作用和出色的成软骨/成骨特性。科室前期研究证明,DPSCs能够抑制炎症,促进组织修复,在慢性牙周病软硬组织缺损中发挥较好的治疗作用。由于自身免疫反应在牙周炎的发病过程中同样占据举足轻重的地位。由此,我们推测DPSCs对自身免疫反应相关炎症所致疾病具有潜在免疫调节作用。基于以上因素,我们考虑使用DPSCs对IVDD及RA动物模型进行治疗,分析DPSCs对二者的治疗作用;并通过分离患者原代细胞,研究DPSCs在二者中发挥作用的相关机制。本研究主要分以下四部分进行。第一部分:目的评估DPSCs对大鼠IVDD模型椎间盘结构及细胞外基质的影响。方法使用针刺髓核法构建大鼠IVDD模型,原位注射DPSCs进行治疗。使用Micro-CT对大鼠IVDD病变情况进行影像学评估。使用H&E染色、Masson染色、番红固绿染色和免疫组织化学染色以及Masuda评分和形态结构参数定量分析对大鼠椎间盘病变及细胞外基质进行组织病理学评估。结果Micro-CT结果证明:DPSCs治疗后,椎间盘高度恢复,影像学表现良好。组织病理学结果证实:DPSCs治疗后,椎间盘组织结构趋于恢复,纤维环与髓核界限清楚,髓核细胞数量恢复;软骨终板肥厚及髓核萎缩均有所缓解;髓核中II型胶原（Col II）分泌增加,细胞外基质增多。结论DPSCs促进IVDD动物模型椎间盘结构恢复及细胞外基质产生。第二部分:目的分析DPSCs培养上清对椎间盘突出患者原代髓核细胞基因表达及信号通路的影响,明确DPSCs治疗后髓核细胞变化的分子机制。方法使用DPSCs上清处理患者原代髓核细胞后进行转录组测序。通过对测序结果进行生物信息学分析,找出差异表达基因（DEGs）及富集的信号通路。使用Western blotting及免疫荧光染色验证测序结果并分析髓核细胞表型变化。结果转录组测序结果证明:DPSCs上清处理后,炎症相关基因如IL6、CCL7、IL1RL1、TNFAIP6等明显下调,髓核细胞功能相关基因如PIK3R1、ITGA10、IGFBP2和LEP等明显上调;GO分析提示,炎性因子分泌及结合过程减弱,细胞外基质分泌增强;Pathway富集分析提示,上调基因主要富集到与细胞外基质分泌相关的信号通路（如弹性纤维和胶原蛋白产生相关信号通路）,下调基因主要富集与炎症相关的信号通路（如Jak-STAT信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路等）。Western blotting结果证实:DPSCs上清处理后,髓核细胞IL-6分泌减少,Col II分泌增加,细胞凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3表达降低;NF-κB及STAT3信号通路活化降低,Akt信号通路活化增加。免疫荧光染色证明:DPSCs培养上清处理后,髓核细胞F-actin组成的丝状骨架结构相对完整,降解较少,细胞凋亡水平降低,功能保持完好。结论DPSCs上清处理抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能。第三部分:目的评估HGF修饰的DPSCs（DPSCs-HGF）及对照基因修饰的DPSCs（DPSCs-Null）治疗对小鼠胶原诱导关节炎（CIA）模型临床表现、病理学和影像学的影响。方法使用腺病毒载体在DPSCs中过表达具有免疫调控及免疫耐受重建作用的HGF分子,构建DPSCs-HGF细胞。静脉注射DPSCs-HGF细胞、对照细胞DPSCs-Null细胞或PBS治疗CIA模型。对CIA小鼠临床表现进行评分。使用H&E染色及Kreen评分标准对CIA小鼠关节滑膜炎进行组织病理学评估。使用Micro-CT对关节骨质破坏情况进行影像学评估。结果临床评分结果证明:DPSCs-Null治疗组小鼠关节肿胀相对较轻,关节表面红疹较少;DPSCs-HGF治疗组早期,小鼠临床评分较低,在治疗中后期小鼠关节炎评分迅猛升高。组织病理学结果证实:DPSCs-Null治疗组能够有效降低滑膜炎的严重程度;DPSCs-HGF治疗组实验终点关节腔内浸润炎症细胞增多,关节滑膜衬里层增厚,滑膜局部细胞密度增加。Micro-CT结果证明:DPSCs-Null及DPSCs-HGF治疗后,骨质破坏均有所缓解,二者无统计学差异。结论DPSCs-Null治疗能够减轻CIA小鼠临床表现,改善关节滑膜炎;DPSCs-HGF治疗早期对CIA小鼠临床症状有益,后期发生病情反弹,总体并无较好收益。第四部分:目的明确DPSCs-HGF治疗CIA小鼠关节炎后期发生病情反弹的机制。方法使用流式细胞术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血免疫细胞亚型。使用多因子检测技术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血炎症因子表达水平变化。使用免疫组织化学染色分析治疗后CIA小鼠关节局部IL-6分子表达。分离患者原代滑膜细胞后,使用HGF和/或抑制剂进行处理。通过细胞克隆形成实验、Western blotting及细胞周期染色实验分析髓核细胞增殖活性、凋亡情况、细胞周期等生物学特性变化。结果CIA小鼠外周血及关节免疫分析结果证明:DPSCs-HGF治疗后,小鼠外周血Treg细胞比例较早出现升高,但维持时间较短;且外周血Th1/Th2细胞比例升高;血清及关节局部IL-6分子在治疗后期迅猛增加;DPSCs-Null治疗后,小鼠Treg细胞比例升高现象出现相对晚,但升高幅度大,维持时间长;外周血Th1/Th2细胞比例较低;血清及关节IL-6保持较低水平。滑膜细胞离体实验证明:HGF分子以时间和剂量依赖性的方式促进滑膜细胞IL-6的分泌;DPSCs-HGF培养上清或外源补充HGF分子通过活化c-Met受体及下游Akt信号通路,诱导Survivin分子表达,增强滑膜细胞克隆形成能力和凋亡抵抗能力;使用抑制剂抑制c-Met、Akt分子活化或减少Survivin分子表达后,滑膜细胞出现G2/M期阻滞,CDK1及Cyclin B1分子表达降低,HGF引起的滑膜细胞克隆形成能力提高和凋亡抵抗能力增强被有效抑制。结论DPSCs-HGF治疗CIA模型,在疾病早期诱导Treg细胞上调,减少IL-6细胞因子分泌,控制关节炎临床表现;在疾病中后期,HGF分子通过激活c-Met受体,活化下游Akt信号通路,诱导Survivin蛋白表达,促进滑膜增殖及凋亡抵抗,加速关节炎的恶化。基于上述内容,本研究系统阐明:（1）DPSCs通过抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能以及促进椎间盘结构恢复,发挥治疗IVDD的潜在作用。（2）DPSCs通过增加免疫抑制性Treg细胞,降低炎性Th1细胞比例及IL-6分泌水平以及控制滑膜炎症,发挥治疗RA的潜在作用。（3）HGF在治疗早期通过抑制免疫系统,发挥控制关节炎的作用;在治疗中后期,HGF通过激活滑膜细胞c-Met受体,活化下游Akt信号通路,促进滑膜细胞增殖及凋亡抵抗,发挥促进关节炎进展的作用。
刘能青[5]（2021）在《不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究》文中研究指明背景:从各种人体组织和器官中可以分离出被称为间充质基质/干细胞（Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs）的多能祖细胞,近10年其研究发展迅速,为细胞治疗和再生医学领域的发展提供了源源不断的动力。研究最广泛的MSCs来源包括骨髓、脂肪、脐带和胎盘等。国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy,ISCT）对MSCs制定了最低标准,包括细胞能够粘附在塑料皿上,并表达相应的分化簇（CD）标记（例如CD73、CD90和CD105标记）,并且可以在体外进行成脂,成软骨和成骨分化。MSCs的细胞治疗效能主要体现在分化潜能和免疫调剂能力上,特别是免疫调节能力让其在全身多个系统的炎性疾病中都显示出不俗的疗效。羊水中也能分离出与MSCs生物学特性高度一致的细胞,通常被定义为羊水间充质干细胞（Amniotic fluid mesenchymal stem cells,AFMSCs）或羊水来源干细胞（Amniotic fluid stem cells,AFSCs）。一般认为AFSCs介于胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和MSCs之间的中间阶段细胞,比起传统的MSCs具有更多良好的生物学特,如相比骨髓和脂肪来源的MSCs有更快增殖速度、更广泛的分化潜能、更强的免疫调节能力等。然而AFSCs具有显着的异质性,许多报道表明了AFSCs在细胞形态、分子表型和分化能力等多个方面存在不稳定性。细胞异质性带来的生物学特性的差异,在体外细胞增殖的过程中会进一步把这种差异扩大,进而影响临床细胞治疗效果的稳定性。而AFSCs异质性主要是因为其存在不同的组织器官来源,有研究指出羊水细胞中可以检测出骨髓、皮肤、肾、肝、肺、心等组织器官的特异性标记物。现今为止虽然已经有研究分离了不同组织特异性的AFSCs,但未对其进行深入的生物学特性检测以及临床治疗效能的评估。为此我们拟分离不同组织特异性的AFSCs,从多个角度的评估其生物学特性差异和治疗效能,为解决AFSCs异质性提供可行的思路,为AFSCs临床治疗应用提供更全面深入的理论基础。第一部分不同培养方法分离羊水来源的干细胞及其生物学特性分析目的:建立合适的AFSCs原代和传代培养方案,评估其生物学特性,同时与脐带间充质干细胞进行比较,为后续研究奠定实验基础。方法:1.建立三种培养模式,商品化培养基进行原代和传代培养（AFC）,传统间充质干细胞进行原代和传代培养（MSC）,以及商品化培养基进行原代培养和传统间充质干细胞进行传代培养（AFC-MSC）;2.通过克隆形成实验、CCK-8实验、群体倍增时间检测评估不同培养途径的培养效率;3.流式细胞仪检测细胞表面CD标志物;4.对不同培养途径获得的细胞进行成骨、成脂、成软骨分化,组织特异性染色和分化标志物基因的表达评估分化效果;5.把细胞与激活的外周血单个核细胞（PBMCs）进行共培养,通过CFSE增殖定量分析、增殖标记蛋白的表达及促炎因子的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.三种培养途径均能获得AFSCs细胞,但AFC培养途径效率更高,而MSC培养途径更廉价,AFC-MSC培养效率和成本处于两者之间;2.不同培养途径获得的AFSCs在在CD105的表达上存在差异,但不影响细胞形态、多能性基因的表达、分化潜能和免疫抑制能等主要生物学特性;3.与UCMSCs比较,AFSCs具有更高的成骨和成软骨分化能力,更强的免疫调节能力。结论:三种培养途径均可有效获得的AFSCs,CD105表达的差异不影响其他主要生物学特性,并具有比UCMSCs更强的分化潜能和免疫抑制能力。综合考虑时间和资金成本,选择AFC-MSC培养途径更合适。第二部分分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析目的:分离出不同组织特异性的AFSCs,从细胞形态、增殖能力、分子表型、多能性基因的表达、分化能力、迁移能力和免疫抑制能力等多个方面分析其差异。方法:1.通过机械挑克隆的方法分离出单个细胞形成的克隆并传代;2.对分离的克隆进行组织标记基因的检测,鉴定出不同组织特异性的AFSCs;3.显微镜下观察细胞形态,群体倍增时间分析增殖能力,β-半乳糖苷酶染色及细胞周期调控标志基因分析衰老程度;4.免疫荧光定性分析胚胎干细胞因子的表达,流式细胞仪定量分析细胞抗原决定簇和多能性因子的表达;5.进行成骨、成脂、成软骨分化,通过分化特异性染色的定性、定量分析及检测分化标志物基因的表达来评估分化程度;6.划痕实验、Transwell实验及检测迁移能力和趋化能力的标志基因评估细胞迁移能力;7.把细胞与激活的PBMCs共培养,通过CFSE细胞增殖实验、增殖标记蛋白的表达和促炎因子基因的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.从中孕期羊水分离的AFSCs能表达肺和肾组织特异性标记物,通过分离单细胞克隆并进行鉴定,可以分离出肾特异性AFSCs（AFSCs-K）、肺特异性AFSCs（AFSCs-L）和未知组织特异性AFSCs（AFSCs-X）;2.相比其他两组,AFSCs-K具有更快的增殖速率,更高的CD90、CD105和CD117的表达水平,更好的中胚层三系分化能力和更强的免疫抑制能力。但AFSCs-K具有更强的水平和垂直迁移能力,表达更多的迁移标志物基因,AFSCs-L则表达更多的趋化因子受体。3.分离后的不同组织特异性的AFSCs的各项生物学指标如细胞形态、增殖能力、分子表型、分化潜能等一致性更高,异质性大幅度降低。结论:AFSCs中可以分离出不同组织特异性的细胞,其生物学特性存在差异,总体上AFSCs-X的特性更优。按组织特异性分离后的细胞异质性大幅下降,细胞的各项指标更趋一致。分离不同组织特异性的AFSCs是解决细胞异质性的可行方案第三部分不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能目的:评估不同组织特异性的AFSCs在脓毒血症小鼠模型中的治疗效能。方法:1.使用盲肠穿刺法构建脓毒血症小鼠模型;2.对小鼠进行生存分析,构建生存曲线;3.对血液和腹腔液进行细菌培养,评估AFSCs的抗菌效能;4.Elisa分析血液中促炎因子的表达情况,评估AFSCs的抗炎效能。结果:1.不同组织特异性的AFSCs均能显着改善脓毒血症小鼠的存活率;2.不同组织特异性的AFSCs均能协助机体清除体内细菌,但以AFSCs-X的效果更为显着;3.相比AFSCs-L,AFSCs-K和AFSCs-X更能抑制促炎因子的表达,但两组之间无明显差异。结论:总体上AFSCs能改善脓毒血症生存率,具有抗菌抗炎的效果,其中以AFSCs-X的效果更为明显。
张美龄[6]（2021）在《黄柏炭与银屑病的治疗》文中指出纵观历代古籍对炭药的记载,可见其具有广泛的临床应用范围,能够治疗多系统、多器官的疾病种类高达百余种,且疗效确切。作为新药研发的全新药物源泉,探索炭药未被发现的、全新的药效,并科学的阐释其起效物质基础和作用机制,对于促进炭药以更广泛的药效服务于临床具有重要意义。黄柏（Phellodendri Chinensis Cortex,PCC）首载于《神农本草经》,也是经方常用组成药物之一。在前期开展多种炭药生物活性的研究中,偶然发现黄柏炭（PCC Carbonisata,PCCC）在改善咪喹莫特（Imiquimod,IMQ）诱导银屑病小鼠模型症状上展现出良好的疗效,然而这一全新药效发挥的起效物质基础和作用机制等基本科学问题尚未有定论。为填补这一研究空白,确证PCCC治疗银屑病的有效性和科学性,拓展其临床应用的范围,本研究展开了以下系列工作。目的:在新线索的基础上,应用IMQ诱导银屑病小鼠模型,进一步确证PCCC治疗银屑病的活性,并初步探讨“火制”程度对其药效的影响。进而以药效为指导,结合电镜技术、色谱技术以及光学技术,证明黄柏炭纳米类成分（PCCC nano-components,PCCC-NCs）是PCCC发挥治疗银屑病药效的物质基础,并分析不同条件制备的PCCC-NCs的物理化学性质与其活性强弱的关联性,获取其治疗银屑病活性最佳的制备工艺参数。于此基础上,进一步探讨PCCC-NCs治疗银屑病的量效关系、给药方式以及体内外安全性,并以调控巨噬细胞极化功能为切入点,阐释其起效作用机制,从而为以PCCC为代表的中药炭药的临床拓展应用与物质基础研究提供前导性研究思路。方法:（1）应用银屑病小鼠模型探讨炮制程度与给药方式对PCCC治疗银屑病作用的影响,初步筛选出活性最佳的“火制”条件,为后续实验的开展奠定基础。（2）采用透析方法将PCCC溶液分离成分子量大于和小于1000 Da的两部分,并借助色谱技术、电镜技术以及光学技术分析鉴定其治疗银屑病的活性部位。（3）考察炭化温度与时间对PCCC活性部位物理化学性质的影响,并通过银屑病小鼠模型和Hacat细胞增殖活力模型评价并筛选出PCCC活性部位的最佳制备工艺参数,进而借鉴材料科学技术进一步分析其结构特征、元素配位等信息。（4）通过检测银屑病小鼠体重、脾指数、后背与耳部皮肤外貌、银屑病皮损与严重程度评分（Psoriasis area and severity index,PASI）以及病理组织（如表皮厚度、炎性细胞浸润以及血管增生等）的变化,对优选获取的PCCC活性部位治疗银屑病的给药方式及量效关系进行研究。（5）利用ELISA法、生化法、流式细胞术、免疫印迹法、免疫组化/荧光法检测皮肤/血清中M1/M2标志性因子水平、脾细胞Th1/Th2和Th17/Treg 比例、氧化应激相关因子以及NF-κB/STAT6通路相关蛋白表达,从调控巨噬细胞极化角度探讨PCCC活性部位治疗银屑病的作用机制。（6）分别以脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和IL-4将RAW264.7细胞诱导极化成M1亚型和M2亚型,结合CCK-8实验获取的PCCC活性部位的安全给药浓度对极化后的RAW264.7细胞进行干预,并以M1/M2亚型巨噬细胞高表达因子为评价指标,体外进一步证实PCCC活性部位对巨噬细胞极化的调控作用。（7）通过细胞CCK-8实验、小鼠急毒及长毒实验,获取PCCC活性部位的安全性参数。结果:（1）确证了市售PCCC（PCCC sale in the market,PCCC-MS）具有治疗银屑病的药效,且腹腔注射效果较灌胃给药和皮下注射更佳;进而考察黄柏及其不同炮制品对银屑病小鼠的治疗效果,结果显示药效由强到弱依次为:改良工艺获取的400℃制备PCCC（PCCC prepared at 400℃,PCCC-400℃）>PCCC-MS>炒黄柏（Fried PCC,F-PCC）>PCC。（2）药效结果显示PCCC-400℃治疗银屑病的活性部位为透析袋内成分（MWCO>1000）,且经HPLC分析发现其色谱图上无吸收峰出现。低分辨透射电镜（Transmission electronmicroscopy,TEM）和高分辨透射电镜（Highresolution TEM,HRTEM）下可见其为0.5～3.6 nm的近球形、晶格明显（0.22 nm）的颗粒。红外和荧光图谱显示该部位具有荧光,且表面存在丰富的羟基、羧基等官能团。另外,对PCCC-MS透析袋内成分进行以上分析,结果与上述较为相似。结合我们团队的前期研究结果,本研究确认PCCC治疗银屑病的物质基础为纳米类成分（Nano-components,NCs）,即PCCC-NCs。（3）HPLC图谱显示9种工艺参数条件下制备的PCCC-NCs中均未有小分子化合物的存在。进一步采用现代材料科学分析技术对其物理化学性质分析发现:炭化温度相同时,延长制备时间会引起PCCC-NCs粒径尺寸减小、荧光最大激发/发射波长蓝移;炭化时间一致时,升高温度也会引起PCCC-NCs粒径尺寸减少,但是荧光波长变化并无规律性。除此之外,炭化的温度和时间还会引起PCCC-NCs的红外吸收峰强和晶格间距发生改变,但仅以当前结果难以分析其中的规律性。进而以治疗小鼠银屑病和抑制Hacat细胞增殖活力的体内外药效为指导,优化获取PCCC-NCs的最佳制备工艺参数为400℃、1h,进一步表征发现该NCs主要由碳和氧元素组成,存在高度不定型碳结构和π-π*、n-π*跃迁,且具有荧光激发-发射依赖性,量子产率为5.63%。（4）基于上述结果,本研究考察并证明了 400℃、1 h获取的PCCC-NCs在降低银屑病小鼠PASI评分上,腹腔注射的疗效较灌胃给药和皮下注射更佳;且本实验设置的高、中、低剂量PCCC-NCs在改善IMQ干预引起的体重降低,脾指数增高,PASI评分升高,背部和耳部皮肤病理组织改变如表皮增厚、炎性细胞浸润以及血管增生等症状上均显示出显着作用,相关指标或蛋白表达的变化也进一步验证了此结果。综合分析发现PCCC-NCs发挥抗银屑病活性的量-效曲线呈“U”型,即实验考察剂量内,中剂量PCCC-NCs表现出更佳的治疗效果。（5）机制研究发现,PCCC-NCs可降低银屑病小鼠血清（TNF-α、IL-6、IL-23、IL-17A和IL-22）和皮肤组织（TNF-α、IL-6、NO和iNOs）中的M1相关因子,且皮肤免疫组化分析可见其能够降低CD86的阳性表达,表明PCCC-NCs具有抑制巨噬细胞M1极化的作用;同时PCCC-NCs可升高皮肤组织和血清中M2相关因子（IL-10和Arg-1）水平,说明其可促进巨噬细胞向M2亚型极化。小鼠脾组织的流式细胞分析显示PCCC-NCs可通过降低Th1/Th2和Th17/Treg比例调节T细胞平衡,且该NCs还可改善IMQ引起的皮肤组织中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT降低,MDA升高的现象。进一步研究发现PCCC-NCs可抑制p65的磷酸化,同时促进STAT6磷酸化。上述结果表明,PCCC-NCs可能通过调控NF-κB和STAT6通路改善IMQ引起的巨噬细胞M1/M2升高现象,进而减少M1巨噬细胞分泌的炎性介质、促进M2型巨噬细胞分泌抗炎介质,实现对Th1/Th2和Th17/Treg平衡的调节和机体氧化应激损伤的缓解,从而发挥治疗银屑病的活性。（6）PCCC-NCs可缓解LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的M1极化,同时促进IL-4诱导的RAW264.7的M2极化,从体外角度进一步印证了该NCs对巨噬细胞极化的调控功能。（7）安全性评价结果显示PCCC-NCs在L02和293T细胞上的安全剂量≤ 1250μg/mL,且其用量在1.56 mg/kg～100.00 mg/kg区间内小鼠均不会出现急毒反应,最大给药量达到200 mg/kg时动物的生理状态和主要器官也未发生明显改变。另外,PCCC-NCs的长毒结果可见该NCs在连续给药1月和停药2周后,小鼠的一般状态、体重、摄食量、血常规、血清生化指标、主要脏器系数及其病理组织未显示出明显毒性变化。结论:本研究首次证实PCCC具有治疗银屑病的功效,且炭化程度高的PCCC腹腔注射效果更佳。综合利用色谱技术、现代材料科学技术和中药药理药效研究方法,追踪并确认PCCC治疗银屑病的物质基础为PCCC-NCs。以此成分为切入点,优化和规范PCCC的制备工艺,并以药效为指导获取该NCs活性最佳的制备工艺参数为400℃、1h。在此基础上,发现PCCC-NCs治疗银屑病无剂量依赖性,可能通过NF-κB和STAT6通路调控巨噬细胞极化,进而改善T细胞比例失衡和机体氧化应激损伤,从而发挥治疗银屑病的活性。另外,PCCC-NCs在细胞毒性、小鼠急毒和长毒实验均显示出极高的安全性。该研究结果将为确证PCCC治疗银屑病的全新药效、并从物质基础和作用机制角度阐述其科学性提供了实验依据,对于以PCCC为代表的中药炭药功效“钩沉创新”、物质基础和工艺规范及优化等基础研究提供了示范性思路,有助于推动PCCC-NCs开发成治疗银屑病新制剂从而使其更好的服务于临床。
曾赛珍[7]（2021）在《儿童腺病毒肺炎临床流行病学及病毒载量动力学特征研究》文中进行了进一步梳理目的腺病毒（Humanadenovirus,HAdV）可引起婴幼儿重症肺炎,并发严重后遗症甚至致命。系统了解儿童HAdV肺炎尤其是重症患者的临床和流行病学特征,并探讨重症HAdV肺炎儿童病毒载量动力学变化情况及相关影响因素,将为儿童HAdV肺炎的精准防控和临床救治提供科学依据。方法回顾性总结和分析2013～2020年湖南省人民医院儿童医学中心收治的HAdV肺炎患儿的临床和流行病资料;前瞻性监测流行期14岁以下重症HAdV肺炎儿童,动态采集病例鼻咽抽吸物（Nasopharyngeal aspirate,NPA）样本,应用实时荧光定量PCR测定HAdN DNA载量,并应用nest-PCR结合测序确定HAdV基因分型;对HAdV-7重症肺炎儿童免疫干预治疗进行分类,观察和分析不同治疗组患儿HAdV DNA载量的动态变化。结果（1）在2013～2020年间诊断为社区获得性肺炎的50805例患儿中,HAdV阳性总检出率13.11%（6662/50805）。男童检出率高于女童（χ2=22.64,P=0.000）,以4～5岁年龄组检出率最高（χ2=987.09,16.65%）（P=0.000）。夏季检出率最高（χ2=143.1,P=0.000）。主要临床表现为咳嗽（91.61%）、发热（82.18%）,其中>39℃ 占 80.02%。HAdV 载量范围为 5.20（3.57,6.78）copies/mL。HAdV 阳性患儿中,37.89%白细胞增多,42.73%C反应蛋白升高,54.94%伴CK-MB升高,87.41%伴LDH升高。在重症社区获得性肺炎中HAdV阳性占24.84%。重症HAdV肺炎以男性多见,6月-2岁年龄段多见。（2）前瞻性监测研究纳入132例重症HAdV肺炎儿童进行病毒载量动力学观察,其中HAdV-7 105例,HAdV-3 12例,共收集1372份合格NPA样本。分析发现NPA样本中HAdV病毒载量与病程呈显着负相关（Spearman r=-0.547,P=0.000）。不同基因型病毒动力学特征存在不同,NPA样本中HAdV-7病毒载量下降速率为每天0.089 log10 copies/mL,预测的排毒持续时间为96.9天（y=8.624-0.089x）,较 HAdV-3 预测的排毒时间 51.4 天更长（y=9.558-0.186x）。在≤2岁及>2岁年龄组、不同性别组、有无基础疾病组及有无闭塞性细支气管炎后遗症组之间病毒载量动力学相似。（3）共计对105例HAdV-7感染的重症肺炎患儿,开展不同干预治疗对病毒载量动力学影响的研究。在大剂量静脉丙种球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）组HAdV-7 DNA下降速率更快,每天下降速度为0.127 log10 copies/mL,预测的排毒持续时间为73.46天（y=9.329-0.127x）,明显短于小剂量IVIG组预测的排毒时间102.3天（y=102.37-0.083x）。在不同剂量激素治疗组、不同疗程激素治疗组、连续性血液净化治疗组和常规治疗组,NPA样本中的病毒载量动力学没有差异。结论HAdV是近年来湖南省5岁以下儿童重症肺炎的重要病因之一。重症HAdV肺炎儿童NPA中排毒时间长,其中HAdV-7较HAdV-3更明显,预测时间超过3月。大剂量IVIG治疗可缩短重症肺炎儿童的排毒时间。提示监测HAdV肺炎特别是重症患儿的病毒载量动力学变化,有助于认识疾病过程,为调整感染控制策略及评估疗效提供客观依据。
李豪[8]（2021）在《水凝胶负载KGN用于促进软骨再生的实验研究》文中研究说明目的:以酰肼修饰明胶（Gelatin-ADH）和磺酸化醛基修饰透明质酸（HA-CHO-SO3）为基础构建一种新型复合水凝胶,并同时混合转化生长因子-β1（TGF-β1）和小分子药物Kartogenin（KGN）,用于协同促进软骨组织再生与修复。方法:分别将明胶,透明质酸和β-环糊精进行改性为酰肼修饰的明胶（Gelatin-ADH）,磺酸化醛基修饰的透明质酸（HA-CHO-SO3）和醛基的修饰β-环糊精（β-CD-CHO）,通过FTIR对修饰后的材料进行结构表征及流变检测。全骨髓法提取兔骨髓间充质干细胞（Rabbit Bone Marrow Stem Cells,r BMSCs）,分别制备空白对照组（Hydrogel组）、单独应用组（Hydrogel+KGN组、Hydrogel+TGFβ组）和联合应用组（Hydrogel+KGN+TGFβ组）四种不同类型水凝胶,观察不同分组条件下r BMSCs的成软骨效果。采用活死细胞染色和细胞骨架染色分别检测四组水凝胶生物相容性;为评估体外诱导r BMSCs向软骨分化的可行性,四组水凝胶体外培养4周后取材,采用Ⅱ型胶原免疫荧光染色及组织蛋白定量检测其软骨相关蛋白（SOX-9、ACAN和COLⅡ）表达情况;为评估水凝胶是否能在体内再生具有特定形状和适当力学强度的软骨组织,我们将负载r BMSCs四组水凝胶通过模具法塑形成圆柱状和管状形态并植入裸鼠体内培养,6周后取材进行检测,采用HE染色、Safranin-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色评估再生软骨组织的软骨相关细胞外基质表达情况及表型;采用Western-blot测定各组再生软骨组织相关蛋白表达情况。最后优选联合应用组负载r BMSCs后再生出管状气管组织,并对兔气管缺损模型进行软骨缺损修复,12周后取材,进行大体观察及组织染色以评价其修复效果。结果:（1）FTIR结果显示明胶,透明质酸和β-环糊精均修饰成功。大体结果显示修饰后的明胶和透明质酸复合可以形成稳定的水凝胶。流变检测表明磺酸化及环糊精的加入不会改变水凝胶的力学性能,生理温度不会破坏水凝胶的稳定性。（2）活死细胞染色和细胞骨架染色表明水凝胶在成胶过程和细胞增殖过程中均具有良好的生物相容性,并且联合应用组r BMSCs表现出最均质的细胞分布,形态良好,且增殖数量最多。（3）体外培养4周后Ⅱ型胶原荧光染色显示联合应用组COL Ⅱ表达最多,蛋白定量测定结果显示联合应用组软骨特征基因和蛋白（SOX-9、ACAN和COLⅡ）表达最为明显。（4）裸鼠体内培养后发现水凝胶复合r BMSCs均成功再生软骨样组织,但联合应用组大体观相比于单独应用组和空白对照组表现出更白的软骨样质地;HE染色、Safranin-O染色和Ⅱ型胶原染色也表现出相同趋势,联合应用组具有更加典型的软骨陷窝结构并且更丰富的软骨特异性细胞外基质沉积;Western-blot结果表明,单独应用组与联合应用组均出现了软骨标志性COLⅡ蛋白,且SOX-9蛋白和ACAN蛋白表达较空白对照组更高。（5）负载r BMSCs的联合应用组水凝胶在裸鼠体内成功再生出管状气管样的软骨组织,组织学显示其具有典型的软骨陷窝结构和软骨特异性细胞外基质沉积。（6）兔气管软骨缺损造模并植入r BMSCs-水凝胶复合物后,12周取材大体观下,修复段气管组织与周围正常组织愈合良好,且能保持中通的管状形态;组织学结果显示修复段气管存在新生软骨组织形成并具有陷窝结构,其余部分被纤维组织填充。结论:（1）本研究通过修饰后的明胶和透明质酸成功制备了具有稳定结构,良好生物相容性,且易于塑形的新型水凝胶。（2）该水凝胶混合TGF-β1和KGN后具有软骨诱导功能,分别在体外和体内均能诱导出软骨样组织,并且可作为r BMSCs的载体,用于软骨缺损修复。（3）联合应用生长因子TGF-β1和小分子药物KGN可更好的促进BMSCs向软骨细胞分化,并再生出成熟的软骨陷窝结构。（4）联合应用生长因子TGF-β1和小分子药物KGN的水凝胶可用于兔气管缺损的修复。
高宇[9]（2021）在《顺铂在PIVAS中的配置和防护策略及临床滴注方式研究》文中提出目的:基于中国医科大学附属盛京医院中注射用顺铂的配置及临床使用情况,探索顺铂注射液适宜的配置方法,评估配置环境中顺铂残留量,分析顺铂正弦曲线法滴注给药时的疗效、安全性及免疫功能变化,以指导医院对静配中心的管理,优化顺铂临床治疗滴注方式,实现理想的治疗效果。方法:1.顺铂配置方法研究用不同溶解操作方式配置出临床常用浓度顺铂注射液,目视法观察其外观,HPLC法测定顺铂含量;光阻法测定经不同的穿刺角度、穿刺次数配置成的注射液中不溶性微粒数。2.顺铂稳定性研究分别以0.9%氯化钠注射液和3%氯化钠注射液作为顺铂溶媒,储存在4℃避光、25℃避光和25℃光照三种不同环境中12 h,检测顺铂注射液p H值、不溶性微粒数及药物百分含量的时间变化。3.顺铂残留量测定选取我院静脉药物调配中心作为检测对象,每个擦拭点擦拭3次（选择3天的同一时间、同一地点擦拭）,经溶解离心等操作后,HPLC法测定环境表面顺铂残留量。4.顺铂正弦曲线法给药检索中英文数据库中已公开发表的关于鼻咽癌患者接受顺铂正弦曲线法时辰化疗治疗的随机对照试验,对符合标准的文献提取相关临床效应指标进行meta分析。结果:1.顺铂注射液配置过程中初溶体积为10 m L时溶解效果要优于5 m L,手摇溶解和振荡器振荡溶解的效果要显着优于注射器抽吸溶解,而溶解操作时间对顺铂含量无明显影响;90°方向穿刺是能产生较少不溶性微粒的最佳穿刺角度,配置中涉及到的不同穿刺次数在10μm和25μm不溶性微粒数方面均符合中国药典中的规定。2.分别用浓度为0.9%和3%氯化钠注射液配置而成的顺铂注射液于4℃避光和25℃避光条件下储存12 h在外观、p H值、不溶性微粒数及主要成分含量上均基本保持稳定,符合药典规定。而在25℃光照的条件下放置12 h时顺铂注射液虽在外观、p H值、不溶性微粒数方面基本保持稳定,但顺铂百分含量随放置时间的延长降解明显,甚至在8 h后降解超过5%,超出药典标准。3.静脉药物调配中心环境中大多数地点顺铂的表面污染都很明显,其中以外层手套、生物安全柜台面、口罩最为严重,内层手套顺铂污染量要明显低于外层手套,提示调配人员佩戴手套和口罩能起到一定的保护作用,配置任务完成后使用75%乙醇和含氯消毒液清洁台面可有效降低环境中的顺铂残留。4.用正弦曲线的规律滴注顺铂对鼻咽癌患者进行时辰化疗能够有效减少恶心呕吐不良反应的发生,并且解除肿瘤对机体的免疫抑制。结论:静脉药物调配中心药师应掌握顺铂注射液最佳的配置方法,提高防护意识,加强配置工作职业技能培训。若临床条件允许,顺铂注射液可采取正弦曲线法进行滴注给药,将有效降低鼻咽癌患者恶心呕吐不良反应发生率,并解除机体的免疫抑制。
买买艾力·玉山[10]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中指出目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
二、一次性骨髓定量抽吸器及临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一次性骨髓定量抽吸器及临床应用（论文提纲范文）
（2）PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究内容一 PACAP/PAC1 受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究 |
| 实验一 电针改善顺铂致小鼠骨髓造血功能低下的治疗效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 电针促进顺铂小鼠骨髓交感神经修复和PACAP分泌的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验三 PACAP/PAC1 受体介导电针改善顺铂致白细胞减少症小鼠的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验四 外源性PAC1 激动剂改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 研究内容二 电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究 |
| 实验五 电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 从中医理论角度论述化疗致白细胞减少症与外周神经损伤的关系 |
| 2 电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的治疗效应研究探讨 |
| 3 PACAP/PAC1 受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制探讨 |
| 4 局限性与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 针灸对肿瘤化疗的减毒增效作用及神经调节机制研究进展 |
| 1 针灸对肿瘤化疗的减毒作用及潜在的神经调节机制探讨 |
| 2 针灸对肿瘤化疗的增效作用及潜在的神经调节机制探讨 |
| 3 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词一览表 |
| 前言 |
| 第一部分:EV的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究动物及饲养 |
| 1.2 研究材料 |
| 1.3 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鼠BMSCs的鉴定 |
| 2.2 EVs的鉴定 |
| 2.3 野生型和CD9-/-小鼠的骨折愈合情况分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分:囊泡干预下骨折小鼠模型中差异表达miRNA的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 B-EV促进骨折小鼠的恢复 |
| 2.2 微阵列分析差异表达miRNA |
| 2.3 筛选差异表达miRNA |
| 2.4 miR-355 的分布预测 |
| 2.5 miR-355 在EV中的表达分析 |
| 2.6 沉默miR-335 可部分降低B-EVs对骨折恢复的促进作用 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分:microRNA-335 通过Vapb和 Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 MTT检测细胞活力 |
| 1.2.2 TUNEL染色检测细胞的凋亡情况 |
| 1.2.3 Alizarin red染色检测细胞凋亡 |
| 1.2.4 碱性磷酸酶染色检测 |
| 1.2.5 免疫荧光染色 |
| 1.2.6 双荧光素报告基因检测miR-355与Vapb之间的结合位点 |
| 1.2.7 RNA pull down检测 |
| 1.2.8 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 B-EV促进成骨细胞增殖及凋亡 |
| 2.2 B-EV对成骨细胞粘附无作用 |
| 2.3 B-EV促进成骨细胞分化 |
| 2.4 沉默miR-335 可逆转B-EVs对成骨细胞分化的促进作用 |
| 2.5 miR-335 靶向作用基因的筛选 |
| 2.6 miR-335 靶向作用Vapb |
| 2.7 Vapb过表达可逆转B-EVs对成骨细胞分化的促进作用 |
| 2.8 携带B-EVs的 miR-335 靶向Vapb激活Wnt/β-catenin通路 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 主要结果与结论 |
| 第五部分 创新性与不足 |
| 参考文献 |
| 综述 囊泡来源microRNA在骨折中应用的研究进展 |
| 胞外囊泡在骨再生中的调控 |
| 骨髓间充质干细胞来源外泌体与骨骼再生 |
| MiRNA 在骨折中的作用 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 一、基本情况 |
| 二、学习工作经历(从大学起) |
| 三、研究成果 |
| (一)科研项目 |
| (二)发表文章 |
| 第一作者文章 |
（4）牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾1 干细胞在IVDD中的研究进展 |
| 1 正常椎间盘结构 |
| 2 椎间盘退变发生机制 |
| 3 干细胞原位移植在椎间盘退变中的治疗作用 |
| 4 原位移植的干细胞选择 |
| 文献回顾2 间充质干细胞治疗类风湿关节炎的研究进展 |
| 1 RA发病机制 |
| 2 MSCs对固有免疫细胞的作用 |
| 3 MSCs对适应性免疫细胞的作用 |
| 4 MSCs治疗RA的临床研究 |
| 第一章 DPSCs促进椎间盘退变动物模型局部结构恢复及II型胶原产生 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 实验动物来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DPSCs细胞鉴定 |
| 2.2 IVDD大鼠模型构建 |
| 2.3 IVDD大鼠模型细胞治疗 |
| 2.4 IVDD大鼠模型Micro-CT拍摄 |
| 2.5 大鼠椎间盘H&E染色 |
| 2.6 大鼠椎间盘退变组织学分级 |
| 2.7 大鼠椎间盘形态结构参数定量分析 |
| 2.8 大鼠椎间盘Masson染色 |
| 2.9 大鼠椎间盘番红固绿染色 |
| 2.10 大鼠椎间盘IHC染色 |
| 2.11 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs细胞形态学观察 |
| 3.2 DPSCs细胞表面标志物鉴定 |
| 3.3 DPSCs成骨分化能力检测 |
| 3.4 DPSCs成脂分化能力检测 |
| 3.5 DPSCs治疗后大鼠椎间盘退变影像学改变 |
| 3.6 DPSCs治疗后大鼠椎间盘退变病理学改变 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 IVDD动物模型的选择 |
| 4.2 DPSCs体内治疗效果评价 |
| 第二章 DPSCs抑制髓核细胞炎症保护其存活及功能 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 椎间盘突出患者标本来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代髓核细胞的分离与培养 |
| 2.2 髓核细胞RNA提取与质量控制 |
| 2.3 文库构建及测序 |
| 2.4 转录组测序数据分析: |
| 2.5 Western Blotting实验 |
| 2.6 细胞骨架染色 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs处理前后DEGs分析 |
| 3.2 基于DEGs的 GO分析 |
| 3.3 基于DEGs的信号通路分析 |
| 3.4 信号通路相关分子蛋白表达分析 |
| 3.5 DPSCs上清促进髓核细胞功能恢复 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 转录组测序揭示髓核细胞改变 |
| 4.2 炎症因子变化影响髓核细胞功能 |
| 4.3 TNF-α对髓核细胞影响 |
| 4.4 IL-1β对髓核细胞影响 |
| 第三章 DPSCs与 DPSCs-HGF治疗类风湿关节炎动物模型的疗效对比 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 实验动物来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CIA小鼠模型构建及评分 |
| 2.2 CIA小鼠模型细胞治疗 |
| 2.3 小鼠关节H&E染色 |
| 2.4 小鼠关节滑膜炎组织学分级 |
| 2.5 小鼠关节Micro-CT拍摄及分析 |
| 2.6 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DPSCs-Null治疗降低CIA小鼠关节炎临床评分 |
| 3.2 DPSCs-HGF治疗无较好长期收益 |
| 3.3 DPSCs-Null及 DPSCs-HGF对 CIA骨质破坏的治疗作用 |
| 4.讨论与小结 |
| 4.1 DPSCs生物学特性 |
| 4.2 DPSCs多向分化及免疫调节作用 |
| 第四章 HGF基因修饰DPSCs发挥抑制免疫与促滑膜炎的双重作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 健康牙髓组织来源 |
| 1.2 滑膜组织标本来源 |
| 1.3 主要器材 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原代滑膜细胞的分离与培养 |
| 2.2 Western Blotting实验 |
| 2.3 免疫细胞亚型分析 |
| 2.4 小鼠细胞因子检测 |
| 2.5 培养上清IL-6浓度检测(ELISA法) |
| 2.6 小鼠关节IHC染色 |
| 2.7 H score评分 |
| 2.8 克隆形成实验 |
| 2.9 细胞周期分析 |
| 2.10 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DPSCs-Null与 DPSCs-HGF治疗后免疫细胞亚型变化 |
| 3.2 DPSCs-Null与 DPSCs-HGF治疗后炎症因子变化 |
| 3.3 HGF对滑膜细胞生物学表型及信号通路影响 |
| 3.4 HGF活化c-Met/Akt信号通路促进滑膜细胞增殖及凋亡抵抗 |
| 4 讨论与小结 |
| 4.1 HGF及 c-Met受体结构及生物学功能 |
| 4.2 HGF 及 c-Met 受体免疫调控作用 |
| 4.3 HGF 在自身免疫性疾病中的治疗作用 |
| 4.4 HGF在RA中的作用研究 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（5）不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究（论文提纲范文）
| 缩略词英中文索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言总论 |
| 第一部分 不同培养方法分离羊水来源的干细胞及分析其生物学特性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基于分化潜能和免疫调节特性的羊水来源干细胞的治疗潜力 |
| 参考文献 |
| 附录 研究技术路线图 |
| 硕士研究生在读期间发表的论文及个人奖励 |
| 致谢 |
（6）黄柏炭与银屑病的治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一 黄柏临床用药的文献综述 |
| 1. 黄柏临床用药的古代文献考证 |
| 2. 黄柏炮制品的现代研究进展 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 银屑病的中西医研究概况 |
| 1. 中医对银屑病的认识 |
| 2. 现代医学对银屑病的认识 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 黄柏及其炮制品对银屑病小鼠的治疗作用评价 |
| 引言 |
| 实验一 PCCC-MS经不同给药方式干预银屑病小鼠模型的作用比较 |
| 实验二 黄柏及其炮制品对银屑病小鼠模型的治疗作用比较 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 黄柏炭治疗银屑病的物质基础——纳米类成分的提取与确认 |
| 引言 |
| 实验一 利用IMQ诱导银屑病小鼠模型筛选PCCC的有效部位 |
| 实验二 利用HPLC技术分析PCCC的有效部位 |
| 实验三 利用电镜技术和光学技术分析鉴定有效部位 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 黄柏炭纳米类成分的制备工艺优化 |
| 引言 |
| 实验一 PCCC-NCs的制备条件考察 |
| 实验二 利用银屑病小鼠模型优化PCCC-NCs的制备工艺参数 |
| 实验三 应用Hacat细胞优化PCCC-NCs的制备工艺参数 |
| 实验四 最佳条件获取的PCCC-NCs的表征研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 黄柏炭纳米类成分对银屑病的治疗作用研究 |
| 引言 |
| 实验一 PCCC-NCs治疗银屑病的给药方式研究 |
| 实验二 PCCC-NCs治疗银屑病的量效关系研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 黄柏炭纳米类成分治疗银屑病的作用机制研究 |
| 引言 |
| 实验一 PCCC-NCs对血清和皮肤组织中M1/M2相关因子水平的影响 |
| 实验二 PCCC-NCs对皮肤组织中M1极化标志物阳性表达的影响 |
| 实验三 PCCC-NCs对脾组织中Th1/Th2和Th17/Treg比例的影响 |
| 实验四 PCCC-NCs对皮肤组织中氧化应激相关因子水平的影响 |
| 实验五 PCCC-NCs对皮肤组织中NF-κB和STAT6通路相关蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 黄柏炭纳米类成分对RAW264.7巨噬细胞极化的调控作用研究 |
| 引言 |
| 实验一 利用CCK-8法研究PCCC-NCs对RAW264.7细胞活力的影响 |
| 实验二 PCCC-NCs对M1型巨噬细胞的调控作用研究 |
| 实验三 PCCC-NCs对M2型巨噬细胞的调控作用研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 黄柏炭纳米类成分的安全性评价 |
| 引言 |
| 实验一 细胞毒性研究 |
| 实验二 小鼠急毒实验研究 |
| 实验三 小鼠最大给药量检测 |
| 实验四 小鼠长毒实验研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在校期间主要研究成果 |
（7）儿童腺病毒肺炎临床流行病学及病毒载量动力学特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 2013年～2020年湖南地区儿童腺病毒肺炎临床流行病学特征 |
| 前言 |
| 1. 研究对象、材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 重症腺病毒肺炎儿童病毒载量动力学特征 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 干预因素对HAdV-7感染重症肺炎病毒载量动力学的影响 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 腺病毒病毒载量在临床中的应用 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及课题 |
| 致谢 |
（8）水凝胶负载KGN用于促进软骨再生的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Kartogenin对软骨再生作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写的论文 |
（9）顺铂在PIVAS中的配置和防护策略及临床滴注方式研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 PIVAS工作中顺铂注射液配置方法的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试药 |
| 3 方法与结果 |
| 3.1 高效液相色谱法测定顺铂含量的分析方法的建立 |
| 3.2 溶解过程配置操作的优化研究 |
| 3.3 注射器穿刺过程操作的优化研究 |
| 3.3.1 穿刺角度 |
| 3.3.2 穿刺次数 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 顺铂注射液的稳定性研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试药 |
| 3 方法与结果 |
| 3.1 0.9%氯化钠溶液与注射用顺铂的配伍 |
| 3.2 3%氯化钠溶液与注射用顺铂的配伍 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PIVAS环境中顺铂残留量的评估 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试药 |
| 3 方法与结果 |
| 3.1 色谱条件 |
| 3.2 样本的收集与处理 |
| 3.3 检测限与定量限 |
| 3.4 线性与范围 |
| 3.5 精密度考察 |
| 3.6 干扰试验 |
| 3.7 提取回收率的测定 |
| 3.8 防护用品及环境监测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 顺铂正弦曲线法给药治疗鼻咽癌疗效、安全性及免疫功能的Meta分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 方法与结果 |
| 3.1 资料来源 |
| 3.2 文献纳入和排除标准 |
| 3.3 文献质量评价和观察指标 |
| 3.4 统计学处理 |
| 3.5 文献检索情况和质量评价 |
| 3.6 有效性Meta分析结果 |
| 3.6.1 完全缓解 |
| 3.6.2 部分缓解 |
| 3.6.3 临床总缓解 |
| 3.7 安全性Meta分析结果 |
| 3.8 免疫学指标Meta分析结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 附录 顺铂注射液配置调查问卷 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 铂类药物指南推荐临床常用配伍及前景展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物及伦理 |
| 1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
| 1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
| 1.6 观察与检测指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 观察与检测指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、一次性骨髓定量抽吸器及临床应用（论文参考文献）
- [1]省医疗保障局关于公布2021年第一批新增、修订医疗服务价格项目的通知[J]. 贵州省医疗保障局. 贵州省人民政府公报, 2021(06)
- [2]PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究[D]. 黄锦. 天津中医药大学, 2021(01)
- [3]骨髓间充质干细胞来源囊泡中microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复作用机制研究[D]. 胡海峰. 山西医科大学, 2021(01)
- [4]牙髓干细胞对椎间盘退变与类风湿关节炎的免疫调控作用及治疗机制研究[D]. 董曦文. 军事科学院, 2021(02)
- [5]不同组织特异性的羊水来源干细胞的生物学特性及在脓毒血症小鼠模型中的治疗研究[D]. 刘能青. 广州医科大学, 2021
- [6]黄柏炭与银屑病的治疗[D]. 张美龄. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]儿童腺病毒肺炎临床流行病学及病毒载量动力学特征研究[D]. 曾赛珍. 南方医科大学, 2021
- [8]水凝胶负载KGN用于促进软骨再生的实验研究[D]. 李豪. 潍坊医学院, 2021(02)
- [9]顺铂在PIVAS中的配置和防护策略及临床滴注方式研究[D]. 高宇. 中国医科大学, 2021(02)
- [10]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)