一、EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用（论文文献综述）
杨佳宁,李娜,董鸿铭,徐媛,李淑英[1]（2021）在《EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响》文中指出目的探讨爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）编码的BARF1基因对人胃上皮细胞（GES-1）增殖、迁移及细胞周期分布的影响。方法将pIRES-EGFP/BARF1重组质粒、pIRES-EGFP空载体转染GES-1细胞,通过G418筛选,获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1及pIRES-EGFP的GES-1细胞。在荧光显微镜下观察转染与未转染组细胞生长状况;通过逆转录PCR（Reverse Transcription-PCR,RT-PCR）检测转染细胞中BARF1基因表达情况;通过细胞计数及CCK8法评估转染与未转染三组细胞的增殖能力;通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）染色法评价不同组别细胞周期蛋白Cyclin D1的表达情况;应用划痕实验分别对稳定转染BARF1组和空载体组GES-1细胞的迁移效率进行分析评价;应用流式细胞仪检测与分析细胞周期的分布情况。结果获得稳定表达pIRES-EGFP/BARF1、pIRES-EGFP的GES-1细胞模型;稳定转染BARF1组的细胞增殖能力高于未转染组及转染空载体组,并且稳定转染BARF1组S期显着延长;稳定转染BARF1组GES-1细胞的迁移能力比转染pIRES-EGFP空载体组得到明显提升;细胞周期蛋白Cyclin D1集中表达在稳定转染BARF1组的GES-1细胞核内。结论作为EBV编码的癌基因BARF1能够促进人胃上皮细胞GES-1增殖、迁移及分裂,抑制细胞凋亡,促进胃上皮细胞的恶性转化。
赵爽[2]（2021）在《基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究》文中进行了进一步梳理背景:EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）广泛感染人类,引发多种疾病包括恶性肿瘤,其中与鼻咽癌发病密切相关——在约98%的鼻咽癌患者的肿瘤组织中,可以检测到EBV的核酸。目前,已有多种EBV毒株的基因序列发表,不同肿瘤来源的EBV毒株携带不同的基因变异。EBV的变异可能在其致瘤过程中发挥作用,从而影响特定类型肿瘤的生物学行为。然而,对与鼻咽癌相关的EBV基因变异尚缺乏系统性研究。鼻咽癌是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,目前,TNM分期系统是鼻咽癌治疗决策和预后评估的主要依据。然而,该系统对于评估鼻咽癌预后的价值有限,已经不能完全满足临床需求。目的:这一博士学位课题的研究工作基于转录组测序数据分析,目的有二,①发现、鉴定与鼻咽癌相关的EBV基因变异,解析不同EBV亚型与鼻咽癌临床特征的关系,初步揭示鼻咽癌相关EBV基因变异的生物学功能。②筛选、构建鼻咽癌预后分子模型。方法:本项研究共纳入两组鼻咽癌患者;第一组67个病例,主要参加转录组测序及相关分析;第二组32个病例,主要参加EBV基因变异的验证分析。此两组鼻咽癌病例互为独立样本。针对第一组67例鼻咽癌患者的肿瘤和癌旁组织进行转录组测序。对测序数据进行生物信息学分析,从中发现鼻咽癌相关EBV的基因变异。采用RNA原位杂交技术BaseScope联合免疫组化共染色的方法,在第二组32例鼻咽癌组织样本中对测序发现的EBV基因变异进行验证。将上述在鼻咽癌中发现、鉴定的EBV变异位点,与公共数据中非鼻咽癌来源的EBV序列进行聚类分析;从中找出鼻咽癌相关的EBV亚型,并分析不同病毒亚型与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。另外,采用常规细胞分子生物学方法,建立稳定表达上述EBV变异基因的鼻咽癌细胞株,通过体外实验探索鼻咽癌相关EBV变异基因的基本生物学功能。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,从第一组参加转录组测序的67例鼻咽癌患者之中选择随访信息完善的60例入组,分为“复发转移组”和“非复发转移组”两组。通过对测序数据的分析,采用随机森林和极限梯度提升的机器学习方法,筛选出宿主的与鼻咽癌预后相关的特征基因。基于这一组特征基因,进一步采用Cox 比例风险回归模型构建鼻咽癌预后模型。继而采用GSEA和相关性分析,评价该模型的医学生物学功能。结果:①转录组测序结果显示,入组的鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中,EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率,分别在65/66和64/66例鼻咽癌组织中被检测到。②采用BaseScope和免疫组化共染技术,在独立样本32个鼻咽癌病例中以单细胞原位的方式验证了测序检出的EBER2的变异;并且证明携带病毒变异的细胞为肿瘤（上皮）细胞,而不是肿瘤组织中的浸润免疫细胞,由此明确了 EBV变异活跃转录的组织细胞来源。③根据EBER2的变异位点,将测序获得的EBV序列与已发表的EBV序列进行聚类分析,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2。其中,根据EBER2 7123位点,可进一步将EB-2细分为A>T和A>G两种亚型。EB-1基因型EBV显着富集于鼻咽癌（卡方检验,p<0.0001）;而EB-2亚型富集于中国北方鼻咽癌患者,且与肿瘤T分期相关（卡方检验,p<0.05）。生存分析显示,相较于EB-1亚型和EB-2-A>G,感染EB-2-A>T亚型EBV的患者预后最差（Log-rank,p=0.026）。④结合宿主mRNA表达谱数据进行差异表达基因分析和富集分析发现,EB-1和EB-2亚型参与影响宿主细胞不同的生物学过程。其中,EB-1亚型主要激活“Epithelial mesenchymal transition”,而 EB-2 亚型则主要激活“MYC targets v1”等。⑤针对另一个发生高频率变异的病毒基因LMP2变异的体外实验分析发现,相较于对照组,变异的LMP2B有显着促进鼻咽癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,对于转录组测序数据重点关注宿主的基因表达。⑥采用机器学习方法筛选出“复发转移组”和“非复发转移组”之间的特征基因,共 13 个:CES4A、GIMAP1.GIMAP5、GLB1L、LGR5、LOC730098、MLF1、MTHFD1L、MYLPF、NUP160、SIRPB1、TCN2、TMEM265、U2AF1L5。⑦基于这些特征基因构建Cox风险比例模型,得到一个4-mRNA signature,包括U2AF1L5、TMEM265、GLB1L和MLF1基因。根据这一模型计算每个患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组。⑧Kapan-Meier生存曲线和ROC曲线分析显示,这一预后模型能较好地评估鼻咽癌患者的预后,高风险组患者预后显着差于低风险组（Log-Rank,总生存:p=0.00126,无病生存:p=0.000059）。这一 4-mRNA signature在评估患者总生存以及无病生存的效果（AUC分别为0.893和0.86,）优于T分期（AUC为0.619和0.538）及N分期（AUC:0.582和0.622）。⑨多因素Cox分析结果显示,风险评分是鼻咽癌的独立预后因素（总生存,HR=14.501,p=0.012,无病生存:HR=13.752,p<0.001）。⑩GSEA 富集分析发现 4-mRNA signature 与细胞增殖和宿主免疫应答密切相关。结论:鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率。鼻咽癌组织内发生基因变异的EBV存在于肿瘤细胞而非浸润免疫细胞中。根据EBER2的变异模式,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2;它们与鼻咽癌患者的临床特征、预后相关,并可能与宿主发生不同的相互作用。通过对转录组数据的分析挖掘,构建了包含4个基因的4-mRNA signature模型,可用于鼻咽癌预后评估。
蔡曌[3]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中研究表明这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
王强[4]（2021）在《TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究》文中提出胃癌（gastric cancer,GC）是源于胃的恶性肿瘤,是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡主要原因。胃癌作为最常见的癌症之一,每年男性发病率为每100000人中有18例,女性发病率为每100000人中有9例。胃癌的形成机制复杂,主要涉及基因修复功能异常、细胞生长、死亡和凋亡基因的功能紊乱等,相关研究发现不同类型的胃癌存在不同发展机制、检测标记物、临床病理特征。为了明确胃癌的发展机制,为胃癌的治疗提供新的证据和方向,改善患者预后,研究胃癌分类的相关分子机制至关重要。TCGA分型和ACRG分型是近些年学者们提出的新的胃癌相关的分子分型方法,该分型方法的提出可以弥补传统病理分型的不足,为胃癌个体化治疗奠定基础。TCGA分型主要来源于欧洲人群,而ACRG分型来源于亚洲人群,主要来自日本和韩国,这两种分型在基因扩增、基因突变、临床特征、预后等各个方面均有显着的研究价值,对于临床的精准个体化治疗有重要意义。然而,TCGA分型和ACRG分型在河北省人群中的临床特征及其与临床参数和预后的关系尚不清楚。本研究旨在通过使用免疫组织化学（IHC）和二代测序（NGS）进行肿瘤分型,探讨两种分型方法和胃癌的临床病理特征、预后的关系,并通过大数据深入挖掘研究胃癌发生发展的分子机制,为胃癌研究提供新的方向和实验理论。第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:研究ACRG分型在GC组织中的表达情况,探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确ACRG分型是否适用于河北人群,探讨ACRG分型对预后的影响。方法:1.采用免疫组化染色法检测65例患者GC组织中MDM2,P21,E-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平。2.分析相关蛋白的表达水平与GC患者临床病理特征的相关性。结果:1.IHC染色显示MLH1,MDM2和P21蛋白主要位于细胞核中,而E-钙粘蛋白和波形蛋白则主要在肿瘤细胞的细胞质和膜中表达。2.不同年龄段（≤60岁和>60岁）胃癌病人的MLH1和MDM2表达水平有统计学差异（P<0.05）。3.E-钙粘蛋白和波形蛋白在不同位置的表达水平有统计学差异（P<0.05）。4.四种ACRG分子分型的GC患者在性别、年龄、肿瘤位置、Lauren分型或术后辅助治疗类型上均无明显差异（P>0.05）。5.MSS/TP53+胃癌在胃食管结合部（EGJ）（10.3%）显示出低频率,而大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃（41.7%）。6.MSS/EMT GC患者倾向为弥漫型（53.8%）,而MSS/TP53-GC患者为肠型（57.1%;MSS/TP53-GC患者倾向于肠型）。7.MSI与MSS/EMT预后明显不同（P<0.001）,MSS/EMT与MSS/TP53-预后明显不同（P<0.001）。MSS/EMT预后最差,其次为MSS/TP53-、MSS/TP53+、MSI。8.ACRG分子分型（P=0.045）、Lauren分型（P=0.001）和辅助治疗（P=0.013）与GC的总生存率（OS）相关。小结:1.MLH1和MDM2蛋白与年龄显着相关。2.E-钙粘蛋白和波形蛋白与肿瘤的位置显着相关。3.MSS/EMT胃癌患者倾向为弥漫型,而MSS/TP53-胃癌患者则倾向为肠型。大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃。4.在所有ACRG分型中,MSI的OS最好,复发率最低。第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:采用二代测序对胃癌进行综合分析,根据TCGA分型对65例胃癌患者进行分类。探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确TCGA分型是否适用于河北人群,评价TCGA胃癌分子分型对预后的影响。方法:1.采用二代测序方法对65例患者GC组织的基因突变进行筛选和注释。2.应用相关统计学分析TCGA与GC患者OS之间的关系。结果:1.NGS测序结果显示在65例GC病例中,EBV+为6例（9.2%）,MSI为15例（23.1%）,GS为14例（21.5%）,CIN为30例（46.2%）2.MSI在女性中更为常见（53.3%）,而EBV+在男性中更为常见（83.3%）。3.65例胃癌中,TP53的突变率为80.0%,扩增百分比CCNE1为20.0%4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗患者的预后最差。5.Kaplan-Meier图显示多基因突变患者的预后较差。单变量和多变量分析表明TP53突变的患者（危险比=4.193,95%置信区间=1.260-13.945）的预后较差。小结:1.MSI和EBV+发生的概率有性别差异;2.GS和MSI在不同的年龄段发生概率有差异;3.CIN胃癌在胃食管连接处更为常见;4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗的患者的预后最差;5.突变率最高的基因是TP53,扩增百分比最高的是CCNE1;6.多基因突变患者的预后较差;7.TP53突变是GC的独立预后指标。第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索目的:利用来自NCBI的基因表达数据库（GEO）、癌症基因组的大型公共数据集数据库（TCGA）研究ACRG分型的生物信息分析,并探讨其在胃癌中的临床意义,对MSI和EMT突变频率进行分析,探讨MSI和EMT相关的差异表达基因,并进行GO富集分析和KEGG分析,对MSI和EMT相关基因和通路进行分类。从基因层面探讨MSI和EMT型胃癌的影响因素。方法:1.利用TCGA数据库和来源于NCBI的GEO数据库中的数据,分析比较TCGA数据库与GSE62254数据集中MSI和EMT表达水平的差异,探讨GC患者预后。2.对MSI和EMT相关的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG分析。3.单变量Cox风险回归分析来探讨差异基因与胃癌患者预后的关系。结果:1.对GSE62254胃癌数据集和TCGA数据库的综合分析显示,EMT阳性与不良总体存活显着相关,且MSI的总体生存显着优于EMT。2.MSI的突变频率明显高于EMT。3.8个基因与胃癌患者EMT和MSI分型显着相关,分别是THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3。4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。小结:1.MSI的突变频率明显高于EMT;2.MSI患者的总体生存显着优于EMT;3.通过生物信息学分析发现THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3与胃癌患者的分类及预后显着相关;4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。
李红玉[5]（2021）在《HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究》文中认为研究目的:为了探索EB病毒与新疆地区霍奇金淋巴瘤的发病的相关性,了解新疆地区霍奇金淋巴瘤患者的临床现状,在已筛选出新疆地区人群与霍奇金淋巴瘤相关HLA-DPB1分型的基础上,进一步检测新疆地区健康人群HLA-DPB1亚型与霍奇金淋巴瘤HLA-DPB1亚型与EB病毒gp42的的结合方式、结合力的大小及差异。研究方法:1)我们使用慢病毒感染的方式,对T1细胞进行HLA-DPB1亚型的慢病毒感染,构建HLA-DPB1重组载体;2)使用免疫荧光标记的方法标记gp42蛋白,探索不同浓度下,gp42蛋白与HLA-DPB1重组载体的结合效率,获取最佳的gp42蛋白的结合浓度;3)使用流式细胞术检测HLA-DP+gp42+双阳性细胞,计算HLA-DPB1亚型与gp42蛋白亲和力大小及差异;4)我们使用分子动力学模拟的方式模拟gp42蛋白和HLA-DPB1亚型的结合,获取两者的结合方式、结合形态及所形成复合物的基本属性;5)回顾性分析在2016年1月1日至2020年9月1日期间初次就诊于新疆肿瘤医院的霍奇金淋巴瘤患者105例,收集该患者的临床特征,结合实验室检查结果及病理组织学检测,利用SPSS16.0软件进行统计学分析,探讨EB病毒感染者与非EB病毒感染者之间的临床特征及病理学特征的差异;6)分别选取EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者15例及淋巴结反应性增生的患者10例,检测两组患者的CD3、CD4、CD8、PD1、PDL-1、HLA-DPB1、LMP1、CD30等分子的表达,对比免疫功能及表达产物的差异。研究结果:1)T1细胞进行慢病毒感染的最佳条件是选择B2助感染液、MOI=100、感染时间为72小时,在此基础上成功构建LV-DPB1-H组和LV-DPB1-HL组质粒载体;2)探索出gp42蛋白的最佳结合浓度,即gp42蛋白在80μg浓度时,HLA-DPB1与gp42的结合效率最高;3)HLA-DPB1的B链与gp42的A链通过氢键结合形成一个复合物,该复合物属亲水类蛋白,Resolution为3.25;4)LV-DPB1-HL组的HLA-DP+gp42+的双阳性率明显高与LV-DPB1-H组（29.467±2.108vs 15.867±0.929）,差异具有统计学意义;5)收集了105例霍奇金淋巴瘤患者的临床资料及病理特征并进行统计学分析,单因素分析结果显示:性别（P=0.007<0.1）、年龄（P=0.000<0.1）,Ann Arbor分期（P=0.088<0.1）、病理分型（P=0.000<0.1）是影响EB病毒阳性预后的因素;经多因素COX回归分析结果显示:年龄是影响EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤预后的独立因素（P=0.000<0.05,HR:1.026,95%CI:1.014～1.042）;6)通过对15例EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者及10例淋巴结反应性增生患者的免疫功能及表达产物分析,EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者中LMP1、CD30、PDL1的表达量均高于EB病毒阳性淋巴结反应性增生患者,提示LMP1、CD30、PDL1与EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的发病机制存在相关性;与对照组相比,CD4+T细胞在病例组中的表达比例升高,差异有统计学意义;CD8+T细胞在病例组中的表达比例降低,差异有统计学意义;HLA-DPB1的表达量在病例组vs对照组的比例降低,差异有统计学意义。研究结论:EB病毒的gp42蛋白可以与人类白细胞抗原HLA-DPB1在细胞表面相结合,在gp42蛋白的浓度达到80μg时,两个蛋白可以达到较高的结合效率,共同结合后可以在细胞内作用,导致人体的免疫抑制作用发生改变,共同参与到霍奇金淋巴瘤的发病过程中。在EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤组中,性别、部位、EBV-DNA复制、Ann Arbor分期、病理组织分型、初始治疗方案与EB病毒感染患者的预后无相关性,但年龄、血液EB病毒检测是影响EB病毒感染患者预后的独立预后因素,且EB病毒感染后,霍奇金淋巴瘤的免疫功能及免疫产物较淋巴结反应性增生均发生变化。因此,我们也许可以通过降低gp42浓度,即降低EB病毒的感染率来降低霍奇金淋巴瘤的发病;另一方面,根据分子动力学模拟的结果:我们可以通过断裂氢键、阻止亲水性结合等方式阻止疾病的发生,这些数据可能为后期霍奇金淋巴瘤的治疗方式及疫苗研究提供一定的参考价值。
王泽洋[6]（2021）在《EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:胃癌（Gastric Cancer,GC）是全球范围内第五大高发肿瘤疾病,居肿瘤死亡原因第二位。胃癌病因包括遗传因素、理化因素及感染因素等。在感染因素中,幽门螺杆菌与胃癌有关已达成研究者共识。除此之外,近年来EB病毒（epstein barr virus,EBV）也已引起研究者高度重视。EBV是1964年Epstein和Barr从非洲儿童Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的病毒,属人类疱疹病毒4型,即γ-型疱疹病毒,特异性人类嗜淋巴细胞性病毒。目前已知,EBV感染与多种人类恶性肿瘤如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病及非霍奇金淋巴瘤等密切相关。1993年,Tokunaga等通过原位杂交技术证实胃癌细胞内存在EBV编码的小RNA,将之定义为EBV相关性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。2014年癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）根据分子水平的差异将胃癌分为四种分子病理亚型,包括EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中,EBVaGC以其区别于其他类型胃癌的多种特质引起了广泛关注。据统计,EBVaGC约占全世界胃癌发病率的10%,且在不同地域间存在差异（[6]）。全面认识EBVaGC对胃癌发生机制研究及临床诊治有重要指导意义。表型特征是生物体从宏观到微观（即分子组成）、从胚胎发育到出生、成长、衰老乃至死亡过程中,形态特征、功能、行为、分子组成规律等所有生物、物理和化学特征的集合。全景解析人类表型特征,建立宏观表型与微观表型间多维度关联,是解析生命科技的重要线索。目前,对EBVaGC分子表型及临床表型特征等已有所了解,比如,EBVaGC中显示出PIK3CA的反复突变、DNA甲基化以及JAK2,PD-L1和PDL2过表达扩增等。然而,EBVaGC的分子模式非常复杂,包含多种遗传学和表观遗传学变异、转录组学及蛋白组学变异等,对此,我们的认知还十分有限,尚需深入探索,EBVaGC主要临床表型特征及具体发病机制也需要进一步深入研究。全面阐释EBVaGC表型特征可提供潜在的新型胃癌治疗靶标和路线图,可为制定胃癌精准诊治策略提供参考。EBVaGC致癌原因与EB病毒感染有关。病原微生物感染的基因组学和蛋白质组学研究旨在找出在病原体感染和宿主防御整个过程中影响重要生物学活动的关键蛋白以及这些蛋白的功能机制。对重要微生物的基因组学和蛋白质组学差异的鉴定不仅有助于深入了解其发病机制,还可为相关疾病的治疗提供新靶点。然而对于EBV感染导致的胃癌,目前几乎所有基因和蛋白水平的研究均聚焦于单一因素或基于生物信息学数据库的大样本数据集,仍缺乏通过独立采集质谱技术检测蛋白质组学变化建立的对EBVaGC基因和蛋白表达谱的综合研究。血清学检测,作为一种方便、非侵入性和成本效益高的检测手段,在人群流行病学调查、疾病过程的动态监测和风险预测方面显示出显着的优势。到目前为止,EBV血清学检测已经广泛应用于Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,霍奇金或非霍奇金淋巴瘤,睾丸癌等疾病的风险预测及早期诊断。然而,很少有研究集中于EBV血清学与胃癌风险的关系。此外,目前尚不清楚EBV血清学检测是否具有GC预测和预后的潜能。综上,本研究试图从基因变异、蛋白表达、病理组织学形态、血清抗体表达等不同层面,多维度探讨EBVaGC表型特征并筛选鉴定EBVaGC关联蛋白。对于已鉴定出的EBVaGC关联蛋白,我们进一步探究了其在EBV相关性胃癌中的分子调控机制。本研究为进一步探讨EBVaGC关联蛋白的作用机制奠定基础。研究目的:1.明确EBVaGC的表型特征。2.EBVaGC关联蛋白的筛选鉴定。3.明确EBVaGC关联蛋白GBP5的作用机制。研究方法:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别（一）EBVaGC差异表达基因分析利用公共数据资源GEO数据库检索包含EBV相关性胃癌信息的基因表达谱芯片,确定GSE51575作为分析芯片。该芯片包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本基因表达信息。采用GEO2R分析出该表达谱芯片的差异表达基因,|FC|>2.0,P<0.05为具有统计学意义。（二）EBVaGC差异表达蛋白筛选验证a)收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织共计132例。b)应用EBV编码RNA（EBER）原位杂交（ISH）技术对胃癌样本进行EBV原位检测。c)利用EBV阳性与阴性胃癌组织进行DIA-相对定量蛋白质组学分析,筛选具有差异表达水平的蛋白。（三）EBVaGC病理组织学特征分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织及其癌旁正常组织标本共计132例。通过患者病历收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、淋巴结外肿瘤种植等临床病理信息。2.通过原位杂交检测EBV原位感染情况,进行分析。（四）EBVaGC血清EBV抗体表达分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年11月至2020年6月的胃癌手术患者以及庄河胃癌高发现场患者血样本,其中包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎以及胃癌病例共计1790例。在患者病历中收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、节外种植等临床病理信息。本研究获得中国医科大学第一附属医院研究所医学伦理委员会的批准,所有受检者均提供书面知情同意书。2.利用血清定量检测不同EBV-VCA IgG抗体滴度,分析其表达水平与EBV相关性胃癌发病风险、预后及临床病理参数的相关性。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究（一）GBP5原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后关系利用免疫组化技术对255对胃癌组织以及癌旁正常对照组织进行免疫组化染色,分析其与胃癌之间的关系。（二）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响1.GBP5过表达和沉默质粒的构建:分别选取GV146和GV102为GBP5的过表达以及沉默质粒载体,并经过酶切确认。化学合成GBP5基因序列,用Kpn I/Bam HI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2.根据文献报道,选取EBV阳性SNU719胃癌细胞系以及EBV阴性AGS胃癌细胞系,并经过Real-time PCR确认EBV的表达,进行后续实验。3.采用CCK-8进行细胞增殖效应的检测。（三）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响1.EBVaGC差异表达免疫相关基因的确定本研究经查阅文献后共总结出47个免疫相关基因,进一步将GSE51575中差异表达基因与47个基因取交集后筛选出差异表达的免疫相关基因。P<0.05被认为具有统计学意义。2.确定EBVaGC与GBP5相关的免疫基因采用斯皮尔曼相关分析方法分析GBP5与EBVaGC差异表达相关的免疫相关基因的相关情况。|r|>0,P<0.05具有统计学意义。3.验证EBVaGC免疫相关基因差异表达本研究收集GBP5过表达和沉默的SNU719和AGS细胞系培养液上清进行酶联免疫吸附实验对预测的GBP5相关的免疫基因进行验证。利用SPSS Statistics 24和Graph Pad Prism 8进行统计分析。P<0.05为具有统计学意义。（四）GBP5表达调控网络分析1.EBV相关性胃癌中GBP5蛋白互作网络构建本研究利用STRING在线工具（v11.0,https://string-db.org）预测GBP5蛋白互作网络。将GSE51575中差异表达基因与预测出的GBP5互作蛋白取交集,筛选出差异表达的GBP5互作蛋白,P<0.05被认为具有统计学意义。2.EBVaGC中GBP5与互作蛋白间的关联分析本研究利用斯皮尔曼相关分析计算GSE51575数据集中GBP5与其差异表达互作蛋白间的相关性。|r|>0,P<0.05被认为具有统计学意义。3.EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析对GBP5及其具有显着相关性的互作蛋白进行GO（包括生物学过程、分子功能和细胞组成）和KEGG富集分析,P<0.05具有统计学意义。研究结果:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别1.EBVaGC关联基因表达特征（EBV+胃癌vs EBV-胃癌差异表达基因）对包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本的基因表达谱芯片GSE51575进行差异分析,结果显示在EBVaGC中共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）,其中排位前者包括CXCL17、GBP5、DMBT1、SLC6A8等。将EBVaGC表达的关联基因进行通路富集分析,结果表明统计学差异最显着的前10条通路均与机体免疫功能相关,例如抗原加工和呈递;辅助性T细胞1、辅助性T细胞2以及辅助性T细胞17分化、移植物抗宿主反应等。2.EBVaGC关联蛋白表达特征（EBV+胃癌vs EBV—胃癌差异表达蛋白）2.1基于EBV检测的金标准EBER-ISH,EBV感染细胞在遵照试剂盒说明书处理过后细胞核可以被显着棕染。结果显示132例胃癌样本中共有7例组织标本具有阳性EBER信号。2.2 EBVaGC的蛋白质组学研究采用上述7例EBV+胃癌样本及与之年龄性别临床病理参数匹配的7例EBV—胃癌样本进行DIA-相对定量蛋白质组学分析。结果显示与EBV-阴性胃癌组相比,在EBV-阳性胃癌组中共鉴定出137个差异表达蛋白。其中,GBP5、C5AR1、THRAP3、P3H3和MDK为47个上调蛋白中差异前五的蛋白。2.3本研究将GSE51575中差异表达的基因分别与鉴定出的差异表达蛋白取交集。结果发现共有25个基因在两组数据中均差异表达,其中GBP5在25个差异表达蛋白中差异表达倍数最高,其在EBV-阳性胃癌中相较EBV-阴性胃癌同样显着上调（P=1.19E-03,log2FC=3.21）,提示GBP5可能是一种与EBVaGC高度相关的蛋白。3.EBVaGC临床病理参数分析我们进一步对EBVaGC的组织病理学特征进行了分析。首先利用EBV原位杂交实验检测132例胃癌组织,结果显示7例具有阳性信号,EBVaGC检出率为5.3%。全部EBV+胃癌病例为中老年男性。其基本病理学特征为:全部病例为中晚期胃癌,多发于胃体部位（4/7,57.14%）;大体分型以溃疡/溃疡浸润型为主（6/7,85.71%）;组织学分型以中分化及低分化腺癌为主（6/7,85.71%）;绝大多数呈浸润性性生长（6/7,85.71%）;淋巴结转移多见（5/7,71.43%）;所有病例均存在癌周淋巴细胞浸润。免疫组化染色结果显示,Ki67指数较高,多伴有P53阳性表达（5/7,71.43%）以及EGFR与VEGF表达（4/7,57.14%）。EBV-阳性胃癌与EBV-阴性胃癌相比,临床病理参数未见显着差异（P>0.05）。4.EBV血清抗体表达与胃癌风险/预后的相关性在发病风险方面,分析1790例EBV-VCA IgG感染状态与不同胃疾病的组间比较发现,萎缩性胃炎组和胃癌组的EBV-VCA IgG阳性率均显着高于对照组（AG:40.0%vs.30.5%;GC:38.6%vs.30.5%）。经年龄和性别校正后,研究发现EBV-VCA IgG感染者罹患萎缩性胃炎和胃癌的风险分别提高到1.55倍和1.36倍（分别为P=0.001,95%CI=1.21-1.99;P=0.011,95%CI=1.07-1.72）。在胃癌预后方面,对临床病理资料齐全的234例胃癌患者进行了随访。结果发现,在肠型胃癌亚组,EBV-VCA IgG感染状态与总生存期有关,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差（Mean survival month:49.2 vs.61.3,P=0.009,HR=3.50,95%CI=1.37-8.94）。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究1.GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性我们首先探讨了GBP5蛋白表达与胃癌组织病理学特征的关系,结果提示GBP5蛋白表达水平与浸润深度、脉管癌栓、淋巴结外肿瘤种植存在显着相关,在其他病理学参数的分组中未发现GBP5蛋白存在差异表达（P>0.05）。我们还分析了GBP5蛋白表达对胃癌预后的影响,单因素与多因素COX回归分析均未发现GBP5蛋白表达与胃癌预后具有相关性（P>0.05）。2.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响EBV+SNU719和EBV—AGS细胞系中转染GBP5过表达质粒和对照质粒以及沉默和沉默对照质粒,分别观察两组细胞在24h、48h、72h的细胞活性。结果发现SNU719细胞系中,GBP5过表达组72h时的细胞活性较阴性对照组升高（P=0.001）,GBP5沉默组细胞活性较沉默对照组降低（P<0.001）。3.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响采用GSE51575芯片数据,利用GEO2R分析GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫基因表达的影响,结果显示共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）。进一步将47个免疫相关基因与GSE51575中差异表达基因取交集后发现23个基因在该芯片中存在差异表达,且均为上调表达,例如CXCL17等。4.GBP5表达与EBV相关性胃癌调控网络的关联分析本研究采用Sanger Box预测GBP5互作蛋白并确定其在EBVaGC中的差异表达情况,结果显示FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2和OASL可能为GBP5互作蛋白,且其在EBVaGC中均为上调表达,与GBP5存在显着的正相关关系。富集分析表明GBP5及其潜在的互作蛋白（OAS2、GBP2）可参与寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路,提示EBVaGC中差异表达的GBP5、OAS2和GBP2可能通过影响此通路活性从而促进EBV相关性胃癌进展。研究结论:1.EBVaGC关联基因表达差异显着者有GBP5、CXCL17等,功能分析显示均与机体免疫功能相关。2.EBVaGC关联蛋白表达差异显着者有GBP5、C5AR1等,功能分析显示可能与乙醇降解Ⅱ类蛋白具有富集效应。3.EBV-阳性胃癌多见于中老年男性;胃体部位多发;溃疡/溃疡浸润型多见;中低分化腺癌多见,淋巴结转移多见。4.携带血清EBV-VCA IgG抗体者罹患胃癌发病风险升高;在肠型胃癌亚组中,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差。5.GBP5原位表达与胃癌不良临床病理参数正相关,尤其是与浸润深度、脉管癌栓以及结外肿瘤种植显着相关。6.GBP5可促进EBV阳性胃癌细胞增殖活性。7.在EBVaGC中,GBP5与23个免疫相关基因存在显着的相关性,其中CXCL17、IL-17、1L-8已经血清学表达实验证实。8.在EBVaGC中,GBP5表达调控通路生信分析结果提示,GBP5可与FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2、OASL互作。GBP5可能通过影响寡聚化域样受体信号通路活性从而促进肿瘤进展。
郑小辉[7]（2020）在《鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究》文中提出目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤,在中国南方和东南亚地区广泛流行。临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。寻找和建立简单可靠的生物学标志物应用于高发区鼻咽癌的早期诊断和筛查是亟待解决的重要问题。已有充分的研究表明,EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）感染在鼻咽癌的发病中扮演着非常重要的角色,鼻咽刷取样结合EB病毒核酸标志物检测可能会为高发区鼻咽癌的诊断和筛查提供新的研究思路。我们开展该项研究的目的主要有:（1）探讨鼻咽刷取样结合EBV DNA检测对中国华南区高发的鼻咽癌是否具有较好的诊断应用价值。（2）明确鼻咽刷样本中EBV的产生来源,以确定是否是肿瘤细胞来源反应鼻咽癌的发生,为鼻咽部EB病毒核酸标志物的发掘和利用提供清晰的理论基础。（3）发掘适用于辅助鼻咽癌诊断的核酸标志物,尤其适用于在高发现场不依赖临床医生和医疗设备的盲刷取样条件下的标志物,以利于在高发现场人群筛查中的应用。方法:本项研究以鼻咽癌作为研究疾病模型,通过与地处中国华南地区鼻咽癌高发区的中山大学肿瘤防治中心人员合作开展进行,便于充分利用当地丰富的病例资源。（1）首先招募了129例的鼻咽癌患者,116例的对照受试者,58例接受治疗后的复查患者（训练集人群）,对每例受试者通过已建立的鼻咽刷取样体系刷取鼻咽部样本,对鼻咽刷样本中EBV DNA load进行q-PCR检测,对配对血液样本中的EBV VCA-IgA抗体滴度和EBV DNA load分别进行免疫酶法和q-PCR定量检测,评估鼻咽刷EBV DNA load的诊断价值。（2）进一步对上述训练集人群刷取的鼻咽刷样本,同时提取了样本中的总DNA和RNA,对获得鼻咽刷样本中的EBV DNA进行了比较PCR实验,即同时检测EBV基因组中EBNA1基因的99bp和213bp的片段,以判断DNA是否是凋亡裂解的DNA片段;对获得的RNA中EBV转录的六个潜伏期基因（包括EBER1,BART,LMP1,LMP2A,EBNA1和EBNA2）,五个裂解期基因（包括立早期ZEBRA和RTA,早期基因PK和TK以及晚期基因VCA-p18）以及转录的四个Bart miRNAs（mir-bart1-5p,mir-bart5,mir-bart16,mir-bart17-5p）的转录表达进行了q-PCR检测,与EBV DNA load进行了相关性分析,并与49例活检组织（包括36例鼻咽癌和13例黏膜炎症）中这11个EBV mRNA和4个miRNA的表达进行了比较研究;对鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区甲基化状态,包括甲基化程度（methylated degree）和甲基化类型（methylated type）进行了甲基化特异的PCR检测,通过这些实验的开展明确EBV的产生来源,以确定鼻咽刷EBV是否是鼻咽癌来源。（3）最后通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）曲线,相关性分析等分析方法确定截断值（Cut off value,COV）,评价了训练集样本中检测的EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type等多个其它核酸标志物单个及联合应用于鼻咽癌诊断的诊断准确性,并在另一包含424例样本的独立验证集人群（215例鼻咽癌患者和209例非鼻咽癌受试者）中进行验证。此外,又对38例鼻咽癌患者和48例对照受试者平行进行了不依赖内镜引导的取样,获得了配对的盲刷条件下的鼻咽刷样本,评价了这些核酸标志物在盲刷下应用于诊断的价值。结果:（1）对鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测显示在鼻咽癌组,所有的鼻咽刷样本中都显示阳性结果并且EBV DNA load显着升高（平均值为46360 copies/ng DNA,表达范围为40–1395000 copies/ng DNA）。在非鼻咽癌的对照组和现场人群对照组,EBV DNA load阳性率和拷贝数值分别为70.6%（平均值28 copies/ng DNA,表达范围0158 copies/ng DNA）和87.8%（平均值50 copies/ng DNA,表达范围0469copies/ng DNA）,治疗之后,阳性率为63.8%（平均值27 copies/ng DNA,表达范围0417 copies/ng DNA）。通过ROC曲线确定截断值,鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测应用于鼻咽癌诊断的敏感度和特异性分别达到了96%和97%,平行试验显示诊断效果优于EB病毒血清VCA-IgA抗体（敏感度89%,特异度77%）和血浆EBV DNA load（敏感度为76%,特异度为87%）的检测。与11例病人（约为8.5%）需要多次活检不同的是,这11例病例在接受首次刷检时,EBV DNA load都高于设定的截断值,有效弥补传统指标的不足。（2）对EBV DNA进行比较PCR的结果显示,104例鼻咽癌患者鼻咽刷样本中,只在12例样本中检测到EBNA1基因99bp短片段数量的显着增多,提示只有少量样本中有明显的EBV DNA的降解;对EBV六个潜伏期和五个裂解期基因的转录检测结果显示在鼻咽癌鼻咽刷样本中EBV RNA转录是典型的II型EBV潜伏感染,即高表达EBER1,BART,LMP1,LMP2A和EBNA1基因,而不表达EBNA2,同时也检测到一定频率（从31.4%到93%）的裂解期基因的表达,这与鼻咽活检组织表达情况类似,提示鼻咽刷样本标志物能反应鼻咽部鼻咽癌的生长情况。在对照组鼻咽刷样本中,主要在49.3%的样本中检测到少量的EBER1基因的表达,但同时也在0%到15.5%的样本中检测到少量的几个裂解期基因的表达。相关性分析显示无论是在鼻咽癌组还是对照组,潜伏期和裂解期基因的表达频率都与EBV DNA load具有显着的相关性,但EBV DNA load与EBV转录产物EBER1表达的相关性只在鼻咽癌患者中观察到,而在对照组两者不存在显着相关。对EBV miRNAs的检测也得到了相似的结果。EBV DNA C-promoter区甲基化检测结果显示在鼻咽癌组,鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区主要是以methylated type为主,methylated degree较高,而在对照组鼻咽刷样本中则以non-methylated type为主,methylated degree较低,结果提示鼻咽癌患者鼻咽刷样本中EBV DNA load主要来自感染EBV的肿瘤细胞贡献,而在对照组鼻咽刷样本中主要来自游离EBV的贡献。（3）基于EBV DNA load,EBV DNA methylated degree,EBV DNA methylated type和EBV miRNA在鼻咽癌和对照组中表达的显着不同,进一步分析显示EBV mir-bart1-5p（敏感度93.94%,特异度100%）,EBV DNA methylated degree（敏感度95.2%,特异度94.7%）和EBV DNA methylated type（敏感度100%,特异度81.6%）应用于鼻咽癌的诊断均具有较高的准确性。EBV mir-bart-1-5p的诊断价值在另一包含424例样本的独立人群中得到了验证,对于鼻咽癌诊断的敏感度为93.5%,特异度为100%。基于EBV DNA methylated type在鼻咽癌和对照组的性质不同,即在鼻咽癌患者中,EBV DNA C-promoter区域主要呈现甲基化的状态,即启动子区发生甲基化EBV DNA的数量（定义为A类EBV DNA）多于非甲基化DNA的数量（定义为B类EBV DNA）,即A/B>1。而在对照组中,EBV DNA C-promoter区主要呈现非甲基化的状态,即发生甲基化EBV DNA的数量（A类EBV DNA）少于非甲基化DNA的数量（B类EBV DNA）,即A/B<1。这为鼻咽刷刷检发展到不依赖于临床的盲刷取样提供了可能,我们的结果显示在盲刷的取样条件下,由于取样部位失去了电子鼻咽镜的引导,取样的精度降低,这导致鼻咽刷样本中的EBV DNA load（敏感度由95.2%下降到55.3%）和EBV DNA methylated degree（敏感度由95.2%下降到57.9%）等定量指标的诊断敏感度会有很大程度的降低,但获取的总EBV DNA中A/B是大于或小于1的特性是基本不变的（敏感度由100%变为89.5%）。结论:鼻咽部EB病毒核酸标志物,包括EBV DNA load,EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type作为高效的分子标志物,应用于鼻咽癌诊断具有较好准确性;通过对鼻咽刷样本中EBV多个潜伏和裂解期基因转录表达谱的研究,以及对EBV miRNA和EBV DNA C-promoter区甲基化的研究,间接和直接两方面充分表明鼻咽癌患者鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自潜伏感染EBV的肿瘤细胞,反应了鼻咽部鼻咽癌的生长情况,而对照组鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自裂解释放的游离EBV颗粒;基于鼻咽刷样本中EBV DNA在病例组和对照组产生途径的不同及所引起的EBV DNA C-promoter区甲基化性质的不同,我们提出检测methylated type这一适用于盲刷取样的定性标志物,突破了鼻咽刷刷检在现场广泛开展应用的瓶颈。通过开展的这三方面的研究,为中国鼻咽癌高发区的鼻咽癌诊断和筛查提供了新思路,对于完善鼻咽癌的病因理论具有重要价值。
吴硕[8]（2019）在《EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究》文中研究说明目的:探讨EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染对MUS81（methl methanesulfonate and UV sensitive isolate number 81,对乙烷磺酸盐及紫外线敏感的第81号独立序列）表达的影响,研究MUS81基因在EBVaGC发生中的作用和作用机制。方法:（1）采用实时荧光定量PCR技术（Real time quantitative PCR,qRT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中MUS81、EME2（essential meiotic structure-specific endonuclease subunit 2,必需减数分裂结构-特异性内切酶亚基2）及其相关基因在转录水平上的差异;（2）Western blot技术检测两种细胞系中MUS81和EME2蛋白表达的差异;（3）分别构建稳定转染EBV潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein1,LMP1）、潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A,LMP2A）、EBV编码小RNA（Epstein-Barr virus coded small RNA,EBER）的SGC7901细胞系,检测外源性LMP1、LMP2A、EBER表达对MUS81表达的影响;（4）免疫组化技术检测EBV阳性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVa GC）和EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVn GC）组织中MUS81蛋白的表达;（5）亚硫酸氢盐基因组测序法（Bisulfite genomic sequencing,BGS）检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系中MUS81基因启动子区Cp G岛甲基化状态,并用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理BGC823、SGC7901和稳定转染LMP1的SGC7901细胞系,观察对MUS81表达的影响,分析EBV对MUS81表达和MUS81甲基化状态的影响;（6）检测si RNA靶向沉默MUS81和EME2表达后对细胞周期和凋亡的影响。结果:（1）qRT-PCR结果显示,EBV阴性胃癌细胞系中MUS81基因、EME2基因和SLX4基因转录水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中SLX1基因转录水平明显高于EBV阴性胃癌细胞系;两种细胞系中EME1的转录水平没有明显差异。（2）Western blot技术检测结果显示,EBV阴性胃癌细胞系MUS81和EME2蛋白表达水平均明显高于EBV阳性胃癌细胞系。（3）与SGC7901-NC（稳定转染空载质粒的SGC7901细胞系）比较,SGC7901-LMP1、SGC7901-LMP2A和SGC7901-EBER细胞系（稳定转染LMP1、LMP2A、EBER的SGC7901细胞系）MUS81转录水平没有发生明显变化。Western blot检测显示,SGC7901-LMP1,SGC7901-LMP2A,SGC7901-EBER细胞系MUS81蛋白表达与SGC7901-NC细胞系比较没有显着性差异。（4）q RT-PCR检测结果显示,用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理SGC7901-LMP1细胞系MUS81的转录水平及蛋白表达水平没有发生明显变化。（5）EBV阴性胃癌细胞系MUS81基因启动子区甲基化水平明显高于EBV阳性胃癌细胞系。Western blot检测结果显示5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理EBV阴性胃癌细胞系后MUS81蛋白表达水平没有发生明显变化。（6）EBV阳性胃癌组织中MUS81蛋白表达水平明显低于阴性胃癌组织。（7）SGC7901细胞沉默MUS81蛋白表达,与对照组相比,细胞发生G2/M期阻滞（P<0.05）,而凋亡率无明显差异（P>0.05）;沉默EME2表达后,与对照组相比,G2/M期细胞比值增高（P<0.05）,凋亡细胞比例增高（P<0.05）。结论:（1）EBV可抑制胃癌细胞系MUS81及其异二聚体EME2表达,MUS81基因启动子区的甲基化可能不参与其蛋白表达调控。（2）外源性LMP1、LMP2A和EBER表达对MUS81转录和蛋白表达没有明显影响。（3）沉默MUS81和EME2表达可使胃癌细胞系SGC7901阻滞在G2/M期,而下调EME2表达可促进SGC7901细胞凋亡,下调MUS81表达则对SGC7901细胞凋亡无明显影响。
张岩[9]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中指出EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
王海语[10]（2019）在《白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析》文中研究说明目的和背景:EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是重要的DNA肿瘤病毒,与鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,有学者对EBV感染与白血病的关系进行了研究,结果显示EBV独特的表达模式是B细胞特殊分化窗口的标志,可导致慢性白血病;也有研究发现EBV感染与急性白血病的发生相关。然而,关于EBV在血液肿瘤中的潜在作用目前仍不清楚。我们以往曾对山东地区鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤以及健康人群中多个EBV编码基因的多态性进行了研究,但尚不清楚EBV编码基因在恶性血液病中的变异情况及其生物学意义。本研究检测了白血病和骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）病人中EBV 1/2分型、F/f分型、EBV编码小RNA（EBV-encoded small RNAs,EBERs）基因和膜潜伏蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）基因多态性,探讨其与血液肿瘤的关系。方法:选取青岛地区白血病病人313例和骨髓增生异常综合征（MDS）病人99例作为研究对象,取病人外周血标本4 m L,乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝,1200 r/min离心10 min,吸取中间白细胞层,采用蛋白酶K消化法和酚氯仿法提取细胞DNA。采用巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术分析EBV 1/2分型,采用PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）分析可区分F/f变异,PCR结合DNA测序检测分析EBERs基因和LMP1基因多态性。应用DNAStar软件对EBER和LMP1基因核苷酸及编码氨基酸序列进行对比分析,与EBV标准株B95-8序列比较,根据其特征性改变对变异进行分类。结果:（1）白血病、MDS患者和健康人群1型EBV的检出率分别为73.8%（59/80）、88.2%（30/34）和78.9%（45/57）;2型EBV检出率分别为8.7%（7/80）、8.8%（3/34）和17.6%（10/57）,1+2型EBV检出率分别为17.5%（14/80）、3%（1/34）和3.5%（2/57）;（2）F型EBV在白血病、MDS患者和健康人群中的检出率分别为98.8%（82/83）、93.3%（28/30）和94.2%（98/104）,f型EBV在白血病、MDS患者和健康人群中的检出率分别为1.2%（1/83）、6.7%（2/30）和5.8%（6/104）;白血病、MDS患者和健康人群中1/2分型、F/f分型的分布比较显示差异无统计学意义（P>0.05）;（3）白血病、MDS和健康人群中EBERs的主要基因型为EB-6m型,其检出率分别为73.2%（30/41）、83.3%（10/12）和96.7%（89/92）,白血病、MDS与同一地区健康人群之间EBERs基因变异类型的分布不同,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）白血病、MDS和健康人群中LMP1的主要亚型为China 1、XhoⅠ（-）和del-LMP1;（5）China 1亚型在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为70%（28/40）、90%（9/10）和69.8%（30/43）,白血病、MDS与健康人群之间LMP1基因变异类型的分布亦无显着性差异（P>0.05）;XhoⅠ（-）变异在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为75%（30/40）、90%（9/10）和74.4%（32/43）,差异无显着性（P>0.05）;del-LMP1变异在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为77.5%（31/40）、90%（9/10）和69.8%（30/43）,差异无显着性（P>0.05）。结论:（1）青岛地区白血病和MDS的EBV基因型以1型和F型为主;（2）EBERs基因EB-6m亚型是白血病和MDS患者中最常见的类型;（3）白血病和MDS中LMP1的主要亚型为China 1、XhoⅠ（-）和del-LMP1,3种变异型在白血病、MDS和以往健康人群中的分布无显着性差异,提示携带3种变异型EBV毒株可能与白血病和MDS的发生无关。
二、EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用（论文提纲范文）
（1）EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.3 确定G418筛选浓度 |
| 1.2.4 G418抗性单细胞克隆筛选 |
| 1.2.5 RT PCR鉴定 |
| 1.2.5.1 提取细胞RNA |
| 1.2.5.2 逆转录PCR(RT-PCR) |
| 1.2.5.3 BARF1的PCR检测 |
| 1.3 BARF1基因表达效果分析 |
| 1.3.1 细胞增殖活力分析 |
| 1.3.1.1 细胞计数法 |
| 1.3.1.2 CCK8法 |
| 1.3.2 细胞迁移能力分析 |
| 1.3.3 细胞周期检测 |
| 1.3.4 细胞周期蛋白Cyclin D1表达情况的评估 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 GES-1细胞质粒转染效果分析 |
| 2.2 G418耐药性单克隆细胞的获得 |
| 2.3 BARF1基因表达情况的鉴定 |
| 2.4 细胞增殖能力测定 |
| 2.4.1 细胞计数法 |
| 2.4.2 CCK8法 |
| 2.5 IHC法检测细胞周期蛋白Cyclin D1的表达状况 |
| 2.6 划痕实验评估各组细胞划痕愈合能力 |
| 2.7 流式细胞术检测细胞周期分布情况 |
| 3 讨 论 |
（2）基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 与鼻咽癌相关的EBV基因变异及其医学生物学功能 |
| 第一节 导论 |
| 1.EBV概述 |
| 1.1 EBV的基本生物学特征 |
| 1.2 EBV潜伏感染 |
| 1.3 EBV潜伏基因 |
| 2 鼻咽癌概述 |
| 3.鼻咽癌中EBV基因的变异 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.纳入转录组测序分析的鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 2.入组样品的转录组测序分析 |
| 3.鼻咽癌组织中EBV基因变异的分析 |
| 3.1 鼻咽癌组织中EBER2和LMP2携带高频变异 |
| 3.2 EBER2变异与鼻咽癌 |
| 4.鼻咽癌中EBER2变异亚型及其临床意义 |
| 4.1 EBER2亚型与鼻咽癌患者临床特征的关系 |
| 4.2 EBER2亚型与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 5.EBER变异在鼻咽癌独立样本中的实验验证 |
| 5.1 在EBV阳性细胞中验证EBER的变异 |
| 5.2 在鼻咽癌组织中验证EBER的变异 |
| 5.3 独立样本验证中EBER2亚型分布及与临床表型的关系 |
| 6.EBER2亚型对应宿主基因的表达分析 |
| 7.鼻咽癌组织中LMP2B的变异位点 |
| 8.LMP2B-C666和LMP2B-Raji在鼻咽癌细胞中的生物学功能 |
| 8.1 稳定表达外源性LMP2B-C666和LMP2B-Raji的鼻咽癌细胞的构建 |
| 8.2 LMP2B-C666和LMP2B-Raji对鼻咽癌细胞表型的影响 |
| 8.3 LMP2B-C666的蛋白稳定性 |
| 9.LMP2B变异与EBER2亚型的关联 |
| 第三节 讨论 |
| 1.临床相关研究的质量控制 |
| 2.以转录组测序数据分析EBV基因变异 |
| 3.EBER2的变异与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 4.EBER变异的独立样本验证与细胞定位 |
| 5.LMP2B在鼻咽癌中的生物学功能 |
| 本章小结 |
| 第二章 鼻咽癌预后评估模型的建立 |
| 第一节 导论 |
| 1.鼻咽癌概述 |
| 2.与鼻咽癌预后相关的分子标志物 |
| 3.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 3.1 鼻咽癌与免疫治疗 |
| 3.2 浸润免疫细胞与鼻咽癌预后 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.鼻咽癌“复发转移组”和“非复发转移组”的特征性基因表达谱 |
| 1.1 入组的鼻咽癌病例及其临床信息 |
| 1.2 转录组测序数据的主成分分析(principal component analysis,PCA) |
| 1.3 机器学习方法筛选两组鼻咽癌病例肿瘤组织的特征基因 |
| 1.4 两组鼻咽癌患者肿瘤组织中的差异表达mRNA |
| 2.筛选出的13个特征基因与鼻咽癌预后的关系 |
| 2.1 13个特征基因与鼻咽癌患者无进展生存的关系 |
| 2.2 13个特征基因与鼻咽癌患者总生存的关系 |
| 3.鼻咽癌预后模型的建立 |
| 3.1 13个特征基因分别对于鼻咽癌预后的影响 |
| 3.2 多因素Cox比例风险回归模型 |
| 3.3 4-gene signature预后预测能力的评估 |
| 3.4 基于4-gene signature的风险评分与其预后能力的关联 |
| 3.5 基于4-gene signature的风险评分是否为预后的独立因素 |
| 4.4-gene signature的生物学功能 |
| 5.肿瘤免疫浸润和鼻咽癌预后的关系 |
| 5.1 本组鼻咽癌病例肿瘤组织中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 5.2 GEO数据中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 6.4-mRNA signature表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系 |
| 第三节 讨论 |
| 1.筛选与鼻咽癌预后相关的基因 |
| 2.干扰素在鼻咽癌发生发展中的作用 |
| 3.鼻咽癌4-gene signature预后评估模型及其生物学功能 |
| 4.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 本章小结 |
| 第三章 材料与方法 |
| 第一节 研究对象和实验材料 |
| 1.鼻咽癌病例及其组织样品 |
| 2.细胞系 |
| 3.菌株和质粒载体 |
| 4.抗体 |
| 5.主要试剂与耗材 |
| 6.细胞培养的器皿 |
| 7.常用试剂的配制 |
| 8.主要仪器 |
| 9.主要分析软件及网站 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.分子生物学实验方法 |
| 2.细胞生物学实验方法 |
| 3.生物学信息分析 |
| 4.统计学方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（4）TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TCGA和ACRG相关检测指标在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的生存状况分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床资料的收集 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HLA-DPB1与EB病毒gp42 蛋白的结合方式研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法与步骤 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新疆地区EB病毒阳性霍奇金淋巴瘤患者的免疫分子检测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要实验试剂与耗材 |
| 1.3 主要实验方法与步骤 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 EB病毒与霍奇金淋巴瘤发病机制的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 EBV相关性胃癌差异表达基因分析 |
| 2.2 EBV相关性胃癌差异表达蛋白筛选分析 |
| 2.2.1 样品准备 |
| 2.2.2 胃癌组织EBV原位杂交检测 |
| 2.2.3 EBVaGC定量蛋白质组学检测 |
| 2.2.4 蛋白组学数据分析 |
| 2.2.5 免疫组化检测蛋白表达 |
| 2.3 EBV相关性胃癌临床病理参数分析 |
| 2.4 胃癌及癌前疾病血清EBV抗体表达分析 |
| 2.4.1 血清EBV抗体的筛选 |
| 2.4.2 胃癌及癌前疾病血清EBV-VCA IgG抗体表达分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EBV相关性胃癌关联基因表达特征 |
| 3.2 EBV相关性胃癌关联蛋白表达特征 |
| 3.2.1 EBVaGC研究对象的确定 |
| 3.2.2 EBVaGC蛋白质谱特征 |
| 3.2.3 EBVaGC中转录组和蛋白组交集蛋白的筛选验证 |
| 3.3 EBV相关性胃癌临床病理特征 |
| 3.4 血清EBV抗体表达与胃癌风险/预后的相关性 |
| 3.4.1 研究对象的基本信息 |
| 3.4.2 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 3.4.3 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 3.4.4 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 3.4.5 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数的关系 |
| 3.4.6 血清EBV-VCA IgG与胃癌预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EBVaGC关联基因表达特征及功能分析 |
| 4.2 EBVaGC关联蛋白表达特征及功能分析 |
| 4.3 EBVaGC临床病理特征 |
| 4.4 血清EBV-VCA IgG抗体与胃癌发病风险与预后的关系 |
| 4.4.1 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 4.4.2 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 4.4.3 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 4.4.4 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数及预后的关系 |
| 5 结论 |
| 第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料和设备 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 GBP5原位表达与胃癌风险/病理参数/预后的相关性研究 |
| 2.2.1 免疫组化检测 |
| 2.3 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响研究 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 摇菌和质粒提取 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 瞬时转染 |
| 2.3.5 细胞总RNA提取及反转录cDNA |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.7 细胞增殖活性检测 |
| 2.4 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响研究 |
| 2.4.1 EBVaGC关联免疫相关基因的确定 |
| 2.4.2 EBVaGC与GBP5表达相关的免疫基因的确定 |
| 2.4.3 验证EBVaGC免疫相关基因差异表达 |
| 2.5 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 2.5.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络构建 |
| 2.5.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联分析 |
| 2.5.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性 |
| 3.2 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 3.2.1 GBP5在胃癌细胞中的过表达和沉默效率 |
| 3.2.2 GBP5表达对EBVaGC细胞增殖活性的影响 |
| 3.3 GBP5影响不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因的表达 |
| 3.3.1 确定EBVaGC中差异表达免疫相关基因 |
| 3.3.2 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因表达的相关性 |
| 3.3.3 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因相关性验证 |
| 3.4 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 3.4.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络 |
| 3.4.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联 |
| 3.4.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 EBV感染与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽部EBV DNA load的检测及其作为鼻咽癌诊断标志物的准确性评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼻咽部EBV的产生来源研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼻咽部EB病毒其它核酸标志物的诊断价值评价及在盲刷取样下分子标志物的发掘 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用液体的配制 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.2.1 实验前准备 |
| 1.2.2 细胞复苏 |
| 1.2.3 培养液更换 |
| 1.2.4 细胞传代 |
| 1.2.5 去甲基化药物处理细胞 |
| 1.3 基因甲基化状态检测 |
| 1.3.1 NA的提取 |
| 1.3.2 NA样本的重亚硫酸盐处理 |
| 1.3.3 甲基化特异性PCR(BGS) |
| 1.4 MUS81 及相关基因mRNA检测 |
| 1.4.1 RNA的提取 |
| 1.4.2 去g NA处理 |
| 1.4.3 逆转录合成c NA |
| 1.4.4 实时荧光定量PCR |
| 1.5 MUS81 及相关基因蛋白检测 |
| 1.5.1 蛋白质的提取 |
| 1.5.2 蛋白质浓度的测定 |
| 1.5.3 Western blot检测目的基因的表达 |
| 1.5.4 免疫组化实验检测MUS81 蛋白表达 |
| 1.6 细胞学实验 |
| 1.6.1 siRNA靶向沉默 |
| 1.6.2 细胞凋亡实验 |
| 1.6.3 细胞周期实验 |
| 结果 |
| 2.1 实时荧光定量PCR检测MUS81 及其相关基因的转录表达 |
| 2.2 Western blot检测MUS81和EME2 蛋白表达 |
| 2.3 外源性LMP1、LMP2A和 EBER对 MUS81 表达的影响 |
| 2.4 MUS81启动子区甲基化状态检测结果 |
| 2.5 去甲基化药物处理对 MUS81 基因转录的影响 |
| 2.6 去甲基化药物处理对 MUS81 蛋白表达的变化 |
| 2.7 LMP1 对 MUS81 转录表达的影响 |
| 2.8 MUS81和EME2 基因对细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 2.8.1 检测siMUS81和siEME2 的沉默效率 |
| 2.8.2 MUS81和EME2 表达沉默对SGC7901 细胞系细胞周期和凋亡的影响 |
| 2.9 胃癌组织中MUS81 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（9）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞系的选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 首次传代前细胞的复苏 |
| 3.2 细胞传代 |
| 4 研究对象 |
| 4.1 核酸提取 |
| 4.2 EBV阳性标本筛选 |
| 5 1/2 分型、F/f分型检测 |
| 5.1 PCR扩增 |
| 5.2 RFLP分析 |
| 6 EBV潜伏期基因序列多态性检测 |
| 6.1 引物设计 |
| 6.2 EBERs、LMP1 基因扩增 |
| 6.3 测序分析 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 EBV感染与白血病和MDS临床病理特征的关系 |
| 2.1.1 白血病和MDS病人EBV检出情况 |
| 2.1.2 EBV感染与病人临床病理特征的关系 |
| 2.2 1/2 分型及F/f分型结果 |
| 2.2.1 1/2 分型结果 |
| 2.2.2 F/f分型结果 |
| 2.3 EBER基因序列多态性 |
| 2.3.1 EBER序列变异类型 |
| 2.3.2 EBER变异类型在不同人群中的分布 |
| 2.4 LMP1 基因序列多态性 |
| 2.4.1 LMP1 序列变异类型 |
| 2.4.1.1 B95-8 亚型 |
| 2.4.1.2 China1 亚型 |
| 2.4.1.3 China2 亚型 |
| 2.4.1.4 Med-亚型 |
| 2.4.2 LMP1 亚型在3 组人群中的分布 |
| 2.4.3 XhoⅠ(-)变异及del-LMP1 变异 |
| 2.4.4 LMP1 C末端重复序列变异 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| EB病毒编码基因多态性研究进展 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
四、EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用（论文参考文献）
- [1]EB病毒编码的BARF1对GES-1细胞的影响[J]. 杨佳宁,李娜,董鸿铭,徐媛,李淑英. 中国人兽共患病学报, 2021(12)
- [2]基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究[D]. 赵爽. 北京协和医学院, 2021
- [3]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [4]TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究[D]. 王强. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]HLA-DPB1和EB病毒gp42蛋白的结合方式与新疆地区霍奇金淋巴瘤发病的相关性研究[D]. 李红玉. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究[D]. 王泽洋. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究[D]. 郑小辉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]EB病毒对MUS81基因表达调控机制的研究[D]. 吴硕. 青岛大学, 2019(03)
- [9]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [10]白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析[D]. 王海语. 青岛大学, 2019(03)