一、La(Ⅲ)对Bal31核酸酶活性的影响（论文文献综述）
吕和叶[1]（2021）在《基于有序DNA Walker等温信号放大策略的BCR/ABL融合基因检测方法研究》文中研究表明慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia,CML）,是由BCR/ABL融合基因引起的多能造血干细胞恶性肿瘤。BCR/ABL融合基因作为CML的重要分子标志物,检测其表达水平对监测疾病从慢性期到急性期和慢性粒细胞白血病患者在治疗后残留白血病细胞的存在具有重要的临床意义。目前,常规检测融合基因的方法主要有荧光原位杂交、实时定量逆转录PCR、流式细胞术等,但这些方法往往受限制于复杂的技术、昂贵的仪器和较低的灵敏度。因此,发展一种灵敏、快速、简便的BCR/ABL融合基因检测新方法仍是亟待解决的问题。本研究基于有序DNA walker等温信号放大策略结合金纳米粒子功能化的氮化碳纳米复合物（Au@g-C3N4 NHs）,构建了一种用于BCR/ABL融合基因高灵敏检测的ECL生物传感新方法。首先通过三条DNA链（L1,L2和BS）的杂交反应组装了有序的DNA轨道,并将制备的DNA轨道进一步组装到修饰Au@g-C3N4 NHs的电极表面,从而为DNA Walker行走提供了优良的界面轨道。此时,叶酸标记的BS链（FA-BS）与电极表面的Au@g-C3N4 NHs距离较近,因此猝灭其ECL信号。当BCR/ABL融合基因存在时,结合两条用于行走的DNA链（WD1和WD2）形成双足DNA walker,在有序界面轨道上行走,并置换FA-BS使ECL信号恢复,实现基于DNA walker的信号放大。与随机构建的DNA轨道相比,编程调控的有序DNA轨道提供了与DNA walker双足步长匹配的锚点距离,极大降低了动力学能垒和行走过程内中断的风险,从而提高了DNA walker的行走效率。得益于这类DNA walker在信号放大方面表现出的更高效率和能力,所构建的ECL传感器实现了对BCR/ABL融合基因的高灵敏检测,最低检测限低至0.18 f M,动态线性范围为1 f M到100 p M。同时,两条行走DNA链对靶物质的特异识别有效避免了干扰物质对检测的干扰,使得该方法实现了复杂基质环境中对加标样本的特异性检测。综上,所构建的生物传感策略为提高生物传感器的工作效率提供了一种简单的方法,在临床检测和科学研究中具有潜在的应用价值。
陈燕贤[2]（2020）在《影响全基因组测序数据质量-AT分离因素的研究》文中研究指明全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）是对未知基因组序列的个体进行基因组的测序和分析的常规技术。基因组信息对于鉴定遗传性疾病、表征驱动癌症进展的突变和追踪疾病爆发极为重要。基于全基因组重测序的人类遗传学和群体进化学的研究,可以快速的实现基因组多样性分析,遗传进化分析,致病和易感性基因等变异基因的筛选。目前,全基因组学测序主要是使用二代测序仪进行测序,从样本的提取、建库、测序每一个环节都会影响测序数据的质量和产能,而测序数据质量将影响下游信息分析的结果,因此,获得高质量的数据是生物信息分析全面,正确的前提。AT分离是测序数据质量监控的一个关键点,AT分离的结果可能会影响到下游生信分析的变异检测和CNV分析,同时,也可能会导致一些高GC区域的覆盖度偏低,减低高GC区域的位点分析准确性,或无法分析微卫星位点信息。虽然AT分离偏大或偏小对生信分析的影响不大,但为了将这种影响降低至最小,我们对这个指标的影响因素进行了分析并优化,确保更好的保证测序数据的准确性和可靠性。本文采用华大自主研发的测序仪（BGISEQ-500、DIPSEQ）进行WGS文库的测序,并对测序数据进行了分析,发现了影响测序数据AT分离的4种因素,并通过实验进行优化,降低了测序数据的AT分离,从而提高了测序数据质量。结果如下:（1）DNB（DNA nanoball,DNA纳米球）浓度对测序数据AT分离有影响,DNB浓度越高,AT分离越大。DNB浓度在12-20 ng/μL时,测序数据的质量最好,AT分离情况比较小;当DNB浓度<8 ng/μL时,测序数据的质量最差;（2）文库建库方式对测序数据AT分离有影响,通过优化了建库方法,在文库构建后增加酶切反应,并对文库进行定量;同时优化了测序方法,在DNB制备环节,将文库投入量由15μL改为6 ng,方案优化后,分析1421个样本的测序结果,发现方案优化可有效降低测序数据AT分离的情况;（3）文库投入量对测序数据AT分离有影响,通过优化实验方法,在DNB制备环节,将文库投入量由6 ng改为4 ng,在BGISEQ-500测序平台上,比对了3820个样本的测序结果,发现可有效降低测序数据AT分离的情况,但在DIPSEQ测序平台上,比对了65个样本的测序结果,发现效果不明显;（4）X酶对测序数据的AT分离有影响,通过优化实验方法,将X酶浓度定为75 ng/μL,在DIPSEQ测序平台上,分析了79个样本的测序结果,发现可有效降低测序数据AT分离的情况。总之,本研究优化了实验方法,通过实验测试后,发现可有效降低全基因组测序数据的AT分离情况,并将方法应用到生产中,最终测序数据的AT分离情况得到了有效的降低,从而极大地提高了全基因组数据质量,为后续数据分析提供夯实基础。
曹诗琴[3]（2019）在《三聚氰胺及其类似物对dsDNA及EcoRⅠ等核酸酶的影响》文中研究说明三聚氰胺（MEL）、三聚氰酸（CYA）都是高产量、多用途的化工品。但是,自MEL被非法加入婴儿奶粉和许多乳制品、农副产品中的滥用事件之后,引起全球对三聚氰胺在食品中和自然界中的持续关注。MEL等三嗪类物质能通过多种途径进入自然环境。其中,包括作为化肥生产的原料,伴随化肥的使用进入土壤和水域环境;另外,MEL等作为动物饲料添加剂和农药、消毒剂等的代谢产物进入食物链;还包括从工业产品中迁移等渠道。面对MEL等三嗪类污染物在环境中长期低剂量的存在的现实,大多数研究关注MEL的急性毒性、亚急性毒性,对于分子水平作用机制的研究相对较少。因此从分子水平研究它们对生物大分子结构、功能和参与的生命活动的影响是很有必要的。核酸是承载生命体遗传信息的一类生物大分子,对生命活动有着重要作用。本研究选择dsDNA与核酸酶之间的反应,旨在理解MEL等对核酸类生物大分子活性的影响。MEL能够改变DNA热差光谱间接反映了碱基堆积受到MEL的扰动且CYA与MEL一定程度上能够干扰互补双链的配对。CYA和MEL能够增加dsDNA的热稳定性使解链温度上升,与DNA存在弱的相互作用,且不改变环状DNA的超螺旋状态。CYA、MEL及其类似物（2,4-二氨基-6-甲基-1,3,5-三嗪和2,4,6-三氨基嘧啶）主要结合在DNA双螺旋上的小沟区域。与几种小分子之间结构上的相似性相关,它们都能够作用于核酸和蛋白质。BAL-31酶与dsDNA反应时MEL和CYA都能促进反应的进行。BAL-31的荧光能够被CYA猝灭,酪氨酸和色氨酸特征的同步荧光峰在CYA的影响下发生蓝移,说明二者之间存在相互作用。MEL和CYA在DNA与EcoR Ⅰ,Nde Ⅰ和Pst Ⅰ三种酶的反应中均有非单调性的促进。在与EcoR Ⅰ模拟对接结果中,MEL以及结构类似物包括CYA都结合在相同位置且与EcoRⅠ的活性位点接近所以四种小分子都可能对活性位点处的构象产生干扰。圆二色谱结果显示MEL等小分子与BSA相互作用导致肽链二级结构趋向于展开。同步荧光实验发现四种小分子都能改变EcoR Ⅰ上色氨酸残基微环境,2,4,6-三氨基嘧啶对EcoR Ⅰ和BSA具有更强的作用效果,它与两种蛋白的相互作用力的类型是疏水作用力。
丁鹤[4]（2018）在《阴道毛滴虫端粒DNA鉴定及其调节蛋白研究》文中指出阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis,TV）是寄生在人体泌尿生殖系统的寄生性原虫。它不仅能够引起女性滴虫性阴道炎和宫颈炎、男性尿道炎和前列腺炎,还可以感染小鼠和松鼠猴。呈世界性分布,是一种危害人兽健康的重要人兽共患寄生性原虫。目前,尚无有效的防治方法,究其原因是由于对阴道毛滴虫的细胞分子生物学特性的研究较少。而端粒是存在于真核细胞染色体末端的DNA重复序列与一些相关蛋白组成的特殊结构,由端粒酶进行调控。端粒及其相关蛋白的发现成为分子生命科学研究的热点之一。在大多数真核生物中,包括原虫,如贾第虫,微小隐孢子虫、利什曼原虫及布氏锥虫等端粒DNA重复序列及端粒相关蛋白均有研究。但是作为真核生物分支早期的阴道毛滴虫,其端粒DNA重复序列的研究未见报道,通过生物信息学分析在阴道毛滴虫基因组中并没有端粒酶序列。那么是什么对阴道毛滴虫端粒DNA的延伸进行调节。为此,本试验将对阴道毛滴虫端粒DNA及其调节蛋白进行研究。具体如下:端粒DNA重复序列鉴定:利用S1核酸酶及Mbo I限制性内切酶对阴道毛滴虫基因组DNA切割并与pUC18载体相连后测序得出重复序列（TTTTAGGG）n,长度约在2000 bp。通过BAL31核酸酶消化和FISH证明了该重复序列能够定位于阴道毛滴虫染色体末端,是阴道毛滴虫的端粒DNA重复序列。端粒DNA与端粒结合蛋白TRF和TBP相互作用研究:应用原核表达技术构建端粒结合蛋白pET-TRF和pET-TBP原核表达载体,以Western blot及IIF和FISH联合试验对TRF和TBP在阴道毛滴虫体内表达定位,EMSA研究TRF和TBP在体外与端粒DNA结合作用。Western blot结果显示TRF和TBP均在细胞核中表达,是一种低表达的核蛋白。IIF和FISH联合试验证明了TRF和TBP都能够与端粒DNA呈点状部分共定位于阴道毛滴虫细胞核染色体末端。EMSA中阻滞条带表明了两者均能够在体外与双链端粒DNA结合。端粒结合蛋白TRF和TBP对端粒DNA的影响:分别构建针对TRF和TBP的锤头状核酶TRF-HR和TBP-HR研究端粒结合蛋白TRF和TBP分别在体内对端粒DNA延伸的影响。体外切割试验得出TRF-HR和TBP-HR能够有效的对TRF和TBP的体外转录体进行切割,其效率分别为89.4%和92.1%。经电穿孔转染后荧光定量PCR检测出TRF-HR和TBP-HR同样能够在体内对TRF和TBP进行切割,切割效率分别为82.6%及85.2%。Western blot分析显示TRF和TBP在蛋白质水平上也明显减少。通过Southern blot检验得出,在TRF和TBP减少时,端粒DNA重复序列长度反而增加,即阴道毛滴虫TRF和TBP对端粒DNA延伸起到负调节作用。SPP对端粒DNA的影响:应用原核表达技术构建SPP原核表达载体pET-SPP,经EMSA研究SPP在体外与端粒DNA结合作用。构建锤头状核酶SPP-HR研究SPP在体内对端粒DNA延伸的影响。EMSA中阻滞条带表明了SPP能够在体外与双链端粒DNA结合。锤头状核酶SPP-HR体外切割试验得出SPP-HR对SPP的体外转录体的切割效率为89.5%。电穿孔转染至阴道毛滴虫体内,荧光定量PCR分析表明SPP-HR仍能在体内对SPP进行切割,切割效率为84.6%。Western blot检测得到SPP在蛋白质表达水平上也明显减少。经Southern blot检验得出,在SPP mRNA和蛋白质表达水平降低时,端粒DNA重复序列长度也随之缩短,表明SPP对端粒DNA延伸起到正调节作用。PIKK与SPP相互作用及PIKK对端粒DNA的影响:构建pGEX-PIKK原核表达载体及含有阴道毛滴虫α-SCSB启动子的BiFC载体,采用GST-Pull down和BiFC试验研究PIKK和SPP两者之间的相互作用。构建锤头状核酶PIKK-HR研究PIKK在体内对端粒DNA延伸的影响。GST-pull down结果中能够看到重组PIKK和SPP蛋白相互结合条带。BiFC试验更加直观的检测到红色荧光,从而确定了PIKK和SPP在阴道毛滴虫体内外均存在相互作用。锤头状核酶PIKK-HR体外切割试验得出PIKK-HR对PIKK的体外转录体的切割效率为91.2%。电穿孔转染至阴道毛滴虫体内,荧光定量PCR分析表明PIKK-HR能在体内对PIKK进行切割,切割效率为86.7%。Western blot检测得到PIKK在蛋白质表达水平上也明显减少。经Southern blot检验得出,在PIKK蛋白质表达水平降低时,端粒DNA重复序列长度也随之缩短,说明PIKK对端粒DNA延伸起到正调节作用。综上试验研究表明,在不存在端粒酶的情况下,阴道毛滴虫端粒DNA重复序列（TTTTAGGG）n的延伸受到端粒结合蛋白TRF和TBP的负调节,以及SPP和PIKK的正调节。为进一步研究阴道毛滴虫端粒调控机制、阴道毛滴虫分子生物学特性及阴道毛滴虫永生化等方面提供了新的思路。
刘莹[5]（2015）在《嗜盐古生菌温和病毒SNJ2及其宿主溶原体系的相关研究》文中指出迄今为止发现数量尚极其有限的古生菌病毒群体却已展现了极为丰富的多样性,对它们的研究正使人们对病毒的起源、分类和对生命进化的影响形成新的认识。目前报道的古菌病毒大多分离自环境,有关温和病毒的研究尚很少,而生物信息学预测古生菌基因组上整合有不同家族的前病毒区域。此外,对古生菌温和病毒与宿主关系的研究也十分缺乏。本研究从携带二十面体包膜病毒SNJ1的溶原菌株Natrinema sp. J7-1中分离到另一株新的温和病毒,命名为SNJ2（Saline Natrinema sp. J7-1 virus 2）,对其性质进行了详细研究,并分别对SNJ2和SNJ1与宿主的关系进行初步探索。Natrinema sp. J7菌株是本实验室从湖北应城盐矿分离的一株极端嗜盐古生菌,其实验室衍生株Natrinema sp. J7-1和J7-2的染色体DNA序列完全相同,差别仅是所携带的质粒,J7-1菌株携带的质粒pHH205是温和病毒SNJ1的前病毒,可以侵染携带质粒pJ7-1的J7-2菌株形成噬菌斑。根据主要结构蛋白和预测ATPase的氨基酸序列分析,SNJ1被归属为PRD1-adeno virus二十面体病毒家族。然而由于SNJ1结构对高盐浓度的依赖性等原因,此前一直未能观察到该病毒的电镜照片。本研究通过完善SNJ1病毒的纯化方法获得了高纯度病毒颗粒,观察并确定其形态为二十面体内包膜病毒。在建立SNJ1病毒纯化方法过程中,从J7-1菌株中意外地获得了另一株形态不规则、有包膜的温和病毒SNJ2,其极性脂成分几乎无选择性地从宿主细胞膜中获取,SNJ2的大量复制需要SNJ1病毒调控基因区域的协助。该病毒基因组为16992 bp环状双链DNA,其双链上存在由保守基序“GCCCA’’引发的缺刻和单链区域的断裂现象。保守基序处断裂的发生具有随机性和热点的特征,可以分为主要断裂、次要断裂和基本不断裂的位点。SNJ2病毒基因组编码25个预测ORFs,其中的5个ORFs组成多形性包膜病毒家族保守基因簇：两个病毒结构蛋白、ATPase及两个预测与包装相关的蛋白编码基因。病毒的两个结构蛋白——膜蛋白和表面突触蛋白分别由gene12和13编码,命名为VP12和VP13（virion protein, VP）.根据病毒基因组排列、复制方式及保守基因簇同源性,将SNJ2划归为“Pleolipoviridae"病毒科Betapleolipovirus病毒属。对SNJ2病毒与宿主的关系进行研究,SNJ2前病毒整合在J7基因组tRNAMet基因3’末端,整合位点的正向重复序列为14 bp。正常生长的J7-1细胞内存在游离的环状SNJ2基因组,并以较低程度复制释放病毒颗粒。丝裂霉素C （MMC）诱导后,细胞内多倍体基因组中少部分前病毒切离环化进入裂解循环并大量复制释放病毒颗粒,而大部分基因组拷贝仍处于溶原状态,表明在正常生长和诱导情况下,宿主细胞内的SNJ2病毒都存在不同状态。通过不断诱导,我们获得一株所有基因组拷贝均只保留整合位点,不整合SNJ2的菌株Natrinema sp. J7-3。 SNJ2侵染J7-3菌株的双层平板并不大量复制释放病毒颗粒形成噬菌斑,而是重新整合到其基因组上。此外,我们在全基因组数据库中共检索到整合在10个嗜盐古生菌属基因组上总共17株SNJ2-like前病毒,表明嗜盐古生菌基因组上广泛整合有多形性包膜前病毒。绝大多数前病毒包含完整的该病毒家族保守基因簇,少数缺乏其中一至两个保守基因,推测可能为缺陷型前病毒。相比环境中分离的多形性包膜病毒,SNJ2-like前病毒包含一系列病毒-宿主关系的调控基因,如整合酶、转录调控因子、抑制蛋白、Orc1/Cdc6复制起始蛋白的预测编码基因。与SNJ2整合方式相同,这类前病毒其均插入宿主基因组tRNA编码基因处,整合位点处正向重复序列长12-59 bp。对SNJ1病毒与J7宿主菌的关系进行研究,包含SNJ1前病毒的J7-1菌株在共培养实验中较其他J7菌株在生长竞争中更有优势。其释放的病毒能侵染并裂解大部分J7-2细胞,而少部分被侵染的细胞通过形成包含两个质粒的溶原化Natrinema sp. LJ7菌株,而逃避被裂解。LJ7菌株在对SNJ1病毒的免疫性方面表现出与J7-1和J7-2不同的特征,其能够释放SNJ1病毒且对其表现出一定程度的免疫性,同时细胞的自裂解也导致LJ7生长上的不稳定,但该菌株在短期内能较为稳定地携带两个质粒。实验中,分离到一株不含有质粒的Natrinema sp.CJ7菌株,其能被SNJ1侵染并形成噬菌斑。SNJ1侵染敏感菌形成的噬菌斑为模糊状,而通过不断侵染扩增传代,能够稳定获得噬菌斑呈透明状的突变株。分离获得两株突变株SNJ1-Mutant 1/2,其侵染敏感菌J7-2后形成溶原化LJ7的概率极大降低,表现为对敏感菌裂解性增强。SNJ1-Mutant 1/2基因组上分别只有一个碱基位点发生突变（SNJ1-Mutant 1基因组上2531位碱基由A突变为T,SNJ1-Mutant 2基因组上2520位碱基由A突变为G）。两个突变位点均位于预测抗毒素蛋白MazE编码基因及一系列预测调控基因的上游非编码区,推测该位点可能影响了抗毒素蛋白的转录使细胞内毒素-抗毒素系统失衡导致细胞裂解死亡,或影响了下游调控基因中未知的溶原-裂解调控基因的转录使病毒进入裂解循环。对多形性包膜病毒SNJ2本身性质及其与宿主关系的研究加深了我们对嗜盐古生菌温和病毒的认识。预测的SNJ2-1ike前病毒极大地丰富了多形性包膜病毒家族,也预示古生菌基因组上的前病毒数量被严重低估。对SNJ1与其敏感宿主关系的研究表明其病毒自身或与宿主之间可能存在复杂而精细的溶原-裂解调控系统。研究中发现的一些现象也值得我们进一步探索论证,以更深入地揭示古生菌温和病毒自身以及与宿主的相互作用。
范培虎[6]（2015）在《EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立》文中提出第一篇：EV71与人类共同抗原的鉴定及其作为HFMD重症潜在病因的研究手足口病主要是由肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型两种病原引起的以感染5岁以下儿童，手足口部出现疱疹溃疡以及发热等为主要症状的疾病。由于EV71的感染，少数病例可出现严重的神经症状，如无菌性脑干脑炎、急性致死性神经性肺水肿、肺出血、急性呼吸衰竭等严重中枢神经系统症状而导致死亡。因此，澄清EV71的致病机理对重症的控制、及时制定正确的治疗方案减少死亡率具有重要的意义。此前，尽管对EV71致死性神经性症状进行了大量研究，但其真正致病机理尚不明确。目前，EV71对中枢神经系统的致病机理研究主要包括病毒感染对神经元的直接损伤、致病性细胞因子（IP-10, MCP-1, IL-6, IL-8, and G-CSF等）在神经系统中急剧升高导致的神经组织损伤以及EV71与人脑蛋白共同抗体的自身反应性而引发的自身免疫对神经系统的损伤三方面原因的内容。本文鉴定了EV71病毒与人类共同抗原，并主要以机体针对共同抗原产生的具有自身反应性的抗体为出发点，论述了共同抗体在HFMD重症病因中潜在的作用。本研究通过对病毒蛋白质组与人类蛋白质组的比对分析，首次鉴定出在人类脑干部高表达的RNA聚合酶的转录调节复合物的亚基25（mediator complexsubunit25，MED25）与EV71的病毒蛋白1（VP1）存在共同表位PPGAPKP，并将两种共同抗原进行了体外表达，制备了针对该表位的单克隆抗体2H2，假病毒中和试验检测显示该抗体无中和活性。通过Western blot和ELISA试验证实了2H2与MED25，VP1以及EV71病毒样颗粒的结合活性。使用测定蛋白间相互作用的方法测定了共同抗体与自身抗原的结合活性及亲和常数（KD），KD=8.0×10-7，为中等亲和力强度。动物免疫实验证明了两种共同抗原均能够刺激机体产生高滴度的针对共同表位的共同抗体。同时对患者血清进行共同抗体检测，结果显示EV71感染者的血清中同样存在高滴度的共同抗体。应用小动物活体成像技术监测共同抗体在体内的分部情况来反映该抗体对自身抗原的反应性。结果显示，除主要分布在肝脏外，在脑干及延髓处亦有分布，表明共同抗体在活体内可能与自身抗原结合进而引发免疫反应。本研究首次鉴定了共同抗原并系统地证实了自身反应性抗体在体内的大量存在并与自身抗原在体内的结合反应，为EV71的重症致病机理在有关自身免疫反应性方面的进一步研究提供了确实而充分的实验和理论依据。同时，对EV71新型疫苗的开发与应用也有重要的指导意义。第二篇高灵敏性核酸酶联免疫荧光试验的建立酶联免疫吸附试验（ELISA）在传染性病原检测中着实是一种非常有效的方法。但是在应用中仍然存在不足，如在某些领域里其检测灵敏度很难达到要求。为了进一步提高该方法的灵敏性，几十年来，科学工作者做了很多努力。虽然已有很多改善和提高，但是目前该方法的灵敏度及实用性仍不能适应现代医学某些领域的发展和少数传染病复杂化的程度。为了进一步提高该方法的灵敏性，本研究首次将核酸酶和荧光探针用于免疫吸附试验，被称为核酸酶联荧光寡核苷酸试验（Nuclease-linked Fluorescence Oligonucleotide Assay，NLFOA）。在该方法中，具有高酶活性的核酸酶TurboNuclease用作标记酶，水解荧光探针中链接荧光素和淬灭基团的寡核苷酸链，致使淬灭基团对荧光素的淬灭作用消失而发出可检测的荧光。由于核酸酶的高效性和荧光探针的高荧光强度而使源于被检分子的检测信号得到一定程度的放大，从而提高灵敏度。同时，具有信号放大效应的表面偶联有大量链霉亲和素分子的金纳米颗粒也被用于此方法中，能够使被捕获的单个被检抗原分子通过纳米颗粒-亲和素复合物结合大量生物素化的标记核酸酶，使被检测信号进一步放大再次提高灵敏度。本研究在纳米颗粒直径、标记核酸酶使用浓度、纳米颗粒-亲和素复合物使用浓度和荧光探针使用浓度等方面对NLFOA进行了条件的优化。通过检测人类艾滋病毒重要的标志性蛋白分子p24，对NLFOA的检测灵敏性、特异性和重复性进行了评价。结果显示，NLFOA的最低检测限度为1.0pg/mL，低于传统ELISA的最低检测限度（10.0pg/mL）10倍。特异性在两次评价中均达到了100%，重复性在p24的高（100.0pg/mL）、中（50.0pg/mL）、低（1.5pg/mL）三个浓度水平的变异系数（CV）分别为7.8%、9.05%、8.4%，均低于被接受阈值10%。NLFOA是本实验室建立的一种高灵敏性检测抗原的方法，改变相应的抗体后可用与各种传染病抗原的检测。本方法首次把核酸酶和荧光探针应用与酶联免疫试验中，开拓了在免疫试验中使用核酸酶和荧光探针为底物新的思路，显着地提高了检测方法的灵敏性，为疾病的早期诊断避免病原的传播以及及时制定合理的治疗方案提供了强有力的技术手段。
郭坤元[7]（2015）在《拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究》文中研究指明半胱氨酸蛋白酶抑制剂普遍存在于动物,植物和微生物体内,它在蛋白质水解,蛋白酶活性调节等许多生理过程中起着重要的作用。之前人们对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究主要集中在抗病抗虫害方面,但是近些年来,人们逐渐发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物逆境防御过程中也起着重要的作用,因此探求和挖掘半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物逆境防御中的这种抗逆机理和潜在的作用对象具有十分重要的意义。AtCYSb是拟南芥中的一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,GUS染色结果表明AtCYSb在萌发的种子,年幼的叶,花药,种荚和成熟的叶,茎,种荚里均有表达,这表明它是植物生长周期里一个十分活跃的基因。另外前期的研究结果表明它可以受盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的诱导表达,且在拟南芥中过量表达AtCYSb可以提高转基因拟南芥对盐,碱和氧化等逆境胁迫的耐受性,这说明AtCYSb在植物应对逆境胁迫的过程中起着重要的作用。为了探求和寻找AtCYSb转基因拟南芥植株的这种抗逆机理以及它潜在的作用对象,我们对其进行了酵母双杂交筛选并得到了一个与其具有相互作用的蛋白,钙离子依赖性的核酸酶AtCaN2,同时利用酵母共转化实验,体外pull-down实验和体内双分子荧光互补实验验证了AtCYSb与AtCaN2之间的相互作用。AtCaN2的酶活性检测实验表明,AtCaN2对双链DNA （dsDNA）,单链DNA（ssDNA）,环形质粒,rRNA,mRNA和tRNA等多种底物均具有降解能力,且AtCaN2降解RNA的速率快于DNA。除了钙离子之外,AtCaN2的酶活性还可以依赖镁离子和锰离子,以及钙离子+镁离子和钙离子+锰离子双离子条件,但是锌离子和金属螯合剂EDTA可以抑制AtCaN2的酶活性。点突变实验表明AtCaN2氨基酸序列中的天冬氨酸和精氨酸位点在保持其核酸酶活性上起着重要作用。UREA-PAGE实验结果表明AtCaN2是一种从3’端往5’端酶解的外切核酸酶。另外实验过程中还发现,AtCaN2的酶活性可以一定程度上被AtCYSb的抑制,这进一步说明了AtCYSb和AtCaN2之间存在着相互作用关系。AtCaN2的生物学功能研究表明,AtCaN2也可以受盐,碱,渗透和氧化等多种逆境胁迫诱导表达,同时GUS染色也显示AtCaN2在种子,花,茎,衰老的叶等多个时期和组织器官中有表达且逆境胁迫可以提高GUS的表达量,这说明AtCaN2基因也与逆境相关。另外在酵母里的功能研究表明过表达AtCaN2会导致酵母对盐胁迫的敏感性。在拟南芥里的功能研究表明过表达AtCaN2也会导致拟南芥对盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的敏感性,而突变掉该基因则会提高植株对盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的抗性,同时生理指标测定结果也表明,在逆境胁迫条件下,AtCaN2过表达植株更易受到逆境胁迫的伤害,导致其体内叶绿素更容易流失,并积累较高的丙二醛和活性氧含量,同时产生更多坏死的细胞,而AtCaN2突变体植株的这些指标则好于对照,这说明AtCaN2在植物逆境胁迫过程中起着负调控作用。此外,我们在探求AtCYSb抗逆机理及作用对象的同时还得到了它的一个相互作用蛋白60S核糖体蛋白（AtRP12C）,酵母共转化,BiFC和Pull-down实验进一步验证了AtCYSb与AtRP12C蛋白之间的相互作用。我们对其进行了表达特性的初步研究,研究表明,AtRP12C基因在种子里的表达量比较高,在叶中的表达量较低,并且AtRP12C基因也可以受盐,碱,渗透和氧化等多种逆境胁迫诱导表达,说明AtRP12C也是一个与逆境相关的基因。
蔡亚南[8]（2011）在《旋毛虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定》文中研究说明旋毛虫病（Trichinellosis）是一种重要的人畜共患疾病,可通过摄入感染旋毛虫（Trichinella spiralis,T. spiralis）属肉类引起的。旋毛虫具有广泛的流行性,可造成人类和动物疾病。该病的流行,不但对畜牧业、肉食品业以及外贸出口等造成重大经济损失,而且直接威胁着人类健康,因而旋毛虫检验已成为我国和世界各国肉食品卫生检验中的重要内容之一。端粒（Telomere）是真核生物染色体末端能够防止染色体末端融合、降解和重组的特殊核蛋白复合体。端粒酶（Telomerase）则是由RNA和蛋白质亚基组成,能够延长端粒的核糖核蛋白复合体。目前,有关端粒和端粒酶的研究已经成为生命科学研究的热点之一。以寄生虫的端粒和端粒酶为切入点,进而分离端粒酶相关蛋白并针对该蛋白设计药物或疫苗无疑为寄生虫病的预防和治疗开辟了新思路。本研究以T.spiralis为研究对象,将提取的T.spiralis基因组DNA用限制性内切酶PstⅠ进行酶切消化,选取﹥1.3kb的片段与pUC18载体进行粘端连接,成功构建了富含端粒序列文库,进一步通过Southern杂交和酶切筛选阳性克隆,确定了T.spiralis端粒DNA重复序列为5’-TTAGGC-3’;根据已登录GenBank其他线虫端粒酶逆转录酶（TERT）基因序列设计简并引物,使用cDNA末端扩增技术（RACE）,成功克隆T.spiralis端粒酶TERT基因,序列全长为3788bp,其中3603bp的ORF编码1201个氨基酸,同时含有38bp的5’UTR和129bp 3’UTR以及多聚腺苷酸尾。利用生物信息学分析软件分析表明该基因包含TERT家族的主要特征性基序;采用改进的TRAP法检测了T.spiralis肌幼虫期、成虫期和新生幼虫期端粒酶活性,结果显示成虫期和新生幼虫期具有较高的端粒酶活性,肌幼虫期无端粒酶活性;采用不同浓度的苦参碱对不同时期虫体的端粒酶活性进行抑制作用。结果表明,苦参碱在浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL时,对T.spiralis不同时期虫体端粒酶活性均未抑制;苦参碱在浓度为2.0mg/mL、4.0mg/mL时,对T.spiralis肌幼虫端粒酶活性无抑制作用,对T.spiralis成虫有明显的抑制作用,对T.spiralis新生幼虫有轻微的抑制作用。本研究为进一步深入探索旋毛虫端粒形成、端粒酶活性调控、基因表达和变异、细胞周期调节等机制并针对端粒结合蛋白设计特异的抗线虫靶向药物预防和治疗旋毛虫病奠定了基础。
刘杉,胡林,刘艳辉[9]（2011）在《短双链DNA分子成环及微环缺陷结构研究》文中提出选用长为316 bp的双链DNA片段研究其柔韧性和成环能力,并用两种核酸内切酶探测微环DNA结构的完整性.结果表明,在T4连接酶的催化作用下,与Widom的报道一致,短双链DNA确实能够自发弯曲成环.用两种核酸酶——BAL31和S1作用之后,DNA环发生不同程度的消失,说明环状分子上存在非常规的缺陷结构.这种缺陷结构与短双链DNA的弯折刚性大大降低之间可能存在一定关系.
杨桂连[10]（2009）在《柔嫩艾美耳球虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定》文中研究说明鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳球虫引起以肠道病变为主要特征的细胞内寄生虫病,呈世界性分布,严重危害养鸡业的发展。其中尤以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella,E.tenella）引起的危害最为严重。端粒（Telomere）是真核生物染色体末端能够防止染色体末端融合、降解和重组的特殊核蛋白复合体。端粒酶（Telomerase）是一种核糖核蛋白,能以自身携带的RNA为模板,不断合成新的端粒DNA序列添加到染色体末端以维持染色体端粒长度。目前,有关端粒和端粒酶的研究已经成为生命科学研究的热点之一。而寄生虫防治过程中存在的一个非常棘手的问题就是耐药虫体和虫株的不断出现,严重影响抗寄生虫药和驱虫药的效果。以寄生虫的端粒和端粒酶为切入点,进而分离端粒结合蛋白并针对该蛋白设计药物或疫苗无疑为寄生虫病的预防和治疗开辟了新思路。本研究以E.tenella为研究对象,应用单卵囊分离技术成功分离具有较强感染力的地方分离株。在此基础上,成功构建了富含端粒序列文库,进一步通过Southern杂交和酶切筛选阳性克隆,确定了E.tenella端粒DNA重复序列为5’-TTTAGGG-3’。采用CODEHOP方法根据已登录GenBank其他球虫目原虫端粒酶逆转录酶（TERT）基因序列设计简并引物PCR同时结合3’、5’-RACE技术,成功克隆E.tenella TERT 4688bp全长cDNA序列,其中包括4491bp的ORF编码1497个氨基酸,同时含有42bp 5’UTR和152bp 3’UTR以及多聚腺苷酸尾。利用生物信息学分析软件分析表明该基因包含TERT家族的主要特征性基序。最后采用改进TRAP法检测了E.tenella未孢子化卵囊、子孢子和裂殖子端粒酶活性,结果显示子孢子和裂殖子具有较高的端粒酶活性。本研究为进一步深入探索球虫端粒形成、端粒酶活性调控、基因表达和变异、细胞周期调节等机制并针对端粒结合蛋白设计特异抗球虫靶向药物预防和治疗球虫病奠定了基础。
二、La(Ⅲ)对Bal31核酸酶活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、La(Ⅲ)对Bal31核酸酶活性的影响（论文提纲范文）
（1）基于有序DNA Walker等温信号放大策略的BCR/ABL融合基因检测方法研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略词名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 DNA walker |
| 1.3 电化学发光技术 |
| 1.4 本课题研究 |
| 2.实验部分 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 有序DNA轨道的制备 |
| 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.5 构建Ⅰ型和Ⅱ型DNA walker |
| 2.6 制备FA-BS猝灭探针 |
| 2.7 g-C_3N_4 NSs和Au@g-C_3N_4 NHs的制备 |
| 2.8 ECL传感器的构建和ECL分析 |
| 3.结果和讨论 |
| 3.1 检测原理 |
| 3.2 DNA轨道的表征 |
| 3.3 基于有序轨道的DNA walker的荧光动力学探究 |
| 3.4 g-C_3N_4 NSs和Au@g-C_3N_4 NHs的表征 |
| 3.5 Au@g-C_3N_4NHs量子效率探究 |
| 3.6 传感器构建的表征 |
| 3.7 可行性分析 |
| 3.8 检测性能分析 |
| 3.9 特异性和稳定性分析 |
| 3.10 回收实验 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 生物医学中的动态DNA纳米结构:实用性和局限性 |
| 1.前言 |
| 2.常用工程策略 |
| 2.1 无支架DNA(瓦片组装) |
| 2.2 支架DNA折纸 |
| 2.3 实现DNA纳米结构动力学的原理 |
| 3.生物医学中的动态DNA纳米结构 |
| 3.1 DNA盒子和纳米机器人 |
| 3.2 DNA循环 |
| 3.3 DNA步行器 |
| 4.生物和临床应用面临的挑战 |
| 4.1 DNA结构在生物介质中的稳定性 |
| 4.2 细胞摄取和内吞 |
| 5.结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文和参加的课题 |
（2）影响全基因组测序数据质量-AT分离因素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 全基因组重测序的应用与发展 |
| 1.2 测序仪的介绍 |
| 1.2.1 测序仪的发展概述 |
| 1.2.2 Illumina测序仪 |
| 1.2.3 华大测序仪 |
| 1.3 测序数据AT分离介绍 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 样本的提取 |
| 2.2.2 文库的构建 |
| 2.2.3 上机测序 |
| 2.3 研究与分析 |
| 2.3.1 DNB浓度对测序数据AT分离影响的分析 |
| 2.3.2 文库浓度对测序数据AT分离影响的分析 |
| 2.3.3 文库投入量对测序数据AT分离影响的分析 |
| 2.3.4 X酶浓度对测序数据AT分离影响的分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 DNB最适上机浓度的确定 |
| 3.2 WGS文库构建方法的优化 |
| 3.3 文库投入量的优化 |
| 3.4 X酶最适投入浓度的确定 |
| 3.5 4种优化方案的综合应用 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）三聚氰胺及其类似物对dsDNA及EcoRⅠ等核酸酶的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 三聚氰胺等三嗪类污染物概述 |
| 1.1.1 三聚氰胺及其类似物的理化性质 |
| 1.1.2 三聚氰胺及其类似物的生产用途 |
| 1.2 三聚氰胺的污染现状 |
| 1.2.1 宠物食品污染事件和奶粉掺假事件 |
| 1.2.2 三聚氰胺的迁移 |
| 1.3 三聚氰胺及相关污染物的毒性 |
| 1.3.1 三聚氰胺的代谢 |
| 1.3.2 三聚氰胺的毒理学研究 |
| 1.3.3 三聚氰胺等化合物与DNA的相互作用 |
| 1.4 三聚氰胺等化合物与生物大分子相互作用的研究方法 |
| 1.5 本论文的选题特色和主要内容 |
| 第二章 三聚氰胺及三聚氰酸对dsDNA与BAL-31核酸酶反应的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 寡核苷酸链序列 |
| 2.2.4 ssDNA预处理 |
| 2.2.5 dsDNA杂交 |
| 2.2.6 BAL-31核酸酶的内源荧光 |
| 2.2.7 热差光谱 |
| 2.2.8 三聚氰胺和三聚氰酸对互补双链DNA杂交的影响 |
| 2.2.9 解链温度 |
| 2.2.10 dsDNA与BAL-31核酸酶酶切反应 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BAL-31核酸酶的内源荧光 |
| 2.3.2 热差光谱 |
| 2.3.3 三聚氰胺和三聚氰酸对互补双链DNA杂交的影响 |
| 2.3.4 解链温度 |
| 2.3.5 dsDNA与BAL-31核酸酶酶切反应 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 三聚氰胺及结构类似物对限制性内切酶EcoR I,Nde I和Pst I的反应的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 pBR322 DNA在两种小分子作用下的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.4 EcoRI,Nde I和Pst I酶切实验 |
| 3.2.5 圆二色谱(CD)表征三聚氰胺及其类似物与小牛胸腺DNA的相互作用 |
| 3.2.6 圆二色谱测定三聚氰胺及其类似物与BSA的相互作用 |
| 3.2.7 底物-DNA的对接模拟 |
| 3.2.8 蛋白质(酶)定量 |
| 3.2.9 三聚氰胺及其类似物对BSA内源荧光的影响 |
| 3.2.10 三聚氰胺及其类似物对EcoR I内源荧光的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 pBR322 DNA的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.2 EcoR I,Nde I和Pst I酶切实验 |
| 3.3.3 圆二色谱测定三聚氰胺及其类似物对小牛胸腺DNA的相互作用 |
| 3.3.4 圆二色谱测定三聚氰胺及其类似物对BSA的相互作用 |
| 3.3.5 三聚氰胺及其类似物对BSA和EcoRI内源荧光的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）阴道毛滴虫端粒DNA鉴定及其调节蛋白研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 阴道毛滴虫研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 致病机制 |
| 4 临床症状 |
| 5 诊断 |
| 6 防治 |
| 7 分子生物学 |
| 8 阴道毛滴虫病毒 |
| 第二章 端粒及其相关蛋白研究进展 |
| 1 端粒 |
| 2 端粒相关蛋白 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 阴道毛滴虫端粒DNA鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 端粒DNA与端粒结合蛋白TRF和TBP相互作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 端粒结合蛋白TRF和TBP对端粒DNA的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 SPP对端粒DNA的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 PIKK与SPP相互作用及PIKK对端粒DNA的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（5）嗜盐古生菌温和病毒SNJ2及其宿主溶原体系的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文中所使用的英文缩写列表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 古生菌(Archaea) |
| 1.1.1 古生菌的分类 |
| 1.1.2 古生菌的特征 |
| 1.2 嗜盐古生菌(Halophilic archaea) |
| 1.2.1 嗜盐生物(Halophiles)及其生存环境 |
| 1.2.2 极端嗜盐古生菌(Halophilic archaea)基本特征及应用 |
| 1.2.3 嗜盐古生菌分类及基因组测序 |
| 1.2.4 Natrinema sp.J7菌株全基因组序列测定 |
| 1.3 病毒的形态与分类 |
| 1.4 古生菌病毒 |
| 1.4.1 泉古生菌病毒 |
| 1.4.2 广古生菌病毒 |
| 1.4.3 多形性包膜病毒家族(Pleolipoviral lineage) |
| 1.5 古生菌病毒与细胞间的关系 |
| 1.6 古生菌前病毒 |
| 1.7 本研究的背景、内容和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 序列 |
| 2.1.4 药品和试剂 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 实验仪器 |
| 2.1.8 数据库和软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SNJ1病毒制备 |
| 2.2.2 SNJ2病毒制备 |
| 2.2.3 双层平板法测定病毒效价 |
| 2.2.4 SNJ1病毒纯化 |
| 2.2.5 SNJ2病毒纯化 |
| 2.2.6 SNJ2病毒宿主范围筛查 |
| 2.2.7 透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察病毒形态 |
| 2.2.8 (Tricnine-)SDS-PAGE检测蛋白 |
| 2.2.9 病毒结构蛋白鉴定 |
| 2.2.10 病毒脂质苏丹黑B染色 |
| 2.2.11 病毒及嗜盐古生菌脂质成分薄层色谱(TLC) |
| 2.2.12 病毒基因组提取 |
| 2.2.13 E.coli DH5α感受态细胞的制备和转化 |
| 2.2.14 SNJ2病毒基因组测序 |
| 2.2.15 病毒基因组酶消化及鉴定 |
| 2.2.16 SNJ2病毒基因组断裂检测 |
| 2.2.17 SNJ2病毒基因组开放阅读框(ORF)预测分析 |
| 2.2.18 PCR验证前病毒整合、切离 |
| 2.2.19 SNJ2-like前病毒的搜查和同源基因比对 |
| 2.2.20 SNJ2-like前病毒及宿主的系统发育分析 |
| 2.2.21 生长竞争实验 |
| 2.2.22 SNJ1-Mutant全基因组测序 |
| 2.2.23 SNJ1-Mutant与SNJ1-WT对J7-2菌株裂解程度比较 |
| 第三章 温和多形性包膜病毒SNJ2性质的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SNJ1病毒的纯化和形态观察 |
| 3.2.2 SNJ2病毒的发现、形态观察和敏感菌筛查 |
| 3.2.3 SNJ2病毒的纯化 |
| 3.2.4 SNJ2病毒结构蛋白和包膜脂质分析 |
| 3.2.5 SNJ2基因组上由"GCCCA"保守基序引发的断裂现象 |
| 3.2.6 SNJ2属于多形性包膜病毒家族 |
| 3.2.7 SNJ2的大量复制需要SNJ1(质粒pHH205)的协助 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 SNJ2病毒属于Betapleolipovirus属 |
| 3.3.2 SNJ2病毒基因组上有断裂现象 |
| 3.3.3 SNJ2病毒的大量复制需要SNJ1病毒帮助 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SNJ2、SNJ1与宿主细胞关系的初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SNJ2前病毒整合在宿主基因组tRNA~(Met)基因3'末端 |
| 4.2.2 嗜盐古生菌基因组上广泛整合SNJ2-like多形性包膜前病毒 |
| 4.2.3 SNJ2-like前病毒整合规律相似 |
| 4.2.4 前病毒对宿主生长竞争的影响 |
| 4.2.5 Natrinema sp.LJ7性质初步研究 |
| 4.2.6 Natrinema sp.CJ7菌株的鉴定 |
| 4.2.7 SNJ1突变株对J7敏感菌的裂解性增强 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 SNJ2及SNJ2-like前病毒为多形性包膜病毒增加新特征 |
| 4.3.2 SNJ1病毒对菌株生长及生长竞争的影响 |
| 4.4 小结 |
| 研究总结与展望 |
| 研究总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词 |
| 第一篇 肠道病毒 71 型与人类共同抗原的鉴定及其对神经系统潜在致病作用的研究 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手足口病概览 |
| 1.2 病毒学 |
| 1.3 病毒的致病机理 |
| 1.4 分子流行病学 |
| 1.5 机体对病毒的免疫反应及免疫病理 |
| 1.5.1 固有免疫反应 |
| 1.5.2 抗体反应 |
| 1.5.3 T 细胞免疫反应 |
| 1.6 本研究要解决的问题、实验思路及意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用化学药品 |
| 2.1.2 抗体和抗原 |
| 2.1.3 载体及细胞 |
| 2.1.4 其它试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病毒蛋白氨基酸序列与人体蛋白共同抗原表位的扫描 |
| 2.3.2 共同表位在病毒颗粒中位置的确定 |
| 2.3.3 共同表位抗原肽的合成 |
| 2.3.4 共同表位单克隆抗体的制备 |
| 2.3.5 MED25 真核表达质粒的构建 |
| 2.3.5.1 MED25 基因的 PCR 扩增 |
| 2.3.5.2 PCR 产物和质粒的酶切和连接 |
| 2.3.5.3 连接产物的转化与酶切鉴定 |
| 2.3.6 MED25 的真核表达和鉴定 |
| 2.3.7 MED25 与 2H2 和 MED25 多克隆抗体的免疫荧光共定位实验 |
| 2.3.8 MED25 截短蛋白（241-1080 bp）原核表达质粒的构建 |
| 2.3.9 MED25 截短蛋白的原核表达 |
| 2.3.10 MED25 截短蛋白的纯化 |
| 2.3.11 MED25 截短蛋白与 2H2 单抗的 ELISA 试验及 ELISA 抑制试验 |
| 2.3.12 MED25 截短蛋白与 2H2 之间亲和常数的测定 |
| 2.3.13 EV 71 VLP 和 MED25 兔高免血清的制备 |
| 2.3.14 EV 71 VLP 和 MED25 免疫血清以及 EV71 感染人血清中共同抗体的检测 |
| 2.3.15 小鼠脑组织的免疫组化 |
| 2.3.16 小动物活体成像技术检测抗共同抗原的抗体在体内的分部 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 EV71 VP1 蛋白与人类脑组织蛋白存在共同表位 |
| 3.2 共同表位位于病毒颗粒外表面峡谷斜坡上 |
| 3.3 单克隆抗体 2H2 的纯化及其与共同表位抗原肽和 EV71 VP1 的反应性 |
| 3.4 真核细胞表达质粒 pcDNA3.1-MED25XXH 构建 |
| 3.5 MED25-His 真核细胞内的表达和鉴定 |
| 3.6 MED25 蛋白的 2H2 和抗 MED25 抗体免疫荧光共定位 |
| 3.7 MED25 截短蛋白原核表达质粒 pET28a-MJDEXH 的构建 |
| 3.8 MED25 截短蛋白的表达与纯化 |
| 3.9 MED25 截短蛋白可有效地抑制 2H2 与 VLP 的结合反应 |
| 3.10 MED25 与 2H2 的亲和常数 |
| 3.11 MED25 和 VLP 高免血清以及 EV71 感染人血清中存在高水平的抗共同抗原的抗体 |
| 3.12 小鼠脑组织免疫组化 |
| 3.13 2H2 在体内与小鼠脑组织间的反应性 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二篇 高灵敏性核酸酶联免疫荧光探针试验的建立 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ELISA 方法的背景与现状 |
| 1.2 本研究目的、创新性及意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 缓冲液 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 核酸酶活性评估 |
| 2.2.2 酶-底物反应灵敏性测定 |
| 2.2.3 Turbo 核酸酶的生物素化及生物素化后活性鉴定 |
| 2.2.4 核酸酶联免疫荧光探针试验 |
| 2.2.5 NP-SA、bio-TN、荧光探针的最适工作浓度和纳米颗粒粒径的优化 |
| 2.2.6 NP-SA 和荧光探针底物信号放大效应的鉴定 |
| 2.2.7 灵敏性、特异性和重复性检测 |
| 2.2.8 NLFOA 与 ELISA 方法的灵敏性比较 |
| 2.2.9 NLFOA 与 ELISA 两种方法信噪比（S/N）的比较 |
| 2.2.10 统计方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 标记酶的选择 |
| 3.2 常用集中酶-底物系统和 TurboNclease-荧光探针系统的敏感性检测 |
| 3.3 NP-SA、bio-TN 和荧光探针的最适工作浓度 |
| 3.4 NP-SA 和荧光探针的信号放大效应 |
| 3.5 NLFOA 与 ELISA 对 p24 的检测灵敏性比较 |
| 3.6 NLFOA 的特异性和重复性 |
| 3.7 NLFOA 的信噪比（S/N） |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（7）拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 1.1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制机制 |
| 1.1.2 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的生物学功能 |
| 1.2 核酸酶 |
| 1.2.1 核酸酶的分子量和结构特性 |
| 1.2.2 核酸酶的温度等电点和pH条件 |
| 1.2.3 核酸酶的金属离子和底物特异性 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 拟南芥AtCYSb与钙离子依赖性的核酸酶AtCaN2的相互作用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 拟南芥AtCYSb基因序列的生物信息学分析 |
| 2.2.2 AtCYSb启动子表达特性研究 |
| 2.2.3 AtCYSb蛋白的亚细胞定位分析 |
| 2.2.4 AtCYSb与AtCaN2相互作用的验证 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 钙离子依赖性核酸酶AtCaN2酶活特性分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 His-AtCaN2蛋白的大量诱导和纯化 |
| 3.2.2 His-AtCaN2点突变蛋白的大量诱导和纯化 |
| 3.2.3 GST-AtCYSb蛋白的大量诱导和纯化 |
| 3.2.4 核酸酶AtCaN2的酶活性分析 |
| 3.2.5 AtCYSb对AtCaN2的酶活性的影响 |
| 3.2.6 AtCaN2外切核酸酶特性的鉴定 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 拟南芥钙离子依赖性核酸酶AtCaN2的生物学功能解析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 拟南芥AtCaN2基因序列的生物信息学分析 |
| 4.2.2 AtCaN2表达特性研究 |
| 4.2.3 AtCaN2蛋白的亚细胞定位分析 |
| 4.2.4 AtCaN2基因在酵母中的功能分析 |
| 4.2.5 AtCaN2转基因拟南芥的表型分析 |
| 4.2.6 AtCaN2转基因拟南芥生理指标的测定 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 AtCYSb与60S核糖体蛋白AtRP12C的相互作用研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 拟南芥AtRP12C基因序列的生物信息学分析 |
| 5.2.2 AtRP12C蛋白的亚细胞定位分析 |
| 5.2.3 His-AtRP12C融合蛋白的诱导和纯化 |
| 5.2.4 AtCYSb与AtRP12C相互作用的验证 |
| 5.2.5 AtRP12C表达特性研究 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 AtCaN2的酶活特性分析 |
| 6.2 AtCaN2在植物对逆境胁迫响应中发挥的作用 |
| 6.3 AtCYSb与AtCaN2在逆境胁迫中的相互作用机制 |
| 6.4 AtRP12C在逆境胁迫中的初步研究 |
| 6.5 本论文的创新点 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）旋毛虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 旋毛虫病的分子生物学研究进展 |
| 1.1 旋毛虫基因组DNA 限制性酶切片段长度差异分析 |
| 1.2 旋毛虫基因随意扩增多态DNA 指纹图分析 |
| 1.3 旋毛虫DNA 重复序列及其PCR 分析 |
| 1.4 旋毛虫cDNA 文库的构建及ES 基因表达的研究 |
| 第2章 分子生物学技术在旋毛虫属分类方面的应用 |
| 2.1 限制性酶切分析和DNA 探针 |
| 2.2 限制性片段长度多态性 |
| 2.3 随机扩增多态性DNA( RAPD) |
| 2.4 裂解片段长度多态性 |
| 2.5 扩增片段长度多态性 |
| 2.6 反向线性印迹 |
| 2.7 简单重复序列锚定PCR |
| 2.8 PCR-单链构象多态性分析 |
| 2.9 多重PCR( multiplex PCR) |
| 第3章 端粒及端粒酶研究进展 |
| 3.1 端粒的由来 |
| 3.2 端粒的结构与功能 |
| 3.3 端粒酶的结构与功能 |
| 3.4 端粒酶的活性调控 |
| 3.5 端粒酶活性检测的研究 |
| 3.6 端粒酶抑制剂 |
| 第4章 寄生虫端粒及端粒酶研究进展 |
| 4.1 寄生虫端粒研究进展 |
| 4.2 寄生虫端粒酶研究进展 |
| 4.3 寄生虫端粒酶活性检测 |
| 4.4 总结与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 旋毛虫端粒DNA 重复序列克隆 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 旋毛虫端粒酶逆转录酶(TERT)基因克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 旋毛虫不同发育时期虫体端粒酶活性的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 苦参碱对旋毛虫端粒酶活性影响的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）柔嫩艾美耳球虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 球虫基因组研究进展 |
| 1.1 寄生虫基因组计划 |
| 1.2 球虫基因组研究 |
| 第2章 端粒及端粒酶 |
| 2.1 端粒和端粒酶研究历史 |
| 2.2 端粒的结构与功能 |
| 2.3 端粒结合蛋白 |
| 2.4 端粒酶的结构和功能 |
| 2.5 端粒酶对端粒DNA 的延伸 |
| 2.6 端粒酶活性的分子调控机制 |
| 第3章 寄生虫的端粒及端粒酶 |
| 3.1 寄生虫端粒 |
| 3.2 寄生虫的端粒酶 |
| 3.3 寄生虫端粒酶活性检测 |
| 3.4 总结与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 E.tenella 单卵囊分离株的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 E.tenella 端粒 DNA 重复序列克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 E.tenella 端粒酶逆转录酶（TERT）基因克隆 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 E.tenella 不同发育阶段虫体端粒酶活性检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
四、La(Ⅲ)对Bal31核酸酶活性的影响（论文参考文献）
- [1]基于有序DNA Walker等温信号放大策略的BCR/ABL融合基因检测方法研究[D]. 吕和叶. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]影响全基因组测序数据质量-AT分离因素的研究[D]. 陈燕贤. 华南理工大学, 2020(02)
- [3]三聚氰胺及其类似物对dsDNA及EcoRⅠ等核酸酶的影响[D]. 曹诗琴. 华中师范大学, 2019(06)
- [4]阴道毛滴虫端粒DNA鉴定及其调节蛋白研究[D]. 丁鹤. 吉林大学, 2018(12)
- [5]嗜盐古生菌温和病毒SNJ2及其宿主溶原体系的相关研究[D]. 刘莹. 武汉大学, 2015(03)
- [6]EV71和人类共同抗原的鉴定及其作为重症HFMD潜在致病机理的研究和高敏核酸酶联免疫荧光试验的建立[D]. 范培虎. 吉林大学, 2015(08)
- [7]拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究[D]. 郭坤元. 东北林业大学, 2015(01)
- [8]旋毛虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定[D]. 蔡亚南. 吉林大学, 2011(07)
- [9]短双链DNA分子成环及微环缺陷结构研究[J]. 刘杉,胡林,刘艳辉. 四川大学学报(自然科学版), 2011(04)
- [10]柔嫩艾美耳球虫端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性测定[D]. 杨桂连. 吉林大学, 2009(08)