一、乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究（论文文献综述）
周建卫[1]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
袁超[2]（2020）在《鸡Prox1基因的亚细胞定位及其在不同组织发育中的表达分析》文中研究指明Prox1（Prospero-related homeobox protein 1,Prox1）蛋白是homeo-box转录因子家族中的一个重要成员,在脊椎动物胚胎时期的神经、肝脏、心脏、眼睛和淋巴系统等组织器官发生发育过程中发挥了重要作用,并且其表达和功能的改变还与多种人类癌症相关。Prox1蛋白含有homeo-prospero结构域和prospero结构域,并且homeo-prospero与prospero结构域形成的同源结构域能特异性结合DNA,调节其它基因的转录。目前,Prox1基因的研究主要集中在人和小鼠,对果蝇、蝾螈、爪蟾、金鱼和斑马鱼也有一些研究。人、小鼠、爪蟾、金鱼和斑马鱼的Prox1基因c DNAs已得到了克隆、序列分析和功能研究,但是鸡Prox1基因的克隆、亚细胞定位以及在鸡组织发育过程中的表达情况尚不清楚。本研究首先对鸡Prox1基因的完整CDS区进行克隆和生物信息学分析,研究鸡Prox1蛋白的亚细胞定位并鉴定介导其细胞核定位的核定位信号,同时采用荧光定量PCR技术检测Prox1基因在鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）不同组织中的表达情况,分析其在鸡胚组织发育过程中的表达规律。1.鸡Prox1基因的克隆和生物信息学分析根据Gen Bank已发表的鸡Prox1基因序列（NM＿001005616.1）设计合成引物,以鸡眼睛提取的总RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增Prox1基因CDS区,利用生物信息学软件,对Prox1蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、亚细胞定位、互作蛋白、蛋白结构域和系统进化树进行分析。结果表明:从鸡眼睛提取的总RNA反转录产物中成功扩增出鸡Prox1基因CDS区,其长度为2211 bp,共编码736个氨基酸,理论p I为6.62,相对分子质量约为82.86 ku,分子式为C3601H5671N1049O1136S32。序列分析表明,鸡Prox1蛋白二级结构主要是由无规则卷曲（占53.67%）和α螺旋组成（占39.40%）。亚细胞定位和互作蛋白预测结果显示:鸡Prox1蛋白主要定位在细胞核,与其互作的细胞蛋白主要有LYVE1、PAX6、KDR、VEGFC和FLT4。核苷酸同源性及遗传进化分析发现,鸡与鹌鹑Prox1基因核苷酸同源性最高（为97.8%）,并且与鹌鹑的亲缘关系最近。以上研究为下一步开展鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的鉴定和组织表达特性提供基础。2.鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的预测和鉴定以构建的鸡Prox1基因重组克隆质粒p CR2.1-Prox1为基础,构建鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,将其转染HEK-293T细胞,通过Western blotting方法检测重组蛋白的表达,同时利用倒置荧光显微镜观察和分析重组蛋白的亚细胞定位。另外,运用在线软件预测鸡Prox1蛋白中假定存在的NLS（putative NLS,p NLS）,构建鸡Prox1蛋白p NLS缺失体重组真核表达载体,转染细胞后通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位来确定NLS。同时,将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力。另外,将NLS中的碱性氨基酸位点进行突变,鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果表明,成功构建了鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,转染细胞后重组蛋白EGFP-Prox1正确表达;荧光观察和亚细胞定位分析结果显示EGFP-Prox1重组蛋白主要定位在细胞核。对鸡Prox1蛋白NLS预测结果显示,鸡Prox1蛋白中共存在6个p NLS。进一步对p NLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,p NLS1(15KRRR18)和p NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其它禽类、人和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。此外,碱性氨基酸点突变试验结果证实,K15、R16和R18,K165、R166和R168分别是鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2中的关键碱性氨基酸位点。以上研究结果表明,两个高度保守的NLS1(15KRRR18)和NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。3.鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达特性分析分别采集鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）4个时间点的眼、脑、心、肝、肺、胃、胸肌和腿肌的样品。提取总RNA并反转录成c DNA,设计荧光定量PCR引物,通过荧光定量PCR方法检测Prox1基因在鸡肝、肾、脑、眼睛、肌肉不同阶段组织中的表达量,分析Prox1基因在鸡不同组织发育过程中的表达情况。结果表明,Prox1基因在鸡E14 d和7 d的胃中表达最高;0 d和14 d的肺脏中表达最高。表达规律显示:Prox1基因在眼睛和脑中表达稳定;心脏中7 d前表达稳定,7 d后开始呈上升趋势;肝脏和肺脏中均在E14 d时表达最低,14 d时表达最高,整体呈上升趋势;胃和腿肌中在E14 d时表达最高,0 d时表达最低,7 d时有较高表达,呈“W”表达趋势;胸肌中,E14 d到7 d阶段表达逐渐增加,在7 d时达到最高,之后开始下降,到14d表达最低。以上研究为后续开展Prox1基因调控鸡相关组织发育研究奠定基础。
李彤亚[3]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中提出由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
戴薇[4]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中研究指明癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
张烜[5]（2010）在《乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的持续感染是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）发生的最主要因素。HBV X （HBx）基因在肝细胞基因组中的整合和X蛋白的反式激活作用对HCC的发生和发展具有重要意义,但其致癌的分子机制目前尚不十分清楚。对HBx的研究大多着眼于X蛋白的反式激活功能,而忽略了HBx基因在肝细胞基因组整合的作用。研究表明,在HBV导致肝癌发生过程中,病毒DNA在宿主基因组中有高频率的整合,整合部位随机分布于多条染色体上,这种整合多发生在HBV X基因区域。前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系（L-02-X）发生恶性转化,推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。此外,HBx蛋白对HCC的发生和转移具有重要作用。近年来研究发现,骨桥蛋白（osteopontin, OPN）及钙蛋白酶小亚基1（calpain small subunit 1,Capn4）与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移。为了进一步阐明HBx基因/蛋白与肝癌发生发展的关系,本研究应用细胞模型和病人肝癌组织标本,探讨了HBx基因整合在肝癌发生中的直接作用和HBx蛋白促进肝癌细胞迁移作用的分子机制,主要研究内容如下：第一部分：HBx基因整合与肝癌发生关系的研究一、HBx基因突变体稳定整合细胞模型的建立前期研究发现,稳定整合HBx基因的人正常肝胞系（L-02-X）发生了恶性转化,因此推测HBx基因的整合可能与肝癌发生有直接关系。但是,其中包含了HBx蛋白的反式激活作用。为了探讨HBx基因整合与肝细胞转化的直接关系,首先建立了无反式激活功能的HBx基因突变体稳定整合的细胞模型。本研究中,HBx基因被随机分成五个片段,并分别克隆到真核表达载体pCMVTag-2B,获得的质粒分别命名为pCMV-X1、pCMV-X2、pCMV-X3、pCMV-X4和CMV-X5。将此五个质粒及克隆有全长HBx基因的质粒分别瞬时转染人肝细胞L-02使其蛋白过表达,同时检测对核因子-κB（NF-κB）和人端粒酶反转录酶（hTERT）启动子活性的影响,发现与野生型相比,五个突变的HBx基因片段失去了对NF-κB和hTERT启动子活性的上调作用。通过基因转染技术将克隆有这五个片段的质粒分别导入人正常肝细胞系L-O2和人肝癌细胞系H7402中,经G418筛选,获得了稳定转染细胞系,分别命名为L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5（或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5）。二、HBx基因片段整合导致肝细胞恶性转化的作用为了阐明L-02-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-02-X5细胞系的恶性表型,进行了免疫印迹实验。结果显示,与对照组相比,在L-02-X3和L-02-X5细胞中有甲胎蛋白（AFP）表达,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则检测不到AFP。软琼脂克隆形成实验显示,与对照组相比,L-02-X3和L-02-X5细胞克隆形成能力显着增强,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞克隆形成能力与对照组相比无明显差异。进一步研究发现,将L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5分别皮下接种裸鼠后,L-02-X3和L-02-X5细胞接种的裸鼠在接种部位形成原位瘤,而L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞接种的裸鼠则未能成瘤。本结果说明,整合有HBx基因片段的L-02-X3和L-02-X5细胞发生了恶性转化,HBx基因整合与肝细胞的转化直接相关。三、HBx基因整合导致肝细胞转化分子机制的研究1、HBx基因整合模式的鉴定。提取L-02-X细胞基因组DNA,应用HBx-AluPCR方法检测HBx基因整合模式,测序结果显示,HBx基因整合到Alu核心序列和亚端粒DNA（subtelomeric DNA）序列上游,整合后HBx基因发生了3’末端（381-465 bp）缺失,产生HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。然后,设计针对该重组体中HBx基因和亚端粒的引物进行PCR,在其他HBx基因稳定整合的细胞系（如H7402-X、3T3-X、HepG2-X和HepG2.2.15）中检测上述重组体是否存在。结果显示,仅在H7402-X细胞系中检测到该重组体。2、HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体与肝细胞转化的关系。为了阐明该重组体是否参与肝细胞的转化,应用上述特异于HBx基因和亚端粒的引物,在稳定整合HBx基因突变体的细胞系（L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4和L-02-X5；H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5）中进行验证。结果显示,在上述发现的已发生恶性转化的L-02-X3和L-02-X5（或H7402-X3和H7402-X5）细胞中检测到HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而未发生转化的细胞无该重组体。为了进一步提供HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致肝细胞发生转化的证据,应用报告基因及免疫印迹的方法对L-02-X1、L-02-X2、L-02-X3、L-02-X4、L-02-X5和L-02-X（或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4、H7402-X5和H7402-X）细胞系转录因子启动子活性及癌蛋白表达进行检测,结果显示NF-κB、AP-1和hTERT启动子活性在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、（或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X）细胞中显着增强,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4则与对照组无明显差异。c-Myc、PCNA和Bcl-2蛋白表达在L-02-X3、L-02-X5和L-02-X、（或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X）细胞中显着上调,而在L-02-X1、L-02-X2和L-02-X4细胞中则与对照组无明显差异。提示,HBx基因整合导致的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组是肝细胞转化的重要原因之一。3、在肝癌和癌旁组织中检测HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体。应用PCR方法对60例肝癌组织和癌旁组织中HBx基因进行检测,发现HBx在60例肝癌组织及其癌旁组织中有44例（73.3%）。然后,应用PCR方法在44例HBx阳性的肝癌组织及其癌旁组织中检测上述重组体,结果发现其中有5例肝癌组织中存在与细胞模型中相同的HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组体,而在其对应的癌旁组织无上述重组体,临床标本检测结果进一步证实HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组与肝癌发生有密切的关系。本研究发现HBx基因整合与肝细胞转化具有直接的关系,HBx基因/Alu核心序列/亚端粒DNA重组导致基因组不稳定是肝细胞转化的重要原因之一。这一发现首次为揭示HBV DNA在肝细胞基因组中整合的致癌作用提供了直接证据,对于肝癌的预防具有重要的指导作用。第二部分：HBx蛋白促进肝癌细胞迁移分子机制的研究近年研究发现OPN和Capn4与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润及转移密切相关。因此,HBx蛋白可能通过OPN及Capn4促进肝癌细胞迁移,为此进行了以下研究：一、HBx蛋白促进肝癌细胞迁移信号传导途径的研究本研究对HBx蛋白促进肝癌细胞迁移的信号传导途径进行了探讨。前期研究发现HBx蛋白通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；在此基础上,进一步研究显示HBx蛋白在启动子转录活性、mRNA及蛋白等水平通过5-脂氧化酶（5-LOX）上调肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达；进而,OPN可以通过NF-κB上调肝癌细胞HepG2和H7402中Capn4的表达；而Capn4则以正反馈的形式对肝癌细胞HepG2和H7402中OPN的表达起调节作用。体外划痕实验显示,HBx蛋白可显着增强肝癌细胞HepG2的迁移能力,而对HepG2-X细胞中OPN或Capn4进行RNA干扰后,其迁移能力受到明显抑制。表明,HBx蛋白通过正反馈环HBx/5-LOX/OPN/NF-κB/Capn4/OPN促进肝癌细胞迁移。二、HBx蛋白突变体HBxΔ127促进肝癌细胞迁移分子机制的研究实验室前期研究发现了一个新的HBx蛋白突变体,将其命名为HBx△127。研究表明,HBx△127具有明显促进肝癌细胞增殖的作用。在此基础上,本研究探讨了HBx△127对肝癌细胞迁移的影响,结果发现HBx△127具有促进肝癌细胞迁移的作用。HBx△127可通过5-LOX上调肝癌细胞中OPN的表达,进而促进肝癌细胞迁移。与野生型HBx蛋白相比,HBx△127促进肝癌细胞迁移的作用更强。上述实验结果进一步丰富了HBx蛋白及其突变体促进肝癌细胞迁移的分子机制,为肝癌的治疗提供了理论基础。
王琦[6]（2010）在《乙型肝炎病毒X蛋白突变体致癌作用及其信号传导途径的研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）与肝癌（HCC）的发生发展密切相关,乙肝病毒X开放读码框编码的X蛋白（HBx）作为反式激活因子在肝癌的发生中发挥重要的作用。但是,HBx致癌作用的分子机理仍不十分清楚。在肝癌组织中发现HBx基因普遍存在点突变和缺失突变,频率高达70%,但其作用不清。本研究为了进一步阐明HBx及其突变体在肝癌细胞中的作用和分子机制,从信号传导途径等方面探讨了野生型HBx促进肝癌细胞生长的分子机制；应用PCR技术从肝癌患者的癌组织和癌旁组织中筛选新的X基因突变体,并对已发现的HBx羧基端缺失突变体（命名为HBx△127）促进肝癌细胞生长的分子机制进行深入细致的研究。本论文从以下三个方面对HBx作用的分子机制进行了研究,主要研究内容如下：第一部分：HBx促进肝癌细胞增殖信号传导途径研究本研究探讨了5-脂氧合酶（5-lipoxygenases,5-LOX）在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用。应用稳定表达HBx的人肝癌细胞系HepG2-X和H7402-X,通过real-time PCR、免疫印迹和酶联免疫分析等方法检测5-LOX表达水平,结果显示HBx能够上调5-LOX的表达,其细胞培养液中5-LOX代谢产物LTB4的含量增加；在此基础上,探讨HBx上调5-LOX表达的分子机制。结果显示,Nuclear factor-kappa B （NF-κB）的特异性抑制剂PDTC和NF-κB siRNA干扰片段可明显降低5-LOX的表达,表明HBx通过NF-κB上调了5-LOX的表达；然后,应用5-LOX的特异性抑制剂MK886和5-LOX siRNA处理HepG2-X （or H7402-X）细胞,发现5-LOX通过正反馈促进NF-κB的表达。因此,本研究结果提示,HBx通过5-LOX和NF-～B之间的正反馈调节环促进和维持肝癌细胞的生长。第二部分：新的乙肝病毒X基因突变体的筛选为了发现新的HBx基因突变,我们从60例肝癌病人的癌组织和癌旁组织中筛选HBx基因新的突变体。结果显示,44例癌组织和癌旁组织里均可检测到HBx基因,阳性率为73.3%；其中28例癌组织中HBx基因发生了突变（63.6%）,27例的癌旁组织里HBx基因发生突变（61.3%）；测序结果显示,癌组织和癌旁组织中HBx点突变分别有35种不同类型,其中癌组织中HBx蛋白第30,33,38,144位氨基酸为热点突变位点,而第30,33和38位氨基酸伴随有组合突变（突变率30%）,该突变体目前未见报道；癌旁组织中HBx蛋白的第31,40,87,94位氨基酸为热点突变位点,第94位氨基酸点突变（突变率11%）目前未见报道。在此基础上,对癌组织中发现的HBx组合突变体的功能进行了初步研究,通过报告基因检测了上述HBx组合突变体对NF-κB、hTERT、AP-1和survivin启动子转录活性的影响,结果显示第30,33和38位HBx的组合突变体与野生型的HBx蛋白结果相同,提示该组合突变并未影响其功能改变。第三部分：HBx突变体HBx△127促进肝癌细胞增殖信号途径研究我们实验室前期研究发现HBx△127与野生型HBx相比具有更强的促进肝癌细胞增殖的能力,但其分子机制尚不清楚。为了探讨HBx△127在肝癌发生、发展中的作用,本研究首先应用人肝癌细胞系HepG2和H7402,通过基因转染和G-418筛选等方法,获得了稳定转染HBx△127的肝癌细胞系,分别将其命名为HepG2-X△127和H7402-X△127;在此基础上,探讨了HBx△127对脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase, FAS）和固醇调节元件结合蛋白-lc （Sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP-1c）的影响。应用real-time PCR、荧光素酶报告基因、免疫印迹和酶联免疫分析等方法,发现HBx△127能够上调FAS和SREBP-1c的启动子活性及SREBP-1c的表达；进一步研究发现,5-LOX的特异性抑制剂MK886可明显抑制上述上调作用,提示HBx△127可通过5-LOX上调FAS的转录活性和SREBP-lc的表达,进而促进肝癌细胞的增殖；然后,我们进一步观察了HBx△127对5-LOX代谢产物LTB4的影响。应用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测,发现HepG2-X△127和H7402-X△127细胞条件培养液中LTB4的含量与对照细胞组相比明显增加。当在培养液中外加100nM LTB4时,荧光素酶报告基因检测结果显示,FAS的启动子活性明显增强。最后,应用FAS的特异性抑制剂cerulenin处理HepG2-X△127和H7402-X△127细胞,5-LOX的表达受到抑制,提示FAS可调节5-LOX的表达。流式细胞术检测结果证实,FAS和5-LOX具有促进肝癌细胞增殖的作用。因此,本研究结果表明HBx△127具有促进和维持肝癌细胞生长的作用,与FAS和5-LOX之间的正反馈调节环有关。综上所述,本研究为深入揭示HBx的致癌机理提供了新的实验依据,可进一步丰富HBx致癌的分子机理,对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论价值。
朱平安[7]（2007）在《肝癌组织中HBx基因多态性分析及其突变体对QSG7701细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理研究背景原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在东南亚和中国是最常见的恶性肿瘤之一，大量流行病学调查表明，长期慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是导致HCC的主要病因，感染HBV的人群患HCC的危险性是未感染者的100余倍，且HCC病人家庭内有HBV感染的聚集性倾向，提示HBV感染与HCC的发生密切相关。来自台湾的研究表明，在儿童实行接种乙型肝炎病毒疫苗后，肝癌发生率明显下降。HBV是含3.2kb基因组的部分双链DNA病毒，包含S、C、P和X 4个开放读码框（open reading frames，ORF），其中X基因是最小的开放读码框，也是功能重叠最明显的区域。X基因（hepatitis B virus X gene，HBx）位于HBV基因组第1374～1838位核苷酸之间，编码约含154个氨基酸的多肽即HBx蛋白，分子量约为17kDa。在这4个开放读码框中，HBx基因常常更频繁地整合到宿主染色体上，编码的HBx蛋白能反式激活宿主及病毒调控基因，参与细胞调亡和受损细胞DNA剪切与修复，与HBV相关性肝细胞癌形成密切相关。而HBx基因在大多数肝癌组织上表达，表明HBx蛋白在调节与肿瘤相关的原癌蛋白和HCC抗凋亡方面发挥着重要作用。在HBV感染自然史上，突变势必蓄积在HBV基因组上。目前在一些进展性肝病病人中发现了某些类型的突变：HBx基因点突变，特别是K130M和V131I双替换，在肝硬化和肝癌病人出现的频率比轻型肝病更高；Chen等（2005年）在40％肝癌组织和70％肝癌病人血清中发现，HBx基因在204位置上插入突变（插入204AGGCCC）常伴随260（G→A）和264（G／C／T→A）位置上点突变，并在同一个病人或同一种样本中发现多种类型突变；在HCC癌细胞中，80％以上是整合型病毒，最保守的基因片段是HBx。整合的HBx基因部分缺失，使HCC癌组织中C-端截短的HBx蛋白检出率比非肝癌组织高。C-端截短的HBx蛋白失去了抗增殖作用，与原癌基因ras和myc一道，参与细胞转化。尽管HBV感染与肝细胞癌发生发展密切相关，但HBV诱发HCC的确切机制目前尚不十分清楚。研究目的（1）了解中国南部部分地区（包括湖南、湖北、江西等省）肝癌组织中HBV基因型的分布状况。（2）探讨肝细胞癌病人中是否存在特征性HBx基因突变。（3）构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体，研究HBx基因缺失型突变体与肝癌的关系。（4）建立稳定表达HBx-d382和HBx-d431蛋白QSG7701肝细胞株。（5）研究HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体对永生化QSG7701肝细胞生物学行为的影响，探讨其克隆形成能力和致瘤性。研究方法（1）应用型特异性引物巢式PCR检测肝细胞癌组织中HBV基因型，并随机选择HBV携带者血清作为对照。（2）采用巢式PCR，单链构象多态性分析（single-stranded conformational polymorphism，SSCP）和异源性双链分析（heteroduplex analysis，HA）等方法对51份肝细胞癌组织石腊包埋标本和25份乙型肝炎病毒携带者血清HBx基因进行多态性分析，选择可能有突变的HBx基因进行克隆、测序，并与参考序列进行比对分析。（3）以pGM-T／HBx-d382和pGM-T／HBx-d431质粒为模板，采用PCR方法，分别扩增含Kpn I和Apa I酶切位点的HBx基因序列。pcDNA3载体及HBx基因PCR产物经上述两种酶双酶切后，在DNA连接酶作用下，将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α中，经酶切鉴定和DNA序列测定，筛选出重组pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431质粒。（4）应用基因转染的方法，将质粒pcDNA3／HBx-d382、pcDNA3／HBx-d431、pcDNA3／HBx-2215和pcDNA3转染入QSG7701肝细胞中，筛选出稳定表达HBx蛋白的肝细胞株。（5）采用HE染色法，观察转染细胞形态学变化；通过MTT、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪分析和裸鼠成瘤实验研究稳定转染细胞的生物学特性。研究结果（1）在35份分型的肝癌组织标本中，B基因型12份（34.3％），C基因型17份（48.6％），B＋C混合基因型4例（11.4％），B＋D混合基因型2例（5.7％）。在60份HBV携带者血清中，B基因型28份（46.7％），C基因型24份（40.0％），B＋C混合基因型7例（11.6％），B＋D混合基因型2例（1.7％）。C基因型在肝癌组织中占优势，而HBV携带者血清以B基因型为主。（2）肝癌组织中HBx基因存在点突变和缺失型突变，B和C基因型之间突变类型和数量有一定差异，C基因型点突变频率更高。肝癌组织中31.3％的HBx基因存在特征性带形。在4个随机选择具有特征性带形的样本中，HBx基因在nt382-400共同存在缺失突变并伴随29个点突变，导致读码框漂移，在nt1818位置上出现新的终止密码。4个样本中，3个是B基因型，1个未测出。在另一肝癌组织样本中，第一轮PCR扩增产生的片段比预期要短，经基因序列分析，结果在HBV nt1577-1840之间出现了264个碱基缺失。此外，一肝癌组织中HBx基因在nt431-445位置上缺失了15个核苷酸。（3）成功构建了重组pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431质粒，经DNA序列测定与比对，重组前后目的HBx基因片段一致。（4）成功建立了稳定表达羧基端截短的HBx蛋白肝细胞株pcDNA3／HBx-d382／QSG7701和pcDNA3／HBx-d431／QSG7701。（5）与转染空质粒pcDNA3相比，转染肝癌组织中HBx-d382和HBx-d431突变体及HepG2.2.15细胞株中HBx-2215基因的QSG7701细胞大小形态不一致、体积增大、核浆比例增大，生长速度更快，克隆形成率高（p＜0.05）。与转染空质粒pcDNA3 S期百分比（29.4％）和凋亡率（13.1％）比较，pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-2215组细胞S期百分比例增高，分别为32.8％和35.0％，pcDNA3／HBx-d431组凋亡率下降（4.5％）。除QSG7701组未成瘤外，其余在7周内均形成了肿瘤。转染HBx-d382和HBx-d431缺失突变体的QSG7701细胞在裸鼠体内2周成瘤，成瘤时间明显短于HBx-2215基因的5周和空质粒pcDNA3的6周。pcDNA3／HBx-d431组裸鼠成瘤率为50％（2／4），其余成瘤组均为25％（1／4）。7周后测量肿瘤的体积，pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431组肿瘤明显大于pcDNA3／HBx-2215组和pcDNA3组。结论（1）中国南部部分地区肝细胞癌组织中存在基因型B、C，及混合基因型B＋C与B＋D，以C基因型为主，其次为B基因型。（2）HBx基因在肝细胞癌组织中频繁地发生突变，HBx基因在nt 382-400位置上的缺失突变可能在中国南部部分地区肝癌发生发展中发挥重要的作用。（3）成功构建了pcDNA3／HBx-d382和pcDNA3／HBx-d431真核表达载体，可为缺失型HBx基因突变体，特别是HBx-d382基因及其蛋白的生物学功能研究提供基因材料。（4）成功建立了pcDNA3／HBx-d382／QSG7701和pcDNA3／HBx-d431／QSG7701细胞模型，为HBx-d382和HBx-d431基因及其蛋白的深入研究奠定了基础。（5）HBx-d382和HBx-d431缺失型突变体能促进QSG7701细胞增殖和恶性转化，促使肿瘤的形成。HBx基因可能通过缺失型突变修饰其生物学功能，在HCC发生中起着重要的作用。
李进[8]（2006）在《乙型肝炎病毒X蛋白反式调节作用的研究》文中提出乙型肝炎病毒（HBV）感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且是肝纤维化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的主要病因。病毒基因组编码的蛋白通过反式调节宿主肝细胞基因组的表达,调控肝细胞的生长,可能是HBV致病（癌）的重要分子机制之一。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF）,分别命名为S、C、P、X区,其中X区编码154个氨基酸残基组成的17.5 kDa的产物-HBx。HBx是一种具有反式调节作用的病毒蛋白质,关于其反式调节作用,来自不同研究小组的实验结果甚至相互矛盾,因此,HBx在病毒复制和发病机制中的确切作用还有待进一步阐明。利用寡核苷酸基因芯片技术对HBx蛋白反式调节靶基因进行新的开拓,全面了解HBx蛋白反式调节作用的靶基因,有助于阐明HBV感染的部分分子生物学机制。 本课题首先应用常规分子生物学技术构建HBx蛋白的真核表达载体pcDNA3.1（-）-X,并将构建好的重组质粒瞬时转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体为平行对照。应用寡核苷酸基因芯片技术对HBx反式调节的靶基因进行筛选,同时结合生物信息学技术对差异表达的基因进行分析。在筛选的21,329条基因中,有426条差异表达的基因,其中168条基因表达上调,258条基因表达水平下调,这些基因包括许多与细胞生长调节、细胞凋亡、信号转导、免疫反应、物质代谢、细胞分裂周期、肿瘤发生和转移等相关的基因,还包括一些未知功能的新基因,其中之一命名为HBx蛋白反式激活基因11（XTP11）。 为进一步研究细胞中表达的HBx蛋白对抑癌基因p53的调节作用,我们利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域（p53p）,构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独及与pcDNA3.1（-）-X共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示,克隆的p53启动子序列具有激活下游基因转录的活性,当pCAT3-p53p与pcDNA3.1（-）-X共转染时CAT的表达活性明显下降;进一步采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测表明,瞬时转染了pcDNA3.1（-）-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。说明HBx蛋白在转录水平上反式抑
吴煜[9]（2004）在《乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（HBV）基因组为部分双链环状DNA病毒，属嗜肝DNA病毒科，其基因组约3200个碱基对（bp），分为结构基因和调节基因序列两部分。HBV DNA负链核苷酸序列至少有4个开放读框（ORF），4种ORF分别有各自的启动子。X基因启动子（XP）在1235-1374 nt区段，调节转录0.8的mRNA，无TATA盒，有不同的5’-端。XP的组织特异性不如CP和SP的严格，可在肝细胞以外的组织中起转录调节作用。X启动子调节编码HBxAg的0.8 kb mRNA转录，这个可调节的转录位于转录开始位点前140 nt，并且这个最小的启动子与3`-末端的增强子Ⅰ成分相重叠，由20 nt组成。这个最小的启动子象大多数HBV启动子一样与增强子Ⅰ的转录是分开的，它缺乏通常的TATA-盒或GC丰富的序列结构。但是，X启动子包含了广泛结合的位点和肝特异性转录因子，如调节作用蛋白X启动子结合蛋白（XP-BP）结合位点。HBxAg表达具有调节作用的转录包含顺式相互作用位点，能与转录因子NF1、C／EBP、ATF和AP1／Jun-Fos结合而且肿瘤抑制基因产物p53可与之结合并抑制启动子功能。我们利用人肝细胞cDNA文库，以生物素化的XP的DNA作为固相分子进行筛选，研究影响HBV DNA复制的肝细胞蛋白的结构和功能。 方法 应用噬菌体表面展示技术，以生物素化的HBV X基因启动子（XP）PCR产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”过程，经噬斑的PCR扩增后，构建T-A克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索，确定XP DNA结合蛋白的名称 结果2001级硕士学位论文乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究1.噬菌体经富集后，从随机筛选的21个克隆中得到17个阳性克隆， 成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了和 HBv XP DNA结合的肝细胞蛋白，共编码14种蛋白，其中9个克隆 编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码尼克酞胺腺嗓吟二核昔 酸脱氢酶亚型4、人血清白蛋白、泛素特异性蛋白酶10、翠丸增 强基因转录子、激肤酶原。2.成功构建了HBV XP的报告基因载体。用以T ELISA法测量结果: pCAT一XP实验组CAT酶的表达是pCAT的10余倍。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV XP的结合蛋白，分析了该 蛋白的编码基因，可能是作用于XP的反式调节因子，为进一步 研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的途径;成功地运用 DNA为固相靶分子筛选人肝cDNA文库，确定了和HBVX基因启动 子结合的肝细胞蛋白一尼克酞胺腺嚓吟二核昔酸脱氢酶亚型4 （NADHPH4）等结合蛋白，噬菌体展示技术作为一种研究DNA一蛋白 质相互作用的方法可进一步用于其他相关研究。
成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟[10]（2004）在《HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响》文中研究表明目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白- 蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响. 方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体.酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性. 结果:重组表达载体pcDNA3.1（-）-HCBP6、pcDNA3.1（-）- core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显着的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%. 结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显着的抑制作用.
二、乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究（论文提纲范文）
（1）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（2）鸡Prox1基因的亚细胞定位及其在不同组织发育中的表达分析（论文提纲范文）
| 课题来源 |
| 中文摘要 |
| Summary |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 转录因子Prox1结构与功能的研究进展 |
| 1 Prox1蛋白的结构特征 |
| 2 Prox1在胚胎发育中的作用 |
| 2.1 中枢神经系统 |
| 2.2 眼睛 |
| 2.3 心脏 |
| 2.4 肝脏 |
| 2.5 胰腺 |
| 2.6 淋巴系统 |
| 3 Prox1在癌症发生中的作用 |
| 3.1 神经系统肿瘤 |
| 3.2 胃肠道肿瘤 |
| 3.3 肝癌 |
| 3.4 Prox1在其它肿瘤中的作用 |
| 4 小结 |
| 5 目的与意义 |
| 第一章 鸡Prox1基因的克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和组织 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡Prox1基因的克隆与鉴定 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 RNA的提取 |
| 2.1.3 反转录 |
| 2.1.4 Prox1基因的扩增 |
| 2.1.5 PCR产物的纯化 |
| 2.1.6 连接 |
| 2.1.7 转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 鸡Prox1蛋白的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡Prox1基因的克隆与测序 |
| 3.2 鸡Prox1蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.1 鸡Prox1蛋白理化性质分析 |
| 3.2.2 鸡Prox1蛋白二级结构分析 |
| 3.2.3 鸡Prox1蛋白三级结构预测 |
| 3.2.4 鸡Prox1蛋白功能结构域保守性分析 |
| 3.2.5 鸡Prox1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.2.6 与鸡Prox1蛋白互作细胞蛋白的分析 |
| 3.2.7 Prox1基因核苷酸同源性分析 |
| 3.2.8 Prox1基因的遗传进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的预测和鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组真核表达载体p EGFP-Prox1 的构建 |
| 2.1.1 双酶切 |
| 2.1.2 连接 |
| 2.1.3 转化 |
| 2.1.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 鸡Prox1蛋白核定位信号的预测与鉴定 |
| 2.2.1 鸡Prox1蛋白核定位的预测 |
| 2.2.2 引物的设计 |
| 2.2.3 鸡Prox1 蛋白p NLS缺失体重组真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 鸡Prox1 蛋白NLS及其碱性氨基酸突变体重组真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 质粒小提 |
| 2.2.6 细胞培养及转染 |
| 2.2.7 重组蛋白的Western Blotting检测 |
| 2.2.8 重组蛋白的亚细定位分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组真核表达载体p EGFP-Prox1 的鉴定 |
| 3.2 重组蛋白EGFP-Prox1 的表达分析 |
| 3.3 重组蛋白EGFP-Prox1 的亚细胞定位结果 |
| 3.4 鸡Prox1 蛋白p NLS的预测 |
| 3.5 鸡Prox1 蛋白p NLS缺失体重组真核表达载体的构建 |
| 3.5.1 鸡Prox1 蛋白p NLS单缺失体重组真核表达载体的构建 |
| 3.5.2 鸡Prox1 蛋白p NLS双缺失体重组真核表达载体的构建 |
| 3.6 鸡Prox1 蛋白NLS及其碱性氨基酸突变体重组真核表达载体的构建 |
| 3.7 鸡Prox1 蛋白p NLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位 |
| 3.7.1 鸡Prox1 蛋白p NLS单缺失体重组蛋白的亚细胞定位 |
| 3.7.2 鸡Prox1 蛋白p NLS双缺失体重组蛋白的亚细胞定位 |
| 3.8 鸡Prox1 蛋白NLS的保守性分析及核输入能力检测 |
| 3.9 鸡Prox1 蛋白NLS中关键碱性氨基酸位点的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段组织中的表达分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物与样品采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 荧光引物的设计与合成 |
| 2.2 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 2.2.1 组织样品的采集 |
| 2.2.2 组织总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.3 鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段组织中的表达分析 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡Prox1 基因荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.2 鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段组织中的表达分析 |
| 3.3 Prox1基因在鸡胚不同组织发育过程中的表达规律 |
| 4 讨论 |
| 第四章 总结、创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士研究生期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（4）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（5）乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 乙型肝炎病毒(HBV)分子结构 |
| 第二节 HBV DNA整合与肝癌发生 |
| 第三节 HBx基因/蛋白在肝癌发生发展中的作用 |
| 第四节 骨桥蛋白和钙蛋白酶小亚基1在肝癌转移中的作用 |
| 第五节 研究目的和意义 |
| 第一部分 乙肝病毒X基因整合致癌作用的研究 |
| 第二章 HBX基因突变体稳定整合细胞模型的建立 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 HBX基因片段整合导致肝细胞恶性转化作用的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 HBX基因整合导致肝细胞转化分子机制的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二部分 HBX蛋白促肝癌细胞迁移作用分子机制的研究 |
| 第五章 HBX蛋白促肝癌细胞迁移的信号传导途径 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第六章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:乙肝病毒致癌分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 常规溶液配制 |
| 个人简历、在学期间发表的论文与研究成果 |
（6）乙型肝炎病毒X蛋白突变体致癌作用及其信号传导途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 HBx基因和HBx蛋白 |
| 第二节 HBx的功能及其致癌作用 |
| 第三节 HBx激活的细胞信号传导途径 |
| 第四节 HBx基因突变的生物学特征及其功能 |
| 第五节 5-LOX及其致癌作用 |
| 第六节 FAS及其作用机制 |
| 第七节 研究内容、目的和意义 |
| 第二章 HBx促进肝癌细胞增殖信号传导途径的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 新的乙肝病毒x基因突变体的筛选 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 HBx突变体促进肝癌细胞增殖信号途径的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述:乙肝病毒X基因及突变体致癌作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历、在学期间发表的论文与研究成果 |
（7）肝癌组织中HBx基因多态性分析及其突变体对QSG7701细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、英汉缩略语名词对照表 |
| 四、论文正文 |
| 前言 |
| 第一章 肝细胞癌组织中HBV基因型分析 |
| 引言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 肝细胞癌组织中HBx基因多态性分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 重组HBx缺失型突变体转化QSG7701肝细胞及其稳定细胞株的筛选 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 HBx基因缺失型突变体对OSG7701肝细胞增殖和凋亡的影响 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 五、综述 |
| 综述一:乙型肝炎病毒X基因及其蛋白与肝细胞癌 |
| 综述二:治疗性HBV DNA疫苗研究进展 |
| 六、攻读学位期间发表的论文 |
| 七、致谢 |
（8）乙型肝炎病毒X蛋白反式调节作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 第一部分 乙型肝炎病毒X蛋白反式调节肝细胞基因表达谱的研究 |
| 第一节 HBx真核表达载体的构建及其反式激活SV40立即早期启动子的研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二节 应用基因芯片筛选HBx蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 差异表达分析结果的验证实验——乙型肝炎病毒X蛋白对抑癌基因p53表达的下调作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 新基因XTP11结构和功能的初步研究 |
| 第一节 XTP11基因克隆化及生物信息学分析 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 HBx蛋白对新基因XTP11启动子的转录激活作用 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第三节 XTP11基因的细胞内定位 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第四节 XTP11基因的原核表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第五节 XTP11基因在酵母细胞中的转录激活功能 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第六节 讨论 |
| 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录一 主要仪器设备 |
| 附录二 英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要仪器设备 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 HBV-X抗原启动子的构建及转录活性鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 HBV-XP报告载体的构建 |
| 第二节 HBV-XP转录活性的鉴定 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用噬菌体展示技术筛选HBV XP的结合蛋白 |
| 引言 |
| 第一节 HBV X基因启动子的构建 |
| 第二节 应用噬菌体cDNA文库筛选与HBV XP结合的蛋白基因 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 文献综述 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究（论文参考文献）
- [1]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [2]鸡Prox1基因的亚细胞定位及其在不同组织发育中的表达分析[D]. 袁超. 贵州大学, 2020
- [3]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
- [4]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [5]乙型肝炎病毒X基因整合/X蛋白与肝癌发生关系的研究[D]. 张烜. 南开大学, 2010(07)
- [6]乙型肝炎病毒X蛋白突变体致癌作用及其信号传导途径的研究[D]. 王琦. 南开大学, 2010(07)
- [7]肝癌组织中HBx基因多态性分析及其突变体对QSG7701细胞生物学行为的影响[D]. 朱平安. 中南大学, 2007(01)
- [8]乙型肝炎病毒X蛋白反式调节作用的研究[D]. 李进. 中国人民解放军军医进修学院, 2006(09)
- [9]乙型肝炎病毒X基因启动子结合蛋白的研究[D]. 吴煜. 中国人民解放军军医进修学院, 2004(04)
- [10]HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响[J]. 成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟. 世界华人消化杂志, 2004(04)