一、人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达（论文文献综述）
于海滨[1]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中研究指明随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
吴可佳[2]（2019）在《毛囊皮质部特异表达绵羊KAP13-1转基因小鼠的鉴定》文中研究说明羊毛品质主要由羊毛纤维的特性决定,羊毛纤维由角质层、皮质和髓质组成,其中皮质部表达的基因对羊毛纤维的性状有重要影响,KAP13-1基因在绵羊毛囊皮质部表达,且影响毛纤维的细度。本课题组在前期研究中构建了具有在毛囊皮质部特异表达的绵羊KAP11-1启动子并制备了毛囊皮质部特异表达绵羊KAP13-1和绿荧光蛋白ZSG的转基因小鼠,命名为pKAP11-1-sKAP13-1-2A-ZSG-Plus（简称Plus小鼠）,初步鉴定发现Plus小鼠的毛纤维细度与野生型相比变细了。本研究在此基础上对Plus小鼠进行了三个世代（G2-G4代）的传代交配,首先分析Plus小鼠外源基因遗传和表达的稳定性,并对Plus小鼠毛囊表型进行检测,最后通过生物信息学预测、EMSA、免疫荧光等技术鉴定能够与KAP11-1启动子结合的转录因子,并在不同的绵羊群体中对转录因子NFAT5进行了SNP筛选。主要的研究结果如下:1、Plus小鼠外源基因表达的稳定性检测（1）利用基因组步移技术鉴定发现Plus小鼠外源基因插入在小鼠17号染色体Ermard基因和delta-like protein 1 precursor基因之间的基因间区内,以及X染色体上的Mbnl3基因和Hs6st2基因之间的基因间区内。在三个世代的Plus小鼠的9个个体中检验插入位点,发现Plus小鼠的插入位点没有随着配种传代而改变。（2）在G2、G3和G4世代Plus小鼠基因组中检测外源基因的拷贝数,结果表明在G2代Plus小鼠中外源基因有6个拷贝,G3代Plus小鼠有4个拷贝,G4代有2个拷贝,说明随着传代的进行外源基因的拷贝数逐渐趋于稳定。（3）检测了G2、G3和G4世代Plus小鼠外源基因的表达量变化,发现外源基因的表达量与外源基因的拷贝数成正相关,并且G4世代Plus小鼠的毛发仍可观察到绿荧光。2、Plus小鼠毛囊表型的测量分析测定了以下几种毛囊表型（1）初级毛囊直径、初级毛囊毛乳头面积和初级毛囊毛干直径;（2）次级毛囊直径和次级毛囊毛干直径;（3）毛囊密度;（4）毛囊髓质部空气间隙密度。其中初级毛囊毛乳头面积和毛囊髓质部空气间隙密度在Plus小鼠和野生型小鼠中没有显着差异,但是（1）雌性野生型小鼠的初级毛囊直径显着大于雌性Plus小鼠的初级毛囊直径（P=0.0377）;（2）野生型小鼠的次级毛囊直径显着大于Plus小鼠的次级毛囊直径（雄性:P=0.0139,雌性:P=0.0109）;（3）雌性野生型小鼠的毛囊密度显着低于雌性Plus小鼠的毛囊密度（P=0.0078）。以上结果说明sKAP13-1在Plus小鼠中能够影响Plus小鼠的毛囊表型,sKAP13-1可能在毛囊发育过程中起重要作用。3、对KAP11-1启动子有调控作用的转录因子研究预测发现转录因子NFAT5和KLF4可能与KAP11-1上游-251-148bp区域结合,EMSA结果表明NFAT5能够与KAP11-1上游-251-148bp区域上的结合位点结合,但没有验证KLF4与该区域互作。NFAT5免疫荧光结果显示该转录因子在Plus小鼠的皮质部有表达并且在生长期（P9天、P15天）的毛囊中有较强的表达,在休止期（P18）和退行期（P21）的毛囊中基本不表达,这与绵羊KAP11-1在毛囊中的表达模式以及Plus小鼠中sKAP13-1的表达模式一致。结果说明NFAT5可能在KAP11-1的表达调控中起作用。4、转录因子NFAT5基因的SNP在不同绵羊群体中的多态性检测通过数据库预测发现绵羊NFAT5基因上有30个可能改变氨基酸的SNP位点,通过PCR测序检测了其中24个SNP位点,发现只有3个SNP位点在中国美利奴羊（新疆型）、德国美利奴羊以及西藏羊群体中存在多态性。卡方独立性检验发现这3个SNP位点的等位基因频率在这3个绵羊群体中差异不显着。
汤飞[3]（2019）在《fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究》文中提出多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是一类含多个不饱和键的长链脂肪酸的统称,可依据多不饱和键个数及位置分为n-3 PUFAs和n-6 PUFAs等类别。它具有促进哺乳动物神经发育和胎儿生长,防治心血管疾病的发生等功能。多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸,必须从食物中摄取。由于猪肉是我国居民最主要的肉类消费品,提高其中PUFAs含量,对提高人们健康水平具有重要意义。为解决猪肉中n-3和n-6 PUFAs含量不足的问题,本研究获得控制PUFAs合成的两个必需酶基因,Δ12脂肪酸去饱和酶基因（fat2）和Δ15脂肪酸去饱和酶基因（fat1）,通过转基因技术初步制备fat1-fat2基因融合表达的转基因猪,并制备fat2-2A-fat1基因共表达的转基因小鼠模型。通过检测发现这两个动物模型肌肉、脂肪等组织中n-3和n-6PUFAs含量都得到了提高,为生产自身合成多不饱和脂肪酸的转基因动物研究提供基础研究。1.融合表达fat1-fat2转基因猪制备及检测我们使用本实验室前期已构建的p CAG-fat1-fat2融合表达质粒,通过脂质体介导稳定转染至猪胎儿成纤维细胞,利用体细胞核移植技术,获得fat1和fat2基因融合表达的转基因猪。本研究共获得5头在3日龄及120日龄均稳定表达fat1-fat2融合基因的转基因猪,利用实时荧光定量PCR证实fat1-fat2融合基因在肌肉组织中高效表达。转基因猪肌肉、皮肤、脂肪组织中PUFAs含量得到提高,其中3日龄转基因猪肌肉组织中n-3 PUFAs总量增加90.34%,n-6 PUFAs总量增加32.64%;120日龄转基因猪肌肉、脂肪、皮肤组织中n-3 PUFAs总量分别增加41.84%（p<0.01）、25.23%（p<0.01）、22.90%（p=0.05）,n-6 PUFAs总量分别降低25.01%（p<0.05）、24.32%（p<0.01）、36.17%（p=0.01）。同时我们发现转基因猪体内组织中SREBP1c、FAS、NFκB基因表达下调;三种组织中PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因的表达上调。LXRα基因在三种组织中的表达并未检测到明显变化。2.fat2和fat1共表达质粒的构建及在细胞中的表达和功能验证为进一步提高fat1和fat2基因表达效率,采用重叠延伸PCR技术,利用2A序列构建了实现双基因自我剪切、共表达的fat2-2A-fat1片段;并构建p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP共表达质粒。将共表达质粒以脂质体介导瞬时转染至PK15细胞48小时后,细胞能高效表达fa2-2A-fat1;细胞内n-3 PUFAs总量增加30.7%（P=0.05）,n-6 PUFAs总量减少34.74%。3.共表达fat2和fat1的转基因小鼠制备与检测将试验2中构建的共表达双基因质粒经显微注射制备转基因小鼠,最终获得6只F0代阳性小鼠。其中606号小鼠经PCR、Southern blot、m RNA表达量检测和肌肉组织PUFAs含量的检测显示其fat2-2A-fat1基因表达量最高;以此为父本,共繁育出11只F1代阳性小鼠,26只F2代阳性小鼠。通过检测PUFAs含量发现,F0代转基因小鼠肌肉组织中n-6 PUFAs含量较对照组增加30.61%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量增加6.87%;脂肪组织中n-6 PUFAs含量降低29.47%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量降低29.20%（p<0.01）;皮肤组织中n-6 PUFAs总量升高8.39%,n-3 PUFAs总量下降33.10%。F1代雄性转基因小鼠肌肉组织中n-6PUFAs总量比对照组增加4.31%,n-3 PUFAs总量增加9.47%;雌性小鼠中n-3 PUFAs总量增加16.34%,n-6 PUFAs总量增加22.64%。脂肪组织中雄性小鼠n-3 PUFAs总量增加7.21%,n-6 PUFAs总量增加6.50%;雌性小鼠n-6 PUFAs总量增加16.50%,n-3PUFAs总量减少5.93%。推测转基因小鼠fat2和fat1基因共表达水平及PUFAs含量存在组织和性别上的差异转基因小鼠体内FAS、SREBP1c和LXRα基因在部分组织中表达下调;PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因在三种组织中均表达上调;但NFκB基因在三种组织中表达量无显着变化。结论:本研究成功制备fat1和fat2双基因融合表达的转基因猪与共表达转基因小鼠,两种转基因动物体内均能高效表达fat1和fat2基因,显着提高体内PUFAs的含量,为未来培育富含多不饱和脂肪酸的转基因家畜新品种提供基础。
王明[4]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中研究说明外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
巩芷娟[5]（2018）在《HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究》文中研究表明肝脏是人体的重要器官,肝脏的各种损害会导致肝炎、肝纤维化、肝硬化,发展为癌症。为研究肝癌的发病机制,制备能够模仿人类肝损伤复杂过程最终导致肝癌的小鼠模型,对于肝损伤以及肝癌发生的研究都有重要意义。我们在已得到小鼠血清白蛋白调控的肝内表达HSV-tk的转基因小鼠的基础上,制备了3个新的HSV-tk小鼠家系,实验证实,HSV-tk分别整合在染色体的8C3-C4的基因间、5E1-E2的Rufy3和11A1-A2的Abca13内含子中。免疫荧光分析显示HSV-tk在3个小鼠家系肝脏内有不同程度的表达。GCV可以诱导小鼠发生肝损伤,并具有CK19+和α-SMA+细胞增加,血清ALT和AST明显升高。因此,本研究将HSV-tk小鼠作为GCV诱导的肝损伤模型以研究造血干细胞（HSC）宫内注射对肝损伤的修复作用,结果表明在肝脏损伤条件下HSC可以归巢到肝脏并增殖和分化,从而对肝损伤有一定程度的保护和修复效果。HSV-tk小鼠无GCV诱导的情况下,6月龄后发生肝炎和肝癌。肝癌是否与HSV-tk转基因有关,其发生机理如何?为了探讨上述问题,我们分析了HSV-tk小鼠肝癌和肝炎的转录谱,GO富集分析显示癌症小鼠中表达上调的基因主要包括免疫和细胞周期相关基因,表明免疫系统对HSV-tk小鼠肝癌的发生和发展可能具有重要贡献。而肝癌中下调的基因主要富集于脂类代谢相关通路,至使肝癌伴随脂肪变性。将HSV-tk小鼠与已发表的Notch转基因肝癌小鼠的表达谱进行比较。基因探针富集分析（GSEA）结果显示HSV-tk小鼠中免疫相关的信号通路较Notch小鼠上调,而细胞周期和DNA修复信号通路则下调。这表明,免疫/炎症相关的基因高表达是HSV-tk小鼠特有的现象。以上分析结果提示了炎症-细胞周期-癌症三者在肝癌发生中的密切联系。分析TCGA人肝癌数据库,发现免疫/炎症反应的信号通路在人肝癌的部分样本中高表达。本课题研究了HSV-tk小鼠作为GCV诱导肝损伤模型在造血干细胞体内损伤修复中的应用;转录谱分析表明HSV-tk小鼠肝癌发生可能与炎症/免疫信号通路相关,同时脂类代谢障碍在肝炎到肝癌的发展中可能也有一定贡献。为人类与免疫/炎症及脂肪性肝炎相关的肝癌提供了良好的研究模型。
朱奎成[6]（2017）在《Hr调控毛发生长发育的分子机制研究》文中研究指明脱发（alopecia）是临床上最常见的皮肤病之一,仅在我国,就有超过2亿的人口受到脱发困扰。常见的脱发有斑秃（Alopecia areata,AA）,脂溢性脱发（androgenetic alopecia AA）和全身性脱发（Alopeciauniversials,AU）三种类型,引起的原因各不相同,发病机制也不清楚,不能取得满意的治疗效果。结合其家族史和毛囊周期紊乱的共性,这些脱发均具有遗传性。毛囊的生长周期分为生长期、退行期和休止期3个阶段,这是一个高度复杂的过程,多条细胞信号通路构成复杂的网络调控系统,调控毛囊的形态发生和周期变化。因此,研究影响毛发正常生长发育的信号通路及关键细胞因子,可能为解决脱发难题提供重要的思路和切入点。然而,要从众多的信号通路网络中寻找影响毛囊生长的关键因子并非易事。借助自发突变动物模型或遗传工程动物模型研究毛发在特定病理表型下相关生长因子的改变,是现代生物遗传学的重要手段。无毛基因（hairless,Hr）编码的无毛蛋白（HR）对毛乳头与毛囊上皮之间的信号传递及毛囊周期变化具有重要作用,无毛基因的自发突变可引起人和小鼠脱发,无毛基因不同位点的突变可引起人和小鼠身体不同部位、不同程度的脱发,可以推测价是调控毛囊生长的必需因子。以Hr为切入点,通过建立Hr基因工程动物模型,结合自发突变小鼠,深入研究Hr的功能及其功能改变对信号通路的影响,探讨调控毛发生长周期的关键细胞因子及信号通路。前期工作已培育Hr自发突变小鼠（豫医无毛小鼠,YYHL）并构建Hr基因敲除小鼠（KO）。本研究利用Gateway技术在Hr基因的3427位引入点突变（G→A）,构建pRP（Exp）-EF1A>mHairlessmutant>IRES/EGFP真核表达载体,显微注射受精卵获得转基因F0代小鼠。PCR鉴定、筛选、交配,成功构建#3、#8和#12三条Hr突变转基因品系。在培育Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠（TG）过程中,发现三种小鼠均表现为出生后毛发生长正常,到14日龄开始脱发,但脱发方式有所区别。YYHL和KO小鼠皮肤毛发先稀疏,再脱尽,终生不再长发;转基因小鼠（TG）出生后14天开始从背部脱发,35天时毛发从脱落部位重新生长,并不再脱发。皮肤组织学和透射电镜观察发现,自发突变和基因敲除小鼠脱发时毛囊细胞发生凋亡,提前进入了退化期,并不再进入生长期;转基因小鼠在脱发时经历了同样的改变,但在出生后的第二个毛囊生长周期毛发能重新进入生长期。脱发时转基因小鼠皮肤外源突变Hr的表达显着高于内源Hr基因,而毛发重新生长时内源基因的表达占有显着的优势,说明外源基因抑制了内源基因的表达,突变后功能改变或丧失的无毛蛋白已经失去了原有的功能而导致毛发周期紊乱,引起脱发。为研究Hr对皮肤毛发全基因组转录谱的影响,本文用含45,281个基因的MouseWG-6 v2 Expression BeadChip检测三种基因工程小鼠皮肤组织基因表达谱,运用GO功能注释、IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件对芯片结果进行分析,并与野生小鼠皮肤组织作比较。结果显示,YYHL、KO和TG小鼠开始脱发时背部皮肤分别筛选出1839（包括965个已知功能基因和874个未知基因）、1816（包括1038个已知功能基因和778个未知基因）、2027（包括1238个已知功能基因和789个未知基因）个差异表达基因。转基因小鼠毛发重新生长时差异表达的基因为530个(包括359个已知基因和171个未知基因。GO分析显示差异表达的基因主要涉及到炎症反应、表皮发育、角质形成细胞分化、抗凋亡、细胞粘附、趋化现象、免疫反应、细胞增殖正向调控和细胞信号转导等生物学过程。Kegg通路分析显示,筛选的差异表达基因主要参与了 Notch、BMP、Wnt、P53以及钙信号通路等。免疫组织化学结果表明HR功能改变时,BMP2在毛囊中高表达,这时WNT信号通路中的关键调控因子Catenin几乎检测不到;转基因皮肤毛发重新生长时,BMP通路被抑制,WNT通路被显着激活。Hr是Notch信号通路中的辅阻遏物。芯片结果显示,HR功能改变或丧失时,Notch细胞信号通路中的HES家族基因表达升高,BMP信号通路被激活且抑制了 Wnt通路,毛囊提前进入退化期。HR功能恢复后,平衡重新建立,毛发进入正常的生长周期。此外,芯片检查和免疫组织化学结果都显示脱发时调控角质形成细胞终末分化的CASP-14及构成毛囊结构骨架的角蛋白基因显着上调,透射电镜观察发现角蛋白丝的大量聚集,排列紊乱,细胞中见大量大小不一、类似脂滴的空泡,提示HR蛋白功能丧失或改变时,毛囊干细胞（HFSCs）终末分化为皮脂腺（SG）和角质形成细胞（KC）,毛发不能形成。实验结果可能为研究毛发生长发育、毛囊干细胞的分化调控,进而为解决人的脱发难题提供重要思路。
马林媛[7]（2017）在《猪转基因友好整合位点的筛选与应用》文中进行了进一步梳理外源基因导入受体细胞后,其表达会受到多种因素的影响。其中,外源基因整合于染色体上的位置,对其是否表达及表达量的高低起着决定性作用。若外源基因随机插入到受体基因组中,易受位置效应（Position Effect Variegation,PEV）的影响,造成表达不稳定。前期研究发现,通过在表达载体上添加某些染色体的特定序列或优化目的基因表达单元的结构,模拟染色体上的高转录活性区域,能够减小位置效应的影响。另外,筛选出处于转录活跃染色体区域的位点,将外源基因直接整合到这些位点上,也可以实现外源基因稳定高效表达。猪作为具有重要农业和医学研究价值的大动物,目前还鲜有关于外源基因定点整合的研究。从猪基因组中发掘和筛选适合外源基因表达的友好整合位点,在不影响猪自身生长发育的前提下,实现外源基因稳定高效的表达,将有利于转基因技术在猪中更广泛的应用。本研究首先利用已发表的猪全基因组基因表达数据,进行外源基因候选整合位点的筛选。将基因组分成500 kb的表达单元,寻找在各组织中均一高表达的、处于转录活跃染色体区域的表达单元。因为癌症相关基因的功能相对重要,本研究在排除含有癌症相关基因的表达单元后,对500 kb表达单元的基因表达平均值进行计算。为了尽可能地降低外源基因插入对内源基因表达的影响,将表达水平排在前三位的表达单元中所有的基因间隔区域作为候选区域。最终选择了两个不含有非编码RNA、核小体形成能力较小的基因间隔区域作为候选整合位点,命名为Pifs501和Pifs302,其分别位于 chr15:137957000-137958000 和 chr16:44288700-44289700。本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源重组,实现了外源绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因在Pifs501和Pifs302位点上的定点整合。在细胞水平上,Pifs501和Pifs302位点能够支持CMV、PGK和EF1α启动子分别启动的外源EGFP基因在IBRS-2细胞和中国实验用小型猪（Chinese Experimental Mini Pig,CEMP）成纤维细胞中持续并稳定的表达;通过对候选整合位点前后各300 kb之内所有基因的表达水平进行定量分析,发现外源EGFP基因在Pifs501位点上的插入并未对邻近600 kb内基因的表达造成显着干扰;对EGFP基因插入候选位点后,启动子DNA甲基化的水平进行检测,发现插入到Pifs501位点上的EGFP基因,其启动子呈现较低的DNA甲基化水平;染色体免疫共沉淀实验结果表明,在Pifs501位点上整合的EGFP基因具有较低的组蛋白H3K27me3修饰程度。以上结果表明Pifs501位点处于表观相对开放的染色体状态上。在Pifs501位点定点整合EGFP的转基因猪中,EGFP基因能够在个体囊胚期、胚胎期以及出生后等不同发育时期稳定表达;并能在不同组织中广泛表达,其中以心脏和胰腺中的表达量较高。同时,外源基因在各组织中的稳定表达,并未显着干扰各组织中Pifs501位点邻近600 kb内源基因的表达。鉴于Pifs501位点在细胞和个体水平上适合外源基因表达的友好性,本研究利用Pifs501位点建立了含有Cre重组酶识别位点loxP的Master细胞系。通过将表达Cre重组酶的载体和两端带有loxP序列的Follistatin基因的替换载体共转Master细胞系,成功将Follistatin基因高效定点整合到Pifs501位点上。Pifs501位点上Master细胞系的建立,将外源基因的定点整合从依赖同源重组转换成依靠Cre/loxP系统介导的重组反应,从而极大地提高了外源基因定点敲入特定基因位点的效率。综上所述,本研究利用基因表达数据建立了友好外源基因整合位点的筛选方法;筛选出一个处于表观开放染色质区域且具有外源基因表达友好性的整合位点Pifs501位点;并利用Pifs501位点建立了可以用于后续外源基因定点整合的Master细胞系。此项工作为猪基因组的精确编辑,提供了良好的方法和工具,将极大地提高外源基因在转基因猪中的整合和表达效率,对转基因技术在猪育种产业及疾病模型构建中的广泛应用具有重要意义。
陈冉[8]（2016）在《猪MYOD/PPAR-γ2转基因鼠外源基因的插入位点效应的研究》文中研究指明外源基因在转基因动物体内的表达既受到表达载体的启动子影响,又受到外源基因在插入过程中所引起的插入位点效应的影响。本实验室采用原核显微注射法制备了可以稳定遗传的MyoD和PPAR-γ2转基因鼠。为了研究影响外源基因在转基因动物体内表达的因素,本试验将实验室保留的F3代的MyoD和PPAR-γ2转基因鼠经世代纯繁建系,检测转基因鼠中外源基因在DNA、RNA和蛋白水平的表达;通过热不对称交错式PCR（TAIL-PCR）法对转基因鼠中的外源基因MyoD和PPAR-γ2进行定位,确定外源基因的插入位点,再分析外源基因整合过程中产生的插入位点效应,为日后应用于生产实践奠定理论基础。主要研究结果如下:1、测定PPAR-γ2转基因鼠和野生型鼠后腿肌肉组织中的甘油三酯含量和PPAR-γ蛋白的表达情况,检测的结果表明PPAR-γ2阳性转基因鼠肌内甘油三酯的含量高于野生型鼠（p<0.05）,PPAR-γ蛋白在转基因鼠中的表达高于野生型鼠;2、用RT-qPCR法检测MyoD转基因鼠各组织中外源基因的表达量,结果表明外源基因MyoD在肌肉组织中的表达量高于其他组织,且后腿肌肉组织中MyoD蛋白的表达量MyoD转基因鼠明显高于野生型鼠;3、对两种转基因鼠进行纯繁建系,经过世代的纯繁和检测得到了纯合阳性转基因鼠;4、采用热不对称交错式PCR法对转基因鼠中的外源基因进行定位,结果将PPAR-γ2转基因鼠中的外源基因PPAR-γ2定位于鼠9号染色体的RP23-366E1,外源基因PPAR-γ2存在串联插入的情况;外源基因MyoD也存在串联插入的情况;再通过ORF Finder对外源基因PPAR-γ2插入位点两翼2000 bp的核酸序列进行分析,发现外源基因PPAR-γ2插入位点两翼都有ORF框;又用Promoter 2.0和Promoter Scan对外源基因PPAR-γ2插入位点上游2000 bp的核酸序列是否存在启动子区域进行预测,结果显示外源基因PPAR-γ2插入位点的上游2000 bp内存在内源的启动子;5、采用绝对定量PCR法测定PPAR-γ2和MyoD转基因鼠中外源基因的拷贝数,拷贝数计算所得数据表明外源基因可以整合到转基因鼠的基因组,且外源基因在转基因鼠基因组上的拷贝数会因转基因鼠的传代而增长直至得到纯合阳性转基因鼠;6、经在线软件预测外源基因的CpG岛,结果表明构建的外源基因PPAR-γ2的表达载体pGL3-Myoz1-PPAR-γ2his-Basic中没有CpG岛;构建的外源基因MyoD的表达载体pSV40-Myf6-MyoDEGFP-N1中存在3个CpG岛且有一个处于表达载体的启动子区域。用亚硫酸盐PCR-SSCP法分析MyoD转基因鼠中外源基因Myo D的甲基化情况,发现MyoD阳性转基因鼠中的外源基因MyoD的表达载体的Myf6启动子区域的CpG岛的甲基化的程度很高。综上所述,在PPAR-γ2转基因鼠中,外源基因PPAR-γ2显着高表达;外源基因PPAR-γ2定位于9号染色体;外源基因PPAR-γ2的表达载体不存在CpG岛;外源基因PPAR-γ2是多拷贝插入。在MyoD转基因鼠中,外源基因MyoD高表达,且外源基因MyoD基因在转基因鼠肌肉组织中的表达量高于其他组织;外源基因MyoD的表达载体有3个CpG岛、一个位于Myf6启动子区域,甲基化检测发现外源基因MyoD表达载体的Myf6启动子区域CpG岛的甲基化的程度很高,外源基因MyoD是多拷贝插入。
刘秉乾,武玉东,魏金星,李沛寰,李光三,张立霞,李胜芝,张志宏,马腾骧[9]（2009）在《人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究》文中研究说明目的观察人α1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因转移对抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力。方法通过显微注射建立转基因小鼠动物模型,Southern印迹杂交和流式细胞计数筛选出人HT和/或DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。研究表达不同目的基因的转基因小鼠血管内皮细胞与15%人血清孵育后溶破细胞的百分数,免疫细胞化学染色检测细胞核因子（NF）-κB的激活,流式细胞计数检测细胞表面血管细胞黏附分子（VCAM）-1的表达。结果子代小鼠血管内皮细胞人HT/DAF共基因表达7只,人HT与DAF单基因表达分别为6只和8只。与15%人血清孵育后,人HT/DAF共表达组细胞的溶破细胞百分数（4±2）%低于人HT表达组细胞（25±10）%、人DAF表达组细胞（31±11）%及正常组细胞（76±24）%（P均<0.05）。转双基因抑制细胞NF-κB激活的能力强于转人HT或DAF单基因,且转双基因细胞表面VCAM-1的表达较转单基因细胞显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论人HT/DAF基因联合转移具有部分抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力。
刘秉乾,王广有,李胜芝,张志宏,李光三,张立霞,马腾骧[10]（2007）在《联合转移人HT和DAF基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用》文中提出目的探讨联合转移人α1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用。方法通过显微注射制备转人HT及DAF基因的子代小鼠,以聚合酶链反应和流式细胞仪筛选出人HT和（或）DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。以同时表达人HT和DAF基因的小鼠为实验组,单一表达人HT或DAF基因的小鼠为HT对照组和DAF对照组,取其心脏,采用改良的Langendorff心脏灌注装置灌注心脏,先以KH液逆向灌注,30 min后再以含15%（体积分数）人AB血清的Krebs-Henseleit液（KH液）灌注。记录不同灌注时间的心率、左心室收缩压及左心室舒张末压,计算左心室获得压,以心率与左心室获得压的乘积作为心脏左心室收缩功能的指标,免疫组化法观察灌注后的心脏血管内皮细胞和组织中IgM与C3c的沉积情况。结果KH液灌注过程中,各组间心脏做功能力的差异无统计学意义;KH液中加入人血清后,HT对照组和DAF对照组的心脏做功能力明显下降,在灌注60 min时心脏做功分别为最大值的27%和23%,平均做功时间分别为118 min和89 min,普通小鼠心脏在灌注后50 min时停止搏动,而实验组的心脏做功能力下降缓慢,至60 min时心脏做功维持在最大值的67%以上,平均做功时间为225 min,其心脏做功能力与搏动时间高于HT对照组和DAF对照组（P<0.05）。免疫组化染色显示,实验组小鼠心脏血管内皮细胞与组织中未见IgM和C3c沉积,HT对照组可见C3c少量沉积,DAF对照组可见IgM沉积和C3c少量沉积,普通小鼠心脏可见IgM和C3c沉积。结论小鼠联合转移人HT和DAF基因后,其心脏在人血清灌注下的免疫损伤明显减轻,这可能对抵御异种移植超急性排斥反应有一定帮助。
二、人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达（论文提纲范文）
（1）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（2）毛囊皮质部特异表达绵羊KAP13-1转基因小鼠的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 羊毛品质是重要的经济性状之一 |
| 1.2.2 毛囊的发育对羊毛品质有重要影响 |
| 1.2.3 毛囊皮质部特异表达基因KAP11-1和KAP13-1 |
| 1.2.4 转录因子对KAP基因的表达有重要调控作用 |
| 1.2.5 转基因动物外源基因遗传和表达的稳定性研究 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 组织样品 |
| 2.1.3 主要分子生物学网站和软件 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA提取步骤 |
| 2.2.2 RNA提取以及反转录 |
| 2.2.3 基因组步移技术(Genome Walking) |
| 2.2.4 外源基因拷贝数鉴定 |
| 2.2.5 HE染色及免疫荧光技术 |
| 2.2.6 毛囊性状测量方法 |
| 2.2.7 细胞核蛋白的提取 |
| 2.2.8 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 2.2.9 NFAT5的SNP检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 Plus小鼠遗传稳定性鉴定 |
| 3.1.1 Plus小鼠外源基因插入位点鉴定 |
| 3.1.2 不同世代小鼠个体的外源基因插入位点检测 |
| 3.1.3 Plus小鼠外源基因拷贝数鉴定 |
| 3.1.4 Plus小鼠外源基因的表达量与插入位点及拷贝数之间的关系 |
| 3.2 Plus小鼠毛囊表型的鉴定 |
| 3.2.1 初级毛囊直径以及毛乳头面积测定 |
| 3.2.2 次级毛囊直径测定 |
| 3.2.3 初级毛囊毛干直径以及次级毛囊毛干直径测定 |
| 3.2.4 毛囊密度测定 |
| 3.2.5 髓质空气间隙密度测定 |
| 3.3 绵羊KAP11-1 基因上游-251~ -148bp区域转录因子的鉴定 |
| 3.3.1 转录因子NFAT5 与绵羊KAP11-1 基因上游-251~ -148bp区域结合 |
| 3.3.2 转录因子KLF4 与绵羊KAP11-1 基因上游-251~ -148bp区域结合 |
| 3.4 绵羊中NFAT5 基因的SNP位点检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Plus小鼠的遗传稳定性分析 |
| 4.2 sKAP13-1 影响Plus小鼠的毛囊性状 |
| 4.3 转录因子NFAT5 以及KLF4 对绵羊KAP11-1 启动子的调控 |
| 4.4 绵羊中转录因子NFAT5的SNP分型 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 我国的猪肉生产及消费概况 |
| 1.1.2 猪肉中脂肪酸的组成、含量及对人体的影响 |
| 1.1.2.1 猪肉中脂肪酸的组成及含量 |
| 1.1.2.2 n-3和n-6 PUFAs的生物学功能 |
| 1.1.3 PUFAs的膳食推荐量及我国居民的实际摄入量 |
| 1.1.4 培育富含多不饱和脂肪酸的转基因猪是我国种猪育种新方向 |
| 1.1.4.1 多不饱和脂肪酸合成途径 |
| 1.1.4.2 通过转基因技术提高猪肉中PUFAs含量的研究概况 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第2章 融合表达fat1-fat2 的转基因猪制备及检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 质粒和细胞系 |
| 2.2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2.1.4 试剂配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 转基因猪移植及分娩生产 |
| 2.2.2.3 转基因猪体表绿色荧光检测 |
| 2.2.2.4 转基因猪基因组DNA抽提 |
| 2.2.2.5 PCR鉴定转基因猪中fat1-fat2 基因的表达 |
| 2.2.2.6 转基因猪组织样RNA的提取 |
| 2.2.2.7 转基因猪反转录PCR鉴定 |
| 2.2.2.8 转基因猪的Southern Blot检测 |
| 2.2.2.9 实时荧光定量PCR检测转基因猪中融合基因表达水平 |
| 2.2.2.10 转基因猪肌肉、脂肪、皮肤组织中多不饱和脂肪酸含量的测定 |
| 2.2.2.11 转基因猪脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 fat1-fat2 基因融合表达质粒的制备 |
| 2.3.2 PCR鉴定fat1-fat2 融合表达质粒 |
| 2.3.3 fat1-fat2 融合表达转基因猪的制备 |
| 2.3.4 PCR鉴定转基因猪中融合基因的整合 |
| 2.3.5 Southern Blot检测鉴定转基因阳性猪 |
| 2.3.6 转基因猪体表绿色荧光蛋白表达检测 |
| 2.3.7 转基因猪肌肉、皮肤、脂肪组织中融合基因的表达量检测 |
| 2.3.8 三日龄转基因猪肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9 一百二十日龄转基因猪多不饱和脂肪酸含量的检测 |
| 2.3.9.1 一百二十日龄转基因猪肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9.2 一百二十日龄转基因猪脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.9.3 一百二十日龄转基因猪皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 2.3.10 转基因猪脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 fat2和fat1 共表达质粒的构建及在细胞中的表达和功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 质粒和细胞系 |
| 3.2.1.2 试剂及耗材 |
| 3.2.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 引物设计 |
| 3.2.2.2 p CAG-fat2-2A-fat1-NEO质粒的制备 |
| 3.2.2.3 p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP质粒的制备 |
| 3.2.2.4 共表达质粒转染PK15细胞 |
| 3.2.2.5 共表达质粒细胞转染后绿色荧光表达及RNA抽提 |
| 3.2.2.6 共表达质粒细胞转染后fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 3.2.2.7 共表达质粒转染后细胞中PUFAs含量的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 fat2和fat1 共表达质粒的构建 |
| 3.3.1.1 fat2-2A-fat1 共表达基因片段的构建 |
| 3.3.1.2 p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP质粒的构建 |
| 3.3.2 fat2和fat1 共表达质粒在猪细胞中的表达验证 |
| 3.3.2.1 fat1和fat2 双基因共表达质粒转染PK15 细胞后绿色荧光蛋白的表达 |
| 3.3.2.2 转染PK15 细胞后fat2-2A-fat1 基因的m RNA表达检测 |
| 3.3.3 fat2和fat1 共表达质粒在细胞中功能验证 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 共表达fat2和fat1 的转基因小鼠制备与检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 质粒和小鼠 |
| 4.2.1.2 试剂及耗材 |
| 4.2.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 引物设计 |
| 4.2.2.2 转基因鼠模型的制备 |
| 4.2.2.3 转基因小鼠的日常饲养与管理 |
| 4.2.2.4 转基因小鼠基因组DNA抽提 |
| 4.2.2.5 转基因小鼠组织样RNA的提取和反转录PCR |
| 4.2.2.6 小鼠体表组织绿色荧光蛋白表达检测 |
| 4.2.2.7 PCR鉴定转基因小鼠中fat2-2A-fat1 基因共表达 |
| 4.2.2.8 转基因小鼠的Southern Blot检测 |
| 4.2.2.9 转基因小鼠的实时荧光相对定量PCR检测转基因m RNA表达水平 |
| 4.2.2.10 转基因小鼠的肌肉、脂肪、皮肤多不饱和脂肪酸含量的测定 |
| 4.2.2.11 转基因小鼠脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因小鼠的制备 |
| 4.3.2 PCR鉴定F0代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.3 Southern blot检测F0 代转基因小鼠 |
| 4.3.4 转基因小鼠体表绿色荧光蛋白检测 |
| 4.3.5 F0 代转基因小鼠肌肉组织中fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 4.3.6 F0 代转基因小鼠的肌肉、脂肪、皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.1 F0 代各家系转基因小鼠肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.2 F0 代转基因小鼠脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.6.3 F0 代转基因小鼠皮肤组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.7 F0代转基因小鼠配种与扩繁 |
| 4.3.8 PCR与 Southern blot鉴定F1 代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.8.1 PCR鉴定F1代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.8.2 Southern blot检测F1 代转基因小鼠 |
| 4.3.9 F1 代转基因小鼠肌肉组织中fat2-2A-fat1 基因表达量的检测 |
| 4.3.10 F1 代转基因小鼠的肌肉、脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.10.1 F1 代转基因小鼠肌肉组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.10.2 F1 代转基因小鼠脂肪组织中PUFAs含量的检测 |
| 4.3.11 F1代转基因小鼠配种与扩繁 |
| 4.3.12 PCR检测鉴定F2代转基因阳性小鼠 |
| 4.3.13 转基因小鼠脂肪合成通路相关基因表达量的检测 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 全文讨论与结论 |
| 5.1 双基因表达方法的探讨 |
| 5.2 Fat1或fat2 单转基因与fat1和fat2 双转基因对动物体内多不饱和脂肪酸合成的影响 |
| 5.3 影响转基因动物的多不饱和脂肪酸含量的因素 |
| 5.4 提高动物的多不饱和脂肪酸含量对调控脂肪合成相关基因表达的影响 |
| 5.5 Fat1和fat2 基因的转入对动物生长发育及繁殖性能的影响 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:文献综述 |
| 1 多不饱和脂肪酸的分类及疾病防治 |
| 2 脂肪酸去饱和酶的研究进展 |
| 附录B 基因序列 |
| 1 Fat2序列 |
| 2 2A序列 |
| 3 Fat1序列 |
| 附录C 在读期间发表科研成果 |
（4）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（5）HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 引言参考文献 |
| 1 不同家系HSV-tk转基因小鼠GCV诱导肝损伤的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 2 应用HSV-tk小鼠研究HSC宫内移植治疗GCV诱导肝损伤 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 3 HSV-tk转基因小鼠肝癌发生的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录Ⅰ 肝癌与正常对照相比上调的信号通路 |
| 附录Ⅱ 骨髓干细胞修复肝损伤的机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术文章 |
（6）Hr调控毛发生长发育的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 毛囊结构和生长周期 |
| 1.2 毛囊的形态发生 |
| 1.3 毛囊生长周期的识别与判断标准 |
| 1.3.1 生长期 |
| 1.3.2 退行期 |
| 1.3.3 休止期 |
| 1.4 毛囊形态发生及生长周期中的信号调控 |
| 1.4.1 Wnt细胞信号通路 |
| 1.4.2 BMP细胞信号通路 |
| 1.4.3 Shh细胞信号通路 |
| 1.4.4 FGF细胞信号通路 |
| 1.4.5 Notch细胞信号通路 |
| 1.5 Hr与遗传学脱发 |
| 1.5.1 Hr基因和表达产物结构 |
| 1.5.2 Hr与毛发周期 |
| 1.5.3 Hr突变相关的脱发疾病 |
| 1.6 Gateway技术构建转基因小鼠 |
| 1.6.1 通过PCR技术将目的基因克隆到入门载体上 |
| 1.6.2 DNA线性化和提纯 |
| 1.6.3 DNA显微注射 |
| 1.6.4 新生鼠基因检测 |
| 1.7 Hr基因的研究背景 |
| 1.8 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 Hr转基因小鼠模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 利用重叠PCR扩增attB1-gene1-attB2 |
| 2.1.5 利用Gateway技术构建入门克隆pDown |
| 2.1.6 利用Gateway技术构建pUP-Promoter |
| 2.1.7 利用Gateway clone构建pTail- IRES/gene2 |
| 2.1.8 利用Gateway Technology构建最终表达载体 |
| 2.1.9 转基因小鼠的制作及鉴定 |
| 2.1.10 转基因小鼠交配策略 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 转基因小鼠的制作 |
| 2.2.2 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Hr在自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠中的作用研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 Hr突变对小鼠皮肤组织病理形态学的影响 |
| 3.1.3 Hr突变对小鼠皮肤组织超微结构的影响 |
| 3.1.4 Hr突变对小鼠皮肤组织无毛基因mRNA表达的影响 |
| 3.1.5 Hr突变对小鼠皮肤组织无毛蛋白表达的影响 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠表型观察 |
| 3.2.2 Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠皮肤组织学观察 |
| 3.2.3 Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠超微结构观察 |
| 3.2.4 Hr突变对无毛基因转录和翻译水平表达影响的研究 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠的基因表达谱比较研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 总RNA提取与cDNA制备 |
| 4.1.4 实时荧光定量PCR验证芯片结果 |
| 4.2 芯片结果 |
| 4.2.1 总RNA提取及质量监控 |
| 4.2.2 差异表达基因的筛选 |
| 4.2.3 GO分析 |
| 4.2.4 差异表达基因的Kegg通路分析 |
| 4.2.5 荧光定量PCR验证芯片结果的可靠性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 协调控毛发生长的分子机制分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 上游调控分子分析 |
| 5.1.2 Hr互作网络的构建及活性分析 |
| 5.1.3 Hr参与的信号通路活性分析 |
| 5.1.4 HR、BMP2、CASP14和β-catenin免疫组织化学染色 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Hr自发突变小鼠、基因敲除小鼠和转基因小鼠上游调节的激活或抑制分子和生物学功能 |
| 5.2.2 Hr基因的调控网络构建 |
| 5.2.3 差异表达基因对Wnt、BMP和Notch信号通路的影响 |
| 5.2.4 免疫组织化学染色结果及分析 |
| 5.3 讨论 |
| 总结 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 英文缩写一览表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间参与的科研及发表的学术论文 |
（7）猪转基因友好整合位点的筛选与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因技术的广泛应用 |
| 1.1.1 过表达研究目的基因的功能 |
| 1.1.2 转基因动物生物反应器 |
| 1.1.3 转基因遗传育种 |
| 1.1.4 基因治疗 |
| 1.1.5 疾病模型 |
| 1.2 转基因随机整合的问题 |
| 1.2.1 位置效应 |
| 1.2.2 插入突变 |
| 1.2.3 外源基因拷贝数不确定 |
| 1.3 定点整合技术 |
| 1.3.1 基因打靶技术 |
| 1.3.2 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9核酸酶 |
| 1.3.3 重组酶和整合酶 |
| 1.4 友好的外源基因整合位点 |
| 1.4.1 鉴定友好位点的原则 |
| 1.4.2 可能存在的位置 |
| 1.4.3 寻找友好整合位点的方法 |
| 1.4.4 整合位点的研究现状 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 细胞系与实验动物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验试剂及配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒提取 |
| 2.2.2 酶切、连接、转化 |
| 2.2.3 PCR |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 反转录 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 DNA提取 |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 Southern blotting |
| 2.2.10 DNA甲基化检测 |
| 2.2.11 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.12 冰冻切片 |
| 2.2.13 细胞复苏 |
| 2.2.14 细胞传代 |
| 2.2.15 细胞冻存 |
| 2.2.16 细胞转染 |
| 2.2.17 中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞的建立 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 外源基因候选整合位点的筛选 |
| 3.1.1 猪基因组中转录活跃区域的筛选 |
| 3.1.2 适合转基因整合的候选基因间隔区的选择 |
| 3.1.3 精确候选外源基因整合位点的确定 |
| 3.1.4 结果讨论与分析 |
| 3.2 候选整合位点友好性细胞水平上的功能验证 |
| 3.2.1 外源基因定点整合载体的构建 |
| 3.2.2 外源基因在候选位点实现定点整合 |
| 3.2.3 外源基因在候选位点上高效表达 |
| 3.2.4 外源基因在Pifs501位点上的整合未显着上调邻近基因的表达 |
| 3.2.5 候选位点Pifs501显示出开放的表观修饰状态 |
| 3.2.6 结果讨论与分析 |
| 3.3 候选位点友好性个体水平上的功能验证 |
| 3.3.1 转基因克隆猪的制备与新生猪定点整合的鉴定 |
| 3.3.2 外源基因在个体水平上的表达 |
| 3.3.3 个体水平上Pifs501位点邻近基因的表达不受影响 |
| 3.3.4 转基因猪个体健康可育 |
| 3.3.5 结果讨论与分析 |
| 3.4 候选位点在定点整合上应用 |
| 3.4.1 外源基因定点整合通用细胞系的构建 |
| 3.4.2 Follistatin替换载体的构建 |
| 3.4.3 Follistatin在Pifs501位点的成功定点整合 |
| 3.4.4 结果讨论与分析 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（8）猪MYOD/PPAR-γ2转基因鼠外源基因的插入位点效应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 转基因动物建系 |
| 3 外源基因定位的方法及研究进展 |
| 3.1 热不对称交错式PCR法 |
| 3.2 反向PCR法 |
| 3.3 荧光原位杂交法 |
| 3.4 连接介导PCR法 |
| 4 插入位点效应的研究进展 |
| 4.1 甲基化的检测方法及研究进展 |
| 4.1.1 限制性酶切PCR |
| 4.1.2 甲基化特异性PCR |
| 4.1.3 变性高效液相色谱法 |
| 4.1.4 亚硫酸盐测序PCR |
| 4.1.5 亚硫酸盐PCR-SSCP |
| 4.2 拷贝数的检测方法及研究进展 |
| 4.2.1 绝对定量PCR法 |
| 4.2.2 Southern Blot |
| 4.2.3 CGH芯片 |
| 4.2.4 高密度SNP芯片 |
| 4.3 其他插入位点效应及研究进展 |
| 5 研究的目的与意义 |
| 第二章 材料方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 载体和质粒 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 后代阳性转基因鼠的鉴定 |
| 2.1.1 小鼠基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 阳性鼠的鉴定 |
| 2.2 转基因鼠基因组外源基因拷贝数的鉴定 |
| 2.2.1 小鼠单拷贝基因重组质粒的检测 |
| 2.2.2 PCR扩增产物的检测 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.4 阳性克隆的检测及测序 |
| 2.2.5 将连接目的片段的pGL3-Basic的重组质粒小量提取 |
| 2.2.6 转基因鼠基因组内拷贝数的鉴定 |
| 2.3 转基因鼠目的基因在RNA水平表达情况的验证 |
| 2.3.1 转基因鼠不同组织RNA的提取 |
| 2.3.2 RNA的反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR分析MyoD转基因鼠不同组织中MyoD基因的表达情况 |
| 2.4 转基因鼠目的基因在蛋白水平表达情况的验证 |
| 2.4.1 转基因鼠与野生型鼠肌肉组织蛋白的提取 |
| 2.4.2 Western blot检测目的蛋白质的表达量 |
| 2.5 转基因鼠肌肉组织甘油三酯的测定 |
| 2.6 外源基因定位 |
| 2.6.1 热不对称交错式PCR |
| 2.6.2 PCR扩增产物的检测 |
| 2.6.3 PCR产物的回收及纯化 |
| 2.6.4 胶回收产物连接T载体 |
| 2.6.5 连接产物的转化 |
| 2.6.6 阳性克隆的检测及测序 |
| 2.7 亚硫酸盐PCR-SSCP |
| 2.7.1 外源基因CpG岛分析 |
| 2.7.2 基因组DNA亚硫酸盐处理 |
| 2.7.3 亚硫酸盐处理产物PCR扩增 |
| 2.7.4 PCR扩增产物的检测 |
| 2.7.5 PCR产物的回收及纯化 |
| 2.7.6 胶回收产物连接T载体 |
| 2.7.7 连接产物的转化 |
| 2.7.8 阳性克隆的检测及测序 |
| 2.7.9 测序结果SSCP检测 |
| 2.8 统计学分析 |
| 第三章 研究结果与分析 |
| 1 PPAR-γ2 阳性转基因鼠的检测 |
| 2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定 |
| 3 肌肉组织中外源基因PPAR-γ2 的表达情况 |
| 4 肌肉组织内甘油三酯的测定 |
| 5 TAIL-PCR定位外源基因PPAR-γ2 的结果 |
| 6 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应 |
| 6.1 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因拷贝数的判定 |
| 6.2 PPAR-γ2 转基因鼠中外源基因其他的插入位点效应 |
| 7 MyoD阳性转基因鼠的检测 |
| 8 MyoD转基因鼠中外源基因稳定遗传的判定 |
| 9 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的表达情况 |
| 9.1 MyoD转基因鼠中外源基因MyoD的组织表达谱分析 |
| 9.2 肌肉组织中外源基因MyoD的表达情况 |
| 10 MyoD转基因鼠中外源基因存在的插入位点效应 |
| 10.1 MyoD转基因鼠外源基因拷贝数的判定 |
| 10.2 MyoD转基因鼠中外源基因启动子区域的CpG岛甲基化的鉴定 |
| 10.3 MyoD转基因鼠外源基因其他插入位点效应的鉴定 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 1 本试验取得的结果 |
| 2 后期研究设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达（论文参考文献）
- [1]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [2]毛囊皮质部特异表达绵羊KAP13-1转基因小鼠的鉴定[D]. 吴可佳. 华中农业大学, 2019(02)
- [3]fat1和fat2融合表达转基因猪与共表达转基因小鼠的制备及研究[D]. 汤飞. 华南农业大学, 2019(02)
- [4]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)
- [5]HSV-tk小鼠肝损伤修复及其肝癌发生机理研究[D]. 巩芷娟. 上海交通大学, 2018(05)
- [6]Hr调控毛发生长发育的分子机制研究[D]. 朱奎成. 河南师范大学, 2017(09)
- [7]猪转基因友好整合位点的筛选与应用[D]. 马林媛. 中国农业大学, 2017(05)
- [8]猪MYOD/PPAR-γ2转基因鼠外源基因的插入位点效应的研究[D]. 陈冉. 华中农业大学, 2016(02)
- [9]人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究[J]. 刘秉乾,武玉东,魏金星,李沛寰,李光三,张立霞,李胜芝,张志宏,马腾骧. 中华实验外科杂志, 2009(06)
- [10]联合转移人HT和DAF基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用[J]. 刘秉乾,王广有,李胜芝,张志宏,李光三,张立霞,马腾骧. 中华器官移植杂志, 2007(09)