一、严重腹腔感染大鼠JAK/STAT通路活化与多器官功能损害的关系（论文文献综述）
张月竹[1]（2021）在《DEHP对大鼠肝脏脂质代谢的影响及其调控机制》文中研究指明邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）是一种环境内分泌干扰物,作为增塑剂被广泛应用于医疗器械、儿童玩具和食品包装材料等塑料制品中。DEHP被摄入机体后,可以在肝脏和肠道中被消化酶代谢成以邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP）为主的水解产物,并对机体产生毒性作用。近年来研究发现DEHP/MEHP可以影响机体脂代谢过程,引起肥胖。肝脏作为调节机体脂代谢最重要的器官,DEHP暴露可以造成肝脏脂代谢紊乱,促进肝脏中的脂质合成和蓄积,但其作用机制尚不清楚。本研究通过给予大鼠DEHP染毒、BRL-3A大鼠肝细胞MEHP染毒,分析DEHP暴露对大鼠肝脏脂代谢的影响,探讨脂代谢相关信号通路和脂代谢关键基因在DEHP暴露影响大鼠肝脏和BRL-3A大鼠肝细胞脂质代谢中的作用和机制,为防治环境内分泌干扰物所致脂代谢相关疾病提供理论依据。第一部分DEHP对大鼠肝脏脂代谢水平的影响以及炎症在其中的作用目的:明确DEHP对大鼠肝脏和MEHP对BRL-3A大鼠肝细胞脂代谢的影响,探讨脂代谢关键因子和炎症在DEHP暴露影响大鼠肝细胞脂代谢中的作用。方法:1.体内实验选取鼠龄21天的SPF级Wistar大鼠80只,雌雄各40只,随机分为4组,即对照组、5 mg/kg/d DEHP组、50 mg/kg/d DEHP组和500 mg/kg/d DEHP组。每组20只,雌雄各半。每日清晨灌胃染毒,连续染毒8周,每日观察大鼠状态并记录体重。末次染毒24 h后,对大鼠进行心脏采血并分离血清,取肝脏组织。利用全自动血清生化分析仪测定大鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）的含量;利用ELISA法测定大鼠肝组织中TG和TC含量;HE染色观察大鼠肝组织病理学改变;Real-Time RCR法检测大鼠肝脏中脂代谢关键基因PPARγ、Fasn、Acox1、a P2和Pdk4 m RNA表达水平;免疫组化法和western blot法检测大鼠肝脏中PPARγ、Fasn、Acox1、Pdk4和a P2的蛋白表达水平。采用IBM SPSS 24.0统计软件进行数据处理与分析。采用单因素方差分析比较DEHP暴露后各组间大鼠脂质、肝脏脂代谢关键基因的m RNA和蛋白水平的差异,组间两两比较采用LSD检验,检验水准设定为α=0.05。2.体外实验给予BRL-3A细胞不同剂量MEHP暴露24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;并根据CCK-8实验结果确定染毒剂量,实验分组为:空白对照组（Con）、溶剂对照组（VCon）、10μM MEHP组、50μM MEHP组、100μM MEHP组和200μM MEHP组。ELISA法测定BRL-3A大鼠肝细胞中脂质TG和TC含量,以及细胞培养液中炎症因子IL-8和IL-1β水平;Real-Time RCR法检测BRL-3A细胞中脂代谢关键基因PPARγ、Fasn、Acox1、a P2和Pdk4 m RNA表达水平;western blot法检测BRL-3A细胞中PPARγ、Fasn、Acox1、Pdk4、a P2和PPARα蛋白表达水平。使用100μg/m L Aspirin对BRL-3A细胞进行抗炎处理后的实验分组为:空白对照组（Con）、溶剂对照组（VCon）、Aspirin组、100μM MEHP组和100μM MEHP暴露的抗炎组（MEHP+Aspirin）,抗炎后细胞TG、TC、IL-1β和IL-8水平用ELISA法检测;抗炎后PPARα蛋白水平用western blot法检测。采用单因素方差分析比较各组间脂质、脂代谢关键基因的m RNA、蛋白水平以及细胞培养液中炎症因子水平的差异,组间两两比较采用LSD检验,检验水准设定为α=0.05。结果:1.体内实验（1）500 mg/kg/d DEHP组大鼠的体重从暴露第3周起显着高于对照组（P<0.05）。（2）500 mg/kg/d DEHP组大鼠血清中的TC水平显着高于对照组和5mg/kg/d DEHP组（P<0.05）,500 mg/kg/d DEHP组大鼠血清中的HDL水平显着高于其他组（P<0.05）。（3）DEHP暴露后,大鼠肝组织出现肝细胞水肿、细胞质松散和肝细胞索紊乱等异常改变,500 mg/kg/d DEHP组大鼠的肝组织中肝细胞界限完全模糊,肝细胞出现了少量的脂肪变性,肝损伤明显。（4）DEHP暴露大鼠肝脏Fasn、Acox1和PPARγm RNA表达水平随着DEHP染毒剂量的增加逐渐升高（P<0.05）;500 mg/kg/d DEHP组a P2 m RNA表达水平明显高于其他三组（P<0.05）。（5）500 mg/kg/d DEHP组的Fasn蛋白水平显着高于其他组（P<0.05）;所有DEHP组大鼠肝脏Pdk4蛋白水平均高于对照组（P<0.05）;500 mg/kg/d DEHP组Acox1蛋白水平显着高于对照组和50 mg/kg/d组（P<0.05）;5 mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP组a P2蛋白水平显着高于对照组（P<0.05）。2.体外实验（1）MEHP染毒后,200μM MEHP组BRL-3A细胞内TG水平显着高于对照组和10μM MEHP组（P<0.05）,100μM MEHP组TG水平高于10μM MEHP组（P<0.05）;200μM MEHP组TC水平与Con组相比显着升高（P<0.05）。（2）BRL-3A细胞内Fasn、Pdk4和a P2 m RNA表达水平随染毒剂量的升高逐渐增加（P<0.05）;100μM MEHP组PPARγm RNA表达较对照组、10μM和50μM MEHP组高,200μM MEHP组PPARγ水平最高（P<0.05）;200μM MEHP组Acox1 m RNA的表达水平在所有组中最高（P<0.05）。（3）100μM MEHP组BRL-3A细胞中Fasn和Pdk4蛋白水平显着高于对照组、10μM和50μM MEHP组（P<0.05）,100μM MEHP组Acox1蛋白水平与对照组、10μM和50μM MEHP组相比明显升高（P<0.05）;200μM MEHP组Fasn、PPARγ、Acox1和a P2蛋白表达水平高于其他组（P<0.05）。（4）与对照组、10μM和50μM MEHP组相比,100μM和200μM MEHP组BRL-3A细胞培养液中的IL-8水平显着升高（P<0.05）;50μM MEHP组IL-1β水平显着高于对照组,100μM MEHP组IL-1β水平高于对照组、10μM和50μM MEHP组,200μM MEHP组IL-1β水平高于其他剂量组（P<0.05）。（5）BRL-3A细胞内PPARα蛋白表达水平随染毒剂量升高逐渐下降,50μM和100μM MEHP组PPARα蛋白水平显着低于对照组（P<0.05）。（6）100μg/m L Aspirin处理细胞后,MEHP组IL-8和IL-1β水平显着高于对照组和Aspirin组（P<0.05）;MEHP+Aspirin组IL-8和IL-1β水平显着低于MEHP组（P<0.05）。（7）MEHP组PPARα蛋白表达显着降低（P<0.05）;MEHP+Aspirin组PPARα蛋白表达水平低于对照组和Aspirin组（P<0.05）。（8）MEHP组TG和TC水平显着高于对照组和Aspirin组（P<0.05）;MEHP+Aspirin组TG水平高于对照组,低于MEHP组（P<0.05）;MEHP+Aspirin组TC水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.高剂量DEHP暴露可以导致大鼠体重异常增加,引起肝组织病理学改变。2.DEHP暴露可以促进大鼠肝脏和BRL-3A细胞中的脂质合成和蓄积。3.MEHP可以引起BRL-3A细胞中PPARα蛋白表达水平下降,分泌IL-8和IL-1β水平升高。4.炎症可以通过抑制PPARα蛋白表达促进BRL-3A细胞脂质合成和蓄积。5.DEHP暴露能够上调PPARγ、Fasn、Pdk4、Acox1和a P2基因m RNA和蛋白的表达影响大鼠肝细胞脂质代谢。第二部分JAK-STAT信号通路在DEHP影响大鼠肝脏脂质代谢中的作用及其机制目的:明确DEHP对大鼠肝脏和MEHP对BRL-3A大鼠肝细胞内JAK-STAT信号通路表达的影响,探讨JAK-STAT信号通路在DEHP影响大鼠肝细胞脂质代谢中的作用及其机制。方法:1.体内实验实验分组与DEHP染毒同第一部分。Real-Time PCR法检测大鼠肝脏中JAK2、STAT5A、STAT5B、TYK2和STAT1 m RNA表达水平;western blot法检测大鼠肝脏JAK2、STAT5A、STAT5B、P-STAT5A、P-STAT5B、TYK2、STAT1、P-TYK2、和P-STAT1蛋白表达水平。采用Pearson相关分析法分析大鼠肝脏中STAT5和STAT1蛋白表达水平与脂代谢关键基因蛋白表达水平的关联。检验水准为α=0.05。2.体外实验BRL-3A大鼠肝细胞培养、实验分组与MEHP染毒同第一部分。Real-Time PCR法检测正常BRL-3A细胞中JAK2、STAT5A和STAT5B m RNA表达水平;western blot法检测正常BRL-3A细胞中JAK2、STAT5A、STAT5B、P-STAT5A和P-STAT5B蛋白表达水平。采用STAT5A过表达慢病毒（Lv/sh-STAT5A）和空白载体病毒（Lv/sh-NC）分别感染BRL-3A大鼠肝细胞,构建稳定转染BRL-3A大鼠肝细胞STAT5A基因过表达细胞株。采用Real-Time PCR法和western blot法检测细胞中STAT5A的过表达效率。慢病毒转染后的实验分组为:亲本对照组（Parental）、空白载体感染组（Lv/sh-NC）、过表达STAT5A感染组（Lv/sh-STAT5A）、100μM MEHP暴露的空白载体感染组（Lv/sh-NC+MEHP）和100μM MEHP暴露的过表达STAT5A感染组（Lv/sh-STAT5A+MEHP）。ELISA法检测慢病毒感染后细胞TG和TC水平;western blot法检测慢病毒感染后细胞内Fasn、Acox1和a P2蛋白表达水平。结果:1.体内实验（1）与对照组相比,DEHP暴露后大鼠肝脏JAK2 m RNA表达水平降低,其中500 mg/kg/d DEHP组的JAK2 m RNA水平最低（P<0.05）。50 mg/kg/d和500mg/kg/d DEHP组STAT5B m RNA的表达水平显着升高（P<0.05）。（2）500 mg/kg/d DEHP组JAK2蛋白水平与其他组相比明显降低（P<0.05）。500 mg/kg/d DEHP组P-STAT5A蛋白表达水平与其他组相比升高（P<0.05）。5mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP组STAT5B蛋白水平高于对照组（P<0.05）。（3）500 mg/kg/d DEHP组TYK2 m RNA表达水平显着高于其他组（P<0.05）。与对照组相比,所有剂量DEHP组STAT1 m RNA表达水平显着升高（P<0.05）。（4）5 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP组TYK2蛋白表达水平与对照组相比明显升高（P<0.05）。5 mg/kg/d和50 mg/kg/d DEHP组P-STAT1蛋白表达水平显着高于对照组和500 mg/kg/d DEHP组（P<0.05）。（5）DEHP暴露后,大鼠肝脏STAT5A蛋白水平与a P2蛋白水平呈显着正相关,P-STAT5A蛋白表达水平与Acox1和Fasn蛋白表达水平也呈显着正相关。2.体外实验（1）100μM和200μM MEHP组JAK2 m RNA水平低于其他三组（P<0.05）;100μM MEHP组STAT5A m RNA表达水平显着低于对照组和10μM MEHP组（P<0.05）,200μM MEHP组STAT5A水平低于其他剂量组（P<0.05）;MEHP染毒组STAT5B水平明显低于对照组（P<0.05）。（2）MEHP染毒组JAK2、P-JAK2、STAT5A、P-STAT5A、STAT5B和PSTAT5B蛋白表达水平与对照组相比明显降低（P<0.05）;100μM MEHP组BRL-3A细胞中STAT5A、P-STAT5A、STAT5B和P-STAT5B和蛋白水平显着低于10μM MEHP组。（3）STAT5A过表达慢病毒（Lv/sh-STAT5A）和空白载体病毒（Lv/sh-NC）成功感染BRL-3A大鼠肝细胞;Lv/sh-NC组与Parental组相比,BRL-3A细胞内STAT5A基因m RNA和蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）,而Lv/sh-STAT5A组STAT5A基因m RNA和蛋白水平显着升高（P<0.05）。（4）Lv/sh-NC组TG和TC水平与Parental组相比无差异（P>0.05）;Lv/shSTAT5A组BRL-3A细胞与Parental、Lv/sh-NC组相比TG和TC水平显着降低（P<0.05）;Lv/sh-NC+MEHP组TG、TC水平高于Parental、Lv/sh-NC和Lv/shSTAT5A组（P<0.05）;Lv/sh-STAT5A+MEHP组TG和TC水平显着低于Lv/shNC+MEHP组（P<0.05）。（5）与Parental组相比,Lv/sh-NC组Fasn、Acox1和a P2蛋白水平均无明显改变（P>0.05）;Lv/sh-STAT5A组Fasn和a P2蛋白水平显着低于Parental组和Lv/sh-NC组（P<0.05）;Lv/sh-NC+MEHP组Fasn、Acox1和a P2蛋白表达高于Parental组、Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT5A组（P<0.05）;Lv/sh-STAT5A+MEHP组Fasn、Acox1和a P2蛋白表达水平均显着低于Lv/sh-NC+MEHP组（P<0.05）。结论:1.DEHP可以影响大鼠肝脏TYK2-STAT1信号通路基因m RNA和蛋白表达。2.DEHP/MEHP可以影响大鼠肝脏和BRL-3A大鼠肝细胞中JAK2-STAT5信号通路基因m RNA和蛋白的表达。3.DEHP暴露后大鼠肝脏中STAT5A蛋白水平与a P2蛋白水平,P-STAT5A蛋白水平与Fasn、Acox1蛋白水平显着相关。4.STAT5A能够抑制BRL-3A大鼠肝细胞中的脂质蓄积。5.STAT5A可以通过调节脂代谢关键酶Fasn、Acox1和a P2的表达在MEHP所致大鼠肝细胞脂代谢紊乱中发挥作用。第三部分Notch信号通路在DEHP影响大鼠肝脏脂质代谢中的作用及其机制目的:明确DEHP对大鼠肝脏和MEHP对BRL-3A大鼠肝细胞内Notch信号通路表达的影响,探讨Notch信号通路在MEHP影响大鼠肝细胞脂质代谢中的作用及其机制。方法:1.体内实验实验分组与DEHP染毒同第一部分。Real-Time PCR法检测大鼠肝脏中Notch信号通路Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jag1、Jag2、Dll1和Dll4 m RNA表达水平;western blot法检测大鼠肝脏中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jag1、Jag2、Dll1和Dll4蛋白表达水平。采用Pearson相关分析法分析大鼠肝脏中Notch受体蛋白表达水平与脂质水平的相关性,检验水准设定为α=0.05。2.体外实验BRL-3A大鼠肝细胞培养、实验分组与MEHP染毒同第一部分。Real-Time PCR法检测正常BRL-3A细胞中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jag1、Jag2、Dll1和Dll4 m RNA表达水平;western blot法检测正常BRL-3A细胞中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jag1、Jag2、Dll1和Dll4蛋白表达水平;免疫荧光法检测正常BRL-3A细胞内Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的蛋白表达情况。使用50μM DAPT抑制BRL-3A细胞中Notch信号通路的表达,采用western blot法检测细胞中Notch信号通路下游靶基因Hes1的蛋白表达水平确定通路抑制效率。Notch通路抑制后实验分组为:空白对照组（Con）、溶剂对照组（VCon）、抑制剂组（DAPT）、100μM MEHP组（MEHP）和MEHP暴露的抑制剂组（MEHP+DAPT）。western blot法检测通路抑制后细胞内Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和PPARα蛋白表达水平,ELISA法检测TG、TC、IL-8和IL-1β水平。结果:1.体内实验（1）大鼠肝脏中Notch信号通路配体Jag1、Dll1和Dll4 m RNA表达水平随染毒剂量增加逐渐升高;500 mg/kg/d DEHP组Jag2表达水平高于其他三组（P<0.05）;与对照组相比,Notch1 m RNA表达水平显着升高,500 mg/kg/d DEHP组大鼠肝脏中Notch1水平最高（P<0.05）;50 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP组的Notch2水平显着高于对照组和5 mg/kg/d DEHP组（P<0.05）;Notch3水平随DEHP暴露剂量的增加而逐渐升高（P<0.05）;与对照组和5 mg/kg/d DEHP组相比,50 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP组的Notch4 m RNA水平升高（P<0.05）。（2）500 mg/kg/d DEHP组大鼠肝脏中Jag1和Dll1蛋白表达水平显着高于其他三组（P<0.05）;所有DEHP组Jag2蛋白水平高于对照组（P<0.05）;DEHP暴露后,Dll4蛋白表达水平随染毒剂量增加逐渐升高（P<0.05）;与对照组比较,所有DEHP组Notch1蛋白水平明显升高,其中500 mg/kg/d DEHP组Notch1蛋白水平最高（P<0.05）;与对照组相比,所有DEHP染毒组的Notch2、Notch3和Notch4蛋白表达水平均升高（P<0.05）。（3）DEHP暴露后,大鼠肝脏中Notch1、Notch2、Notch3和Notch4蛋白表达水平均与肝脏中TG水平呈显着正相关关系（P<0.05）。2.体外实验（1）MEHP染毒后BRL-3A细胞中Jag1、Jag2、Dll1和Dll4 m RNA表达水平显着升高（P<0.05）;与对照组比较,所有MEHP组BRL-3A细胞中的Notch1、Notch2、Notch3和Notch4 m RNA表达水平均显着升高,且100μM和200μM MEHP组BRL-3A细胞中Notch受体基因m RNA表达水平最高（P<0.05）。（2）100μM MEHP组BRL-3A细胞内Jag1和Jag2蛋白水平高于其他剂量组（P<0.05）;与对照组相比,10μM和100μM MEHP组Dll1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,100μM MEHP组Dll1蛋白水平最高（P<0.05）;从50μM MEHP组开始,Dll4蛋白表达水平随MEHP剂量增加而逐渐升高（P<0.05）;100μM MEHP组Notch1蛋白表达水平最高（P<0.05）;100μM和200μM MEHP组Notch2蛋白表达水平显着高于其他组（P<0.05）;200μM MEHP组Notch3蛋白表达水平明显高于其他剂量组（P<0.05）;100μM MEHP组Notch4蛋白表达水平显着高于其他组（P<0.05）。（3）四种Notch受体均在BRL-3A细胞中表达,其中Notch1蛋白表达水平最高,Notch1和Notch2蛋白水平高于Notch3和Notch4（P<0.05）;MEHP染毒后,细胞中所有Notch受体蛋白水平均高于相应对照组,Notch1蛋白水平最高,Notch1和Notch2蛋白水平高于Notch3和Notch4蛋白表达水平（P<0.05）。（4）使用50μM DAPT抑制BRL-3A细胞内Notch信号通路后,DAPT组Notch1、Notch2、Notch3和Notch4蛋白水平低于对照组（P<0.05）;MEHP组Notch1、Notch2、Notch3和Notch4蛋白表达水平高于对照组和DAPT组（P<0.05）;MEHP+DAPT组Notch1和Notch2蛋白水显着低于MEHP组（P<0.05）。（5）DAPT组细胞培养液中IL-8和IL-1β水平与对照组相比无改变（P>0.05）;MEHP组IL-8和IL-1β水平高于对照和DAPT组（P<0.05）;MEHP+DAPT组IL-8和IL-1β水平低于MEHP组（P<0.05）。（6）与对照组相比,DAPT组细胞PPARα蛋白表达水平呈上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;MEHP组PPARα蛋白水平显着低于对照组和DAPT组（P<0.05）;MEHP+DAPT组PPARα蛋白表达水平高于MEHP组（P<0.05）。（7）DAPT组细胞内TG和TC水平与对照组相比显着降低（P<0.05）;MEHP组TG和TC水平显着高于对照组和DAPT组（P<0.05）;MEHP+DAPT组TG和TC水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.DEHP可以影响大鼠肝脏中Notch信号通路基因m RNA和蛋白的表达。2.DEHP暴露后大鼠肝脏中Notch受体蛋白表达水平与TG水平显着相关。3.Notch信号通路激活能够促进BRL-3A大鼠肝细胞中的脂质蓄积。4.Notch信号通路可以通过引起炎症在MEHP所致大鼠肝细胞脂代谢紊乱中发挥作用。
陈吉英[2]（2021）在《CTRP9介导的巨噬细胞极化与败血症及动脉粥样硬化关系的研究》文中指出研究背景败血症是一种危及全身多器官多系统的严重炎症疾病,可由全身炎症反应综合征（SIRS）迅速进展为全身多器官功能衰竭,甚至引起败血症休克。败血症是世界范围内需要关注的健康问题,是重症患者死亡的主要原因之一。重症监护室的总费用中有超过45%用于治疗这种感染性疾病,给全球经济带来沉重负担。因此,了解其发病机制,提早诊断并进行干预是降低死亡率、改善患者预后最有效的方式。在败血症发病机制中,炎症因子扮演着重要的角色,机体感染细菌或者病毒后启动全身免疫系统,免疫细胞释放大量炎症因子,对机体造成炎性损伤。另外在毒素作用下体内生成一氧化氮合酶（NOS）,其中诱导型一氧化氮合酶（iNOS也叫NOS2）发挥着重要的作用,因为iNOS在生理状态下是不表达的,只有在一些致炎因子如LPS等的诱导下才会表达,一旦表达就会消化底物释放大量一氧化氮（NO）,直至底物耗尽。有证据支持血管扩张剂NO在败血症休克中的重要作用。NO虽然具有舒张血管的作用,但是大量的NO持续作用机体,尤其是血管,则会导致血管反应性降低,从而降低血压,持续难以逆转的低血压使组织器官灌注量下降,继而组织缺氧,最终引起休克。包括巨噬细胞在内的先天免疫细胞的深度活化在败血症的免疫发病机理中起着非常重要的作用。巨噬细胞是先天免疫系统的前哨细胞,其位置分布广泛,从外周血到各种靶器官,包括肺、肝、脑、肾、皮肤、睾丸、血管内皮等。NOS2在巨噬细胞中的表达主要受细胞因子和微生物产物的控制,主要是通过转录诱导。人NOS2最容易在患有感染或炎性疾病的患者的单核细胞或巨噬细胞中观察到。因此,败血症中巨噬细胞细胞的激活或调节失调可直接影响败血症的结果。补体Clq/瘤坏死因子相关蛋白9（CTRP9）是一种脂肪因子,主要在脂肪组织和心肌组织高表达,所以在心血管疾病,如缺血再灌注疾病和脂质代谢相关疾病中发挥着重要的作用;此外有研究显示CTRP9也在炎症疾病中发挥作用,降低氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症因子水平。但是CTRP9是否可以诱导iNOS的表达及CTRP9在败血症中是否发挥作用尚不清楚。因此,在本实验中我们选择巨噬细胞作为研究对象,探究CTRP9是否可以诱导巨噬细胞iNOS的表达并探索其机制以及敲除CTRP9后对LPS诱导小鼠心肺组织iNOS表达的影响。1.研究目的（1）探究CTRP9对巨噬细胞iNOS表达的影响是否具有时间依赖性和浓度依赖性;（2）明确CTRP9和LPS对巨噬细胞iNOS表达的影响;（3）探究敲除CTRP9后对LPS诱导的败血症小鼠心肺组织iNOS表达的影响;（4）阐明CTRP9对巨噬细胞表达iNOS的分子机制。2.研究方法（1）细胞培养:①小鼠源Raw264.7细胞按照要求进行复苏、传代和培养;②小鼠腹腔巨噬细胞:C57BL/6J小鼠腹腔注射无菌淀粉72h后,灌洗腹腔获取细胞并培养;（2）小鼠腹腔巨噬细胞经不同浓度CTRP9干预后,CCK8测细胞活力;（3）小鼠腹腔巨噬细胞,CTRP9按照浓度梯度干预后,提取细胞蛋白和RNA从蛋白水平和基因水平分别检测iNOS的表达,荧光显微镜观察iNOS的荧光强度;（4）小鼠腹腔巨噬细胞和Raw264.7细胞培养后,CTRP9按照时间梯度干预后,提取细胞蛋白和RNA从蛋白水平和基因水平分别检测iNOS的表达,荧光显微镜观察iNOS的荧光强度;（5）评估LPS和CTRP9对巨噬细胞iNOS表达的影响:实验分为四个组,分别是对照组,LPS组,CTRP9组,LPS+CTRP9组;刺激后通过western blot和RT-PCR检测iNOS的表达;（6）蛋白酶K实验:为了明确CTRP9是否有LPS的污染,将CTRP9重组蛋白和蛋白酶K同时刺激细胞,然后检测iNOS的表达;（7）LPS诱导小鼠败血症模型:将野生型和CTRP9-/-小鼠分别注射生理盐水和LPS,取材后观察小鼠心肺组织iNOS的表达及NO的含量;（8）JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平:巨噬细胞经CTRP9刺激后,western blot 检测 JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 表达情况;加入 JAK2 抑制剂 VX509 之后,检测 JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3、iNOS 的表达水平;（9）进行统计分析。3.研究结果（1）CCK8结果显示,不同浓度CTRP9未影响细胞活力;（2）经不同浓度CTRP9刺激后,与对照组相比,巨噬细胞表达iNOS呈递增趋势;（3）经CTRP9（1μg/ml）刺激不同时间后,与对照组相比,巨噬细胞表达iNOS呈递增趋势;（4）LPS和CTRP9共同刺激巨噬细胞24h后,iNOS的表达高于LPS单独刺激和CTRP9单独刺激。另外,蛋白酶K实验显示:经蛋白酶K抑制后的CTRP9,不能诱导巨噬细胞iNOS的表达;（5）腹腔注射LPS可以上调WT和CTRP9-/-小鼠组织iNOS和NO的水平,但敲除CTRP9则可以改善iNOS和NO的上调水平;（6）CTRP9和LPS都可以上调JAK2和STAT3的磷酸化水平;（7）JAK抑制剂VX509可以明显抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平并下调CTRP9诱导的巨噬细胞iNOS表达。4.研究结论（1）CTRP9以浓度和时间依赖性性方式促进iNOS的表达;（2）CTRP9和LPS协同促进腹腔巨噬细胞表达iNOS增加;（3）敲除CTRP9基因后可以降低LPS诱导的败血症小鼠心脏和肺组织iNOS表达水平;（4）CTRP9通过JAK2/STAT3途径促进巨噬细胞iNOS的表达。研究背景当今世界,在导致各种疾病的发病率和死亡率居于首位的心血管疾病中,动脉粥样硬化（AS）是最常见的疾病,病变特点是来自血液的脂质进入动脉管壁,沉积于内膜,形成粥样的斑块,使动脉壁变厚变硬。其中,“内皮损伤反应学说”显示巨噬细胞和平滑肌细胞（VSMCs）在动脉粥样的发生和发展过程中扮演关键的角色。研宄表明,巨噬细胞具有很强的异质性和可塑性,根据体内复杂的环境中发挥独特的甚至截然不同的类型和功能。因此,从功能以及状态的角度将巨噬细胞分为两个大类:M1和M2型巨噬细胞。简述如下:M1即经典活化的巨噬细胞,特异性表达CD86、iNOS、分泌TNF-a、IL-6等炎性因子;主要参与体内的促炎反应,在机体抵御外界细菌和病毒入侵的过程中发挥重要作用;M2即替代性活化的巨噬细胞,特异性表达CD206、ARG-1、分泌IL-10;在体内与组织修复、寄生虫感染、组织纤维化、肿瘤疾病发展及抗炎反应有密切关系;在动脉粥样硬化斑块的不同时期、不同部位存在两种分型的巨噬细胞。斑块内M1型巨噬细胞居多意味着斑块处于进展期,稳定性下降;而M2型巨噬细胞占主导地位时则可以促进组织修复,斑块不易破裂。VSMCs的增殖和凋亡在斑块形成与发展过程中起着重要的作用。生理状态下,VSMCs增殖和凋亡之间保持着动态平衡,但是在许多的病理状态或者受周围环境刺激的影响其增殖和凋亡状态发生失衡,则会引起斑块的一系列的变化。在斑块中,VSMCs增殖受PDGF和ANG-II影响,同时在巨噬细胞和内皮细胞的作用下其增殖和迁移也会受到影响;巨噬细胞增多会引起VSMCs的迁移和在内膜的增殖。另外,VSMCs被细胞外基质（ECM）包裹,VSMCs在一些促炎因子如TNF-a、IL-lp作用下通过MAPK信号通路分泌ICAM-1、VCAM-1、MMP9等,其中MMP可以降解ECM各种蛋白成分,影响ECM稳态。因此,观察巨噬细胞对VSMCs的影响对于探宂AS斑块的稳定性具有重要意义。补体Clq/瘤坏死因子相关蛋白9（CTRP9）属于CTRPs家族成员中的一员。许多研宄证明CTRP9在脂肪代谢、糖代谢、心肌缺血再灌注（M/I）、调节血管内皮功能等方面具有重要作用。但是,目前CTRP9在AS疾病的研宄还处于初级阶段,需要进一步的研究以探究其在CVD中的作用及机制。综上所述,为阐明CTRP9对巨楼细胞表型的影响及其分子机制在AS中的作用,我们体外培养巨噬细胞,CTRP9干预,体内建立ApoE-/-小鼠和ApoE-/-CTRP9-/-小鼠斑块模型,观察CTRP9对巨噬细胞表型的影响,对相关的科学问题进行研宄。1.研究目的（1）探究并明确CTRP9对巨噬细胞表型的影响;（2）建立巨噬细胞和VSMCs共培养体系:观察经CTRP9干预后的巨噬细胞对VSMCs凋亡及増殖的影响;（3）探宄CTRP9促进巨噬细胞表型转化的具体机制。2.研究方法（1）腹腔来源巨噬细胞的提取和培养:C57BL/6J小鼠腹腔注射无菌淀粉72h后,提取细胞并培养;（2）THP-1细胞培养:1640培养基,5%C〇2,37°C培养箱培养;（3）检测细胞表型:Western blot和RT-PCR检测M1和M2表型细胞标志物的表达情况;免疫荧光显微镜观察CD86和CD206的荧光强度;流式细胞技术,观察M1（F4/80+CDllb+CD86+CD206-）和M2（F4/80+CDllb+CD8-CD206+）巨噬细胞的比例;（4）在LPS和CTRP9刺激细胞后,检测M1和M2表型细胞标志物的表达情况;免疫荧光显微镜观察CD86和CD206的荧光强度;流式细胞术检测M1和M2巨噬细胞的比例;（5）巨噬细胞在IL4和CTRP9刺激后,检测同前述;（6）建立ApoE-/-小鼠和ApoE-/-CTRP9-/-小鼠斑块模型,取材后进行册、油红0、Masson染色及免疫荧光染色,观察斑块大小,巨噬细胞表型;（7）建立巨噬细胞和VSMCs共培养体系:利用Transwell小室将巨噬细胞接种在上室,VSMCs接种在下室,经CTRP9干预后通过TUNEL染色、westemblot检测VSMCs的凋亡;（8）建立巨噬细胞和VSMCs共培养体系:利用Transwell小室将巨噬细胞接种在上室,VSMCs接种在下室,经CTRP9干预后通过EdU染色、western blot检测VSMCs的增殖;（9）在巨噬细胞和VSMCs共培养体系中,经CTRP9干预后,分别提取巨噬细胞和VSMCs的蛋白检测MMP2和MMP9的表达;（10）检测MAPK通路中相关蛋白的表达水平:CTRP9刺激后western blot检测P-JNK、JNK、P-ERK、ERK、P-P38、P38的水平变化;抑制MAPK后,检测M1巨噬细胞相关指标变化;（11）应用AdipoRlsi-RNA降低巨噬细胞AdipoRl水平,然后经CTRP9干预,再次检测JNK蛋白的表达及表型相关指标的表达情况;（12）统计学分析。3.研究结果（1）小鼠腹腔巨噬细胞和THP-1细胞在经过CTRP9刺激后,M1相关蛋白的表达上调,M2相关蛋白的表达下调;流式结果显示M1型细胞比例升高,M2型细胞比例降低;TNF-a的分泌增加;（2）CTRP9加剧LPS作用的巨噬细胞M1极化:经LPS+CTRP9刺激后的M1型巨噬细胞蛋白marker表达高于LPS单独作用组,流式细胞显示M1型巨噬细胞比例也高于LPS刺激组;（3）CTRP9通过降低M2巨噬细胞标志物显示出对IL-4的拮抗作用:CTRP9降低IL4作用的M2型巨噬细胞的蛋白表达水平和M2型巨噬细胞的细胞占比;（4）建立ApoE-/-小鼠和ApoE-/-CTRP9-/-小鼠斑块模型,结果显示在高脂喂养小鼠斑块模型中,敲除CTRP9基因后斑块的面积缩小,脂质的含量降低,胶原的含量增加,斑块内巨噬细胞以M2型居多;（5）CTRP9促进巨噬细胞-VSMCs共培养体系VSMCs的凋亡:TUNEL染色及cleaved caspase3的表达水平显示巨噬细胞和VSMCs共培养组VSMCs的凋亡率增高,CTRP9处理的巨噬细胞增强此效应;（6）CTRP9抑制巨噬细胞-VSMCs共培养体系中VSMCs的增殖:EDU染色及PCNA的表达水平显示巨噬细胞和VSMCs共培养组VSMCs的EdU+数目减少,PCNA表达水平降低,CTRP9处理的巨噬细胞-VSMCs共培养组效应更加明显;（7）在共培养体系中,CTRP9促进巨噬细胞MMP2和MMP9表达水平;单独的CTRP9对VSMCs内MMP2和MMP9表达无影响,结果无统计学意义,而在共培养体系中,CTRP9诱导的巨噬细胞抑制VSMCs内MMP2表达,促进MMP9表达;（8）CTRP9通过激活JNK/MAPK信号通路促进巨噬细胞M1极化:首先,western blot结果显示CTRP9可以激活巨噬细胞MAPK信号通路,分别使用JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126、P-38抑制剂SB203580后,发现JNK抑制剂SP600125可以明显抑制M1型巨噬细胞标志物的表达,降低TNF-a的分泌;（9）CTRP9通过激活AdipoRl/JNK/MAPK信号通路使细胞发生M1表型转换:AdipoRl si-RNA抑制巨噬细胞AdipoRl表达后,JNK磷酸化水平及M1型巨噬细胞标志物的表达均出现下调。4.研究结论（1）CTRP9诱导巨噬细胞向M1方向极化,敲除CTRP9可以改善斑块内炎症;（2）CTRP9促进巨噬细胞-VSMCs共培养体系中VSMCs凋亡;（3）CTRP9抑制巨噬细胞-VSMCs共培养体系中VSMCs增殖;（4）CTRP9通过激活AdipoR1/JNK/MAPK促进巨噬细胞M1极化。
王明哲[3]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中认为背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
李良子[4]（2021）在《IL-28A在肠缺血再灌注肠屏障功能损害中的作用及机制研究》文中研究说明背景与目的肠缺血再灌注（I/R）通常发生于多种病理过程中,例如创伤、失血性休克、肠梗阻、严重烧伤、小肠移植和其他一些大的手术。急性小肠I/R往往会引起严重的肠上皮损伤,导致肠上皮屏障功能丧失,引起细菌易位,进而引发全身性炎症反应最终可能造成多器官功能衰竭。当肠I/R损伤发展为休克,多器官功能衰竭和败血症时,死亡率特别高。肠I/R损伤的潜在机制非常复杂,越来越多的研究表明,肠屏障功能障碍在肠I/R损伤的发生发展中起到关键作用。肠上皮屏障（IEB）是肠腔和肠粘膜之间重要的防御屏障,肠上皮屏障包括完整的肠上皮细胞（IEC）和IEC之间的紧密连接（TJs）。紧密连接是由一群跨膜蛋白包括claudins、occludin、Zonula Occludens（ZO）等组成的蛋白复合体,位于上皮细胞膜的顶端,可以调控肠道水、离子和营养物的吸收转运。有证据表明,紧密连接蛋白表达或分布的破坏是导致肠I/R中肠通透性增加和肠上皮屏障功能障碍的重要原因。白介素28A（IL-28A或干扰素λ2）是三型干扰素家族的一员,研究表明IL-28A参与了肠粘膜稳态的维持,但是具体机制尚不明确。最近的一项研究表明,IL-28A可促进结肠炎小鼠中肠上皮细胞的增殖并加速肠粘膜损伤的愈合。另外的一项研究发现,外源性IL-28可通过调控血管内皮细胞紧密连接加强血脑屏障。但是,关于IL-28A在肠I/R和肠上皮屏障功能中的作用和机制的研究尚未有报道。本课题构建小鼠小肠I/R模型和Caco-2细胞缺氧模型,通过免疫组化,蛋白印迹,跨上皮电阻测量,免疫荧光等技术,研究IL-28A在小鼠小肠组织的表达以及对小鼠小肠I/R损伤和肠上皮屏障功能的作用,初步探索了可能涉及的分子机制。研究方法1.将成年C57BL/6小鼠随机分成三组:Sham,I/R和I/R+IL-28A。I/R+IL-28A组的小鼠在手术前12小时腹腔注射重组小鼠源IL-28A。构建小鼠小肠急性I/R模型,用血管夹夹闭肠系膜动脉根部,30分钟后恢复血供,6小时后处死所有小鼠。通过蛋白印迹法和免疫荧光染色评估Sham和I/R组中IL-28A的表达。通过渗透性示踪剂FITC标记的葡萄聚糖4000评估小肠的渗透性。收集小肠标本并照相。通过苏木素-伊红（H&E）染色和Chiu’s评分进行组织学分析。2.通过蛋白印迹法和免疫组化染色检测TJ蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）的表达和分布。通过蛋白印迹和免疫荧光染色评估信号转导和转录激活因子1（STAT1）和p STAT1的表达。3.在体外建立人肠上皮Caco-2细胞缺氧模型,并给予重组人源IL-28A刺激12小时,通过测量跨上皮电阻（TER）评估上皮通透性。通过蛋白印迹法评估紧密连接蛋白和STAT1/p STAT1的表达。通过免疫荧光染色检测claudin-1的表达和分布。4.在体外用小分子抑制剂氟达拉滨抑制STAT1的活化,设置浓度梯度寻找抑制效果最好的浓度。用抑制效果最佳浓度的氟达拉滨与IL-28A共同作用Caco-2细胞,通过蛋白免疫印迹实验检测紧密连接蛋白和STAT1/p STAT1的表达,通过免疫荧光染色检测claudin-1的表达和分布。研究结果1.免疫荧光结果显示,表达IL-28A的细胞主要在小肠的固有层中,并且I/R组IL-28A阳性细胞的相对数量比假手术组明显降低。蛋白质印迹结果显示,与假手术组相比,I/R组IL-28A蛋白的表达量明显降低。2.IL-28A处理明显减轻了I/R导致的的小肠组织水肿和充血。组织学检查显示,I/R引起小肠绒毛缩短,上皮表面脱落,大量隐窝丢失和免疫细胞浸润,而外源性IL-28A处理缓解了上述粘膜损伤。3.与假手术组相比,I/R导致小鼠血清中FITC标记的葡萄聚糖水平升高,而IL-28A处理则部分缓解了FITC标记的葡萄聚糖的升高。免疫组化结果显示,IL-28A处理可显着减轻小肠I/R引发的紧密连接蛋白的破坏,其中包括ZO-1、occludin和claudin-1。免疫印迹表明,在I/R条件下,IL-28A可以促进claudin-1蛋白水平的表达,但对ZO-1和occludin的表达量没有明显影响。4.在体外实验中,无论常氧或低氧环境,IL-28A均可以上调Caco-2单细胞层的跨膜电阻。蛋白质印迹实验表明,低氧明显降低了Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的表达。外源性IL-28A对Caco-2细胞ZO-1和occludin的表达没有影响,但无论在常氧或低氧条件下均上调了claudin-1的表达。5.IL-28A在体内和体外均促进下游信号分子STAT1的活化。在体外Caco-2细胞中,氟达拉滨可抑制STAT1磷酸化,且抑制效果与作用浓度成正相关。氟达拉滨在抑制STAT1磷酸化的同时降低claudin-1的表达,并逆转了IL-28A介导的claudin-1的表达上调,但氟达拉滨对ZO-1和occludin的表达没有影响。结论1.IL-28A主要在肠道固有层中表达,I/R导致小鼠小肠中IL-28A的下调。IL-28A维持肠屏障功能并减轻了小肠急性I/R损伤。2.在小鼠小肠I/R模型和体外Caco-2细胞缺氧模型中,IL-28A均维持了肠上皮紧密连接的分布,并上调了claudin-1的表达。3.抑制STAT1的磷酸化可以逆转IL-28A对Caco-2细胞中claudin-1表达和分布的影响。IL-28A在肠屏障上的保护作用可能是通过JAK-STAT1通路实现的。
姜伟[5]（2021）在《氧化应激介导Nrf2/HO-1与JAK1/STAT3通路参与三氯乙烯致敏小鼠肝脏损伤》文中进行了进一步梳理研究背景三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）作为一种普遍使用的传统工业有机溶剂,被广泛认为是职业和环境污染物,常用作萃取剂、制冷剂、干洗剂以及有机合成、农药生产。长期接触TCE可引起神经系统、内脏及皮肤的损害,其中部分严重的病人罹患职业性三氯乙烯药疹样皮炎（occupational medicamentosa-like dermatit is due to TCE,OMLDT）,该病治疗周期长,脏器受损是其常见病症,其中肝衰竭是主要死因之一。在OMLDT患者临床观察中发现肝功能异常,部分患者B型超声波检查提示肝脏肿大,课题组前期研究发现TCE致敏阳性动物同样有肝脏损伤表现,且TCE致敏阳性动物体内存在明显的氧化应激水平增高。氧化应激介导相关脏器损伤,而腹腔注射四甲基哌啶（4-Hydroxy-TEMPO,Tempol）可缓解机体过氧化从而减轻氧化损伤。研究表明,氧化应激与核因子E2相关因子2（NF-E2-r elated factor 2,Nfr2）及血红素氧合酶1（hemeoxygenase 1,HO-1）蛋白密切相关,并可介导炎症因子释放造成机体损伤。体内ROS等细胞因子刺激可介导Jan us激酶（Janus protein tyrosine kinase,JAKs）活化,可诱导下游信号转录激活因子（Signal t-ransducers and activators of transcription,STAT）激活,JAK/STAT信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应中均有重要作用。研究目的本研究以TCE致敏模型为基础,通过小鼠腹腔注射抗氧化剂Tempol进行对比实验研究,分析各组小鼠肝脏氧化应激水平和Nrf2/HO-1、JAK1/STAT3信号通路相关蛋白及细胞因子表达水平,探讨氧化应激在TCE致敏小鼠免疫性肝损伤中的作用机制。研究方法将40只雌性SPF级Balb/c小鼠随机分为空白组（5只）、溶剂组（5只）、TCE组（15只）和TCE+Tempol组（15只）,沿用课题组经典的TCE致敏模型继续研究。将TCE+Tempol组动物在第19日末次激发前腹腔注射Tempol溶液（100mg/kg）,于末次激发24h后根据小鼠背部皮肤反应做皮肤致敏反应评分,由得分≥1评为致敏,将所有小鼠分为致敏阳性组和致敏阴性组,末次激发72h后摘除眼球取血、颈椎脱臼处死小鼠,于无菌条件下收集组织样本。HE染色观察肝脏组织病理,试剂盒检测血清中谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）水平,试剂盒检测肝脏组织中MDA与ROS含量,Western Blot检测肝组织中Nrf2/HO-1、JAK/STAT信号通路相关蛋白、NLRP3、Caspase-3及IL-1β表达水平,RT-PCR检测Nrf2、HO-1和NLRP3基因层面差异,IHC检测Caspase-3、IL-1β在肝组织的表达水平。研究结果1.皮肤评分空白组及溶剂组小鼠皮肤均未见明显异常,TCE组与TCE+Tempol组中部分小鼠实验部位皮肤出现不同程度的红斑和水肿,TCE组致敏率为40%,TCE+Tempol组致敏率为33.3%。2.肝功能血清中AST与ALT活力值在空白组、溶剂组及TCE致敏阴性组无统计学差异;与溶剂组及TCE致敏阴性组相比,TCE致敏阳性组和TCE+Tempol致敏阳性组AST和ALT均升高,差异有统计学意义（P<0.05）;TCE+Tempol致敏阳性组AST和ALT值相对TCE致敏阳性组下调,差异有统计学意义（P（27）0.05）。3.肝脏病理学检测空白组、溶剂组、致敏阴性组小鼠肝细胞无明显病理改变,TCE致敏阳性组小鼠肝细胞中存在空泡样变性,细胞明显水肿、细胞浆呈疏松状,TCE+Tempol致敏阳性组则表现为部分组织可见肝细胞水肿样表现,较TCE致敏阳性组有所改善。4.肝脏MDA、ROS含量小鼠肝脏MDA、ROS含量在空白组、溶剂组及TCE致敏阴性差异无统计学意义;同溶剂组及TCE致敏阴性比较,TCE致敏阳性组MDA、ROS含量均升高,差异有统计学意义（P<0.05）;TCE+Tempol致敏阳性组MDA、ROS含量较TCE致敏阳性组降低,差异有统计学意义（P（27）0.05）。5.肝组织中Nrf2/HO-1、JAK/STAT信号通路相关蛋白表达水平溶剂组、空白组及TCE致敏阴性中各蛋白条带灰度值均无统计学差异;JAK-1与STAT-1在各组间表达量无统计学差异;TCE致敏阳性组小鼠肝组织pJAK1、p-STAT3、NLRP3、Caspase-3及IL-1β蛋白含量同溶剂组及TCE致敏阴性相比均有明显增加,Nrf2、HO-1蛋白含量有所下调（P（27）0.05）;TCE+Tempol致敏阳性组p-JAK1、p-STAT3、NLRP3、Caspase-3及IL-1β蛋白含量低于TCE致敏阳性组,Nrf2、HO-1蛋白含量升高,差异有统计学意义（P（27）0.05）。6.肝组织中Nrf2、HO-1和NLRP3基因表达水平空白组、溶剂组及TCE致敏阴性间Nrf2、HO-1、NLRP3基因水平差异无统计学意义;同溶剂组及TCE致敏阴性相比,TCE致敏阳性组中Nrf2、HO-1转录水平下调,NLRP3转录水平上升（P（27）0.05）;与TCE致敏阳性组相比,TCE+Tempol致敏阳性组Nrf2、HO-1转录水平升高,NLRP3转录水平下降,差异有统计学意义（P（27）0.05）。7.肝组织中Caspase-3、IL-1β沉积量IHC结果显示,TCE致敏阳性组小鼠肝组织中有大量Caspase-3、IL-1β表达,TCE+Tempol致敏阳性组中Caspase-3、IL-1β沉积相对减少,空白组、溶剂组、致敏阴性组未见明显表达。结论1.TCE致敏免疫性肝损伤与氧化应激有关,Nrf2/HO-1与JAK1/STAT3信号通路参与此免疫性肝损伤。2.Tempol可明显降低该动物模型氧化应激水平,进而调控Nrf2/HO-1与JAK1/STAT3信号通路及相关细胞因子释放,缓解TCE引起的免疫性肝损伤。
田李星[6]（2020）在《细胞色素P4501A1对脓毒症时巨噬细胞极化及吞噬功能的调控作用》文中指出研究背景与目的:脓毒症（sepsis）是由各种致病菌,尤其是革兰阴性菌进入血液生长繁殖引起的全身性系统性过度炎症反应,其常伴发血压骤降,寒战高热及呼吸循环衰竭等严重并发症。由于其发病原因的多样性,病情进展的复杂性以及致病因素的不确定性,现已成为重症医学科死亡率最高的病种之一。以往认为,脓毒症发生发展初期过度活化的单核-巨噬细胞系统所介导的“细胞因子风暴”是造成机体过度炎症反应,并导致脏器损害的重要因素之一。虽然目前已有较多针对脓毒症中如何调控炎症因子释放的研究,但脓毒症的罹患率及病死率仍居高不下,因此我们迫切需要寻找新的作用靶点或治疗策略以抑制巨噬细胞（macrophages,Mj）介导的过度炎症反应,以为今后预防及治疗脓毒症提供新的思路和理论基础。细胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1,CYP1A1）是一种主要存在于肝脏及肠道当中的单加氧酶,并具有环氧化酶及羟化酶双重作用。过去对CYP1A1的研究多关注于其对外源性有害物质的代谢调控,例如CYP1A1可代谢二恶英,黄曲霉素等外源性毒素为细胞毒性产物,引发DNA损伤从而导致癌症发生。近年来,越来越多的研究开始将CYP1A1与免疫调控联系起来。有研究表明,CYP1A1敲除可加剧高浓度氧中毒导致的小鼠急性肺损伤,具体表现为肺水肿加重,蛋白渗出及中性粒细胞浸润加剧等病理改变。另有研究报道,整体性过表达CYP1A1可增加小鼠肠道感染柠檬酸杆菌时的死亡率,提示CYP1A1对机体应对应激反应具有重要的调控作用。除了对机体整体的调控作用外,CYP1A1还可影响不同细胞中炎症因子的表达。CYP1A1过表达能显着降低脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激时,牛乳腺上皮细胞所分泌的促炎因子,但具体机制不明。有研究报道,多氯联苯118可通过激活芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,Ah R）上调CYP1A1,从而活化大鼠甲状腺FRLT-5细胞中的丝裂原活化蛋白激酶通路以释放大量的促炎因子,如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）等。在脓毒症或炎症的发生发展过程中,巨噬细胞往往在1型（M1）或2型（M2）型之间相互转化。在反应初期巨噬细胞往往以M1型为主,主要起促炎杀菌的作用,而在炎症反应中后期,白介素-4（Interleukin-4,IL-4）分泌开始大量增加以促进M1型细胞向M2型极化,从而起到抗炎修复的作用。有研究报道,在白介素-13诱导的M2中,活化的信号传导及转录激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6,STAT6）可引起CYP1A1表达显着增加,使其羟化酶相关代谢产物生成增多而促进巨噬细胞表达2型极化指标。但CYP1A1是否能直接调控巨噬细胞向2型极化,能否直接调控2型极化指标上游转录因子仍然未知。巨噬细胞作为固有免疫应答的第一道防线,其极化与吞噬功能对机体应对脓毒症发生发展具有十分重要的意义。虽然上述研究初步揭示了CYP1A1与免疫调控的关系,但其对极化因素刺激时,尤其是对脓毒症中巨噬细胞极化与吞噬的调控作用仍然不明。本研究将以野生型小鼠腹腔巨噬细胞为研究起点,结合Ah R敲除小鼠腹腔巨噬细胞、野生型小鼠外周血单核细胞（mouse peripheral blood monocytes,m PBMCs）及人外周血单核细胞（human peripheral blood monocytes,h PBMCs）,建构CYP1A1沉默和过表达的原代巨噬细胞,以及CYP1A1基因过表达的RAW264.7稳转细胞系进行机制研究。使用LPS、大肠杆菌（Escherichia.Coli,E.coli）或盲肠结扎穿刺术（cecal ligation and puncture,CLP）建立体内体外脓毒症模型以诱导巨噬细胞向M1型极化,并使用IL-4诱导巨噬细胞向M2型分化。在确定相关机制的基础上,分别引入相关通路或靶点的抑制剂进行体外验证研究,同时进行在体基因编辑细胞回输实验以及引入CYP1A1敲除小鼠进行相关理论的体内验证研究。通过以上方法与实验,我们将明确过度活化巨噬细胞中CYP1A1的变化规律,研究CYP1A1对巨噬细胞极化及吞噬功能的调控作用,并阐明其中的作用机制,实现将CYP1A1作为调控靶点以逆转脓毒症的发生发展。实验方法:一、CYP1A1对巨噬细胞极化功能的影响。1.给予小鼠腹腔注射LPS或E.coli建立脓毒症模型,提取造模后的小鼠腹腔巨噬细胞,使用蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测其中CYP1A1蛋白表达水平;2.提取小鼠腹腔巨噬细胞,在体外培养纯化后给予LPS刺激建立1型极化炎症模型或给予IL-4刺激建立2型极化模型,使用WB及q RT-PCR分别检测其中CYP1A1蛋白及基因表达水平;3.构建CYP1A1过表达的RAW264.7细胞系（CYP1A1/RAW）以及表达阴性对照载体的RAW264.7细胞系（NC/RAW）,使用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块及细胞培养上清,使用ELISA及q RT-PCR检测其中1型极化指标TNF-α及IL-6蛋白和基因表达水平,使用WB及q RT-PCR检测其中2型极化指标-精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）蛋白和基因表达水平;4.提取AhR敲除小鼠及野生型小鼠腹腔巨噬细胞,在体外培养纯化后沉默其中CYP1A1蛋白表达,再给予LPS刺激。收集细胞培养上清用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平;5.给予RAW264.7细胞CYP1A1特异性抑制剂（玫瑰树碱和丹叶大黄素）预作用,完毕后再给予LPS刺激,并收集细胞培养上清用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平。二、CYP1A1调控巨噬细胞极化的具体机制。1.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块用WB检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）、核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）/激活子蛋白-1（activator protein-1,AP-1）等信号通路变化情况,使用IL-4刺激后检测Janus激酶1（janus kinase 1,JAK1）/STAT6通路变化;2.分别敲除CYP1A1/RAW及NC/RAW细胞中的JNK、AP-1、JAK1及STAT6,使用LPS或IL-4刺激后收集细胞团块,用ELISA检测细胞培养上清中TNF-α及IL-6蛋白水平变化,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化情况,并用凝胶电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化;3.使用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞上清用ELISA法检测其中12（S）-氢氧化二十碳四烯酸（12（S）-HYDROXY-5（Z）,8（Z）,10（E）,14（Z）-EICOSATETRAENOICACID,12（S）-HETE）及15（S）-氢氧化二十碳四烯酸（15（S）-HYDROXY-5（Z）,8（Z）,11（Z）,13（E）-EICOSATETRAENOICACID,15（S）-HETE）含量变化,检测细胞中CYP1A1羟基化酶活性;4.联合使用12（S）-HETE与LPS或15（S）-HETE与IL-4刺激RAW264.7细胞,收集细胞团块及细胞培养上清,使用ELISA及q RT-PCR检测其中TNF-α及IL-6蛋白和基因表达水平,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化;5.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,同时使用12（S）-HETE中和抗体中和CYP1A1过表达后所产生的12（S）-HETE,使用ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-6蛋白表达水平,用WB检测JNK/AP-1信号通路变化,并用EMSA检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化;6.用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块检测其中12-脂氧合酶（12-lipoxynase,12-LOX）或15-脂氧合酶（15-lipoxynase,15-LOX）基因变化,并使用12-LOX抑制剂ML355或15-LOX抑制剂PD146176作用CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块及上清分别检测CYP1A1羟基化酶活性、Arg-1、TNF-α及IL-6蛋白表达水平;7.突变CYP1A1/RAW细胞中羟基化酶活性作用位点,使用LPS或IL-4刺激后采用ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-6蛋白表达水平、12（S）-HETE及15（S）-HETE变化情况,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化,并用EMSA检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化。三、CYP1A1对巨噬细胞吞噬功能的影响及其在体内的调控作用。1.在小鼠腹腔巨噬细胞中沉默或过表达CYP1A1,或给予12（S）-HETE及丹叶大黄素预作用后使用E.coli进行刺激,收集细胞团块进行菌落计数以反应吞噬能力变化,同时用q RT-PCR及WB检测吞噬受体A类清道夫受体（scavenger receptor-A,SR-A）的变化,最后使用SR-A中和抗体拮抗SR-A,并再次测定E.coli刺激巨噬细胞后的菌落计数;2.向小鼠腹腔注射E.coli建立脓毒症模型,分离其腹腔巨噬细胞及PBMCs,用q RT-PCR检测PBMCs中CYP1A1基因表达,用激光共聚焦检测PBMCs中JNK/AP-1活化情况,使用WB检测腹腔巨噬细胞中JNK/AP-1信号通路变化;3.预先向小鼠腹腔中注射CYP1A1过表达及CYP1A1羟化酶活性突变的腹腔巨噬细胞及表达空载体的阴性对照腹腔巨噬细胞,再给予小鼠E.coli或CLP进行脓毒症造模,观察移植CYP1A1过表达及酶活性突变细胞对脓毒症小鼠生存率的影响;4.给予E.coli或CLP诱导的脓毒症小鼠丹叶大黄素作用,并观察丹叶大黄素治疗对小鼠生存率的影响;5.向小鼠腹腔注射LPS建立脓毒症休克模型,动态检测PLF中IL-4变化水平,在IL-4表达高峰期向小鼠腹腔注射CYP1A1过表达的腹腔巨噬细胞,观察CYP1A1过表达细胞移植对脓毒症休克小鼠PLF中TNF-α表达的影响;6.采集大坪医院重症医学科30名脓毒症患者及30名健康志愿者外周血,分离血浆和PBMCs,分别用ELISA检测血浆中12（S）-HETE水平,用q RT-PCR检测PBMCs中CYP1A1基因水平。根据临床诊断标准计算每名患者的序贯器官衰竭评估值（Sequential Organ Failure Assessment,SOFA）,并与12（S）-HETE及CYP1A1水平进行关联分析;7.给予CYP1A1敲除小鼠及野生型小鼠腹腔注射LPS造模,取其腹腔灌洗液用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平,取其腹腔巨噬细胞用PCR检测其中TNF-α及IL-6基因表达水平,取其肺脏用于大体观察及苏木精-伊红染色法检测。实验结果:一、CYP1A1对巨噬细胞极化功能的影响。1.给予小鼠腹腔注射LPS或E.coli打击后,其腹腔巨噬细胞中的CYP1A1表达水平随时间增加而逐步增高;2.体外培养小鼠腹腔巨噬细胞时,给予LPS或IL-4刺激后其CYP1A1蛋白及基因表达水平同样也随时间增加而逐步增高;3.CYP1A1过表达使LPS刺激时RAW264.7细胞合成分泌的TNF-α及IL-6水平显着增加,而使IL-4刺激时RAW264.7细胞合成的Arg-1表达增加;4.敲除Ah R并不影响CYP1A1沉默所致的TNF-α及IL-6水平降低;5.玫瑰树碱和丹叶大黄素均可显着降低炎性巨噬细胞分泌的TNF-α及IL-6水平。二、CYP1A1调控巨噬细胞极化的具体机制。1.CYP1A1过表达使LPS刺激时,RAW264.7细胞中JNK/AP-1通路活化水平显着增高,而使IL-4刺激时RAW264.7细胞中JAK1/STAT6磷酸化水平明显升高;2.在CYP1A1过表达RAW264.7细胞中敲除JNK/AP-1通路可显着降低由CYP1A1过表达引起的TNF-α及IL-6表达增高,而敲除JAK1/STAT6通路可明显减少由CYP1A1过表达引起的Arg-1表达增加;3.使用LPS刺激时,CYP1A1过表达可增加CYP1A1羟化酶活性及其产物12（S）-HETE的产量,而使用IL-4刺激时,CYP1A1过表达可增加CYP1A1羟化酶活性及其另一羟化产物15（S）-HETE的产量;4.与单用LPS相比,12（S）-HETE与LPS联合刺激可显着增加RAW264.7细胞分泌的TNF-α及IL-6水平及JNK/AP-1通路活化水平,而与单用IL-4相比,15（S）-HETE与IL-4联合刺激可增加RAW264.7细胞合成的Arg-1水平及JAK1/STAT6通路活化水平;5.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,同时使用12（S）-HETE中和抗体中和CYP1A1过表达后所产生的12（S）-HETE,可显着降低CYP1A1过表达所致的TNF-α及IL-6表达水平增高,减弱JNK/AP-1活化水平,并弱化胞核中AP-1与DNA结合活性;6.CYP1A1过表达并不影响12-LOX及15-LOX的表达水平,分别使用这两者的抑制剂也不能逆转CYP1A1过表达导致的促炎反应;7.突变CYP1A1/RAW细胞中羟基化酶活性作用位点,可明显降低CYP1A1过表达所致的12（S）-HETE、15（S）-HETE、TNF-α及IL-6表达水平增高,降低Arg-1表达水平,并减弱JNK/AP-1及JAK1/STAT6通路活性。三、CYP1A1对巨噬细胞吞噬功能的影响及其在体内的调控作用。1.CYP1A1过表达可显着降低巨噬细胞对E.coli的吞噬能力,并且此效应是通过调控吞噬受体SR-A实现的。沉默CYP1A1及给予丹叶大黄素刺激可增强巨噬细胞的吞噬能力,而12（S）-HETE对吞噬无明显影响;2.接受E.coli打击后,小鼠PBMCs中CYP1A1表达水平及JNK/AP-1活化水平显着增高,而腹腔巨噬细胞中JNK/AP-1通路明显活化;3.在腹腔内移植了CYP1A1过表达的巨噬细胞后,面对脓毒症打击时小鼠死亡率显着增加。移植CYP1A1羟化酶活性突变的腹腔巨噬细胞对死亡率无明显影响;4.腹腔注射丹叶大黄素可降低CLP或E.coli诱导的小鼠脓毒症死亡率;5.给予小鼠腹腔注射LPS后,在其PLF内IL-4达到最高峰时向小鼠腹腔内移植CYP1A1过表达的巨噬细胞,可使其PLF中TNF-α表达水平显着下降;6.与健康志愿者相比,脓毒症患者外周血浆中12（S）-HETE水平显着增加,而PBMCs中CYP1A1基因水平也明显升高,并且与脓毒症严重程度（SOFA评分）呈正相关变化。7.CYP1A1敲除可导致LPS刺激下小鼠腹腔灌洗液及巨噬细胞中TNF-α、IL-6表达降低,但可加重肺部损伤。结论:一、LPS及IL-4刺激均可显着增加小鼠巨噬细胞中CYP1A1表达水平,且LPS刺激的CYP1A1升高为非Ah R依赖性;二、在LPS所致的巨噬细胞1型极化过程中,CYP1A1可通过其羟基化酶作用生成代谢产物12（S）-HETE,强化JNK/AP-1通路活化水平,从而导致促炎因子TNF-α及IL-6合成分泌增加（与12-LOX无关）,而在IL-4所致的2型极化过程中,CYP1A1可通过其羟基化酶作用生成代谢产物15（S）-HETE,强化JAK1/STAT6通路活化水平,从而导致2型极化指标Arg-1合成增加（与15-LOX无关）;三、在脓毒症炎症反应初期（巨噬细胞1型极化期）,CYP1A1可增加巨噬细胞所分泌的促炎因子并导致脓毒症小鼠死亡率增加,而CYP1A1抑制剂丹叶大黄素可有效降低脓毒症小鼠死亡率,但在炎症反应后期（巨噬细胞2型极化期）IL-4表达增加,CYP1A1可增加巨噬细胞所合成的Arg-1,使巨噬细胞向抗炎型（2型）极化并促进小鼠腹膜炎消退。此外,CYP1A1还可通过调控SR-A受体以影响巨噬细胞的吞噬作用;四、在脓毒症患者体内同样存在CYP1A1-12（S）-HETE-JNK/AP-1信号轴,并且CYP1A1及12（S）-HETE表达水平与脓毒症患者病情严重程度呈正相关变化;五、CYP1A1敲除可减弱小鼠腹膜炎的同时加重肺损伤,说明CYP1A1的调控作用具有空间分布异质性。
宋亚军[7]（2020）在《MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究》文中认为背景和目的心脏、肾脏等器官移植术后,患者须长期服用免疫抑制剂类药物预防和治疗排斥反应,以延长移植物存活。吗替麦考酚酯是临床上常用于实体器官移植术后的免疫抑制剂之一,通过肠道吸收后迅速在肝细胞内代谢成其活性成分-霉酚酸。在体内,霉酚酸可以通过非竞争性地、可逆地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的活性,抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径,从而选择性地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化增殖,降低机体的免疫水平,达到减轻对移植物排斥的目的,尽可能保护移植器官功能。但是,吗替麦考酚酯副作用明显,比如白细胞减少、贫血、败血症等,在胃肠道主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应,即便使用肠溶剂型也难以改善。临床上多采用减少用药剂量甚至中断服药来减轻副作用。目前,吗替麦考酚酯引发胃肠反应的具体机制尚有待探究。角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）对多种细胞都具有促进增殖、分化的功能,能够有效改善克罗恩病、缺血再灌注等因素造成的肠粘膜损伤,修复肠粘膜屏障,改善腹痛、腹泻等不良症状。在肠道,KGF多由TCRγδT细胞分泌,在肠粘膜遭受刺激时,KGF表达可升高。多项研究表明,KGF的表达与细胞因子IL-17A高度相关,而作为IL-17A主要细胞来源的Th17细胞,理论上可直接受吗替麦考酚酯的抑制,根据以上反应链条,不难推测:在肠道,吗替麦考酚酯可能通过抑制Th17细胞及其IL-17A的分泌,减少TCRγδT细胞的活化和KGF的表达,进而造成肠粘膜屏障结构和功能受损,这可能是吗替麦考酚酯引发胃肠反应的作用机制之一。为了验证该假说,我们拟建立吗替麦考酚酯诱导的小鼠肠粘膜损伤模型,外源性给予KGF治疗,观察效果并探讨原因;设计体内、外实验,进一步探究吗替麦考酚酯是否通过作用Th17细胞及其特征性细胞因子IL-17A,进而影响肠道TCRγδT细胞表达KGF的部分作用机制。本研究可为减轻吗替麦考酚酯造成的胃肠道反应提供新的研究思路和干预措施。方法:1.建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型C57雄性小鼠,重20 g-25 g,按照:500 mg/kg,每天灌胃1次吗替麦考酚酯混悬液;或:250mg/kg,每天早、晚各灌胃1次的方式建模,连续灌胃14天,每天固定时间称量小鼠的体重,观察小鼠大便性状,处死后称量肠道湿重,并做病理检查,比较两种方法的建模效果。2.外源性KGF对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的保护作用研究我们设计实验,拟从小鼠体重等大体指标、肠道病理变化、肠粘膜通透性、肠上皮细胞凋亡、增殖,紧密链接蛋白表达以及肠粘膜TCRγδ+IEL细胞比例变化等角度,探究外源性KGF对于MMF模型的肠粘膜保护作用。（1）取30只C57小鼠随机分成3组,每组10只,分别为吗替麦考酚酯组（MMF组）,吗替麦考酚酯+重组角化上皮生长因子组（MMF+KGF组）和对照组（Control组）;（2）称量各组小鼠体重、观察肛门血污、肠道肉眼下状态并测量其长度;（3）用FITC-Dextran和多功能酶标仪检测小鼠肠粘膜通透性;（4）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（5）免疫荧光法和蛋白印迹法检测肠粘膜细胞紧密链接蛋白表达情况;（6）分别用Brd U法和TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞增殖和凋亡情况;（7）流式细胞仪检测对比各组小鼠肠道TCRγδ+IEL细胞比例。3.吗替麦考酚酯对小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A表达的影响。建立吗替麦考酚酯诱导的肠粘膜损伤模型,并在模型基础上给予Th17细胞回输,或IL-17A细胞因子腹腔注射,观察各组小鼠肠粘膜损伤,Th17细胞比例以及IL-17A表达情况,以期阐释吗替麦考酚酯的肠粘膜损害作用是否与Th17细胞抑制及其IL-17A表达下调有关。（1）动物模型的建立与分组:取40只C57小鼠随机分成4组,每组10只,分别为空白对照组（Control组）,吗替麦考酚酯组（MMF组）,MMF+Th17细胞回输组（MMF+Th17组）,和MMF+IL-17A腹腔注射组（MMF+IL-17A组）;（2）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（3）流式细胞仪检测各组小鼠肠粘膜Th17细胞比例;（4）免疫印迹法检测各组小鼠肠粘膜IL-17A的表达;4.IL-17A作用Vγ4细胞表达KGF机制的初步探讨（1）用IL-17A（1μg/kg/day,连续5天）腹腔注射野生型小鼠、抗体清除Vγ1细胞小鼠、抗体清除Vγ4细胞小鼠、JAK/STAT信号阻断剂（AG490）小鼠,空白对照组以同样方式注射生理盐水。5天后,用免疫组化法观察KGF表达情况,蛋白印迹法检测JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况;（2）体外培养Vγ4T淋巴细胞,实验组用IL-17A刺激,对照组加等量PBS缓冲液,6 h后用ELISA法检测细胞培养上清液中KGF蛋白的表达,用RT-PCR法检测KGF在RNA水平的变化,蛋白印迹法检测Vγ4T细胞内JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况。结果:1.与以往报道的方法相比,在保证灌饲吗替麦考酚酯总量不变的情况下,早8:00,晚6:00两个时间点分别灌胃的方法具有省时、稳定的优点,所以,我课题组采用这一方法建模。2.与对照组相比,MMF组小鼠体重减轻,肠粘膜损伤和通透性增加,紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）的表达减少,分布紊乱。肠粘膜上皮细胞的增殖减少,凋亡增加;相对于MMF组,MMF+KGF组肠粘膜屏障损害减轻,肠上皮细胞增殖增加,凋亡减少;肠上皮细胞间的紧密链接蛋白更加稳定,肠上皮细胞内的TCRγδ+细胞比例升高。3.与对照组相比,MMF组肠粘膜病理损伤严重,而MMF+Th17组和MMF+IL-17A组肠粘膜损伤好转,病理评分比MMF组下降;流式细胞检测显示MMF组肠粘膜Th17细胞比例下降,MMF+Th17组肠粘膜Th17细胞比例有所回升,MMF+IL-17A组肠粘膜Th17细胞比例与MMF组未见差异。4.免疫组化结果显示,与空白对照组相比,用IL-17A腹腔注射后,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组肠粘膜KGF表达增多,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠KGF表达未见差异;蛋白印迹结果显示,用IL-17A腹腔注射后,与空白对照组相比,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组p-JAK2、p-STAT3表达上升,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠p-JAK2、p-STAT3表达未见差异;在体外细胞培养实验中,相对于对照组,实验组（IL-17A刺激）KGF在蛋白和RNA水平表达升高,蛋白印迹法检测到Vγ4T细胞内p-JAK2、p-STAT3表达升高。5.结论:1.相对于传统,改良后的建模方法（早8:0,晚6:00用250 mg/m L的吗替麦考酚酯混悬液100μL灌胃）,建模时间缩短,肠粘膜损伤明确,最终血药浓度与传统方法无差异。模型的稳定性好,成功率高。2.外源性给予KGF可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这一作用可能是通过促进肠粘膜上皮细胞增殖、抑制其凋亡,保护肠上皮细胞间的紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）,稳定肠上皮内的TCRγδ+细胞实现的。3.回输Th17细胞和腹腔注射IL-17A细胞因子可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这些结果提示:吗替麦考酚酯抑制肠粘膜Th17细胞及IL-17A表达有可能是其造成肠粘膜损伤的部分机制。4.肠粘膜上分泌KGF的γδT细胞亚型主要是Vγ4;IL-17A可以激活Vγ4细胞,增加KGF分泌;体在外实验中,IL-17A可以通过激活JAK/STAT信号通路,上调p-JAK2、p-STAT3水平,进而调控KGF表达;JAK2抑制剂AG490可以有效抑制Vγ4细胞分泌KGF。这些结果提示:IL-17A可通过上调肠粘膜Vγ4细胞JAK/STAT信号通路磷酸化水平调控KGF表达。
张新奇[8]（2020）在《IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化》文中指出目的:肝纤维化（liver Fibrosis,LF）是肝脏对损伤刺激的异常修复过程,其特征表现为肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）的激活和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的沉积。白细胞介素（interleukin,IL）是一类作用十分广泛的细胞因子,其在信息传递,免疫细胞激活与调节,T和B淋巴细胞活化、增殖与分化及炎症反应中起着十分的重要作用。越来越多的证据表明,IL通过调节HSC细胞的活化参与了LF的病理过程,包括IL-1β、IL-6、IL-7及IL-9等。IL-26属于IL-10细胞因子超家族,与类风湿关节炎和炎症性肠病发生发展密切相关。然而,IL-26在LF中的生物学功能仍不清楚。本研究旨在检测IL-26对LF的影响,分析其对HSC细胞增殖和活化的作用及可能的分子机制。方法:构建HBV-Tg转基因小鼠模型,连续2周通过尾静脉每天注射0.25μg/g的人IL-26重组蛋白,饲养8-10个月后,获取肝脏组织,采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）和马松（Masson）染色观察肝脏组织的LF情况。采用ELISA实验检测小鼠肝脏组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6、IL-10、基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9,MMP-9）及α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。体外分离并成功培养HSC细胞,采用饥饿疗法,将HSC细胞用无血清培养基培养24 h,随后分别给予0、50、100和200 pg/ml浓度的人IL-26重组蛋白刺激12 h,并采用细胞计数试剂盒（CCK-8）实验检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期情况,采用Annexin V-FITC/PI双重染色检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR分析HSC细胞中胱天蛋白酶3（caspase 3,CASP3）、Bcl2关联X蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）及信号传导蛋白Smad2（SMAD family member 2）m RNA的表达水平。采用蛋白质印迹分析HSC细胞中上述基因及磷酸化Smad2（p-Smad2）蛋白的表达水平。采用ELISA实验检测HSC细胞中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9及α-SMA蛋白的表达水平。统计学分析采用t检验或方差分析。结果:与对照组相比,尾静脉注射人IL-26重组蛋白促进HBV-Tg转基因小鼠LF,并显着增加肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9及α-SMA蛋白的表达水平（P<0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着增加HSC细胞的增殖（P<0.05）。IL-26刺激呈剂量依赖性导致HSC细胞中S期比例升高,而降低G0/G1期比例（P<0.05）。在不同浓度的IL-26刺激组中,HSC细胞中G2/M期比例没有显着差异（P>0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着降低HSC细胞的凋亡（P<0.05）。IL-26以剂量依赖性方式显着下调CASP3和BAX m RNA的表达水平（P<0.05）。给予不同浓度的IL-26刺激后,HSC细胞中CASP3、cleaved CASP3和BAX蛋白的表达水平呈剂量依赖性下降（P<0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着诱导HSC细胞的活化,其机制主要通过增加IL-6、IL-10、TNF-a、MMP-9和α-SMA的m RNA及蛋白表达水平（P<0.05）。此外,IL-26以剂量依赖性方式上调HSC细胞中TGF-β1、Smad2及p-Smad2蛋白的表达水平（P<0.05）。结论:尾静脉注射人IL-26重组蛋白促进HBV-Tg转基因小鼠LF,并显着增加肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9和α-SMA蛋白的表达水平。IL-26以剂量依赖性方式增加HSC细胞的增殖和活化促进LF。IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化促进HBV-Tg转基因小鼠LF。该研究揭示了IL-26在LF中的重要作用,并将为LF的治疗提供新的思路及潜在靶点。
韩雄哲[9]（2019）在《猴腿蹄盖蕨提取物体内外抗炎作用研究》文中研究说明蕨类植物在中草药领域应用广泛。一段时期以来,全球各地对新药的开发工作越来越得到众人的重视,对药用蕨类植物更是青睐有加。在众多的蕨类植物中,猴腿蹄盖蕨作为生长在长白山地区的中草药,是能够同时满足药用和食用两方面需求的重要蕨类植物。相关研究显示,该种药用蕨类植物能够起到抗氧化以及抑制细菌增长等作用,然而国内外尚无有关蕨类植物-猴腿蹄盖蕨抗炎作用及其机制的系统研究。本文为探讨猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对LPS刺激诱导的小鼠肺损伤的抗炎功效和对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞的影响,借助信号转导通路平台,探析其对相关的关键蛋白分子以及炎性因子蛋白表达的作用,研究猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对小鼠体内外抗炎作用,对猴腿蹄盖蕨的抗炎免疫功效给出科学合理的解释,为猴腿蹄盖蕨的开发与利用提供可靠的理论参考。本文采用MTT方法,深入分析猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对小鼠腹腔巨噬细胞的毒害影响;借助ELISA方法,探讨猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对LPS引发的TNF-α以及IL-6分泌情况的作用;结合Western blot方法,研究炎症信号通路中相关的关键蛋白分子的影响。通过仔细的研究发现:当猴腿蹄盖蕨乙醇提取物的浓度处于0-200.0μg/mL的水平时,其不会毒害到小鼠腹腔的巨噬细胞;同时明显阻碍了TNF-α和IL-6的分泌;此外,猴腿蹄盖蕨乙醇提取物能够以有效调节炎症信号通路的方式起到抗炎的功效。另外,还探讨了猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对LPS刺激诱导的炎症通路的影响以及对小鼠急性肺损伤模型的保护功能。在实验过程中,笔者设置了空白对照、LPS诱导、猴腿蹄盖蕨（5.0 mg/kg体重、10.0 mg/kg体重）+LPS以及地塞米松（7.8 mg/kg体重）+LPS等多组实验。将猴腿蹄盖蕨乙醇提取物通过小鼠胃部注入小鼠体内,并连续注药8天,在LPS开始诱导的两个小时前将地塞米松通过小鼠腹腔注入小鼠体内。之后再拿出小鼠肺脏,形成肺泡灌洗液,并对该灌洗液中的炎性细胞的具体数量进行监测;采取Griess方法,检测炎症介质NO的水平;结合ELISA方法,检测TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平,做好病理切片以研究其中的组织病变情况。分析得到,猴腿蹄盖蕨乙醇提取物能够大幅度减少小鼠肺泡灌洗液内炎性细胞的含量,抑制NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6等的产生。结果提示,猴腿蹄盖蕨乙醇提取物对LPS诱导下的小鼠急性肺损伤模型起到了显着的抗炎功效。实验进一步观察了部分猴腿蹄盖蕨萃取物对小鼠腹腔巨噬细胞抗氧化能力的实验。在作者所萃取的三种物质中,石油醚层与二氯甲烷层清除DPPH、ABTS效果最好,石油醚层在0.2 mg/mL清除DPPH效果达到了 87.33%,在0.2 mg/mL时,清除ABTS效果达到98.73%,乙酸乙酯层铁离子螯合能力最佳,乙酸乙酯在10 mg/mL时,螯合能力达到75%。通过研究得出如下结论:1.猴腿蹄盖蕨提取物可能通过MyD88和TRIF双通路以及抑制炎症因子的产生,抵抗LPS对小鼠的致炎作用;2.猴腿蹄盖蕨乙酸乙酯萃取层的抗一氧化氮能力最佳,石油醚与二氯甲烷萃取层清除DPPH、ABTS效果最好,乙酸乙酯萃取层铁离子螯合能力最佳。
何根林[10]（2018）在《HSP90 β调节小胶质细胞M1型活化在热射病中枢炎症中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景和意义热射病（heat stroke,HS）是热病（heat illness）中对机体损伤最严重、危害最大的一种疾病,其临床症状主要是体温过高和中枢神经系统功能障碍,并伴有横纹肌溶解、弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation,DIC）、全身多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）等严重并发症,其死亡率1550%。由于中枢神经损害是热射病主要临床特征,大脑成为热射病公认的主要损伤靶器官之一,因此热射病中枢神经系统损伤机制及防治措施研究备受关注。有关热射病中枢神经损伤机制目前普遍认为主要是高热对中枢神经细胞的直接打击以及热射病过程中脑水肿、脑缺血、缺氧导致中枢神经细胞继发性损伤。热射病脑损伤的防治措施主要包括高压氧和降温等物理手段,以及靶向功能蛋白干预和干细胞移植等生物手段。随着热射病发病机理的不断探索,近年来研究发现热射病中枢神经系统（central nervous system,CNS）炎症的发生发展与脑损伤程度密切相关。但由于对热射病中枢神经炎症的分子机制还缺乏深入系统研究,也限制了针对神经炎症开展热射病脑损伤的临床救治。小胶质细胞作为中枢神经系统炎症调控的重要效应细胞,在脑外伤、脑缺血以及神经退行性变等诸多神经系统疾病中被激活,呈现出M1型表型活化,具有促炎症反应的致伤特性。但小胶质细胞参与热射病中枢神经系统炎症发生及中枢神经损伤的具体机制目前仍不清楚。因此,揭示小胶质细胞M1型活化在热射病中枢神经系统炎症发生及中枢神经系统损伤中的机理,有望为以小胶质细胞为靶标治疗热射病中枢神经损伤提供参考,对探寻有效神经保护性药物,维护普通人群和职业人群健康具有重要作用。热休克蛋白（heat shock protein,HSP）是细胞在高温、缺氧、寒冷、创伤、感染等应激原诱导下所生成的一组遗传保守的应激蛋白。小胶质细胞热应激后必不可免地会产生热休克蛋白,近年来很多研究已证实热休克蛋白参与调节免疫和控制炎症反应,因此,在高热诱导小胶质细胞M1型活化过程中,极有可能受HSP的调控。而HSP90是已报道最为广泛的促炎相关调控因子,在脓毒症、关节炎、肠炎、多发性硬化症、红斑狼疮等多种炎性疾病中可募集多种炎症信号分子,诱导促炎症因子的产生。HSP90生物学功能的发挥有赖于其HSP90α和HSP90β两种亚型的作用。研究发现,HSP90α可能与肿瘤发生、增强的细胞周期调节、细胞应激时的快速保护等有关;而HSP90β可能与癌症、炎症等细胞功能调整有关。因此,我们推测热射病过程中HSP90β可能参与调控高热刺激小胶质细胞M1型活化。因此,本课题通过构建热射病小鼠模型,观察热射病后中枢神经系统病理改变和炎症反应,检测小胶质细胞M1型活化标志物的表达规律;并在离体小胶质细胞热休克模型上,观察了M1型活化标志物、炎症因子和HSPs三者的表达规律及相关性;采用抑制剂干预证明HSP90及其亚型在调控热休克小胶质细胞M1型活化中的作用,并从MAPK、STAT3、NF-κB炎症信号通路探讨HSP90β调控小胶质细胞M1型活化的机制,为临床靶向HSP90β干预热射病中枢神经系统炎性损伤的治疗提供实验基础。研究方法1,取雄性健康BALB/c小鼠,12周龄,在设定温度42.0℃,湿度60%的环境模拟舱中,持续暴露至小鼠核心温度达到42.7℃,完成热射病小鼠模型的构建。小鼠分成正常对照组（Con）、热射病后恢复即刻0 h组（HS-0h）、恢复3 h组（HS-3h）、恢复6 h组（HS-6h）、恢复24 h组（HS-24h）、恢复72 h组（HS-72h）、Ganetespib组（Gan）和Gan+HS组（恢复后6 h）。观测各组小鼠核心温度和体重变化,纪录死亡情况。于相应时相点取材脑组织,行HE染色病理观察。分析中枢神经系统炎症反应与脑组织损伤之间的相关性。2,对各组小鼠各取一边大脑皮层组织分别提取总RNA和蛋白。对各组细胞分别提取总RNA和蛋白。qRT-PCR法检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和mPGES-1的mRNA表达。ELISA/EIA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2蛋白分泌情况。探讨热射病小鼠和热休克小胶质细胞促炎症反应恢复变化的规律,以及抑制剂和esiRNA干预后炎症反应变化。3,取各组小鼠和细胞蛋白提取物,免疫印迹检测M1表型分子CD45、CD68、CD64和CD16蛋白表达,流式细胞术和免疫组织荧光检测CD45和CD68表达及定位情况。探讨热射病小鼠和热休克小胶质细胞M1型活化的变化规律,以及抑制剂和esiRNA干预对M1型活化的调控效应。4,取各组小鼠和细胞蛋白提取物,免疫印迹检测HSP70、HSP90α和HSP90β蛋白表达,ERK、JNK、p38、JAK2、STAT3、IκB-α和p65蛋白表达及磷酸化情况。免疫组织荧光检测Iba-1、HSP90β和p-STAT3荧光定位表达情况。从MAPK、STAT3和NF-κB炎症信号通路探讨HSP90β调控小胶质细胞M1型活化的内在机制。结果1,以42.0℃热暴露、小鼠核心温度达到42.7℃为阈值成功构建热射病模型小鼠,热射病小鼠恢复期3 h进入明显的低体温期,热射病恢复期6 h内脑组织病理明显改变、体重丢失显着、炎症因子mRNA表达和蛋白分泌增多、M1表型标志物表达增加;24h后仍有未完全恢复。表明热射病小鼠出现明显中枢神经病理损伤、中枢神经炎症以及小胶质细胞M1型活化。2,选取热暴露强度适中的42℃1.5 h热休克处理N9小胶质细胞,发现热休克小胶质细胞恢复期3 h和6 h炎症因子mRNA表达和蛋白分泌、M1表型标志物增加明显,随后均有所下降,但到12 h仍有部分指标仍未完全恢复。HSP27、HSP70和HSP90表达在热休克后12 h内均有不同程度增加,抑制剂分别干预HSP27、HSP70和HSP90,小胶质细胞促炎M1活化仅受HSP90抑制剂Gan调控影响。3,HSP90抑制剂Gan干预后热休克N9小胶质细胞信号转导分子ERK、JAK2和STAT3增强的磷酸化表达水平明显被抑制。ERK抑制剂干预对热休克N9小胶质细胞的炎症因子分泌无影响,而JAK2和STAT3磷酸化抑制剂可明显减少热休克N9小胶质细胞产生的炎症因子。esiRNA瞬时沉默HSP90α和HSP90β基因后结果发现,沉默HSP90β而非HSP90α,能显着抑制热休克N9小胶质细胞炎症因子的mRNA和蛋白表达的增加,并能显着消除热休克小胶质细胞JAK2和STAT3磷酸化表达水平的增加。4,脑立体定位注射Gan靶向HSP90β干预后,热射病小鼠大脑皮层组织脑水肿和炎性等病理损伤得以减轻,炎症因子mRNA表达和蛋白分泌、M1表型标志物荧光强度、STAT3磷酸化荧光强度和入核程度明显低于热射病小鼠,提示在体Gan干预能通过HSP90β–STAT3通路抑制小胶质细胞M1型活化减轻热射病中枢神经系统炎性损伤。全文结论1、热射病小鼠出现明显脑组织损伤病理改变,大脑皮层大量炎症因子产生、小胶质细胞特异M1型标志物激活,提示热射病中枢神经损伤与中枢神经炎症、小胶质细胞M1型活化密切相关。2、热休克诱导N9小胶质细胞炎症因子及M1活化表型分子的mRNA和蛋白表达都增加,表明热应激可直接刺激小胶质细胞出现M1型活化。HSP27、HSP70和HSP90表达在N9小胶质细胞热休克后12 h内均有不同程度增加,HSP90抑制剂Gan能有效抑制热休克对小胶质细胞炎症因子和M1表型标志物的增加,提示HSP90在调节热休克小胶质细胞促炎M1型活化中具有关键作用。3、HSP90抑制剂Gan明显抑制ERK、JAK2和STAT3的磷酸化表达水平增加,应用抑制剂分别干预ERK、JAK2和STAT3的磷酸化激活,结果发现只有JAK2–STAT3信号通路参与了Gan调节小胶质细胞M1型活化促炎反应。通过esiRNA分别沉默HSP90α和HSP90β,发现Gan通过调节HSP90β而不是HSP90α,逆转热休克诱导的N9小胶质细胞的炎症因子分泌增加和下游促炎信号通路蛋白激活。因此,结果提示HSP90β通过STAT3信号通路调节热休克N9小胶质细胞M1型活化产生促炎反应。4、Gan靶向干预HSP90β明显减轻热射病小鼠病理变化、炎症因子与M1表型标志物表达以及STAT3磷酸化,结果表明干预HSP90β可有效抑制小胶质细胞M1型活化,减轻热射病中枢神经系统炎症及中枢神经损伤,进一步证明热射病小鼠小胶质细胞M1型活化产生促炎反应主要受HSP90β-STAT3调控。
二、严重腹腔感染大鼠JAK/STAT通路活化与多器官功能损害的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、严重腹腔感染大鼠JAK/STAT通路活化与多器官功能损害的关系（论文提纲范文）
（1）DEHP对大鼠肝脏脂质代谢的影响及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 DEHP的研究现状 |
| 1.1 DEHP污染及暴露情况 |
| 1.2 DEHP的毒性作用 |
| 1.3 DEHP对脂质代谢的影响 |
| 2 肝脏脂质代谢紊乱 |
| 2.1 肝脏脂质代谢紊乱与肝脏疾病 |
| 2.2 肝脏脂质代谢紊乱的危险因素 |
| 3 肝脏脂质代谢紊乱的调控机制 |
| 3.1 炎症与肝脏脂质代谢 |
| 3.2 JAK-STAT信号通路与肝脏脂质代谢 |
| 3.3 Notch信号通路与肝脏脂质代谢 |
| 3.4 其他信号通路与肝脏脂质代谢 |
| 第一部分DEHP对大鼠肝脏脂代谢的影响及炎症在其中的作用 |
| 1 主要仪器和材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 体内实验 |
| 2.1.1 动物饲养及DEHP染毒 |
| 2.1.2 组织样本的采集 |
| 2.1.3 脂质水平的测定 |
| 2.1.4 肝脏组织病理学观察 |
| 2.1.5 肝组织中脂代谢关键基因mRNA水平的测定 |
| 2.1.6 肝组织中脂代谢关键基因蛋白表达水平的测定 |
| 2.1.7 数据处理与分析 |
| 2.2 体外实验 |
| 2.2.1 BRL-3A大鼠肝细胞的培养 |
| 2.2.2 MEHP染毒剂量的确定 |
| 2.2.3 BRL-3A大鼠肝细胞中脂质水平的测定 |
| 2.2.4 炎症因子水平检测 |
| 2.2.5 抗炎药物Aspirin的剂量确定及实验分组 |
| 2.2.6 BRL-3A大鼠肝细胞内脂代谢关键酶基因mRNA表达水平检测 |
| 2.2.7 BRL-3A大鼠肝细胞内脂代谢关键酶基因蛋白表达水平检测 |
| 2.2.8 数据处理与分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 体内实验 |
| 3.1.1 DEHP暴露对大鼠体重的影响 |
| 3.1.2 DEHP暴露对大鼠脂质水平的影响 |
| 3.1.3 DEHP暴露对大鼠肝脏组织病理学变化的影响 |
| 3.1.4 DEHP暴露对大鼠肝脏脂代谢关键基因m RNA及蛋白表达水平的影响 |
| 3.2 体外实验 |
| 3.2.1 MEHP染毒剂量的确定 |
| 3.2.2 MEHP暴露对BRL-3A大鼠肝细胞脂质水平的影响 |
| 3.2.3 MEHP对BRL-3A细胞脂代谢关键基因mRNA及蛋白表达水平的影响 |
| 3.2.4 MEHP暴露对BRL-3A细胞炎症因子分泌的影响 |
| 3.2.5 MEHP暴露对BRL-3A细胞PPARα 蛋白表达的影响 |
| 3.2.6 抗炎药物Aspirin对BRL-3A细胞存活率的影响 |
| 3.2.7 MEHP暴露对抗炎后BRL-3A细胞炎症因子分泌的影响 |
| 3.2.8 炎症在MEHP引起BRL-3A细胞PPARα蛋白表达改变中的作用 |
| 3.2.9 炎症在MEHP引起BRL-3A细胞脂质水平改变中的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEHP对大鼠体重和肝脏组织形态的影响 |
| 4.2 DEHP暴露对大鼠肝脏和BRL-3A细胞脂质水平的影响 |
| 4.3 脂代谢关键基因在DEHP/MEHP影响大鼠肝脏和BRL-3A细胞脂质代谢中的作用 |
| 4.4 炎症在MEHP影响BRL-3A细胞脂质代谢中的作用 |
| 5 小结 |
| 第二部分JAK-STAT信号通路在DEHP影响大鼠肝脏脂质代谢中的作用及其机制 |
| 1 主要仪器和材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 体内实验 |
| 2.1.1 动物饲养及DEHP染毒 |
| 2.1.2 组织样本的采集 |
| 2.1.3 大鼠肝脏中JAK-STAT信号通路基因mRNA表达水平检测 |
| 2.1.4 大鼠肝脏中JAK-STAT信号通路基因蛋白表达水平检测 |
| 2.1.5 数据处理与分析 |
| 2.2 体外实验 |
| 2.2.1 BRL-3A大鼠肝细胞培养及MEHP染毒 |
| 2.2.2 BRL-3A细胞内JAK2-STAT5信号通路基因mRNA表达水平检测 |
| 2.2.3 BRL-3A细胞内JAK2-STAT5信号通路基因蛋白表达水平检测 |
| 2.2.4 STAT5A基因过表达BRL-3A细胞构建与实验分组 |
| 2.2.5 慢病毒感染后BRL-3A细胞内脂质水平检测 |
| 2.2.6 慢病毒感染后BRL-3A细胞内脂代谢关键酶基因蛋白表达水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 体内实验 |
| 3.1.1 DEHP对大鼠肝脏TYK2-STAT1 信号通路基因m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.1.2 DEHP对大鼠肝脏JAK2-STAT5信号通路基因mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.1.3 DEHP暴露后大鼠肝脏中STAT5 和STAT1 蛋白水平与脂代谢相关基因蛋白水平的关联 |
| 3.2 体外实验 |
| 3.2.1 MEHP对BRL-3A细胞JAK2-STAT5 信号通路基因m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 慢病毒感染细胞效率和STAT5A过表达效率 |
| 3.2.3 STAT5A在MEHP影响BRL-3A细胞脂质水平中的作用 |
| 3.2.4 STAT5A在MEHP影响BRL-3A细胞脂代谢关键酶基因蛋白表达中的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEHP暴露对大鼠肝脏JAK-STAT信号通路的影响 |
| 4.2 MEHP对BRL-3A细胞JAK2-STAT5信号通路的影响 |
| 4.3 STAT5A在MEHP影响BRL-3A细胞脂代谢中的作用 |
| 5 小结 |
| 第三部分Notch信号通路在DEHP影响大鼠肝脏脂质代谢中的作用及其机制 |
| 1 主要仪器和材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 体内实验 |
| 2.1.1 动物饲养及DEHP染毒 |
| 2.1.2 组织样本的采集 |
| 2.1.3 大鼠肝脏中Notch信号通路基因mRNA表达水平检测 |
| 2.1.4 大鼠肝脏中Notch信号通路基因蛋白表达水平检测 |
| 2.1.5 数据处理与分析 |
| 2.2 体外实验 |
| 2.2.1 BRL-3A细胞培养及MEHP染毒 |
| 2.2.2 Notch通路抑制效率检测及实验分组 |
| 2.2.3 Notch信号通路基因mRNA表达水平检测 |
| 2.2.4 Notch信号通路基因蛋白表达水平检测 |
| 2.2.5 炎症因子水平检测 |
| 2.2.6 脂质水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 体内实验 |
| 3.1.1 DEHP暴露对大鼠肝脏Notch信号通路基因mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.1.2 DEHP暴露后大鼠肝脏Notch信号通路基因蛋白水平与脂质水平的关联 |
| 3.2 体外实验 |
| 3.2.1 MEHP对BRL-3A细胞Notch信号通路基因m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 MEHP暴露后BRL-3A细胞内不同Notch受体蛋白表达水平的比较 |
| 3.2.3 Notch信号通路抑制剂DAPT对BRL-3A细胞存活率的影响 |
| 3.2.4 Notch信号通路抑制效率 |
| 3.2.5 MEHP对Notch信号通路抑制的BRL-3A细胞Notch受体蛋白表达水平的影响 |
| 3.2.6 MEHP对Notch信号通路抑制的BRL-3A细胞炎症因子分泌的影响 |
| 3.2.7 MEHP对Notch信号通路抑制的BRL-3A细胞中PPARα蛋白表达的影响 |
| 3.2.8 MEHP对Notch信号通路抑制的BRL-3A细胞脂质水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DEHP/MEHP对大鼠肝脏和BRL-3A细胞中Notch信号通路的影响 |
| 4.2 DEHP/MEHP通过Notch信号通路对肝脂质水平的影响 |
| 4.3 DEHP/MEHP通过Notch信号通路影响肝细胞脂质代谢的机制 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Notch信号通路在肝脏糖脂代谢中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）CTRP9介导的巨噬细胞极化与败血症及动脉粥样硬化关系的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CTRP9对巨噬细胞和败血症小鼠iNOS表达的影响及机制研究 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CTRP9对巨噬细胞表型及动脉粥样硬化的影响及机制研究 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Paper Ⅰ |
| Paper Ⅱ |
（3）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）IL-28A在肠缺血再灌注肠屏障功能损害中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 IL-28A对小鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 IL-28A对小鼠I/R条件下肠屏障和紧密连接蛋白的作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 体外缺氧环境下IL-28A对上皮细胞屏障和紧密连接蛋白的调控作用 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 IL-28A调控紧密连接蛋白claudin-1的机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Ⅲ型干扰素与粘膜免疫 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肠屏障功能与相关疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）氧化应激介导Nrf2/HO-1与JAK1/STAT3通路参与三氯乙烯致敏小鼠肝脏损伤（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 生化试剂 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 动物处理 |
| 2.4 皮肤致敏评分 |
| 2.5 组织采集、保存 |
| 2.6 肝功能AST、ALT测定 |
| 2.7 肝组织HE检测 |
| 2.8 TBA法检测MDA含量 |
| 2.9 化学荧光法测ROS |
| 2.10 Western Blot法检测肝脏相关蛋白表达 |
| 2.11 RT-PCR检测基因水平 |
| 2.12 IHC测Caspase-3、IL-1β |
| 2.13 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠致敏评分结果 |
| 3.2 血清AST、ALT含量 |
| 3.3 肝脏病理 |
| 3.4 肝脏MDA与ROS水平 |
| 3.5 肝脏JAK1与STAT3蛋白含量 |
| 3.6 肝组织中Nrf2、HO-1和NLRP3蛋白及基因表达水平 |
| 3.7 肝组织中Caspase-3沉积量 |
| 3.8 肝组织中IL-1β沉积量 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 氧化应激与肝损伤研究进展 |
| 参考文献 |
（6）细胞色素P4501A1对脓毒症时巨噬细胞极化及吞噬功能的调控作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 CYP1A1对巨噬细胞极化功能的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CYP1A1调控巨噬细胞极化的机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CYP1A1对脓毒症时巨噬细胞吞噬功能的影响及其在体内的调控作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞与脓毒症/炎症关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 外源性 KGF 对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的 保护作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 吗替麦考酚酯降低小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 IL-17A调控Vγ4 细胞表达KGF机制的初步探讨 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 总结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 γδT细胞在人类疾病中的免疫学作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 IL-26 促进HBV-Tg转基因小鼠肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第二章 IL-26诱导肝星状细胞的增殖和活化促进肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第三章 IL-26 通过调控TGF-β1/Smad2 信号通路促进肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 白细胞介素在肝纤维化过程中的作用及分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 急性肝功能衰竭的急诊临床管理的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）猴腿蹄盖蕨提取物体内外抗炎作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 名词中英文对照和缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蹄盖蕨研究 |
| 1.1.1 蹄盖蕨化学成分研究 |
| 1.1.2 蹄盖蕨药理活性研究 |
| 1.2 炎症研究 |
| 1.2.1 脂多糖诱导炎症反应 |
| 1.2.2 中药抗炎免疫调控 |
| 1.2.3 急性肺损伤研究进展 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验用主要试剂及药物的配制 |
| 2.1.3 实验主要设备仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猴腿蹄盖蕨活性成分的提取 |
| 2.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 |
| 2.2.3 药物处理及实验分组 |
| 2.2.4 细胞毒性实验 |
| 2.2.5 一氧化氮检测 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附(ELISA)实验 |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹(WESTERN BLOT)实验 |
| 2.2.8 急性肺损伤动物模型建立及相关因子检测 |
| 2.2.9 AM的指纹图谱及总黄酮含量检测 |
| 2.2.10 体外抗氧试验 |
| 2.2.10.1 清除DPPH试验 |
| 2.2.10.2 铁离子螯合能力 |
| 2.2.10.3 清除ABTS试验 |
| 2.2.11 数据处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 AM提取物的细胞毒性 |
| 3.2 AM提取物对炎症介质表达的影响 |
| 3.2.1 AM提取物对LPS刺激诱导NO表达的影响 |
| 3.2.2 AM提取物对LPS刺激诱导iNOS、COX-2蛋白表达的影响 |
| 3.2.3 AM提取物对LPS刺激后TNF-α表达的影响 |
| 3.2.4 AM提取物对LPS诱导IL-6表达的影响 |
| 3.2.5 AM提取物对LPS诱导IL-1β表达的影响 |
| 3.3 AM提取物对LPS刺激PM细胞诱导MAPKs信号转导通路关键蛋白表达的影响 |
| 3.4 AM提取物对LPS刺激PM细胞诱导NF-κB蛋白表达的影响 |
| 3.5 AM提取物对LPS刺激PM细胞诱导JAK/STAT信号转导通路关键蛋白表达的影响 |
| 3.6 AM对急性肺损伤小鼠的影响 |
| 3.7 AM提取物的指纹图谱及总黄酮量 |
| 3.8 不同溶剂对AM的萃取率 |
| 3.9 AM萃取物细胞毒性试验 |
| 3.10 AM萃取层对NO释放量影响对比试验 |
| 3.11 AM体外抗氧化试验 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）HSP90 β调节小胶质细胞M1型活化在热射病中枢炎症中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 小胶质细胞活化参与热射病小鼠中枢神经系统炎症进程 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HSP在热休克激活小胶质细胞中的表达及作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HSP90β在调节热休克小胶质细胞促炎症反应中的作用及信号传导机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 干预HSP90β对热射病小鼠中枢神经系统炎症的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一炎症反应与中枢神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 文献综述二热休克蛋白与炎症调控 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、严重腹腔感染大鼠JAK/STAT通路活化与多器官功能损害的关系（论文参考文献）
- [1]DEHP对大鼠肝脏脂质代谢的影响及其调控机制[D]. 张月竹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]CTRP9介导的巨噬细胞极化与败血症及动脉粥样硬化关系的研究[D]. 陈吉英. 山东大学, 2021(12)
- [3]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]IL-28A在肠缺血再灌注肠屏障功能损害中的作用及机制研究[D]. 李良子. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]氧化应激介导Nrf2/HO-1与JAK1/STAT3通路参与三氯乙烯致敏小鼠肝脏损伤[D]. 姜伟. 安徽医科大学, 2021
- [6]细胞色素P4501A1对脓毒症时巨噬细胞极化及吞噬功能的调控作用[D]. 田李星. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [7]MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究[D]. 宋亚军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [8]IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化[D]. 张新奇. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]猴腿蹄盖蕨提取物体内外抗炎作用研究[D]. 韩雄哲. 延边大学, 2019(03)
- [10]HSP90 β调节小胶质细胞M1型活化在热射病中枢炎症中的作用及机制研究[D]. 何根林. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)