一、噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望（论文文献综述）
胡福泉[1]（2021）在《噬菌体的过去、现在与未来》文中研究说明噬菌体是由Frederick Twort和Félix d’Hérelle分别在1915和1917发现的。作为感染细菌的病毒,噬菌体天然地具有抗细菌感染的应用前景。在抗生素耐药性日益严峻的今天,人类在抗感染的斗争中不能只有抗生素这一种武器,这已成为全球共识。2016年,国家卫生计生委、发改委等14个部委联合印发了《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》,这个计划的实施还只是开局之战,破解细菌耐药性将是长期的战斗。在这一大背景下,噬菌体治疗（phagotherapy）作为抗细菌感染的手段再次引起了人们的高度关注。基于此,本文介绍了噬菌体的发现过程;噬菌体研究在推动科学进步上的历史贡献;噬菌体在疾病治疗中的应用;噬菌体在疾病诊断中的应用;噬菌体在疾病预防中的应用;噬菌体在农业领域的应用;噬菌体在工业及饮食卫生中的应用;噬菌体在生物高技术领域中的应用等相关内容。希望本文对于推动噬菌体教学、科学研究与未来应用中有所裨益。
陈愿,张永安,周洋[2]（2021）在《噬菌体在水产养殖业中的研究进展》文中进行了进一步梳理随着水产养殖业的发展,养殖密度越来越高,细菌性疾病暴发频繁。现如今主流抗菌手段是抗生素,但其大规模且不规范的使用使得细菌耐药性问题越发严重。为了有效防治水产细菌性疾病,加快推进水产养殖业绿色发展,促进产业转型升级,人们亟需寻求新的抗菌手段来缓解当今的局面。噬菌体是一种感染细菌和古细菌的病毒,具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点。在国内外被广泛研究,同时也被应用于多种疾病的防控,其相关产品也获得认可,但其本身存在的限制也不容忽视。本文首先综合介绍了噬菌体治疗的原理和优势,然后对噬菌体治疗在水产养殖动物细菌性疾病中的研究进展进行综述,并对噬菌体治疗现存的困难和应对策略进行讨论,最后在此基础上作出展望,期望能够为后续噬菌体在水产上的应用研究提供参考。
闫继爱[3]（2021）在《金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其结构域的制备与功能特性研究》文中提出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种全世界公认的食源性病原菌之一,可造成许多食品安全问题。同时,随着抗生素的滥用,金黄色葡萄球菌已进化为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S.aureus,MRSA）等多种耐药菌株。MRSA是食品安全、动物健康和现代医疗保健等领域出现的新问题,需要开发新的抗菌药物来取代过度使用的传统抗生素。近年来,针对MRSA等食源性病原菌迫切需要新型杀菌、控菌技术的研发。噬菌体裂解酶被认为是一种很有前途的抗菌剂。本文筛选了一株烈性的MRSA噬菌体,并根据其基因组序列构建表达噬菌体裂解酶及其各功能域,根据各功能域的酶学性质,深入研究其在不同领域的应用,为裂解酶及其功能域在食品及医药中应用提供一定的理论基础。主要研究内容和结果如下:1、金黄色葡萄球菌噬菌体筛选鉴定:从食源性垃圾中筛选到一株烈性噬菌体Z,可裂解MRSA,其效价约105。透射电镜显示此噬菌体属于长尾噬菌体,尾长约200 nm,头部直径约80 nm。在平板上能够完全抑制宿主菌生长。通过测定和分析噬菌体Z的基因组序列,获得噬菌体裂解酶lysz基因,并成功构建含lysz基因的质粒p ET15b-LysZ,通过转化、诱导表达、分离纯化获得了裂解酶LysZ。该酶可裂解包括普通金黄色葡萄球菌和MRSA在内的七种金黄色葡萄球菌,最适温度为35oC,最适p H为6.0。LysZ是金属依赖型酶。LysZ的活性随着离子强度的升高逐渐升高。裂解酶LysZ在牛奶体系中的活性与牛奶组分NaCl（0.049%）。牛奶的低盐环境也会造成裂解酶失活,但在牛奶中加入NaCl后,LysZ活性恢复。2、牛奶体系中裂解酶活性与裂解域和结合域的相关性研究。利用重叠延伸PCR技术成功构建含egfp和cbdz基因的质粒p ET15b-EGFP-CBDz,通过转化、诱导表达、分离纯化获得了结合域EGFP-CBDz,此蛋白可以与金黄色葡萄球菌特异性结合,特异性结合的最适温度为30oC,最适p H为4.0,结合能力随着溶液中离子强度的增高而升高。在牛奶中,随着牛奶中NaCl含量的升高,结合域结合MRSA活性增强。因此,裂解酶在低离子强度下活性较低,可能与结合域在此条件下与细胞壁结合能力较弱有关。噬菌体裂解酶裂解域CHAPLysZ也具有杀灭普通金黄色葡萄球菌和MRSA的特性,其最适温度为40oC,最适p H为9.0。CHAPLysZ也属于金属依赖型酶。CHAPLysZ对离子强度高度敏感,与裂解酶相反,随着离子强度的升高,其活性逐渐降低。CHAPLysZ的活性不受牛奶组分NaCl和乳脂肪的影响,在不另外添加NaCl的全脂乳和脱脂乳中均可发挥其裂解活性,减少MRSA的污染。3、金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶在非酸性食品中应用策略的选择。研究了噬菌体裂解酶在不同盐含量肉制品中的杀菌能力,CHAPLysZ（0.4 nmol/cm2）和LysZ（0.4nmol/cm2）可分别用于新鲜猪肉和盐含量高达10%以上的腊肉中,4oC培养2 h均可分别将MRSA从104CFU/cm2降至0 CFU/cm2。在实际应用中针对非酸性食品中的盐含量不同可以根据LysZ和CHAPLysZ对离子强度的敏感性选择不同的抗菌剂控制金黄色葡萄球菌的污染:低盐食品中,可以使用CHAPLysZ,而高盐食品中可以选择LysZ。清除生产环境、设备上的生物膜可以减少食品加工过程中金黄色葡萄球菌的污染。不同的金黄色葡萄球菌菌株生成生物膜的能力各不相同,本文所用七株金黄色葡萄球菌菌株中MRSA 2102生成的生物膜最不易被裂解酶或裂解域清除,其对甲氧西林的MIC高达128μg/m L。CHAPLysZ单独使用或者与甲氧西林联合去除生物膜的能力优于LysZ。0.05 n M CHAPLysZ联合32μg/m L的甲氧西林协同增效可清除约98%以上MRSA 2102形成的生物膜,这可能与裂解域的大小和裂解机理有关。裂解域可以通过生物膜内小孔隙进入生物膜内部,并不需要与细菌细胞壁结合即可发挥裂解作用。4、噬菌体裂解酶与裂解域可用于清除皮肤伤口上的MRSA,减少MRSA的感染,促进伤口愈合,可减少由外伤感染带来的污染引发的食品安全问题。1 nmol/cm2裂解酶LysZ可以促进小鼠伤口的愈合,作用一天可减少大约2.5 Log10 CFU的菌体,而裂解域CHAPLysZ仅减少0.4 Log10 CFU。可能是因为人体细胞液的离子强度较高,裂解酶LysZ更适合于应用于体内减少MRSA的污染。5、合成一种可以与MRSA细胞壁特异性结合的金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz,此材料呈二维三角形状,平均水合粒径为72.32 nm,Zeta电位为-5.08 m V,在808 nm激光辐照下具有良好的光热转化效应,其升温速度和温度与材料浓度及激光功率成正比,此材料具有较好的生物相容性,不影响细胞的活力。在含1×104MRSA的模拟体系中加入50μg/m L金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz分别接受NIR激光（808nm,1 W/cm2）辐照300 s,360 s,和420 s,可以分别使MRSA降低约1.2 Log10CFU,1.6 Log10CFU和3.1 Log10CFU,特异性杀灭MRSA。金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz可作为靶向蛋白特异性结合小鼠肺部感染的MRSA,通过光辐照靶向杀灭MRSA,减少其引起的肺部细菌感染,并减少由MRSA感染带来的炎症反应,促进机体的好转。
陶程琳[4]（2021）在《裂解多重耐药沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析》文中指出沙门菌病是一种严重危害人类健康和养殖业发展的人畜共患病,其防治一般使用抗生素,由于抗生素的长期不合理使用,引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题。噬菌体是一类能够感染细菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒,其主要宿主为细菌,因此自发现便用于预防及治疗细菌感染。与传统抗生素相比,噬菌体具有分布广、易筛选、高度的宿主专一性、增殖能力强、安全性高、研发成本低等优势。随着多重耐药菌的广泛流行,噬菌体治疗细菌感染重新引起了人们的重视。本研究旨在筛选对不同血清型多重耐药沙门菌具有高效裂解性的广宿主谱噬菌体,并对其进行了生物学特性分析及全基因组测序分析,进一步克隆表达噬菌体溶菌酶分析抑菌活性,以及探究了噬菌体实验室的初步应用,为开发一种新型的抗菌剂奠定基础。1.广宿主谱沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析本研究通过对上海养殖场的粪水进行处理,从中分离出68株鸡白痢沙门菌噬菌体,并纯化出2株具有裂解多重耐药鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌的广宿主谱噬菌体,并对其中一株噬菌体命名为Salmonella phage SHWT1,简称SHWT1。通过进行对噬菌体SHWT1裂解谱分析、电镜分析、吸附能力测定,确定了噬菌体在短时间内吸附细菌的能力。然后进行了噬菌体最佳MOI、一步生长曲线的测定。通过测定pH稳定性、热稳定性、室温稳定性,了解噬菌体最佳储存条件。最后,通过进行噬菌体体外抑菌实验、对沙门菌生物被膜的抑制能力测定、噬菌体在实验室初步应用的探究,分析了噬菌体的安全性及体外体内的抑菌作用。结果显示,噬菌体SHWT1属于有尾噬菌体目（Caudovirales）长尾噬菌体科（Siphoviridae）,对裂解沙门菌具有特异广谱性。噬菌体SHWT1的潜伏期为5 min,爆发量约为150 PFU/cell。噬菌体SHWT1在pH 3-12和温度4-65℃范围内保持稳定,其在鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的最佳感染复数（MOI）分别为0.001、0.01、0.1和100,并对上述4种沙门菌的生长和沙门菌生物膜形成均有抑制作用。噬菌体SHWT1具有良好的安全性、良好的体内活性和抗菌治疗潜力,为噬菌体成为一种新型的抗菌剂提供参考。2.沙门菌噬菌体SHWT1的全基因组学测序及分析本研究对噬菌体SHWT1的全基因组进行测序及分析。首先用噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体DNA,并在Illumina NovaSeq PE150平台上进行全基因组测序。然后用NCBI BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）软件对SHWT1全基因组序列进行比对分析,使用DNA Star对噬菌体DNA序列进行碱基组成比例、GC 含量等分析,使用 tRNAscan-SE（http://lowel ab.ucsc.edu//tRNAs can--SE/）软件识别基因组中tRNA,使用GeneMarkS（Version 4.17）软件对测序的基因组进行 ORF 预测。由 NCBI（National Center for Biotechnology Information）提供ORF Finder对ORF预测功能进行验证。最后利用抗生素抗性基因数据库（https://card.mcmaster.ca/）和 毒 力 因 子 数 据 库（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）检测噬菌体SHWT1基因组中是否存在抗生素抗性基因、噬菌体编码毒力基因。结果表明,噬菌体SHWT1核酸类型为双链DNA,基因组全长40629 bp,GC含量为49.83%,平均基因长度为678 bp,包含56个ORF,其中21个ORF具有注释功能,剩余为假定蛋白。这些功能的基因分别属于DNA复制/修饰模块、结构组分、组装模块、宿主裂解模块。噬菌体SHWT1中没有tRNA基因,未检测到毒素基因、毒力基因和抗生素抗性基因。重要的是,没有鉴定出假定整合酶基因,表明噬菌体SHWT1不能整合到宿主细菌基因组中,为此噬菌体SHWT1具有临床应用潜能。3.沙门菌噬菌体溶菌酶LysSHWT1的制备及抑菌活性分析为了分析溶菌酶LysSHWT1的抑菌效果,对其进行原核表达,然后使用His-tag蛋白纯化磁珠纯化蛋白,最后进行平板裂解试验、裂解谱分析及与膜通透剂EDTA联用抑菌试验。结果显示,溶菌酶重组蛋白LysSHWT1对鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,裂菌圈直径分别为16 mm、13 mm、14 mm、13 mm,对照组无裂解圈。LysSHWT1对101株临床沙门菌株中的60种存在裂解作用,未发现能裂解除沙门菌外的其他菌株。进一步发现溶菌酶在EDTA的协同作用下展现更好的抑菌活性,可使鸡白痢沙门菌SP01、鸡伤寒沙门菌SG02、鼠伤寒沙门菌SAT52、肠炎沙门菌SE12滴度显着下降。研究表明,溶菌酶LysSHWT1可有效裂解沙门菌,在防控沙门菌感染方面具有潜在的应用价值。
汪敏[5]（2021）在《种鸡生产链沙门菌污染的研究及鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定》文中研究说明沙门菌（Salmonella）能侵害各日龄的鸡只,存在于家禽生产的不同阶段。因此,了解Salmonella在种鸡生产链中的分布状况,对防控养殖过程中Salmonella的污染及传播至关重要。目前,抗生素疗法是治疗沙门菌病（salmonellosis）最主要的方式,但由于细菌耐药性特别是多重耐药菌株的产生,使临床治疗难度加大并存在重大食品安全危害,因此寻找有效的抗生素替代品就显得十分重要。噬菌体作为一种能裂解细菌的病毒,具有专一性强、不易产生抗性菌株的特点,正成为各国研发新型抗生素替代产品的热点之一。本研究通过对广西五家黄鸡种鸡公司多个生产环节中Salmonella的流行状况进行调查,了解各公司Salmonella的污染状况、耐药性及其潜在的关键控制点;通过基因分型对同一公司内、不同公司之间的Salmonella分离株之遗传关系进行研究,以评价基因分型技术的应用价值;以鸡白痢沙门菌（S.pullorum,SP）为宿主菌,从某种鸡场的鸡粪样品中分离筛选到一株强裂解性噬菌体,并研究其生物学特性及测定体外抑菌的效果,评估其开发应用的潜在价值。本课题从5家种鸡公司共采集样品1 325份,包括未消毒蛋壳表面、消毒蛋壳表面、叮壳蛋表面、孵化后期死胚、1日龄弱雏以及鸡白痢-伤寒（pullorum disease-fowl typhoid,PD-FT）抗体阳性、阴性的种鸡等6个环节7类样品。结果显示,共有232份样品呈Salmonella阳性,分离率为17.51%。其中,DGGX12公司的检出率最高（32.08%,85/265）,DGGX11公司分离率最低（11.70%,31/265）;不同环节/样品的Salmonella检出率也有差异,PD-FT抗体阳性鸡检出率最高（48.00%,24/50）,其次依次为孵化后期死胚（30.40%,76/250）、1日龄弱雏（26.00%,65/250）、叮壳蛋表面（23.20%,58/250）、PD-FT抗体阴性鸡（8.00%,2/25）、未消毒蛋壳表面（2.00%,5/250）和消毒蛋壳表面（0.80%,2/250）;对50只PD-FT抗体阳性种鸡体内不同部位的带菌情况进行检测,结果显示有24只为带菌鸡,不同部位均可检出Salmonella,卵巢（37.50%,9/24）的检出率最高,其次为输卵管（33.33%,8/24）、脾脏和肺脏（29.17%,7/24）,盲肠及其内容物（4.17%,1/24）,肛拭子的检出率最低（4.17%,1/24）;所有分离株的血清型鉴定结果显示,SP为优势血清型（85.17%）,其余依次为S.give（8.48%）、S.kedougou（2.97%）、S.london（1.69%）和S.weltevreden（1.27%）,还有1株未能定型;耐药性试验结果显示,分离株对17种供试药物均表现不同程度的耐药性,其中对磺胺异恶唑（99.0%）、复方新诺明（98.01%）、甲氧苄胺嘧啶（97.51%）、萘啶酸（97.51%）、阿莫西林（96.02%）、氨苄西林（94.53%）的耐药性最高,其次为链霉素（74.13%）、头孢他啶（57.71%）、四环素（34.83%）、头孢曲松（30.85%）、头孢噻肟（30.35%）、丁胺卡那（30.35%）,对环丙沙星、卡那霉素、呋喃妥因、庆大霉素、氟苯尼考较为敏感。此外,分离株耐3重及以上药物的比例达99.00%。本课题利用ERIC-PCR技术对来自5家公司不同生产环节的367株Salmonella进行分型,然后根据不同的年份、公司及ERIC基因型选取31个代表菌株进一步用MLST分型。结果表明367株Salmonella分属17类共24个ERIC基因型,每家公司的分离株均有其独特的基因型,也有少数基因型在不同公司呈交叉分布。MLST分型结果表明所有代表株均为ST92型（5-2-3-7-31-41-11）。本课题还从某种鸡公司的新鲜鸡粪样品中分离出了2株SP裂解性噬菌体,分别命名为SP11和SP19,其噬菌斑中心透亮、边缘清晰,直径分别为2.5 mm和3.5 mm,效价分别为2.45×108PFU/m L、1.08×109PFU/m L;对包括13个血清型的Salmonella、大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）在内的218株细菌的宿主谱测定结果显示,两株噬菌体仅特异性裂解Salmonella,其中SP19的宿主范围与裂解能力均优于SP11;进一步对噬菌体SP19的研究显示,透射电镜观察有明显尾部,头部呈多面体对称,直径约为52 mm;最佳感染复数为0.1,一步生长曲线表明其潜伏期为5 min,裂解期为45 min,裂解量为11 PFU/cell。在40～70℃能保持较高活性,在pH值为3.0～12.0也可稳定保持较高活性,体外抑菌试验结果表明,SP19可有效抑制宿主菌的增殖。综上所述,目前广西种鸡公司的生产链均存在不同程度的Salmonella污染,其中SP为优势血清型,分离株多重耐药现象严重,且不同地区、不同环节的菌株存在交叉污染的现象;噬菌体SP19具有高度的特异性且能有效控制宿主菌SP04-111的增殖,因此具有一定的开发价值。
张晓旭[6]（2021）在《遗传多态性驱动细菌和噬菌体的共进化》文中研究说明近年来,细菌耐药性的出现和传播给临床抗感染治疗带来了巨大挑战,超级耐药细菌对于人类健康的威胁日益得到重视,能治疗耐药细菌感染的噬菌体疗法重新引起了人们的广泛关注。然而,在噬菌体治疗中,细菌很容易对噬菌体产生抗性,极大地阻碍了噬菌体治疗耐药菌的发展。因此,探究细菌快速产生烈性噬菌体抗性的机制并克服细菌对噬菌体的耐受成为了噬菌体治疗细菌感染领域的首要问题。理论上,与抗生素不同,噬菌体是一种病毒,它可以通过进化恢复对已获得噬菌体抗性的细菌的感染力、杀伤力。基于噬菌体的特性和目前对细菌和噬菌体共进化机制的研究基础,为了探索和克服细菌快速产生噬菌体抗性的问题,本研究采用第二代测序（NGS）技术深入探究了细菌和噬菌体共进化系统中双方易感性改变的机制,开展了如下研究。论文的第一部分以金黄色葡萄球菌AB91118及其烈性噬菌体LQ7为研究对象,目的是解析细菌与噬菌体共进化的机制。首先分离到一株对原始噬菌体LQ7具有抗性的突变菌株R1-3-1,通过实验室进化LQ7获得能够抑制R1-3-1生长的噬菌体。对进化前后细菌基因组分析发现突变株R1-3-1基因组上仅发生了一个存在于非编码区的点突变,这难以解释突变株对噬菌体耐受的原因。因此,本研究创新地引入准种概念至细菌与噬菌体共进化研究中,自主开发了一种基于次频率等位基因（Minor allele）鉴定的方式确定遗传多态性位点的方法。利用此方法分析发现R1-3-1的基因组上存在57个特有的遗传多态性位点,这些特有遗传多态性位点存在于38个参与能量代谢的功能基因上,从而推测R1-3-1通过提高自身能量代谢水平获得了对噬菌体LQ7的抗性。进一步针对性选择了可以抑制细菌能量代谢的氯霉素与LQ7联用,发现亚最小抑菌浓度的氯霉素与LQ7噬菌体联合使用可以有效抑制R1-3-1的生长,证明了上述的推测。对于噬菌体,同样也证明了遗传多态性辅助其进化并恢复对突变株R1-3-1杀菌能力。除此之外,氯霉素与进化后噬菌体联用能在一定程度帮助克服细菌耐受性的产生。基于以上结果,本部分研究发现并证明了金黄色葡萄球菌和其烈性噬菌体存在次频率等位基因的遗传多态性,并且遗传多态性是影响二者共进化的重要原因之一。本论文第二部分以第一部分发现的内容为基础,为验证次频率等位基因的遗传多态性不是细菌与噬菌体共进化中的偶然现象,开展了公共数据挖掘。通过数据挖掘的手段,我们在NCBI的SRA数据库中获得了粪肠球菌TX1330和其烈性噬菌体Ef V12-phi 1共进化实验的高通量测序数据,采用第一部分开发的方法,发现共进化中的粪肠球菌及其烈性噬菌体的基因组上均存在次频率等位基因遗传多态性。进化后的粪肠球菌特异的遗传多态性位点存在于参与了酶催化活性改变的功能基因上。进化后的噬菌体在编码尾丝蛋白的基因上同样存在次频率等位基因遗传多态性位点。此外,对4株单菌基因组测序公共数据分析表明这些细菌基因组中均存在遗传多态性现象。以上结果首先证明了次频率等位基因遗传多态性普遍存在于细菌和噬菌体共进化过程中,其次拓展了我们对细菌等原核生物在群体基因组层面的认识。本论文的第三部分是基于前面两部分的分析,证明在非生物逆境的噬菌体适应性进化中也存在遗传多态性现象。开展了农业病害微生物果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum、Pectobacterium atrosepticum和青枯病菌Ralstonia solanacearum对应的烈性噬菌体Wc4、CX5和P-PSG-11的高温适应性进化,筛选出在高温逆境下具有稳定性的噬菌体突变株。通过对适应性进化前后的噬菌体基因组进行高通量测序分析发现在三种进化前后的噬菌体基因组上均存在次频率等位基因遗传多态性位点。这些遗传多态性位点大多数存在于编码尾管蛋白、DNA解旋酶和DNA聚合酶等维持噬菌体结构稳定性以及涉及基因组DNA复制等的功能基因上。以上结果证明除了突变以外,遗传多态性也为噬菌体对于非生物逆境的适应性进化提供了遗传基础。以上三个方面的研究结果证明了次频率等位基因遗传多态性在细菌和噬菌体中普遍存在并且驱动细菌和噬菌体的共进化。更重要的是本研究首次提出利用特异性遗传多态性位点所在的功能基因预测细菌进化时微生物生理功能发生的改变,并提出根据预测结果靶向挖掘有效的药物与噬菌体进化联用的治疗新方式,能够在一定程度上克服细菌耐受性的产生,提高噬菌体治疗的有效性。这些发现不仅为噬菌体治疗的合理应用提供了重要的理论基础并且对于噬菌体的临床应用具有实际的指导意义。
高杨[7]（2021）在《沙门菌PhoN蛋白单克隆抗体和纳米抗体的制备及初步应用》文中提出沙门菌（Salmonella）是重要的食源性人兽共患病原菌之一,严重着危害畜禽产业发展和人类健康。迄今为止,已发现的沙门菌血清型高达2600多种。目前,我国沙门菌的检测标准仍是微生物培养法,但其操作复杂,需要至少3天的选择性富集培养。因此,通过沙门菌特异性靶标建立诸如免疫磁珠等快速富集技术对提高沙门菌检测效率具有重要意义。沙门菌外膜蛋白是一类能刺激机体产生较强体液免疫应答和较高抗体水平的抗原,并作为毒力因子在细菌的致病过程中发挥重要作用。PhoN蛋白是沙门菌的一种外膜蛋白,是一种非特异性酸性磷酸酶,可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,具有良好的免疫原性。更重要的是,PhoN存在于绝大多数血清型的沙门菌中,而在大肠杆菌等非沙门肠杆菌科细菌中则不存在,显示出作为沙门菌属检测靶标的应用潜能,相关研究尚未见报道。目前,单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）广泛的应用于包括沙门菌在内的病原微生物的检测。基于McAb的检测及诊断应用,如免疫富集磁珠和血清学诊断试剂盒等,可对沙门菌进行快速检测及诊断。近年来,小型化抗体成为疾病诊断与治疗领域抗体技术的热点之一。驼科动物血液中存在缺失L链的重链抗体（heavy chain antibody,HcAb）抗体,利用特异性引物克隆其可变区,获得单域重链抗体（variable domain of heavy chain of HcAb,VHH）,又被称为纳米抗体（Nanobody,Nb）,是目前最小的功能性抗原结合片段。Nb因其相比传统McAb具有一系列优点,在抗肿瘤、抗病毒、病原微生物检测等领域展现广阔前景。目前制备纳米抗体较成熟的方法为噬菌体展示技术,可以高通量筛选较大库容量的抗体文库。本研究以沙门菌外膜蛋白基因phoN为目的标靶,成功获得大肠杆菌表达的PhoN重组蛋白。使用PhoN蛋白免疫小鼠,筛选获得PhoN的传统单克隆抗体,并基于PhoN单抗制备了免疫磁珠,可特异性捕获沙门菌;同时,将重组蛋白免疫羊驼,通过构建噬菌体展示文库筛选获得针对PhoN的特异性Nbl和Nb2序列,经大肠杆菌表达获得纳米抗体Nb2;基于PhoN两种抗体分别制备沙门菌免疫磁珠,可对沙门菌进行有效富集,且基于Nb2制备的磁珠特异性更高,为沙门菌的快速富集和检测提供了重要材料基础。1沙门菌PhoN蛋白传统单抗的制备及初步应用以鼠伤寒沙门菌ATCC14028S的DNA为模板,克隆phoN基因,经一步法分别连接构建至原核表达载体pCold I和pGEX-6P-1,获得pCold和pGEX-6P-1-phoN的重组质粒,经PCR鉴定及测序结果验证正确后,分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,获得沙门菌PhoN蛋白的两种重组表达菌,分别经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE,其结果显示两种标签的PhoN重组蛋白均以可溶性上清的形式表达,分别使用His和GST标签的纯化柱纯化后获得纯度较高的重组PhoN蛋白,其分子量大小分别为28 kDa和54 kDa左右,与预期理论大小相符,通过Western Blot试验,结果显示目的蛋白与相应标签蛋白抗体均有良好的免疫反应性。使用His-PhoN蛋白3次免疫小鼠,应用杂交瘤淋巴细胞技术,经过3次亚克隆和ELISA筛选后获得5株稳定分泌抗PhoN蛋白单抗的杂交瘤细胞株,且均可以特异性识别并结合重组PhoN蛋白,而不与His-PdgL、His-OmpC和His-OmpF等其他沙门菌重组蛋白反应,显示出良好免疫反应性;制备4B2腹水并进行纯化,通过Western Blot试验,分析其结果显示4B2单抗能与肠炎、鼠伤寒、德尔卑、婴儿沙门菌、印第安纳、伦敦、科瓦利斯、里森等不同血清型沙门菌特异性反应,而与大肠杆菌、志贺杆菌、空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特菌等非沙门菌不反应,表明该单抗具有沙门菌特异性识别的特性。将4B2单抗偶联Fe3O4羧基磁性纳米微球,制备基于PhoN单抗的免疫磁珠,免疫富集试验结果显示其可对鼠伤寒、肠炎、德尔卑、婴儿、科瓦利斯和里森沙门菌进行富集,其中对鼠伤寒沙门菌的捕获效率最高,可达80%,为沙门菌检测中样品的免疫富集预处理提供了重要的生物材料储备。2沙门菌PhoN蛋白纳米抗体的制备及初步应用使用His-PhoN蛋白通过皮下注射方式免疫成年羊驼,提取外周血总RNA并反转录,扩增VHH基因;胶回收第一轮PCR 700 bp条带进行第二轮PCR,胶回收第二轮PCR450bp左右的条带,即为VHH目的片段。将VHH目的片段连接至pCANTAB5E载体后转化TG1感受态细胞,涂布在Amp抗性的LB培养基,通过对涂布后的平板进行计数及VHH特异引物扩增验证,最终得到库容量为4.6×108 CFU/mL、插入率为91.6%的羊驼重链可变区噬菌体展示文库。经过噬菌体文库的救援后,使用噬菌体ELISA方法淘选特异性VHH克隆并制备纳米抗体粗提物,并利用包被GST-PhoN蛋白的间接ELISA对其进行M13和E-tag检测,选取阳性克隆进一步测序验证,使用DNAMAN分析氨基酸序列,获得2条PhoN特异性纳米抗体序列Nb1和Nb2。构建pCold I-Nb2重组质粒,通过原核表达系统表达纳米抗体Nb2,进行SDS-PAGE和Western Blot试验,结果显示获得了特异性识别沙门菌PhoN蛋白的可溶性Nb2纳米抗体。将Nb2偶联Fe3O4羧基磁性纳米微球,制备免疫磁珠,免疫富集试验结果表明其可对鼠伤寒、肠炎、德尔卑、婴儿、科瓦利斯和里森沙门菌进行富集,捕获效率与传统免疫磁珠相当,但特异性更高,对猪肉样品中沙门菌的富集效率可达79%,为沙门菌检测中样品的免疫富集预处理提供了重要的生物材料储备。
周永林[8]（2021）在《齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究》文中认为近年来抗菌药物在畜牧养殖过程中的广泛应用与细菌耐药性形成已成恶性循环,同时诱导和加速多种耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和流行,导致抗生素治疗日趋无效。金黄色葡萄球菌是兽医临床上重要的病原菌,可导致乳房炎和肺炎等多种疾病,严重威胁畜禽养殖业的发展。金黄色葡萄球菌可通过分泌β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素产生抗性,舒巴坦等竞争性酶抑制剂对B类金属β-内酰胺酶抑制作用差,而MRSA如USA300携带多种金属β-内酰胺酶,这使得耐药金黄色葡萄球菌感染的防控难度加大。此外,在NDM-1耐药酶未报道之前,碳青霉烯类抗生素一直被用于治疗临床上严重耐药肠杆菌的感染。然而,随着NDMs和KPCs等碳青霉烯酶的出现和广泛传播,导致所有β-内酰胺类抗生素在碳青霉烯酶阳性菌感染后治疗无效。而且临床上已经出现同时携带ndm和mcr基因的大肠杆菌等革兰氏阴性菌。因此,临床上迫切需要研发广谱β-内酰胺酶抑制剂协同抗菌药物以控制携带β-内酰胺酶耐药菌尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染。细菌性溶血素是细菌在致病过程中所分泌的一类重要毒力蛋白,常见的细菌性溶血素包括金黄色葡萄球菌溶血素Hla,李斯特菌溶血素LLO、肺炎链球菌溶血素PLY和猪链球菌溶血素SLY等。细菌性溶血素可裂解组织细胞和协助细菌逃避机体免疫攻击和获取营养,在细菌感染建立过程中发挥着不可或缺的作用。如金黄色葡萄球菌溶血素敲除菌株在细菌性肺炎、乳房炎和肾炎等模型中毒力显着减弱,甚至缺失。因此,以细菌性溶血素为药物靶点进行抑制剂筛选是抑制细菌致病性的一种有效策略。综上,筛选获得一种可同时抑制耐药酶和毒力因子的天然化合物,这将可能极大的提高耐药致病菌感染的治疗效果,同时减少开发药物的成本。本研究最初的目标是通过酶活性抑制试验从天然化合物中筛选出一种可抑制金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶活性的抑制剂。经筛选发现,齐墩果酸可显着抑制金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶的水解活性,同时对主要碳青霉烯酶如NDM-1、KPC-2和VIM-1也有显着的抑制作用,而对头孢菌素酶Amp C和超广谱β-内酰胺酶的抑制作用不显着。此外,加入不同金属离子进行酶活性抑制试验发现,齐墩果酸仅在锌离子存在的缓冲液中对NDM-1的抑制作用受到影响,在其它金属离子存在的缓冲液中无显着影响,提示齐墩果酸并非特异性金属离子螯合剂。本研究进一步通过棋盘法最小抑菌浓度试验、生长曲线试验、时间-杀菌曲线试验和细菌染色试验等验证了齐墩果酸及其类似物可显着增强β-内酰胺类抗生素对β-内酰胺酶阳性金黄色葡萄球菌和碳青霉烯酶阳性肠杆菌的抗菌作用（FIC≤0.33±0.07）,而舒巴坦仅对金黄色葡萄球菌与β-内酰胺类抗生素具有显着的协同效果,而与美罗培南联合对NDM-1阳性大肠杆菌无显着的协同效果。齐墩果酸在远大于32μg/m L浓度条件下对受试菌株的生长无显着影响。此外,本研究结果显示,齐墩果酸单独使用不会诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300和NDM-1阳性大肠杆菌ZJ487对β-内酰胺类抗生素产生耐药性,而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300在β-内酰胺类抗生素压力下可产生严重的耐药性。为确定齐墩果酸联合β-内酰胺类抗生素的体内协同效果,本研究建立了小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染肺炎模型,通过小鼠存活率、肺组织菌落定殖、肺组织β-内酰胺酶活性检测、靶器官病理变化和炎症反应等指标评价齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体内协同效果。与单独青霉素G钠治疗相比,齐墩果酸联合青霉素G钠治疗后金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率提高50.0%,而舒巴坦联合青霉素G钠治疗后的存活率提高37.5%,略差于齐墩果酸联合组。此外,单独齐墩果酸对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有一定的治疗效果,这提示齐墩果酸在针对金黄色葡萄球菌感染过程还具有其它药理学作用,我们推测其可能抑制了金黄色葡萄球菌致病相关毒力因子。为验证上述推测,本研究通过溶血试验和细胞保护试验等进行了验证,结果显示齐墩果酸及其类似物在4μg/m L浓度条件下可显着抑制多种不同的细菌性溶血素的溶红细胞活性,齐墩果酸可显着降低MH-S细胞和A549细胞由金黄色葡萄球菌溶血素Hla介导的损伤。这一结果进一步证实了齐墩果酸单独使用可降低耐药金黄色葡萄球菌的致病性从而发挥保护作用。本研究通过酶活性抑制试验、溶血试验、荧光定量PCR试验、蛋白免疫印迹试验、分子动力学模拟、氨基酸定点突变和荧光淬灭等试验确定了齐墩果酸不影响金黄色葡萄球菌携带的β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶以及金黄色葡萄球菌溶血素Hla蛋白的分泌和表达,而是与NDM-1蛋白和Hla蛋白通过范德华力直接结合发挥抑制作用。进一步通过对突变子蛋白进行酶活性抑制试验、溶血试验和突变子菌株最小抑菌浓度检测试验确证了分子动力学模拟结果的可靠性。综上所述,作为β-内酰胺酶和细菌性溶血素双靶标抑制剂,齐墩果酸可显着降低由细菌性溶血素对机体造成的损伤和显着恢复β-内酰胺类抗生素的体内外抗菌活性。为基于抑制细菌致病性和耐药性的双靶标抗耐药致病菌感染新药研发奠定了良好的前期试验基础和提供了先导化合物。
洪纤纤[9]（2021）在《噬菌体内溶素的裂解机制及其在宿主水稻细菌性褐条病菌中的抗氧化功能探究》文中研究指明内溶素（Endolysin）是一种由噬菌体编码的肽聚糖水解酶,主要通过破坏宿主细菌细胞来帮助自身释放子代,在噬菌体-细菌长期的互作与进化过程中起到了重要作用。有研究报道,宿主细菌能够通过水平基因转移、溶源转变等方式整合前噬菌体的基因获得除免疫外的其它新表型,并能够正常繁殖而不被裂解。本实验室前期研究发现噬菌体AP1利用内溶素蛋白（LysAP）来裂解水稻细菌性褐条病菌,然而对于宿主细菌是否也编码LysAP类似蛋白及其所发挥的生物学功能鲜有报道。本研究首次发现宿主水稻褐条病菌Acidovorax oryzae RS-2中存在与噬菌体AP1内溶素（LysAP）高度同源的蛋白（LysAo）。内溶素在噬菌体和宿主菌共同存在这一现象无疑凸显了其在噬菌体-宿主细菌互作中的重要性,迫切需要搞清楚类噬菌体内溶素在宿主细菌中的功能。为了进一步阐明噬菌体内溶素的作用机制及其在宿主细菌中存在的生物学功能,有助于全面理解噬菌体与水稻病原细菌的互作机制,本研究拟在实验室前期良好的基础上,开展如下工作:为了探究噬菌体内溶素LysAP的转运方式及影响其裂解效率的氨基酸位点,首先测定添加叠氮化钠后大肠杆菌的生长曲线,菌体裂解受到抑制,初步证实了LysAP是通过Sec蛋白转运到内膜上;其次,进行LysAP的点突变研究,发现保守位点的点突变（LysE15A）对细菌裂解有明显的抑制作用,而跨膜结构域（Transmembrane domain,TMD）附近的阳离子位点突变（LysR222A）仅有较弱的缓解裂解作用;最后,通过western blot（WB）发现LysR222A样品无法从细胞质中检测到蛋白质条带,说明R222电荷的改变并不影响其在膜上的锚定。为了探究类噬菌体内溶素LysAo的生物学功能,首先通过生物信息学预测分析得到LysAo属于内溶素Lyz＿like＿superfamily家族成员,与LysAP在蛋白结构上具有较高的相似性;其次构建过表达质粒p ET-28a-lysAo转化至大肠杆菌BL21（DE3）,通过测定生长曲线、进行荧光活死菌染色、革兰氏染色、透射电镜观察、β-半乳糖苷酶活性检测,发现LysAo蛋白大量表达会导致细菌细胞壁被裂解,生长速率受到抑制,证明LysAo蛋白具有裂解活性;接着构建缺失lysAo基因的突变体并比较其与野生型菌株在生长、游动性、生物膜形成、胞外多糖分泌、胞外酶活力、抵御噬菌体侵染以及耐过氧化氢能力的差异,结果显示突变体的过氧化氢耐受能力显着低于野生型;最后通过qPCR定量实验发现过氧化氢能够刺激lysAo编码基因的表达,通过细菌对过氧化氢清除力检测实验发现野生型去除过氧化氢能力较强,而其主要的三种抗氧化物酶活性无显着差异,同时进行水稻致病性检测发现缺失lysAo会降低细菌RS-2的致病能力。综上所述,本研究一方面揭示了噬菌体内溶素蛋白LysAP的裂解机制,为LysAP裂解功能的应用奠定理论基础;另一方面在宿主细菌中新发现与LysAP具有较高同源性的蛋白LysAo,并证明LysAo与细菌抵抗氧化逆境及其致病性相关,这不仅极大地丰富了水稻病原细菌的致病机制,更为研究噬菌体-宿主细菌的互作提供了新视野。
屈云[10]（2021）在《奶牛乳房炎病原菌调查及裂解性噬菌体的分离鉴定与生物学特性研究》文中认为奶牛乳房炎是奶牛养殖过程中最常见的疾病之一,患有乳房炎的奶牛会出现产奶量下降,产出的牛乳质量下降,奶牛身体还会出现发烧、体重下降的情况,严重的病例还会引起奶牛的死亡。奶牛乳房炎常给养殖业带来巨大的经济损失,也一直制约着我国奶牛养殖业的发展。最常见的奶牛乳房炎病因是微生物感染,特别是葡萄球菌,一旦奶牛乳腺被病原菌感染会非常难治愈,且还可能出现交叉传染情况,给牧场带来严重的经济损失。目前治疗奶牛乳房炎主要还是依靠抗生素,由于兽药残留严重和耐药菌株的出现等问题,学者们正在积极寻找可以替代抗生素的治疗方法。本研究通过对奶牛养殖过程中的乳房炎奶牛乳汁、乳头、皮毛等部位,及牛圈、挤奶车间等环境进行样品进行采集。分离鉴定出奶牛乳房炎致病菌,并挑选具有代表性且最难治愈的金黄色葡萄球菌作为研究对象,对其流行病学进行调查,然后利用其作为宿主菌,从奶牛养殖环境中分离出裂解性金黄色葡萄球菌的噬菌体,并深入探究噬菌体对奶牛乳房炎病原菌的抑菌能力和生物学特性。主要研究结果如下:（1）从奶牛牧场共采集样品1000份,分离出细菌494株,总分离率为49.40%。分离菌株经过16S r DNA测序鉴定包括13种类别细菌,包括:葡萄球菌、粪肠球菌、变形杆菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、海氏肠球菌、棒状杆菌、克雷伯氏菌、浅绿气球菌、猪粪细菌、尿链球菌、格氏乳杆菌,其中葡萄球菌属又包括18个不同的种。（2）从上述葡萄球菌属中进一步鉴定出16株金黄色葡萄球菌,并对其流行病学特征进行研究。分析发现所有分离菌株都携带有毒力基因和耐药基因,共检出13种肠毒素基因、5种其他毒力基因、2种耐消毒剂基因和12种耐药基因。传统肠毒素只检测出sec,携带率为56.25%,12种新型肠毒素携带率在12.50%和87.50%之间;12株金黄色葡萄球菌携带nuc基因,携带率为75.00%,其中6株携带mec A基因（37.50%）,所有nuc阳性菌株都同时携带hlα、hlβ基因（75.00%）,tsst-1携带率为（68.75%）,eta携带率为（12.50%）;5种耐消毒剂基因的检测结果中,10株金黄色葡萄球菌同时携带qac A/B及qac G基因（62.50%）;共检出12种耐药基因的携带情况,其中grl A携带率最高（87.50%）,van A和msr A检出率最低（6.25%）,其余耐药基因携带率在12.50%～81.25%之间。（3）16株金黄色葡萄球菌对19种抗生素药物表现出耐受性,50.00%菌株为多重耐药菌（3-15耐）,耐药谱最广达到15耐,12耐及以上菌株有6株。菌株对替考拉宁耐受性最强（75.00%）,其次为青霉素（50.00%）,也表现出对左氧氟沙星、氨苄西林、甲氧苄啶、诺氟沙星等其他抗生素不同程度的耐受性,菌株对头孢他啶、苯唑西林、链霉素有不同大小的中介和敏感率,没有菌株表现出对以上三种抗生素耐受;全部菌株对亚胺培南敏感。（4）以金黄色葡萄球菌分离株为宿主筛选得到一株肌尾科裂解性金黄色葡萄球菌噬菌体（命名为SP-Cm Sa-11）,其效价为:7.6×109PFU/m L;最佳MOI为:0.1;潜伏期为:60 min,爆发期为:40 min;裂解量约为:130 PFU/cell。该噬菌体的裂解谱包括13株乳房炎奶牛源金黄色葡萄球菌、7株人源MRSA、1株木糖葡萄球菌、1株表皮葡萄球菌、1株粪肠球菌。p H耐受范围为4.0-10.0;在40℃温度下可以正常存活,50℃生长受到一定抑制,可以在60℃存活40min,70℃存活20 min;对氯仿及紫外不敏感。（5）SP-Cm Sa-11在LB培养基及巴氏杀菌乳中表现出了很好的抑菌效果,在LB培养基中SP-Cm Sa-11可以在4小时左右完全裂解培养基质中的金黄色葡萄球菌,在巴氏杀菌乳中,相比于不加噬菌体的只接种金黄色葡萄球菌的对照组,可以使巴氏灭菌乳中的金黄色葡萄球菌菌浓度降低106CFU/m L,持续抑菌时间可以达到36 h。
二、噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望（论文提纲范文）
（1）噬菌体的过去、现在与未来（论文提纲范文）
| 1 噬菌体的发现 |
| 2 噬菌体研究在推动科学进步上的历史贡献 |
| 3 噬菌体在疾病治疗中的应用 |
| 4 噬菌体在疾病诊断中的应用 |
| 4.1 用于细菌的鉴定与分型 |
| 4.2 用于检测标本中的未知细菌 |
| 4.3 用于细菌诊断的噬菌体新技术 |
| 4.3.1 噬菌体触发的离子级联感应(sensing of phage-triggered ion cascade)技术 |
| 4.3.2 基于噬菌体检测细菌的生物发光法 |
| 4.3.3 基于噬菌体检测细菌的电化学发光传感器法 |
| 4.3.4 利用基因工程表达的噬菌体RBP检测细菌 |
| 5 噬菌体在其他领域中的应用 |
| 5.1 噬菌体在疾病预防中的应用 |
| 5.2 噬菌体在农业领域的应用 |
| 5.3 噬菌体在工业及饮食卫生中的应用 |
| 5.4 噬菌体在生物高技术领域中的应用 |
| 5.4.1 转座子文库与细菌基因功能研究 |
| 5.4.2 噬菌体展示技术与生物制药 |
| 5.4.3 基因编辑技术与生物改造 |
| 6 展望 |
（3）金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其结构域的制备与功能特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.1.1 金黄色葡萄球菌生物学特征 |
| 1.1.2 金黄色葡萄球菌肠毒素及危害 |
| 1.1.3 金黄色葡萄球菌生物膜及危害 |
| 1.2 噬菌体及噬菌体裂解酶 |
| 1.2.1 噬菌体 |
| 1.2.2 噬菌体裂解酶 |
| 1.3 立题背景及研究意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 金黄色葡萄球菌噬菌体的筛选及其裂解酶的功能特性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 金黄色葡萄球菌噬菌体的筛选及鉴定 |
| 2.3.2 噬菌体裂解酶LysZ的原核表达 |
| 2.3.3 金黄色葡萄球菌抗生素敏感性试验 |
| 2.3.4 金黄色葡萄球菌菌悬液的制备 |
| 2.3.5 裂解酶LysZ酶活的测定 |
| 2.3.6 裂解酶LysZ最适温度的研究 |
| 2.3.7 裂解酶LysZ最适pH的研究 |
| 2.3.8 金属离子对裂解酶LysZ裂解活性的影响 |
| 2.3.9 离子强度对裂解酶LysZ裂解活性的影响 |
| 2.3.10 牛奶组分对裂解酶LysZ裂解活性的影响 |
| 2.3.11 牛奶体系中裂解酶LysZ的裂解活性 |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 噬菌体的筛选 |
| 2.4.2 重组质粒p ET15b-LysZ的构建 |
| 2.4.3 裂解酶LysZ的表达及纯化 |
| 2.4.4 裂解酶LysZ的酶学性质 |
| 2.4.5 离子强度对裂解酶LysZ活性的影响 |
| 2.4.6 裂解酶LysZ在牛奶中的应用研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 噬菌体裂解酶结合域和裂解域的制备与功能特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验原料与主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组质粒pET28a-EGFP-CBDz的构建 |
| 3.3.2 结合域EGFP-CBDz的表达与纯化 |
| 3.3.3 结合域EGFP-CBDz与金黄色葡萄球菌结合 |
| 3.3.4 温度对结合域EGFP-CBDz与金黄色葡萄球菌结合的影响 |
| 3.3.5 pH对结合域EGFP-CBDz与金黄色葡萄球菌结合的影响 |
| 3.3.6 离子强度对结合域EGFP-CBDz与金黄色葡萄球菌结合的影响 |
| 3.3.7 牛奶体系中结合域EGFP-CBDz与金黄色葡萄球菌结合研究 |
| 3.3.8 重组质粒pET28a-CHAP的构建 |
| 3.3.9 裂解域CHAP_(LysZ)的表达纯化 |
| 3.3.10 裂解域CHAP_(LysZ)的裂解活性检测 |
| 3.3.11 裂解域CHAP_(LysZ)的酶学性质测定 |
| 3.3.12 裂解域CHAP_(LysZ)温度稳定性的研究 |
| 3.3.13 牛奶组分对裂解域CHAP_(LysZ)活性的影响及其在牛奶中的应用 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 结合域EGFP-CBDz酶学性质研究 |
| 3.4.2 基于牛奶体系中裂解酶结合域与MRSA的结合能力评价 |
| 3.4.3 重组质粒pET28a-CHAP的构建 |
| 3.4.4 裂解域CHAP_(LysZ)的表达纯化 |
| 3.4.5 裂解域CHAP_(LysZ)的酶学性质 |
| 3.4.6 基于牛奶体系中裂解域CHAP_(LysZ)控制MRSA污染能力评价 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 噬菌体裂解酶及其裂解域在肉制品杀菌中应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验原料与主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)对猪肉和腊肉的MRSA污染的削减能力评估 |
| 4.3.2 最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 |
| 4.3.3 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)对MRSA生物膜去除能力评估 |
| 4.3.4 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)与抗生素协同对生物膜去除能力评估. |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)对鲜猪肉中MRSA的削减能力 |
| 4.4.2 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)对鲜猪肉中MRSA的削减能力 |
| 4.4.3 裂解酶LysZ和裂解域CHAP_(LysZ)对MRSA生物膜的削减能力 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 噬菌体裂解酶及其裂解域在皮肤杀菌中应用研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验原料与主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 小鼠皮肤模型建立 |
| 5.3.2 实验分组及处理 |
| 5.3.3 血液白细胞检测 |
| 5.3.4 伤口MRSA计数 |
| 5.3.5 皮肤组织苏木精伊红染色 |
| 5.3.6 炎症因子酶联免疫反应试验 |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 裂解酶和裂解域对皮肤损伤小鼠皮肤伤口愈合的影响研究 |
| 5.4.2 裂解酶和裂解域对皮肤损伤小鼠伤口组织的影响研究 |
| 5.4.3 裂解酶和裂解域对皮肤损伤小鼠伤口MRSA杀菌效果的研究 |
| 5.4.4 裂解酶和裂解域对皮肤损伤小鼠炎症反应及免疫反应的影响研究 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 噬菌体裂解酶结合域偶联金纳米颗粒制备与靶向杀菌研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 实验原料与主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器与设备 |
| 6.2.3 溶液配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 金纳米颗粒 Au@PEG-EGFP-CBDz 的制备 |
| 6.3.2 金纳米颗粒Au@PEG-COOH的表征 |
| 6.3.3 金纳米颗粒 Au@PEG-EGFP-CBDz 与 MRSA 的结合 |
| 6.3.4 金纳米颗粒Au@PEG-EGFP-CBDz在模拟体系中对MRSA的杀灭效果研究 |
| 6.3.5 金纳米颗粒Au@PEG-EGFP-CBDz对MRSA的体内杀灭作用研究 |
| 6.3.6 统计学分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 金纳米颗粒的表征 |
| 6.4.2 金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz在缓冲体系中对MRSA的杀灭效果研究 |
| 6.4.3 金纳米颗粒Au@PEG@EGFP-CBDz对小鼠细菌性感染的MRSA的杀灭效果研究 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）裂解多重耐药沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 沙门菌简介 |
| 1.2 噬菌体研究进展 |
| 1.2.1 噬菌体的形态和结构 |
| 1.2.2 噬菌体的分类 |
| 1.2.3 噬菌体的生活周期 |
| 1.2.4 噬菌体疗法在防控细菌感染中的应用 |
| 1.2.5 噬菌体疗法的劣势 |
| 1.2.6 噬菌体疗法的发展方向 |
| 1.2.7 展望 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第2章 广宿主谱沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品处理、初筛噬菌体、噬菌体分离与纯化 |
| 2.2.2 噬菌体增殖 |
| 2.2.3 噬菌体的效价测定 |
| 2.2.4 噬菌体复苏与保存 |
| 2.2.5 噬菌体裂解谱测定 |
| 2.2.6 噬菌体电镜 |
| 2.2.7 噬菌体吸附性试验 |
| 2.2.8 噬菌体的最佳MOI测定 |
| 2.2.9 噬菌体一步生长曲线测定 |
| 2.2.10 噬菌体pH稳定性测定 |
| 2.2.11 噬菌体热稳定性测定及室温稳定性测定 |
| 2.2.12 噬菌体体外抑菌试验 |
| 2.2.13 噬菌体对沙门菌生物被膜的抑制能力测定 |
| 2.2.14 噬菌体SHWT1安全性试验 |
| 2.2.15 鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌感染小鼠的LD_(50)测定 |
| 2.2.16 不同治疗时间对感染小鼠存活率的影响 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 噬菌体分离 |
| 2.3.2 噬菌体纯化 |
| 2.3.3 噬菌体的效价测定 |
| 2.3.4 噬菌体保存 |
| 2.3.5 噬菌体裂菌谱测定 |
| 2.3.6 噬菌体电镜 |
| 2.3.7 噬菌体吸附性试验 |
| 2.3.8 噬菌体的MOI测定 |
| 2.3.9 噬菌体一步生长曲线测定 |
| 2.3.10 噬菌体pH稳定性测定 |
| 2.3.11 噬菌体热稳定性测定及室温稳定性测定 |
| 2.3.12 噬菌体体外抑菌试验 |
| 2.3.13 噬菌体对沙门菌生物被膜的抑制能力测定 |
| 2.3.14 噬菌体SHWT1安全性试验 |
| 2.3.15 鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌感染小鼠的LD_(50)测定 |
| 2.3.16 不同治疗时间对感染小鼠存活率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 沙门菌噬菌体SHWT1的全基因组学测序及分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬菌体SHWT1核酸类型鉴定 |
| 3.2.2 噬菌体SHWT1全基因组测序 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 噬菌体核酸类型 |
| 3.3.2 噬菌体基因组分析 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 沙门菌噬菌体溶菌酶LysSHWT1的制备及抑菌活性分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 分子生物学及数据分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 溶菌酶LysSHWT1的克隆表达 |
| 4.2.2 溶菌酶LysSHWT1的裂解活性 |
| 4.2.3 溶菌酶LysSHWT1裂解谱的测定 |
| 4.2.4 溶菌酶LysSHWT1与膜通透剂EDTA联用抑菌活性分析 |
| 4.2.5 溶菌酶LysSHWT1对4种血清型沙门菌的裂解活性测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 沙门菌溶菌酶序列分析 |
| 4.3.2 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.3 融合蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.4 溶菌酶LysSHWT1抑菌活性检测及裂解谱测定 |
| 4.3.5 溶菌酶LysSHWT1与膜通透剂EDTA联用抑菌活性分析 |
| 4.3.6 溶菌酶LysSHWT1对4种血清型沙门菌的裂解活性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）种鸡生产链沙门菌污染的研究及鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英语缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Salmonella病原学 |
| 1.1.1 Salmonella的形态结构 |
| 1.1.2 Salmonella的理化特性 |
| 1.1.3 Salmonella的培养特性 |
| 1.1.4 Salmonella的生化特性 |
| 1.1.5 Salmonella的分类 |
| 1.2 鸡源Salmonella的流行病学研究 |
| 1.2.1 鸡养殖链Salmonella的污染情况 |
| 1.2.2 禽类产品中Salmonella污染情况 |
| 1.2.3 禽salmonellosis的危害 |
| 1.2.4 Salmonella耐药现状 |
| 1.3 鸡产业链防控Salmonella的措施 |
| 1.3.1 种鸡群Salmonella的净化 |
| 1.3.2 生物安全防控措施 |
| 1.3.3 药物预防和治疗 |
| 1.3.4 微生态制剂 |
| 1.3.5 噬菌体治疗 |
| 1.4 Salmonella分型研究 |
| 1.4.1 表型分型 |
| 1.4.1.1 血清分型 |
| 1.4.1.2 生化分型 |
| 1.4.1.3 噬菌体分型 |
| 1.4.2 分子分型 |
| 1.4.2.1 脉冲场凝胶电泳(PFGE) |
| 1.4.2.2 多位点序列分析(MLST) |
| 1.4.2.3 肠杆菌间重复共有序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR) |
| 1.5 本课题研究的主要内容及其目的和意义 |
| 第二章 种鸡生产链中Salmonella的分离鉴定及耐药性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 Salmonella分离鉴定所需仪器及材料 |
| 2.1.3 标准菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 采集样品 |
| 2.2.2 样品的处理 |
| 2.2.3 Salmonella的分离与初步鉴定 |
| 2.2.4 Salmonella的血清型鉴定 |
| 2.2.5 Salmonella分离株的抗生素敏感性试验 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不同种鸡公司Salmonella的分离情况 |
| 2.3.2 不同环节Salmonella的分离情况 |
| 2.3.3 PD-FT抗体阳性种鸡体内不同器官Salmonella检出结果 |
| 2.3.4 Salmonella血清型鉴定结果 |
| 2.3.5 Salmonella分离株抗生素敏感性测定结果 |
| 2.3.6 Salmonella分离株多重耐药测定结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 种鸡生产链Salmonella优势血清型基因分型的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 试验用仪器及材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 受试菌株的复苏及血清型的鉴定 |
| 3.2.2 受试菌株DNA的提取 |
| 3.2.3 ERIC-PCR分型 |
| 3.2.3.1 ERIC-PCR引物 |
| 3.2.3.2 ERIC-PCR扩增 |
| 3.2.3.3 ERIC-PCR指纹图谱分析 |
| 3.2.4 MLST分型 |
| 3.2.4.1 管家基因及引物 |
| 3.2.4.2 MLST扩增及测序 |
| 3.2.4.3 分型 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 沙门菌鉴定结果 |
| 3.3.2 ERIC-PCR的扩增结果 |
| 3.3.3 SP分离株的ERIC-PCR聚类分析结果 |
| 3.3.3.1 DGGX04 公司SP分离株的ERIC-PCR结果 |
| 3.3.3.2 DGGX11 公司SP分离株的ERIC-PCR结果 |
| 3.3.3.3 DGGX12 公司SP分离株的ERIC-PCR结果 |
| 3.3.3.4 DGXX13 公司SP分离株的ERIC-PCR结果 |
| 3.3.3.5 DGGX17 公司SP分离株的ERIC-PCR结果 |
| 3.3.3.6 各公司代表性ERIC型 SP分离株的聚类分析结果 |
| 3.3.4 MLST分型结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 鸡白痢Salmonella噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 主要的实验设备 |
| 4.1.4 主要试剂及培养基的制备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 噬菌体的分离纯化 |
| 4.2.1.1 宿主菌菌液的制备 |
| 4.2.1.2 样品处理 |
| 4.2.1.3 验证噬菌体 |
| 4.2.1.4 分离与纯化噬菌体 |
| 4.2.1.5 测定噬菌体效价 |
| 4.2.1.6 噬菌体的宿主谱筛选 |
| 4.2.2 噬菌体SP19 的生物学特性测定 |
| 4.2.2.1 噬菌体的形态观察 |
| 4.2.2.2 噬菌体感染复数(MOI)的测定 |
| 4.2.2.3 噬菌体一步生长曲线的测定 |
| 4.2.2.4 噬菌体的温度稳定性 |
| 4.2.2.5 噬菌体的pH稳定性 |
| 4.2.2.6 噬菌体对氯仿的敏感性试验 |
| 4.2.2.7 噬菌体对宿主菌的抑制试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 噬菌体的分离纯化 |
| 4.3.1.1 噬菌体的分离 |
| 4.3.1.2 噬菌体的纯化 |
| 4.3.1.3 噬菌体效价的测定 |
| 4.3.1.4 噬菌体宿主谱的筛选 |
| 4.3.2 噬菌体SP19 生物学特性的测定 |
| 4.3.2.1 噬菌体电镜形态观察结果 |
| 4.3.2.2 噬菌体MOI的测定结果 |
| 4.3.2.3 噬菌体的一步生长曲线测定结果 |
| 4.3.2.4 噬菌体温度稳定性的测定结果 |
| 4.3.2.5 噬菌体pH稳定性的测定结果 |
| 4.3.2.6 噬菌体氯仿敏感性试验的测定结果 |
| 4.3.2.7 噬菌体对宿主菌SP04-111 的抑制作用结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
（6）遗传多态性驱动细菌和噬菌体的共进化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 噬菌体的基本特性 |
| 1.2 噬菌体治疗的发展 |
| 1.3 细菌耐受噬菌体研究现状 |
| 1.4 噬菌体与细菌共进化的研究进展 |
| 1.5 噬菌体与细菌共进化的研究方法 |
| 1.5.1 进化前后噬菌体和细菌形态结构改变的研究方法 |
| 1.5.2 进化前后噬菌体和细菌生理生化功能改变的研究方法 |
| 1.5.3 基于高通量测序技术鉴定细菌和噬菌体在进化过程中遗传信息的改变 |
| 1.5.4 基因组变异信息识别的生物信息学技术 |
| 1.6 目前噬菌体与细菌共进化研究存在的问题 |
| 1.7 本论文的研究思路 |
| 1.8 本论文的研究目的、内容与意义 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌及其烈性噬菌体基因组中存在遗传多态性 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 试剂与耗材 |
| 2.2.3 菌株和培养条件 |
| 2.2.4 培养基与溶液配方 |
| 2.2.5 耐噬菌体细菌的筛选 |
| 2.2.6 进化前后细菌的扩增与保存 |
| 2.2.7 进化前后细菌生长速率的测定 |
| 2.2.8 噬菌体LQ7的实验室进化 |
| 2.2.9 噬菌体侵染活性测试 |
| 2.2.10 进化前后噬菌体对耐原始噬菌体突变株生长的影响 |
| 2.2.11 进化前后噬菌体电镜观察形态变化 |
| 2.2.12 噬菌体吸附能力测试 |
| 2.2.13 细菌基因组DNA提取 |
| 2.2.14 噬菌体基因组DNA提取 |
| 2.2.15 基因组数据质量控制与过滤 |
| 2.2.16 细菌和噬菌体基因组的从头组装 |
| 2.2.17 细菌和噬菌体基因组注释 |
| 2.2.18 构建单拷贝同源基因系统发育树 |
| 2.2.19 细菌和噬菌体基因组变异分析 |
| 2.2.20 细菌和噬菌体遗传多态性分析 |
| 2.2.21 测定氯霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度 |
| 2.2.22 氯霉素和原始噬菌体LQ7联用对细菌R1-3-1生长的影响 |
| 2.2.23 探究不同处理下原始细菌AB91118对氯霉素和进化前后噬菌体产生耐受突变体的频率 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 耐原始噬菌体的金黄色葡萄球菌突变体的分离和生长速率的测定 |
| 2.3.2 进化后噬菌体显着提高对耐原始噬菌体突变株的杀菌活性 |
| 2.3.3 进化前后噬菌体的形态结构分析 |
| 2.3.4 进化后噬菌体对耐原始噬菌体的突变株R1-3-1的吸附能力显着增强 |
| 2.3.5 细菌和噬菌体基因组DNA浓度与纯度测定结果 |
| 2.3.6 细菌与噬菌体基因组质控与组装 |
| 2.3.7 细菌单拷贝同源基因系统发育分析 |
| 2.3.8 细菌和噬菌体基因组突变分析 |
| 2.3.9 细菌基因组遗传多态性分析 |
| 2.3.10 噬菌体基因组遗传多态性分析 |
| 2.3.11 使用氯霉素验证细菌进化的猜想 |
| 2.3.12 氯霉素和噬菌体联用对细菌敏感性的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 公共数据挖掘噬菌体和细菌基因组中的遗传多态性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 共进化公共数据的获取及数据转化 |
| 3.2.2 共进化公共数据再处理与目的性选择 |
| 3.2.3 利用公共数据分析细菌和噬菌体共进化系统中的遗传多态性 |
| 3.2.4 四株细菌NGS测序公共数据的获取 |
| 3.2.5 公共数据中四株细菌基因组测序深度及测序错误率统计 |
| 3.2.6 公共数据中四株细菌基因组遗传多态性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 共进化公共数据的测序深度 |
| 3.3.2 共进化细菌和噬菌体测序错误率统计 |
| 3.3.3 共进化过程中细菌和噬菌体基因组上存在遗传多态性 |
| 3.3.4 细菌基因组二代高通量数据测序深度和错误率分析 |
| 3.3.5 四株细菌基因组预测结果 |
| 3.3.6 四株细菌基因组上均存在遗传多态性 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 遗传多态性驱动噬菌体在逆境下的适应性进化 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器与试剂 |
| 4.2.2 试剂与耗材 |
| 4.2.3 菌株与培养条件 |
| 4.2.4 培养基与溶液配方 |
| 4.2.5 透射电子显微镜观察噬菌体形态 |
| 4.2.6 适应性进化前后噬菌体基因组提取和高通量测序 |
| 4.2.7 适应性进化前后噬菌体的基因组组装 |
| 4.2.8 适应性进化前后噬菌体系统发育分析 |
| 4.2.9 适应性进化前后噬菌体基因组分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 噬菌体的形态结构 |
| 4.3.2 适应性进化前后噬菌体基因组DNA浓度与纯度测定 |
| 4.3.3 适应性进化前后噬菌体基因组测序深度和测序错误率统计 |
| 4.3.4 适应性进化前后噬菌体基因组组装和基因预测及注释 |
| 4.3.5 适应性进化前后噬菌体系统发育分析结果 |
| 4.3.6 适应性进化前后噬菌体基因组的遗传信息的改变 |
| 4.3.7 适应性进化前后噬菌体基因组中均存在遗传多态性位点 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）沙门菌PhoN蛋白单克隆抗体和纳米抗体的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 沙门菌外膜蛋白及纳米抗体在病原检测中的应用 |
| 1 外膜蛋白在沙门菌检测中的应用 |
| 1.1 沙门菌外膜蛋白概述 |
| 1.2 基于外膜蛋白的沙门菌检测 |
| 2 纳米抗体在病原微生物检测中的应用 |
| 2.1 纳米抗体概述 |
| 2.2 Nb的结构和功能特征 |
| 2.2.1 Nb的结构特征 |
| 2.2.2 纳米抗体的功能特征 |
| 2.3 Nb的制备方法 |
| 2.3.1 酵母表面展示技术 |
| 2.3.2 噬菌体展示技术 |
| 2.4 Nb的应用 |
| 2.4.1 在疾病诊断与治疗中的应用 |
| 2.4.2 在病原微生物检测中的应用 |
| 3 展望 |
| 第1章 沙门菌PhoN蛋白传统单抗的制备及初步应用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 菌种及质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备和实验动物 |
| 1.1.4 沙门菌phoN基因的克隆 |
| 1.1.4.1 引物的设计 |
| 1.1.4.2 DNA模板的制备 |
| 1.1.4.3 phoN基因的扩增 |
| 1.1.5 沙门菌phoN基因重组表达菌的构建 |
| 1.1.5.1 原核表达载体的制备 |
| 1.1.5.2 重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 1.1.5.3 重组表达菌的构建和鉴定 |
| 1.1.6 PhoN重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 1.1.6.1 重组蛋白的表达分析 |
| 1.1.6.2 重组蛋白的纯化 |
| 1.1.6.3 重组蛋白的Western Blot分析 |
| 1.1.7 沙门菌PhoN蛋白传统单克隆抗体的制备 |
| 1.1.7.1 动物免疫 |
| 1.1.7.2 B细胞杂交瘤的制备 |
| 1.1.7.3 建立间接ELISA方法 |
| 1.1.7.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.1.7.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆化 |
| 1.1.7.6 单克隆抗体腹水的制备 |
| 1.1.8 沙门菌PhoN单克隆抗体的鉴定 |
| 1.1.8.1 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 1.1.8.2 腹水效价的测定 |
| 1.1.8.3 ELISA分析单抗特异性 |
| 1.1.8.4 Western Blot分析单抗特异性 |
| 1.1.9 沙门菌免疫富集磁珠的制备 |
| 1.1.9.1 活化PM3-050羧基磁珠 |
| 1.1.9.2 活化磁珠与抗体偶联 |
| 1.1.9.3 免疫磁珠富集不同细菌 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 目的基因的扩增与重组质粒的鉴定 |
| 1.2.2 重组蛋白SDS-PAGE分析 |
| 1.2.3 重组蛋白的Western Blot分析 |
| 1.2.4 间接ELISA方法的建立 |
| 1.2.5 单抗亚类及效价测定 |
| 1.2.6 单抗Western Blot分析 |
| 1.2.7 单抗特异性分析 |
| 1.2.8 免疫磁珠富集效果分析 |
| 1.3 讨论 |
| 第2章 沙门菌PhoN蛋白纳米抗体的制备及初步应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌种及质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 动物免疫和抗体效价测定 |
| 2.1.4.1 羊驼免疫 |
| 2.1.4.2 抗体效价测定 |
| 2.1.5 噬菌体展示文库的构建 |
| 2.1.5.1 血液淋巴细胞总RNA的提取和反转录 |
| 2.1.5.2 引物的设计与合成 |
| 2.1.5.3 VHH目的基因的扩增 |
| 2.1.5.4 重组载体pCANTAB5E-VHH的构建 |
| 2.1.6 噬菌体文库的构建及特异性纳米抗体的淘选 |
| 2.1.6.1 噬菌体的扩增及滴度的测定 |
| 2.1.6.2 文库的救援及浓度测定 |
| 2.1.6.3 重组噬菌体的淘选 |
| 2.1.6.4 重组纳米抗体的诱导表达及粗提物获取 |
| 2.1.6.5 可溶性重组纳米抗体的ELISA检测 |
| 2.1.6.6 特异性纳米抗体测序分析 |
| 2.1.7 纳米抗体Nb2的原核表达和鉴定 |
| 2.1.7.1 目的基因的扩增和重组表达菌的构建 |
| 2.1.7.2 纳米抗体的诱导表达和纯化 |
| 2.1.7.3 纳米抗体的Western Blot分析 |
| 2.1.8 基于Nb2纳米抗体的免疫磁珠的制备 |
| 2.1.9 Nb2-免疫磁珠在沙门菌检测中的初步应用 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 免疫羊驼抗体效价测定 |
| 2.2.2 VHH目的基因的扩增 |
| 2.2.3 噬菌体展示文库的构建 |
| 2.2.4 特异性纳米抗体淘选 |
| 2.2.5 重组蛋白反应原性鉴定 |
| 2.2.6 阳性纳米抗体序列分析 |
| 2.2.7 Nb2基因的扩增与重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 纳米抗体Nb2表达的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.9 纳米抗体Nb2的Western Blot分析 |
| 2.2.10 Nb2-免疫磁珠的富集效率分析 |
| 2.2.11 Nb2-免疫磁珠的初步应用 |
| 2.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 革兰氏阴性菌耐药性研究进展 |
| 1.1 肠杆菌科细菌耐药性研究现状 |
| 1.2 铜绿假单胞菌耐药性研究现状 |
| 1.3 不动杆菌耐药性研究现状 |
| 第2章 金黄色葡萄球菌耐药性研究进展 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性研究 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药性研究 |
| 2.3 金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素耐药性研究 |
| 2.4 金黄色葡萄球菌对四环素类抗生素耐药性研究 |
| 2.5 金黄色葡萄球菌对磷霉素耐药性研究 |
| 2.6 金黄色葡萄球菌对氯霉素耐药性研究 |
| 2.7 金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮类抗生素耐药性研究 |
| 2.8 金黄色葡萄球菌对磺胺类抗生素耐药性研究 |
| 2.9 金黄色葡萄球菌对其它抗生素耐药性研究 |
| 第3章 细菌性溶血素研究进展 |
| 3.1 金黄色葡萄球菌溶血素在其致病过程中的作用研究 |
| 3.2 单增李斯特菌溶血素(LLO) |
| 3.3 肺炎球菌溶血素(PLY) |
| 3.4 猪链球菌溶血素(SLY) |
| 3.5 产气荚膜梭菌溶血素(PFO) |
| 3.6 大肠杆菌溶血素 |
| 第4章 主要五环三萜类化合物的药理学作用研究进展 |
| 4.1 齐墩果酸 |
| 4.2 熊果酸 |
| 4.3 山楂酸 |
| 4.4 科罗索酸 |
| 4.5 其它五环三萜化合物 |
| 第5章 新型抗耐药菌感染药物研究进展 |
| 5.1 现有抗生素的改造和联合使用研究 |
| 5.2 新型抗菌药物的研究 |
| 5.3 天然化合物在抗耐药菌感染中的替代策略研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 广谱β-内酰胺酶抑制剂的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体外协同作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 齐墩果酸与β-内酰胺类抗生素的体内协同作用研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 齐墩果酸抑制细菌性溶血素活性作用的发现 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 齐墩果酸抑制Β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用机制的确证 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 本硕博连读期间发表学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）噬菌体内溶素的裂解机制及其在宿主水稻细菌性褐条病菌中的抗氧化功能探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 水稻细菌性褐条病菌及其噬菌体 |
| 1.1.1 水稻细菌性褐条病菌 |
| 1.1.2 水稻细菌性褐条病菌噬菌体 |
| 1.2 噬菌体内溶素裂解宿主细菌 |
| 1.2.1 内溶素的裂解机制 |
| 1.2.2 内溶素的应用与防治 |
| 1.3 噬菌体在宿主细菌毒力上的作用 |
| 1.3.1 溶源性转换作用 |
| 1.3.2 转导作用 |
| 1.4 细菌抗活性氧系统 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第2章 噬菌体内溶素LysAP裂解机制的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基及溶液配制 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 噬菌体基因组的提取 |
| 2.2.2 LysAP蛋白功能预测 |
| 2.2.3 LysAP突变体的构建 |
| 2.2.4 LysAP运转途径 |
| 2.2.5 裂解活性比较 |
| 2.2.6 Western blot检测LysAP蛋白的表达 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 LysAP蛋白功能预测 |
| 2.3.2 LysAP运转途径 |
| 2.3.3 裂解活性比较 |
| 2.3.4 Western blot检测LysAP蛋白的表达 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 宿主菌类噬菌体内溶素LysAo的抗氧化功能探究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 培养基及溶液配制 |
| 3.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细菌基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 LysAo生物信息学预测 |
| 3.2.3 LysAo过表达质粒的构建 |
| 3.2.4 裂解活性比较 |
| 3.2.5 LysAo突变体及回补体的构建 |
| 3.2.6 LysAo突变体表型测定 |
| 3.2.7 LysAo与致病力和抗氧化系统相关功能鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 LysAo生物信息学预测 |
| 3.3.2 裂解活性比较 |
| 3.3.3 LysAo突变体及回补体的构建 |
| 3.3.4 LysAo突变体表型测定 |
| 3.3.5 LysAo与致病力和抗氧化系统相关功能鉴定 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 全文小结与展望 |
| 4.1 噬菌体内溶素LysAP裂解机制的鉴定 |
| 4.2 宿主细菌类噬菌体内溶素LysAo的鉴定和功能分析 |
| 4.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（10）奶牛乳房炎病原菌调查及裂解性噬菌体的分离鉴定与生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳房炎概述 |
| 1.1.1 奶牛乳房炎的病因 |
| 1.1.2 奶牛乳房炎的诊断 |
| 1.1.3 奶牛乳房炎的预防与治疗 |
| 1.1.4 葡萄球菌性奶牛乳房炎 |
| 1.2 噬菌体概述 |
| 1.2.1 噬菌体的分类 |
| 1.2.2 噬菌体与细菌的作用原理 |
| 1.2.3 噬菌体治疗的优势与局限性 |
| 1.2.4 噬菌体的实际应用与发展趋势 |
| 1.3 本研究意义及创新点 |
| 第二章 引起奶牛乳房炎致病菌调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验培养基及主要试剂 |
| 2.1.2 试验仪器及设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 菌株分离筛选及纯化 |
| 2.2.3 分离菌株DNA提取及16S rDNA序列测序 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 样品采集及分菌结果 |
| 2.3.2 分离菌株的鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌流行特征分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验培养基及主要试剂 |
| 3.1.2 试验仪器及设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 金黄色葡萄球菌携带毒力基因的检测 |
| 3.2.2 金黄色葡萄球菌携带抗性基因的检测 |
| 3.2.3 金黄色葡萄球菌抗生素敏感性实验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 金黄色葡萄球菌携带毒力基因检测结果 |
| 3.3.2 金黄色葡萄球菌携带抗性基因检测结果 |
| 3.3.3 金黄色葡萄球菌抗生素敏感性结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体分离及其生物学特性 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验培养基及主要试剂 |
| 4.1.2 试验仪器及设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 噬菌体的分离 |
| 4.2.2 噬菌体的筛选 |
| 4.2.3 噬菌体的纯化 |
| 4.2.4 噬菌体效价的测定 |
| 4.2.5 噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定 |
| 4.2.6 高效价噬菌体的制备 |
| 4.2.7 噬菌体扩增与保存 |
| 4.2.8 噬菌体透射电镜观察 |
| 4.2.9 噬菌体基因组提取及测序分析 |
| 4.2.10 噬菌体一步生长曲线的测定 |
| 4.2.11 噬菌体宿主范围的测定 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 噬菌体分离纯化结果与效价的测定 |
| 4.3.2 噬菌体的电镜观察 |
| 4.3.3 噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定 |
| 4.3.4 噬菌体基因组测序结果及分析 |
| 4.3.5 噬菌体一步生长曲线 |
| 4.3.6 噬菌体宿主范围的测定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 噬菌体在不同条件下的稳定性及其抑菌效果评价 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验培养基及主要试剂 |
| 5.1.2 试验仪器及设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 噬菌体pH敏感性研究 |
| 5.2.2 噬菌体热稳定性研究 |
| 5.2.3 噬菌体紫外敏感性研究 |
| 5.2.4 噬菌体氯仿敏感性研究 |
| 5.2.5 噬菌体体外试管杀菌效力研究 |
| 5.2.6 噬菌体在牛奶中的杀菌效力研究 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 噬菌体pH敏感性 |
| 5.3.2 噬菌体热稳定性 |
| 5.3.3 噬菌体紫外敏感性 |
| 5.3.4 噬菌体氯仿敏感性 |
| 5.3.5 噬菌体体外试管杀菌效力 |
| 5.3.6 噬菌体在牛奶中的杀菌效力 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 1.本研究主要结论 |
| 2.本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望（论文参考文献）
- [1]噬菌体的过去、现在与未来[J]. 胡福泉. 西南医科大学学报, 2021(05)
- [2]噬菌体在水产养殖业中的研究进展[J]. 陈愿,张永安,周洋. 水产学报, 2021(09)
- [3]金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶及其结构域的制备与功能特性研究[D]. 闫继爱. 江南大学, 2021(01)
- [4]裂解多重耐药沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析[D]. 陶程琳. 扬州大学, 2021
- [5]种鸡生产链沙门菌污染的研究及鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定[D]. 汪敏. 广西大学, 2021(12)
- [6]遗传多态性驱动细菌和噬菌体的共进化[D]. 张晓旭. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2021
- [7]沙门菌PhoN蛋白单克隆抗体和纳米抗体的制备及初步应用[D]. 高杨. 扬州大学, 2021
- [8]齐墩果酸抑制β-内酰胺酶和细菌性溶血素活性作用及其机制研究[D]. 周永林. 吉林大学, 2021(01)
- [9]噬菌体内溶素的裂解机制及其在宿主水稻细菌性褐条病菌中的抗氧化功能探究[D]. 洪纤纤. 浙江大学, 2021(01)
- [10]奶牛乳房炎病原菌调查及裂解性噬菌体的分离鉴定与生物学特性研究[D]. 屈云. 西南民族大学, 2021(02)