一、神经元缺氧坏死与细胞外液中不同钙离子浓度的关系（论文文献综述）
杨顺波[1]（2021）在《钙敏感受体在灵芝酸A干预无镁细胞外液孵育海马神经元中的表达及其对MAPK通路的影响》文中提出目的:通过无镁细胞外液孵育海马神经元诱导异常放电,建立癫痫样放电海马神经元模型,聚焦钙敏感受体、MAPK信号通路,研究灵芝酸A对钙敏感受体和MAPK通路信号转导蛋白（ERK,P38）表达的影响,研究灵芝酸A对痫性细胞的影响,进一步探究灵芝酸A抗癫痫的效应及可能的作用机制。为今后进一步探究癫痫发病机制及癫痫的药物治疗提供理论依据。方法:将培养至第11天的海马神经元全液换成无镁细胞外液处理3 h,建立癫痫样放电海马神经元的模型,将共培养的细胞随机分为8组,A组（正常对照）,B组(无Mg2+细胞外液诱导),C组(无Mg2+细胞外液诱导+丙戊酸钠),D组(无Mg2+细胞外液诱导+灵芝酸A),E组(无Mg2+细胞外液诱导+灵芝酸A+精胺),F组(无Mg2+细胞外液诱导+灵芝酸A+NPS2390),G0组(无Mg2+细胞外液诱导+PD98059+灵芝酸A+精胺)、G1组(无Mg2+细胞外液诱导+SB203580+灵芝酸A+精胺)。通过MTT比色法、TUNEL染色观察检测海马神经元存活率和细胞凋亡,Western blot检测各组Ca SR、ERK、P38蛋白的表达。结果:MTT结果显示,与正常组相比,无镁组细胞存活率显着降低（P<0.01）;与无镁组相比,无镁+丙戊酸钠组,无镁+灵芝酸A组细胞存活率增加（P<0.05）,无镁+灵芝酸A+NPS2390组细胞存活率显着增加（P<0.01）;与无镁+灵芝酸A组相比,无镁+灵芝酸A+精胺组细胞存活率降低（P<0.05）,无镁+丙戊酸钠组细胞存活率无明显差异（P>0.05）。TUNEL染色结果显示,与正常组相比,无镁组细胞凋亡显着增加（P<0.01）;与无镁组相比,无镁+灵芝酸A组细胞凋亡减少（P<0.05）,无镁+灵芝酸A+NPS2390细胞凋亡组显着降低（P<0.01）;与无镁+灵芝酸A组相比,无镁+丙戊酸钠组和无镁+灵芝酸A+NPS2390组细胞凋亡无明显差异（P>0.05）,无镁+灵芝酸A+精胺组细胞凋亡显着增加（P<0.01）。蛋白免疫印迹结果显示,与正常组相比,无镁组Ca SR,P38蛋白表达量显着增加（P<001）;与无镁组相比,无镁+丙戊酸钠组和无镁+灵芝酸A组Ca SR,P38蛋白表达量显着降低（P<001）;与无镁+灵芝酸A组相比,无镁+灵芝酸A+精胺组Ca SR,P38蛋白表达量显着增加（P<0.01）;与正常组相比,无镁组p-ERK蛋白量显着降低（P<0.01）;与无镁组相比,无镁+丙戊酸钠组与无镁+灵芝酸A组p-ERK蛋白量均增加（P<0.05）;无镁+灵芝酸A+NPS2390组p-ERK蛋白量显着增加（P<0.01）;与无镁+灵芝酸A组相比,无镁+丙戊酸钠组和无镁+灵芝酸A+NPS2390组表达量无明显差异（P>0.05）,无镁+灵芝酸A+精胺组蛋白表达量降低（P<0.05）;与无镁+灵芝酸A+精胺组相比,无镁+灵芝酸A+精胺+ERK抑制剂组蛋白表达降低（P<0.05）。结论:1.灵芝酸A可以减轻海马癫痫样放电神经元凋亡,提高细胞存活率;2.灵芝酸A可以降低放电海马癫痫样神经元中Ca SR,p-P38蛋白量的表达,增加p-ERK的表达;3.灵芝酸A可以通过Ca SR介导的ERK,P38信号转导途径保护神经细胞,发挥抗癫痫作用。
陈野[2]（2021）在《H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用》文中认为背景中风是目前最常见的死亡原因之一,也是在全世界范围内持续性和获得性残疾的主要原因,随着人口变化,发病率进一步增加,对人们生活的质量带来巨大负担。中风分为出血性中风和缺血性中风,后者更常见,当前治疗的重点是通过静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注,但再灌注的同时也会损害大脑组织,因此对中风可用的治疗方法极为有限,研究预防策略正朝着卒中管理的前沿发展,一些新的进展为神经保护带来了新的希望。Ras同源家族成员A（Rho A）,是一种分布广泛的胞质蛋白,属于小GTP酶家族,鸟苷三磷酸水解酶（Rho GTPases）构成了相当普遍表达的胞质分子开关,控制了一系列下游效应子的活性,Rho依赖性卷曲螺旋激酶（ROCK）是Rho A最直接、最主要的效应分子,有ROCK1和ROCK2两种亚型。缺血性脑损伤可诱导Rho A激活和ROCK2表达的显着上调,越来越多的证据表明,Rho A/ROCK通路参与了中枢神经系统一些疾病的病理过程。Rho A的磷酸化是导致其功能发生改变和调节其活性的主要方式之一,Rho A在Ser188位点磷酸化能够抑制Rho A激活。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种普遍存在的第二信使分子,起神经调节剂的作用,在许多哺乳动物器官和系统中均具有重要功能,参与大脑的生理和病理机制。内源性H2S合成的酶主要包含胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。我们前期研究证明了H2S可促进大鼠脑血管平滑肌细胞中KCa通道的开放,CSE产生的H2S对小鼠脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤具有保护作用,但其作用的分子机制尚不明确。前期研究者报道脑内皮/神经血管单位（Neurovascular unit,NVU）存在重要作用,脑血管的自动调节对于保护神经细胞免受缺血性损伤非常重要,缺血性脑组织的重塑涉及神经元和微血管细胞之间的相互作用,对神经血管单位缺血性死亡过程涉及的机制有待深入的了解。基于以上的研究背景,我们做了以下几个方面研究:1.构建并表达Glutathione S-transferase（GST）标签的Rho A野生型(GST-Rho Awild)和Rho A Ser188位点突变型(GST-Rho AS188A)蛋白,观察外源性H2S（Sodium hydrosulfide,Na HS）对其体外磷酸化的影响。2.探讨H2S抑制Rho A/ROCK通路的靶点和机制,并研究H2S促进Rho A Ser188磷酸化对海马神经元缺氧复氧（Hypoxia-Reoxygenation,H/R）损伤和大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。目的1.观察H2S对Rho A的Ser188位点磷酸化的调节;2.探讨H2S对海马神经元Rho A Ser188位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨Rho A Ser188位点在H2S对大鼠缺血性脑损伤保护的影响。方法1.构建Rho Awild-p GEX-6p-1和Rho A S188A-p GEX-6p-1重组原核质粒,诱导表达并纯化GST-Rho Awild和GST-Rho AS188A蛋白,在进行体外磷酸化测定。2.构建Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1重组真核质粒,再进行大鼠原代海马神经细胞（Hippocampal nerve cells,HNCs）培养与鉴定,并将重组质粒通过电转染到HNCs中,给与不同浓度的外源性H2S（Na HS）后western blot测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,酶联免疫实验（ELISA）法测定Rho A和ROCK2活性。3.全细胞膜片钳记录Na HS对转染重组质粒后的神经细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）电流的影响。4.建立H/R损伤模型,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染重组质粒后的神经细胞活力变化,乳酸脱氢酶（LDH）,神经特异性烯醇化酶（NSE）释放变化评估其损伤。5.原代大鼠脑血管内皮细胞（ECs）培养与鉴定,CSE-/-小鼠和3-MST-/-大鼠的原代内皮细胞与神经细胞共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达水平,测定Rho A和ROCK2活性,同时测定两种内皮细胞释放的H2S含量。6.分别将Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒转染到HNCs,与CSE-/-ECs进行共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,并进行H/R损伤造模。测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及细胞活力、培养上清LDH和NSE的变化。7.Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察神经细胞核损伤情况,Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测凋亡细胞。8.Ca2+成像系统荧光显微镜（Olympus IX73）检测神经细胞内Ca2+含量并获得细胞内Ca2+信号的荧光图像。9.脑立体定位转染Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒到大鼠海马区域,通过western blot检测Rho Awild和Rho AS188A蛋白表达,冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效果。10.双侧颈总动脉结扎2VO对转染成功的大鼠建立脑I/R模型,激光散斑成像技术（Laser speckle imaging,LSI）检测血流变化,观察造模成功与否。缺血2h再灌注24h后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察海马区域损伤程度,TUNEL检测海马神经细胞凋亡情况,western blot检测海马组织Rho A Ser188磷酸化蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及血清LDH,NSE的变化。结果1.放射自显影结果显示,在PKG1存在下,H2S供体Na HS（100μmol/L）显着促进了GST-Rho Awild蛋白的磷酸化,但是GST-Rho AS188A蛋白并没有发生磷酸化。这表明Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.H2S（Na HS和内皮源性CSE产生）可促进空质粒或GFP-Rho Awild或GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中Rho A的磷酸化,以及GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中GFP-Rho Awild的磷酸化。与对照组相比,p-Rho A/Rho A比值或p-GFP-Rho Awild/GFP-Rho Awild比值明显增加。但对GFP-Rho AS188A的磷酸化没有影响,GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中的p-GFP-Rho AS188A/GFP-Rho AS188A比值与对照组相比没有明显变化。这些结果表明,H2S可以诱导大鼠海马神经元中的Rho A磷酸化,并且这种磷酸化由Rho A Ser188介导。3.H2S能够使Rho A和GFP-Rho Awild在细胞膜中的含量显着减少,在胞质中的表达增高,但对GFP-Rho AS188A在细胞膜和细胞质中的分布没有明显影响。这些结果表明,Ser188是H2S引起神经元中Rho A从细胞膜向细胞质内易位的必需条件,同时可以通过Ser188抑制Rho A活性。4.Na HS对转染GFP-Rho AS188A质粒的神经细胞BKCa通道电流的增加低于转染空质粒和GFP-Rho Awild质粒组且具有显着性差异（30 m V-70 m V）这些结果表明,Na HS对BKCa通道电流的增加受到Rho A Ser188的调控。5.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马神经元中,H2S可显着抑制ROCK2蛋白的表达及其活性,但在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,抑制作用减弱,表明Rho A Ser188与H2S抑制神经元中ROCK2蛋白表达及其活性有关。6.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中,H2S显着抑制细胞活力的降低以及LDH和NSE活性的增加。然而,在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,H2S的这些作用显着降低。这些结果表明,Rho A Ser188介导了H2S对神经细胞H/R损伤的保护作用。7.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒或GFP-Rho AS188A质粒转染的CSE-/-EC共培养神经元中,H/R损伤诱导神经细胞凋亡和细胞内游离Ca2+荧光强度显着增加。在空质粒或GFP-Rho Awild质粒共培养的神经元中,CSE+/+EC可以明显降低H/R损伤诱导神经细胞凋亡的增加和细胞内游离Ca2+荧光强度,但对转染GFP-Rho AS188A质粒共培养的神经元没有影响。这些结果表明,内皮CSE产生的H2S可以通过抑制细胞内游离Ca2+的增加来保护神经元免受H/R损伤,并且该作用是由Rho A Ser188介导的。8.动物体内实验中,在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马中,Na HS能够促进Rho A的磷酸化,抑制Rho A活性,同时降低ROCK2的表达和活性,减轻大鼠脑I/R损伤诱导的血清LDH和NSE的增高,以及海马组织中神经细胞损伤和凋亡。但对转染GFP-Rho AS188A质粒的海马组织中这些作用显着降低。这些结果表明,Na HS减轻大鼠脑I/R损伤且与Rho A Ser188有关。结论1.Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.Na HS可能通过Rho A Ser188增加大鼠海马神经细胞中BKCa通道电流。3.内外源性H2S通过促进大鼠海马神经细胞Rho A Ser188磷酸化来保护海马神经元免受H/R损伤。4.Rho A Ser188介导了H2S对大鼠脑I/R损伤的保护作用。
刘晓洁[3]（2020）在《超声刺激机械敏感离子通道Piezo1蛋白对HUVECs生物学效应的调控作用》文中指出研究背景及目的超声是一种频率高于20000 Hz的声波,由于超声传播方向好,穿透能力强,易于获得较集中的声能,在水中传播距离远,因此可用于测距、测速、清洗、杀菌、消毒等。由于超声具有无创、穿透力深、易远程操作等优点,在医学诊疗中广泛应用,通常用于超声诊断的频率为1 MHz–30 MHz。目前在医学诊疗中主要用于超声的聚焦热能作用,如射频消融,超声刀等;超声的多普勒频移与回波扫描作用,如多普勒彩超与B超;而超声的空化作用主要用于口腔科的牙齿清洗与治疗。超声作用于物体时会产生超声辐射力,辐射力是指单位时间内物体单位表面积向半球空间发射的全部波长的辐射能。超声辐射力作用于细胞时,会在细胞表面产生剪切应力,进而影响细胞的各种生理功能。目前研究,超声辐射力主要通过细胞表面的机械敏感蛋白产生作用,如将高电荷机械敏感离子通道（Mscl）表达在小鼠神经元细胞,超声作用于细胞表面Mscl蛋白,低强度的超声波刺激可以激活小鼠神经元细胞;超声可以通过瞬时受体电位通道Trp-4调控秀丽线虫的感觉神经元,影响它的行为表现;超声也可以作用于细胞表面机械敏感离子通道蛋白Piezo1,启动钙离子内流,增加小鼠原代神经元中的核c-Fos表达,影响小鼠的学习、记忆功能等。Piezo1蛋白广泛分布于哺乳动物中,对超声敏感,有待深入的研究。蛋白Fam38A（Piezo1）是2010年Sciece上报道的一种非选择性钙离子机械敏感通道蛋白,Piezo1蛋白位于人类16q24.3,三叶螺旋状多数分布于细胞质膜与内质网膜上,由2521个氨基酸组成,分子量286790d。在人类肺、膀胱、肾、皮肤、骨骼肌肉、心血管系统等均表达。Piezo1蛋白是非选择性钙离子机械敏感通道,可以将机械力转导为生物信号,在哺乳动物中,机械转导影响胚胎发育、触觉、痛觉、本体感觉、听力、血管张力以及血流调节等,以维持机体各个器官组织的正常功能。Piezo1蛋白作为一种机械敏感离子蛋白,在目前的研究中,已经发现循环拉伸力介导Piezo1蛋白可以促进人骨肉瘤细胞的侵袭与凋亡,抑制细胞的增殖;循环拉伸力也可以诱发泌尿上皮细胞钙离子内流和ATP释放。而血流灌注力作用于Piezo1蛋白可以诱导ATP的释放以及下游信号通路P2Y2/Gq/G11的依赖性激活。由于流体剪切力作用于Piezo1蛋白对血管的生成和内皮细胞的排列具有明显的影响,而且轨道震荡力可以促进胎儿胚胎内皮细胞沿血流方向排列。由此推测,超声辐射力作用于血管内皮细胞将会影响内皮细胞的生物学功能。由于人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）Piezo1蛋白表达含量很高,且在血管形成、血压控制及心血管疾病的发生发展过程中发挥很大作用,所以,本课题采用人类脐静脉内皮细胞系做为研究对象。本课题搭建超声刺激平台和构建Piezo1蛋白表达抑制人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）系,采用超声刺激Piezo1抑制组和对照组细胞,确定超声辐射力对Piezo1蛋白的调控作用;通过对细胞内相关因子的检测,确定超声刺激Piezo1蛋白对HUVECs生物学效应的影响,为心血管系统疾病的治疗探索新的治疗方案。研究方法1.采用超声信号发生器,超声转换探头及共聚焦显微镜,组建超声-激光共聚焦实时检测细胞平台。2.设计si RNA序列,采用RNA干扰技术,瞬时转染si RNA构建Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株:Piezo1抑制组与对照组。3.钙离子荧光探针Fluo-4,AM法检测细胞内钙离子含量,设置Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株外钙离子环境参数,超声刺激强度和时间参数。4.荧光素-荧光素酶法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内ATP的含量;ELISA法检测细胞株内肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对细胞通透性的影响。5.荧光探针DAF-FM DA法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内一氧化氮（NO）的含量;ELISA法检测细胞株内环磷酸鸟苷（c GMP）和血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对血管收缩和舒张的影响。荧光探针法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内活性氧（ROS）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对细胞内ROS含量的影响。6.超声刺激作用于HUVECs样本后,样本RNAsequence信息采集与分析;ELISA法检测人上皮中性粒细胞活化肽78（ENA-78/CXCL5）和人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL/LCN2）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对免疫相关炎性因子的影响。研究结果1.细胞模型构建:利用瞬时转染si RNA成功构建Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株,抑制效率达到80%（P<0.01）。2.超声刺激环境和刺激功率强度:细胞外液钙离子环境有利于钙离子内流,超声刺激过程中需要细胞外液体中具有一定的钙离子浓度,细胞内钙离子浓度40 min后达到稳定;超声刺激时间和功率均会影响钙离子内流,超声刺激功率1w,刺激时间15 s,大部分细胞破碎死亡,刺激功率0.2 w,刺激时间15 s,只有个别细胞破碎,后续实验0.2 w为合适功率;当超声功率为0.2 w时,刺激时间分别采用1 s、5 s、10 s,发现刺激时间10 s时,细胞形态发生轻微改变,后续实验超声刺激以小于10 s为合适时间。3.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内钙离子浓度、ATP及MLCK的调控:按照设定的细胞外液环境钙离子浓度和超声波参数,作用于Piezo1抑制组和对照组细胞;在0.2 w下,分别采用了1 s、5 s、8 s、10 s超声刺激时间,发现随着刺激时间增加,细胞钙离子内流量不断增加,且Piezo1抑制组的钙离子内流量比对照组低（1 s和5 s时,P<0.01,8 s和10 s时,无差异）;通过检测Piezo1抑制组与对照组内ATP的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内消耗的ATP量逐渐升高,且Piezo1抑制组消耗的ATP含量比对照组低（1 s和3 s时,P<0.05,5 s时,无差异）;通过检测Piezo1抑制组和对照组内MLCK的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内MLCK的含量逐渐增高,Piezo1抑制组中MLCK含量比对照组低（1 s时,P<0.05,3 s时,P<0.01,5 s时,P<0.05）。4.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内NO、c GMP及Ang-Ⅱ的调控:超声刺激作用于Piezo1抑制组和对照组细胞后,检测细胞内NO含量,随着刺激时间的增加,细胞内NO荧光含量逐渐降低,并且Piezo1抑制组中NO生成比对照组少（1 s时,P<0.01,3 s和5 s时,P<0.001）;检测Piezo1抑制组和对照组内c GMP的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内c GMP的含量逐渐增高,并且在3 s时,Piezo1抑制组中c GMP含量比对照组含量低（P<0.01）,其它刺激时间无差异。检测Piezo1抑制组和对照组内Ang-Ⅱ的含量,发现刺激时间是3 s时,Piezo1抑制组中Ang-Ⅱ含量比对照组含量低（P<0.05）,其它刺激时间无差异。5.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内ROS的调控:超声刺激作用于HUVECs后,检测细胞内ROS含量,发现细胞内ROS含量随时间逐渐降低（P<0.01）;在给予Piezo1抑制组和对照组细胞3 s刺激时间,发现Piezo1抑制组ROS含量与对照组低相比,差异显着（P<0.01）。6.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内免疫相关因子CXCL5和LCN2的调控:HUVECs给予超声3 s的刺激后,RNAsequence数据分析显示超声组细胞内CXCL5含量降低（P<0.05）,LCN2的含量增加（P<0.05）;超声刺激作用于Piezo1抑制组和对照组细胞1 s、3 s、5 s后,检测细胞内CXCL5的含量,发现刺激时间的增加使细胞内CXCL5含量逐渐降低,并且Piezo1蛋白的抑制也会引起细胞内CXCL5的含量降低（1 s时,P<0.05,3 s和5 s时,P<0.01）;超声刺激时间增加,细胞内LCN2的含量逐渐降低,而Piezo1蛋白的抑制会引起细胞内LCN2的含量增加（1 s和3 s时,P<0.05,5 s时,无差异）。研究结论1.超声刺激Piezo1蛋白对细胞膜的通透性具有调控作用。2.超声刺激Piezo1蛋白具有引起血管舒张的能力,并且能够减少细胞内的ROS含量。3.超声刺激Piezo1蛋白能够调控细胞免疫相关炎性因子CXCL5和LCN2。
黄立鑫[4]（2019）在《拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究》文中认为蜘蛛是一类有超过3亿年进化历史的类群,其进化的成功很大程度上归功于对蛛丝的巧妙应用和毒液的成功进化。除捕食性甲虫外,蜘蛛是最丰富的陆地捕食者。蜘蛛主要捕食节肢动物,部分蜘蛛也能捕食小型的脊椎动物,如老鼠、鸟类、蜥蜴等。毒液是蜘蛛进行捕食的主要武器,大部分蜘蛛都具有成对的毒腺以产生毒液。蜘蛛毒液是由多种化合物组成的混合物,根据对蜘蛛毒液的化学成分和药理多样性的总结,可以将其分为六大类:小分子化合物类、酰基多胺类、线性多肽、富含二硫键的多肽毒素、高分子量蛋白质类毒素以及酶类。富含二硫键的多肽毒素是大多数蜘蛛毒液中的主要毒性物质,毒素是蜘蛛进行捕食或防御的主要活性物质。大多数富含二硫键的蜘蛛毒素作用于外周神经肌肉接头或昆虫中枢神经系统的突触处,靶向突触前离子通道或突触后受体。蜘蛛神经毒素在昆虫中的作用靶标主要包括电压门控钙通道、电压门控钠通道、电压门控钾通道和谷氨酸受体,这些多肽毒素可以减弱昆虫神经系统功能,导致弛缓性麻痹,或过度激活神经系统功能,引起惊厥性麻痹,最终使受到攻击的猎物迅速丧失活动能力。本文以害虫天敌拟环纹豹蛛为研究对象,系统地分析了其毒液的组成,并对各种类型的毒素进行了总结。为了深入研究拟环纹豹蛛神经毒素的功能,本论文建立了富含二硫键的多肽毒素的表达和纯化系统,成功地表达并纯化了包含PPTX-22在内的多个神经毒素,并对PPTX-22的杀虫活性和作用机制进行了研究。一、拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析通过拟环纹豹蛛毒腺转录组测序,共得到了 75,980个转录本。根据序列比对及注释信息分析,共鉴定出43个富含二硫键的多肽毒素。通过结构域分析,发现其中包括38个假定的神经毒素和5个假定的非神经毒性毒素。根据半胱氨酸排列方式、系统发育和结构域分析,将32种神经毒素分为6个家族;而另外的6种神经毒素,未能进行归类,命名为未能分类的类群。根据基因组结果,我们对拟环纹豹蛛神经毒素基因的基因结构进行了分析,结果显示,除Family F中神经毒素的成熟肽序列含有2-3个外显子,剩余5个家族中的神经毒素的成熟肽序列均只含有1个外显子。除了富含二硫键的多肽毒素,拟环纹豹蛛的毒液中还含有一些其它的组分,主要有虾红素样金属蛋白酶、Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂、毒液过敏原和透明质酸等。为了探索拟环纹豹蛛毒素相关基因的组织分布和表达,我们选取了毒腺、脑和脂肪体用于组织表达谱分析。结果显示,大多数假定的神经毒素基因主要在毒腺中特异性表达或者特异高表达。此外,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、毒液过敏原和透明质酸酶基因也在毒腺中特异性表达或者特异高表达。二、富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立为了建立适合富含二硫键的蜘蛛毒素的表达系统,本研究选取了的昆虫杆状病毒表达系统的载体pFastBacTM1、毕赤酵母表达系统的载体pPICZ A和pPICZα A、大肠杆菌表达系统的表达载体pET32a和pLicC-MBP。采用真核表达载体pFastBacTM1和pPICZα A表达毒素的成功率比较低,无法满足后续实验需求。采用真核表达载体pPICZA表达毒素成功率比较高,但是由于非目的条带较多,会影响后续纯化,也无法满足后续实验需求。采用原核表达载体pET32a表达毒素成功率比较高,但是由于融合蛋白不能正确折叠,多聚体严重,因此该载体也不适用于后续实验。采用原核表达载体pLicC-MBP表达毒素成功率比较高,同时目的条带比较单一,利于后期纯化,而且无二聚体。因此,在后续实验中,将采用原核表达载体pLicC-MBP表达富含二硫键的多肽毒素。采用HisTrap HP层析柱,可以得到纯度较高的融合蛋白,融合标签MBP的分子量约为42 kDa,而目的毒素的分子量通常小于10 kDa,因此需要利用TEV蛋白酶将融合标签切除。利用HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱,可以对融合蛋白进行置换缓冲液的处理,以提供TEV蛋白酶的酶切条件。采用超滤管、分子筛、HisTrap Excel层析柱、MBPTrap HP层析柱等方法,均无法有效的将融合标签去除,无法得到较高纯度的重组毒素。最终,采用层析柱MBPTrap HP先除去酶切液中大部分的融合标签,再采用层析柱HisTrap HP将流穿液中剩余的融合标签除去,采用这种方法可以得到满足后续实验需要纯度的重组毒素。以此为基础,重组毒素的纯化系统构建成功。三、神经毒素PPTX-22的作用机制研究拟环纹豹蛛是亚洲稻区农业害虫的优势天敌,主要捕食稻飞虱、稻叶蝉等害虫,其中毒素在拟环纹豹蛛捕食过程中起到非常重要的作用。PPTX-22是拟环纹豹蛛毒液中的一种富含二硫键的神经毒素,含有109个氨基酸残基,主要由信号肽、前肽和成熟肽组成,成熟肽含有69个氨基酸残基,其中有10个半胱氨酸形成的5个二硫键。采用原核表达载体pLicC-MBP成功表达PPTX-22,切除融合蛋白后,重组毒素的分子量约为7.78 kDa。重组毒素PPTX-22可以引起褐飞虱麻痹甚至死亡,其2 h后的PD50为1402 pmol/g,95%置信区间分别为1297-1515 pmol/g,R2为0.9795。钙离子成像实验表明,无论细胞外液中是否含有钙离子,PPTX-22均能引起细胞内钙离子浓度增加;此外,在阻断细胞膜Ca2+通道的情况下,PPTX-22同样可以引起细胞内Ca2+浓度增加,说明该毒素不作用于细胞膜上的钙离子通道。进一步的实验结果表明,用IP3受体的抑制剂2-APB处理细胞后,PPTX-22依然可以引起细胞内钙离子浓度增加;而用高浓度的鱼尼丁处理细胞、阻断鱼尼丁受体后,PPTX-22不能引起细胞内钙离子浓度增加。结果表明,PPTX-22能够激活昆虫鱼尼丁受体,引起细胞内钙离子浓度增加。该研究通过拟环纹豹蛛毒腺进行转录组测序,获得了比较完整的毒素序列信息,在建立富含二硫键多肽毒素表达和纯化系统的基础上,获得了高纯度的重组毒素PPTX-22,并明确了该毒素的分子靶标为鱼尼丁受体,为第一个作用于鱼尼丁受体的生物毒素。拟环纹豹蛛是重要的农业害虫天敌,在农业生态环境中起着重要的作用,其毒素是重要的生物杀虫资源,可成为害虫防治的新资源。
郑智通[5]（2019）在《VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究》文中研究表明研究目的:创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）以其高致死致残率成为世界范围内重要公共卫生问题。创伤后原发性血脑屏障破坏导致脑血流灌注不足、血脑屏障通透性升高,代谢失衡、出凝血障碍等病理过程,引起继发性脑损伤,加重血脑屏障开放,形成恶性循环。及时修复血脑屏障成为TBI治疗的关注重点之一。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）又被称作血管通透性因子,在血脑屏障开放、血管新生中起到重要作用。血管内皮生长抑制因子（Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI）是机体内天然抑制VEGF的因子,且在抑制VEGF的同时并不影响血管内皮细胞的正常功能。因此,本实验在建立TBI动物模型的基础上,检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的表达变化,探讨二者与血脑屏障通透性的相关联系。通过侧脑室注射VEGI纯化蛋白对TBI急性期小鼠进行干预治疗,观察TBI后VEGF表达变化,血脑屏障通透性的改变,创伤侧细胞凋亡水平和小鼠神经运动功能。同时,探究VEGI对VEGF的下游作用机制,及其在TBI急性期抑制血管新生的作用机制。研究方法:1)在C57BL/6雄性小鼠上建立TBI模型,应用Western Blot技术检测TBI后不同时间点创伤侧纤维蛋白原的含量。2)应用Western Blot技术分别检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的各自表达量。3)应用立体定位侧脑室微量注射技术,对TBI后小鼠进行VEGI干预。4)通过改良的神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score,mNSS）和错步实验对实验各组进行神经功能评分。筛选出差异最大时间点,进行后续探究。5)应用Western Blot和免疫荧光技术检测比较TBI第3天对照组和干预组血脑屏障通透性的变化。6)应用Western Blot技术检测VEGFR2和下游eNOS的磷酸化表达。7)应用流式细胞技术和AnnexinV/PI试剂盒检测比较创伤对照组和VEGI干预组小鼠创伤侧细胞凋亡情况。8)应用Western Blot、免疫荧光技术观察血管新生相关细胞的变化。9)体外实验中比较VEGI对内皮细胞和周细胞成管能力的影响。10)应用Western Blot技术检测血管新生相关因子的相对表达变化。结果:1.TBI后小鼠血脑屏障开放在第3天最为显着。VEGF在TBI后逐渐升高,第3天达峰值。VEGI在TBI后第3天下降明显。综合比较VEGF与VEGI比值发现,VEGF/VEGI值在TBI后逐渐升高,在第3天最为明显。2.VEGI干预后对TBI小鼠神经运动功能改善从第3天开始出现明显差异。VEGI干预明显减少创伤侧的细胞凋亡数量,减轻了血脑屏障开放程度。VEGI干预可以显着抑制TBI急性期创伤侧VEGFR2和其下游eNOS的磷酸化。3.VEGI干预显着抑制了TBI后的血管新生,体现在对血管新生相关细胞的抑制和对血管新生相关因子之间平衡的调节。结论:1.TBI急性期后VEGF的单一变化不能完全解释血脑屏障通透性升高的时间峰值,综合VEGF与VEGI相对变化可能会更有效的研究TBI后血脑屏障损伤的原因。TBI急性期第3天VEGF相对于VEGI的高表达可能为血脑屏障通透性峰值的原因之一,为后续TBI急性期的治疗奠定基础。2.VEGI局部干预在TBI急性期对神经功能的改善作用集中于TBI后第3天,我们选用创伤后第3天为后续实验的重要观察点。3.VEGI通过减少紧密连接蛋白的损伤,降低基质金属蛋白酶的表达,抑制VEGF-VEGFR-2下游的磷酸化,有效地降低了血脑屏障通透性。VEGI局部干预在TBI后第3天有效抑制创伤侧的细胞凋亡。4.VEGI干预一定程度上恢复了TBI后促血管新生相关因子和抑制血管新生因子表达的失衡,减少了未成熟的新生血管的形成,以阻止血脑屏障通透性进一步的升高,从而缓解TBI后的继发性损伤。
李鹏跃[6]（2014）在《基于MD-MS技术研究葛根总黄酮及葛根素静脉和鼻腔给药的药动学差异》文中研究表明脑中风学名脑卒中,是严重危害人类健康和生命安全的常见难治疾病,具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高、预后差、经济负担重的特点,在严重影响患者本人生活质量的同时,也给家庭、社会带来了沉重的负担。葛根为治疗脑中风的常用中药。目前,其主要成份葛根素已有4种相关静脉注射制剂上市,在治疗缺血性脑血管疾病方面疗效确切。葛根素作用机制与扩张脑血管、清除自由基、抗氧化、抑制炎症反应等作用有关。同时,现代药理研究亦表明,除葛根素外,葛根总黄酮中其余成分同样具有脑保护作用,能够明显缩小大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型大鼠脑梗死体积、降低脑水肿程度、提高超氧化物歧化酶的活性、降低丙二醛水平,目前已有葛酮通络胶囊及愈风宁心系列口服制剂上市。然而,上述制剂均存在一定的缺陷。葛根素注射剂自1993年上市以来,临床不良反应时有发生,严重者甚至导致死亡;而口服制剂存在吸收差、生物利用度低的问题,并且对于中风病人而言,吞服困难,给药顺应性较差。这些问题均限制了上述制剂在临床中的应用。传统中医学理论和现代医学研究均证明鼻腔给药是治疗脑病的有效途径。因此,本课题基于“鼻通脑络”中医理论,在前期研究的基础上,选择鼻腔作为给药途径,采用微透析取样技术,对葛根素及自制葛根总黄酮经不同途径给药后的药动学差异进行了研究。具体研究内容如下:1葛根总黄酮的提取纯化工艺研究以葛根素和总黄酮提取率为指标,通过正交试验对葛根总黄酮的提取工艺进行了研究,最优工艺为12倍量水,提取3次,每次1.5h,所得工艺便捷可行,目标成分提取率达到90%以上。对葛根水提液进行了醇沉处理,最佳醇沉工艺为提取液浓缩至0.5g药材/ml,加95%乙醇,调节醇浓度为60%,醇沉24h,进一步提高了浸膏中目标成分的纯度。在此基础上,运用单因素考察法对大孔吸附树脂纯化工艺进行了优化,最佳树脂为HPD200A,上样液浓度为0.25g药材/ml,大孔树脂柱径高比为1:5,上样量为0.5g药材/ml树脂,上样流速为1ml/min,水洗2BV,水洗流速为0.5ml/min,30%乙醇洗脱4BV,醇洗流速为0.5ml/min。最终产物的出膏率约为10%,葛根素的纯度在30%以上,总黄酮的纯度在70%以上。对葛根总黄酮的树脂纯化工艺进行放大实验研究,所得提取物纯度基本稳定,工艺可行。对提取物中各成分进行质谱分析,初步推断其中5种主要成分分别为:3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素木糖苷、3’-甲氧基葛根素、大豆苷。以Bcl-2 mRNA为指标对葛根素及提取物的抗凋亡作用进行了比较,实验结果显示,提取物组效果更好,提示提取物中有成份能够促进抗凋亡基因Bcl-2mRNA的高表达,更有助于抑制细胞在缺氧环境下的凋亡。2葛根素微透析及HPLC-MS/MS方法的建立体外透析实验及反渗透实验显示,葛根素的探针传递率及回收率分别为:63.37%和71.52%,两者之间存在显着差异,而不同浓度药液对探针回收率（或传递率）并无影响,通过探针清除率实验,证实了葛根素与探针膜材料之间不存在吸附;同时研究表明,药物回收率、传递率以及两者之间的差值会随着探针外药液搅拌速度的升高而增加;在灌流液中添加适当的添加剂能够有效的提高回收率,降低传递率,同时亦使两者之间的差异增大;随着探针膜长的增加,药物的传递率及回收率均有显着提高,但两者之间的差值亦随之而增大。上述结果提示,如果需要求得体内的真实药物浓度,以探针的在体传递率替代在体回收率是不可行的,故采用零净通量法对探针的在体回收率进行了计算。脑探针的定位按照大鼠脑立体定位图谱结合脑组织切片,确定嗅球的位置为以前囟为基点,AP:+8mm,ML:±1mm处定位,血液探针沿向心室方向植入颈静脉,以生理盐水为灌流液,采用零净通量法测定探针在血液及嗅球部位的在体回收率,分别为:17.52%,29.13%。建立了透析液中葛根素及内标柚皮苷的HPLC-MS/MS测定方法。色谱条件为C18色谱柱（Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column（3.5μm,4.6 × 1Omm,USA））;HPLC条件:甲醇-水,0-8min,24:76,8-15min,60:40;MS/MS条件:离子源:ESI负离子模式,监测离子:415/295（葛根素）,579/271（柚皮苷）。葛根素在0.002-0.111 μg/mL和0.111-8.9 μg/mL范围内线性关系良好。回归方程分别为y=0.23816x-0.0001（r=0.998）和y=0.25562x-0.01582（r=0.999）。精密度、稳定性均符合要求。定量限以标准曲线最低点计。3葛根素经不同途径给药大鼠体内药动学研究以雄性SD大鼠为实验动物,将血液探针埋植于颈静脉,脑探针埋植于嗅球部位,葛根素按照7mg/kg的剂量分别静脉推注、静脉滴注、鼻腔给药,微透析取样,20min收集样品一次,HPLC-MS/MS检测透析液中药物浓度。以Kinetica药动学软件非房室模型处理体内数据。血药动力学结果显示:各组的血药峰浓度Cmax分别为30.89±10.69μg/ml（i.v.）、9.31±3.99μg/ml（i.v.gtt）、3.82±1.03 μg/ml（i.n.）,各组的血药 AUC0-5h 分别为 1524.63±584.05μg/ml.min（i.v.）、1037.18±501.70 μg/ml·min（i.v.gtt）、623.12±170.86 μg/ml.min（i.n.）,各组的 tmax分别为 20min（i.v.）、100min（i.v.gtt）、68±10.95min（i.n.）,各组的平均滞留时间分别为 44.20±8.97min（i.v.）、87.24±7.84min（i.v.gtt）、140.27±7.86min（i.n.）。与静脉给药相比,鼻腔给药组各参数均有显着性差异。嗅球部位药动学结果显示:各组的药物峰浓度Cmax分别为0.29±0.07μg/ml（i.v.）、0.0523μg/ml（i.v.gtt）、0.50±0.16μg/ml（i.n.）,各组的嗅球部位 AUC0-5h 分别为 28.44 ±6.89μg/ml·min（i.v.）、8.30±4.85μg/ml·min（i.v.gtt）、86.84±23.50μg/ml.min（i.n.）,各组的 tmax分别为 20min（i.v.）、132±36min（i.v.gtt）、212±30.33 min（i.n.）,各组的平均滞留时间分别为 81.76±11.46min（i.v.）、162.63±19.00min（i.v.gtt）、186.43±6.25min（i.n.）。各组的脑靶向指数分别为1.87%、0.80%、13.94%。鼻腔给药虽然血药浓度较低,但嗅球部位药物浓度得到了很大的提高,脑靶向性显着提高。4葛根素经不同途径给药MCAO模型大鼠体内药动学研究为了进一步模拟葛根素的临床用药对象和给药方式,以雄性SD大鼠为实验动物,制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,对病理状态下,葛根素经不同途径给药后的药动学行为进行了研究。血药动力学结果表明:各组的血药峰浓度Cmax为13.84±2.45μg/ml（i.v.gtt）、4.36±1.06μg/ml（i.n.）,各组的血药 AUC0-5h分别为 1416.68±249.74μg/ml·min（i.v.gtt）、533.48±136.75μg/ml·min（i.n.）,各组的 tmax分别为 100 min（i.v.gtt）、80±31min（i.n.）,各组的平均滞留时间分别为88.85±6.34 min（i.v.gtt）、115.61±13.82min（i.n.）。鼻腔给药的绝对生物利用度为37.66%,与正常大鼠相比,静脉滴注时MCAO模型大鼠具有较高的血药AUC,鼻腔给药时MCAO模型大鼠血药AUC与正常大鼠组无显着性差异。嗅球部位药动学结果表明:各组的药物峰浓度Cmax为0.19±0.12μg/ml（i.v.gtt）、1.54±0.43μg/ml（i.n.）,各组的嗅球部位的 AUC0-5h 分别为 24.50±16.74μg/ml·min（i.v.gtt）、255.96±87.74μg/ml·min（i.n.）,各组的 tmax 分别为 104±38 min（i.v.gtt）、92±11min（i.n.）,各组的平均滞留时间分别为141.72±12.68 min（i.v.gtt）、136.57±17.12min（i.n.）,各组的脑靶向指数为1.73%和47.98%。鼻腔给药组的Cmax、AUC均显着高于静脉滴注组,脑靶向系数更是高达静脉滴注组的27倍,充分体现了鼻腔给药的优越性。与正常大鼠相比,静脉滴注和鼻腔给药时,MCAO大鼠嗅球部位药物峰浓度和AUC显着增加,并且曲线形态发生明显变化,这种现象可能是由于血脑屏障的破坏或脑缺血对嗅黏膜和嗅神经的影响所导致的。5葛根总黄酮经不同途径给药MCAO模型大鼠体内药动学研究以雄性SD大鼠为实验动物,制备MCAO模型大鼠,自制葛根提取物按照20mg/kg的剂量分别静脉滴注、鼻腔给药,微透析取样,HPLC-MS/MS检测透析液中药物浓度。以Kinetica药动学软件非房室模型处理体内数据。血药动力学结果表明:各组的血药峰浓度Cmax为14.96±3.97μg/ml（i.v.gtt）、0.75±0.30μg/ml（i.n.）,各组的血药 AUC0-5h 分别为 1707.02±457.88μg/ml·min（i.v.gtt）、134.72±37.61μg/ml.min（i.n.）,各组的 tmax 分别为 104±9 min（i.v.gtt）、68±18min（i.n.）,各组的平均滞留时间分别为90.28±15.18 min（i.v.gtt）、139.41±12.11min（i.n.）,鼻腔给药的绝对生物利用度为7.89%,但药物在血浆中的MRT显着长于静脉滴注组。与葛根素单独给药相比,静脉滴注时两者血药AUC并无显着差异,提示在该药物浓度下提取物中其余黄酮类成分并未对葛根素的代谢产生影响;但鼻腔给药时提取物组的血药AUC显着降低,仅为葛根素组的25%,这种现象可能是由于提取物中多种成分在透过鼻黏膜时发生竞争所致。嗅球部位药动学结果表明:各组的药物峰浓度Cmax为0.060±0.03μg/ml（i.v.gtt）、0.37±0.11μg/ml（i.n.）,嗅球部位的 AUC0-5h分别为 7.38±4.65μg/ml-min（i.v.gtt）、58.60±14.48μg/ml·min（i.n.）,鼻腔给药组嗅球部位药物浓度持续升高,并且下降趋势不明显,各组的DTI分别为:0.43%和43.50%。与葛根素单独给药相比,静脉滴注时提取物组嗅球部位AUC仅为葛根素组的30%,这可能是由于透过血脑屏障时黄酮类成分发生竞争所致,鼻腔给药也发生相似的现象。尽管葛根素组和提取物组鼻腔给药后血液和嗅球部位AUC存在显着差异,但二者的DTI分别为47.98%和43.50%,较为接近,进一步证明了黄酮类成分在经鼻转运入脑过程中存在竞争。
张晓丽娜[7]（2011）在《颅脑损伤后颅内局部脑代谢变化的微透析实验研究》文中研究说明目的：通过应用微透析技术研究颅脑创伤患者脑细胞间液中葡萄糖（Glu）,乳酸（Lac）、丙酮酸（Pyr）、甘油（Gly）的变化规律,探讨微透析技术在脑损伤局部生化物质监测中的运用,以及利用该技术动态监测脑损伤局部细胞外液（ECF）中葡萄糖与乳酸变化的意义。方法：对10例颅脑损伤的患者,将微透析导管分别插入患者脑创伤病灶半暗带区,收集微透析液,灌流速度为0.3ul/min,每1h收集1管透析液。收集时间为72h；收集的透析液用生化分析仪CMA600测定葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油浓度。并在出院后每隔3个月随访。结果：通过微透析方法连续检测患者大脑细胞外液中的葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油浓度,观察到脑损伤后葡萄糖含量降低,与术后1h相比下降明显,伤后32h即达峰值,其后逐渐回升。乳酸含量在伤后出现与葡萄糖相反的变化,但其变化稍慢。脑细胞间液中葡萄糖及乳酸含量的变化与损伤程度有关,损伤愈重变化愈明显,持续时间愈长。甘油的变化与乳酸相似,术后4h升高,32h-44h达峰值,而后下降,且变化程度与损伤程度有关。丙酮酸的变化则与葡萄糖变化趋势相似,术后明显下降,术后27h-33h达峰值随后回升,GCS评分越低,变化越明显。结论：1.微透析技术是-种微创、安全、全新的监测手段,能够对脑损伤局部生化物质含量变化进行持续的代谢监测。2.微透析技术检测下脑损伤后ECF中葡萄糖含量降低、乳酸含量升高,二者呈相反的动态变化3.微透析技术检测下脑损伤后ECF中甘油含量变化趋势为缓慢上升而后下降。4.微透析技术检测下脑损伤后ECF中丙酮酸含量变化趋势为先下降而后回复,与葡萄糖相似。
张建东[8]（2011）在《(+)儿茶素对神经元缺血损伤的保护作用及其对酸敏感离子通道影响的研究》文中研究表明目的：脑缺血损伤是困扰人类的疾病之一,其病理病生机制较为复杂。近年来研究显示ASICs（酸敏感离子通道）与脑缺血发生时的酸中毒和钙超载有着密切关系。儿茶素类是绿茶当中主要的茶多酚类活性物质,具有保护脑缺血等多种因素导致的神经元损伤的作用,但作用机制尚不明确。本研究的目的在于进一步研究（+）儿茶素类药物对缺血再灌注损伤的保护作用和酸中毒损伤的保护作用,利用全细胞膜片钳方法来考察儿茶素类药物是否作用于酸敏感离子通道电流,从而为（+）儿茶素治疗脑缺血疾病提供新的依据。方法：新生大鼠皮层神经元原代培养,加入阿糖胞苷抑制非神经元的生长,采用NSE（神经元特异性烯醇化酶）免疫化学染色鉴定神经元纯度。利用MTT比色法研究神经元的细胞存活率与酸损伤时间的关系。分别建立酸损伤模型和OGD/R（氧糖剥夺/再恢复）损伤模型,同时设立阿米洛利（10μmol/1）阳性对照组、正常对照组、（+）儿茶素A、B、C、D （1、0.5、0.25、0.1mmol/1）药物处理组,模型损伤组,MTT比色法检测各组细胞存活率,形态学观察比较,检测各个组NOS,LDH的释放。全细胞膜片技术观察（+）儿茶素对酸诱导的大鼠皮层神经元ASICs的电流的影响。结果：1 （+）儿茶素对酸环境下皮层神经元损伤的保护作用（1）：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞存活率如下（%）：正常组（100±0.00）,模型组（29.13±1.89）,amiloridum组（48.07±4.27）,（+）-catechinA组（37.30±6.26）,（+）-catechin B组（42.66±1.41）,（+）-catechin C组（43.24±2.99）,（+）-catechin D组（41.94±2.45）。与正常组相比,模型组和药物处理组细胞存活率明显下降（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组细胞存活率均可显着提高（P<0.05）；（+）-catechin A组和（+）-catechin D组细胞存活率明显低于amiloridum组（P<0.05）；（+）-catechin B组和（+）-catechin C组细胞存活率与amiloridum组比较无明显差异（P>0.05）（2）：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞外液LDH含量如下（U/L）：正常组（112.9+9.62）,模型组（463.7±13.85）,amiloridum组（288.2±20.10）,（+）-catechinA组（314.4±14.74）, （+）-catechin B组（336.3±14.69）, （+）-catechin C组（344.8±26.24）, （+）-catechin D组（381.2±15.66）。模型组和药物处理组细胞外液中的LDH含量与正常组相比明显升高（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组细胞外液中LDH含量均可显着降低（P<0.05）；（+）-catechin C组和（+）-catechin D组LDH含量明显高于amiloridum组（P<0.05）；（+）-catechin A组和（+）-catechin B组细胞外液中LDH含量与amiloridum组比较无明显差异（P>0.05）（3）：皮层神经元酸环境下处理4h,各组的细胞外液NOS含量如下（U/m1）：正常组（0.67±0.098）,模型组（1.75±0.095）,amiloridum组（1.15±0.087）, （+）-catechinA组（1.23±0.190）,（+）-catechin B组（1.28±0.092）,（+）-catechin C组（1.43±0.140）,（+）-catechin D组（1.49±0.085）。模型组和药物处理组细胞外液中的NOS含量与正常组相比明显升高（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组细胞外液中NOS含量均可显着降低（P<0.05）；（+）-catechin C组和（+）-catechin D组LDH含量明显高于amiloridum组（P<0.05）；（+）-catechin A组和（+）-catechin B组细胞外液中LDH含量与amiloridum组比较无明显差异（P>0.05）。2（+）儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用（1）：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复（OGD/R）损伤,各组的细胞存活率如下（%）正常组（100±0.00）,模型组（35.27±3.41）,amiloridum组（48.50±1.94）,（+）-catechin A组（52.53±3.79）,（+）-catechin B组（57.22±2.99）,（+）-catechin C组（58.68±1.80）,（+）-catechin D组（50.75±2.29）。模型组和药物处理组的细胞存活率比正常组相比显着下降（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组的细胞存活率均可显着提高（P<0.05）；（+）-catechin B组和（+）-catechin C组细胞存活率明显高于与阿米洛利组相比（P<0.05）；而（+）-catechin A组和（+）-catechin D组于与阿米洛利组相比无显着差异（P>0.05）（2）：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复（OGD/R）损伤,各组的细胞外液LDH含量如下（U/L）：正常组（151.6±8.58）,模型组（672.3±28.51）,amiloridum组（398.5±23.82）,（+）-catechin A组（385.7±29.08）,（+）-catechin B组（406.3±41.88）,（+）-catechinC组（434.8±33.27）,（+）-cateChin D组（457.9±19.36）。模型组和药物处理组细胞外液中的LDH含量与正常组相比明显升高（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组细胞外液中LDH含量均可显着降低（P<0.05）；（+）-catechin A组、（+）-catechin B组、（+）-catechin C组细胞外液中LDH含量和amiloridum组相比无显着差异（P>0.05）；（+）-catechin D组细胞外液中LDH含量明显高于amiloridum组（P<0.05）（3）：皮层神经元经氧糖剥夺再恢复（OGD/R）损伤,各组的细胞外液LDH含量如下（U/m1）：正常组（1.04±0.125）,模型组（3.05±0.163）,amiloridum组（2.25±0.111）,（+）-catechin A组（1.84±0.147）,（+）-catechin B组（1.87±0.201）,（+）-catechin C组（2.26±0.266）,（+）-catechin D组（2.42±0.092）。模型组和药物处理组细胞外液中的NOS含量与正常组相比明显升高（P<0.01）；与模型组相比,药物处理组细胞外液中NOS含量均可显着降低（P<0.05）；（+）-catechin C组、（+）-catechinD组和amiloridum组相比无显着差异（P>0.05）；（+）-catechinA组（+）-catechinB组细胞外液中NOS含量明显低于amiloridum组（P<0.05）3（+）儿茶素对酸诱导的ASICs电流的影响10μmol/1 amiloridum和500umol/1（+）-catechin与在不加药物条件pH6.0刺激诱发的ASICs电流幅值均明显下降（P<0.01）,其中10μmol/1 amiloridum作用下电流下降至65.2±4.13%（n=8-12）,而500μmol/1（+）-catechin下降至81.7±3.74％（n=8-12）.500μmol/1（+）-catechin电流幅值明显高于10μmol/1 amilo ridum（P<0.05）.结论：1.皮层神经元经酸环境和缺氧缺糖再恢复损伤时细胞存活率显着降低,（+）-catechin可以明显提高两种模型下的细胞存活率,降低LDH释放和NOS含量。2.（+）-catechin的神经保护作用机制可能包括改善脑组织能量代谢,拮抗NO介导的神经毒性,抑制ASICs通道的开放等。
龙雁[9]（2010）在《钠钙交换体NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5亚型高表达细胞株的建立及生理、病理功能研究》文中研究说明钠钙交换体（NCX）是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种,双向转运体,几乎所有细胞均有NCX蛋白表达。生理情况下,NCX参与心肌细胞兴奋收缩耦联过程,参与神经元中神经递质的释放,而在所有细胞中,NCX参与细胞内钙离子稳态的调节。与此同时,NCX还可能进行反向转运参与众多疾病的发生发展过程。因此,NCX具有极其重要的生理病理意义。目前,关于NCX活性调节和病理功能的研究甚多,但是关于蛋白磷酸化对NCX1活性的调节,以及在缺血相关病理过程中NCX1的功能方面,人们所得到的结论并不完全一致,仍存在相互矛盾之处。因此,本实验采用脂质体转染的方法将心脏型NCX1.1、大脑型NCX1.4和NCX1.5三种基因稳定导入CHO细胞中,建立特异性表达NCX1.l、NCX1.4和NCX1,5三种亚型的细胞模型,以期研究蛋白激酶对不同组织来源的NCX1剪接产物的影响，同时探讨NCX1在缺血.相关病理过程中的功能及筛选可能的NCX调节剂。第一部分NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5稳定转染细胞株的构建我们首先利用酶切法对pcDNA3.1+质粒载体上插入的NCX1.1、NCXl.4和NCX1.5基因的条带大小进行鉴定。结果显示NCX基因插入位点准确,条带数目与大小符合理论值。此外,我们还将上述质粒送交至Invitrogen和Takara公司进行测序,结果发现插入的NCX基因与GenBank中该基因目的序列完全一致。随后,我们采用脂质体转染法将大鼠心脏NCX1.1、大鼠大脑NCX1.4及NCX1.5基因稳定整合到CHO细胞内,用G418处理2-3周并筛选出单个克隆的高表达细胞株。经鉴定,在野生型CHO-K1细胞中未检测到有NCX蛋白的表达,而在3种稳定转染的NCX细胞中大量表达有NCX蛋白,且表达水平相似。采用改变细胞内外环境中Na+浓度的方法,用第二代钙荧光指示剂Fura-2作为Ca2+探针,我们对上述细胞内表达的NCX蛋白的生物活性进行了评估。结果显示,用等摩尔NMDG+替换外液中的NaC1后,野生型CHO细胞的[Ca2+]i几乎没有改变,而3种CHO-NCX细胞的[Ca2+]i均显着升高,提示去除细胞外钠离子可以激活NCX反向转运,进而说明细胞中表达的NCX蛋白具有生物学功能。异硫脲衍生物KB-R7943是迄今发现的对NCX抑制作用较为特异的一种化合物,现己作为药理学工具药被广泛用来研究生理病理状态下NCX的作用。在本部分试验中,我们进一步观察了不同浓度的NCX抑制剂KB-R7943对上述3种稳定转染的NCX细胞中NCX电流（INCX）的影响。结果显示KB-R7943对3种NCXl选择性剪接产物NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5的内外向电流均具有抑制作用,且呈现一定的剂量依赖性,但缺乏亚型选择性。本部分研究提示稳定表达有大鼠心脏型NCX1.1、大鼠大脑型NCX1.4和NCX1.5三种亚型的细胞株构建成功,为下一步对心脏和脑中的NCX1剪接产物的生理调节及病理功能的研究提供了良好的平台。第二部分蛋白磷酸化对NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5反向转运活性的影响参与NCX活性调节的因素很多,如今研究已发现的包括单价、二价和三价阳离子,神经递质,激素和肽类物质等。在众多因素当中,蛋白磷酸化与NCX活性之间的相互关系依然没有定论。为了单独研究蛋白磷酸化对NCX功能的影响,我们采用稳定转染单一NCX亚型的CHO细胞作为平台,观察蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶A（PKA）对NCX反向转运活性的影响。在本部分研究中,我们首先评价了PKC激动剂Phorbol12-myristate13-acetate（PMA）和NCX抑制剂KB-R7943对野生型CHO细胞和稳定转染的NCX细胞中NCX反向转运活性的影响。结果提示,在无Na+环境下,PKC激动剂PMA对野生型CHO细胞中[Ca2+]i无明显影响。但是,心脏型NCX1.1的反向转运却可以为PKC激动剂PMA强烈激活,从而引起细胞内出现大幅度的钙瞬变,3μμM时激动作用达到最大,此时[Ca2+]i上升速率为23.82nM/sec,较对照组具有显着升高。NCX抑制剂KB-R7943预孵育可以有效阻断这种激动作用,从而说明细胞内[Ca2+]i的升高确实经由NCX介导。此外,Ca2+螯合剂EGTA可以有效消除稳定转染的NCX1.1细胞中的钙瞬变现象,该结果提示NCX介导的胞内(Ca2+]i的升高与细胞外液中的Ca2+直接相关。虽然PKC激动剂PMA对大脑型NCX1.4和NCX1.5也具有一定的激动作用,但脑源性的NCX亚型对于PMA的敏感性较心脏型NCX1.1显着降低,两者相差达10倍以上。其中,仅10μM PMA对NCX1.5细胞反向转运具有显着激动作用,其[Ca2+]i上升速率较对照组细胞具有显着升高。此外,我们还观察了PKA激动剂8-Bromoadenosine3’,5’-cyclic momophoshate （8-Br cAMP）和NCX抑制剂KB-R7943对野生型CHO细胞和稳定转染的NCX细胞中NCX反向转运活性的影响。结果提示,在无Na+环境下,PKA激动剂8-Br cAMP对野生型CHO细胞中[Ca2+]i不具有显着的影响。但是,心脏型NCXl.1的反向转运却可以为PKA激动剂8-Br cAMP强烈激活,从而引起细胞内出现大幅度的钙振荡现象。NCX抑制剂KB-R7943预孵育可以有效阻断这种激动作用,从而说明细胞内[Ca2+]i的升高确实经由NCX介导。此外,Ca2+螫合剂EGTA可以有效消除稳定转染的NCX1.1细胞中的钙振荡现象,该结果提示NCX介导的胞内[Ca2+]i的升高与细胞外液中的Ca2+直接相关。PKA激动剂8-Br cAMP对大脑型NCX1.4和NCX1.5的激动作用与心肌型NCXl.1类似,低浓度（101μM）的8-Br cAMP即可以引起上述细胞胞内出现显着的钙振荡。本部分研究提示PKC和PKA均参与了心肌型NCXl.1、大脑型NCX1.4和NCX1.5的反向转运活性的调节,不同的是,大脑型NCX1.4和NCX1.5对PKC激动剂PMA的敏感性较心脏型NCXl.1低10倍以上,从而提示PKC蛋白磷酸化对不同组织来源的NCX1剪接产物的调节作用程度不第三部分NCX在缺血相关病理模型中作用的研究1.H2O2损伤模型中NCX作用的研究我们首先评价了H2O2损伤对野生型和转基因细胞生存率的影响。利用MTT方法,我们发现H2O2损伤24小时可以引起野生型和转基因细胞的细胞生存率出现浓度依赖性的下降,其中70μM H2O2损伤24小时后,NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为45.1%和44.0%,较野生型细胞75.3%的存活显着降低。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡,结果显示转基因细胞在70μM H2O2损伤24小时后,稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为32.7%、49.5%和52.7%,与野生型CHO细胞24.2%的死亡率相比,稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有疆着性的升高。随后,我们还采用钙成像技术实时监测H202损伤后各组细胞胞内[Ca2+]i的动态变化过程,结果显示,野生型CHO细胞胞内的[Ca2+]i升高幅度较低,上升速率较慢。本部分研究提示在氧化损伤模型中,氧自由基可以导致细胞内钙外排系统紊乱,细胞胞内[Ca2+]i升高,而H2O2还可以进一步激活NCX反向转运,加剧细胞损伤。2.酸中毒模型中NCX作用的研究类似的,我们首先评价了中度酸中毒损伤（pH6.4）对野生型和转基因细胞生存率的影响。利用MTT方法,我们发现pH6.4的细胞外液损伤可以引起野生型和转基因细胞的细胞生存率出现时间依赖性的下降,其中pH6.4的细胞外液损伤24小时后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为55.2%、62.5%和61.3%,较野生型细胞48.2%的存活显着升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡,结果显示转基因细胞在pH6.4的细胞外液损伤24小时后,稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为20.7%、22.7%和23.2%,与野生型CHO细胞333%的死亡率相比,稳定转染了NCX基因的二种细胞的死亡率都具有显着性的降低。随后,我们还采用钙成像技术实时监测各组细胞在pH6.4的环境下其胞内[Ca2+]i的动态变化过程,结果显示,野生型CHO细胞胞内的[Ca2+]i随酸化时间的延长而逐渐升高,而NCX转染细胞胞内[Ca2+]i轻微下降或者基本维持不变。本部分研究提示在酸中毒损伤模型中,由于未去除细胞外液中的葡萄糖,因而细胞的能量供应正常,NCX可以以正向转运的方式排出细胞内的钙离子,从而发挥细胞保护作用。3. Ca2+paradox模型中NCX作用的研究我们首先采用无钙细胞外液孵育野生型和转基因细胞1小时,然后复灌标准细胞外液、中钙（2.5mM）及高钙（3.8mM）三种不同钙离子浓度的细胞外液,孵育不同时间后评价钙反常损伤对野生型和转基因细胞生存率的影响。利用MTT方法,我们发现复灌标准细胞外液、中钙（2.5mM）及高钙（3.8mM）三种不同钙离子浓度的细胞外液构建钙反常损伤时,野生型和转基因细胞的生存率均出现时间依赖性的下降。复灌标准细胞外液24小时后,NCX1.1、NCXl.4和NCX1.5细胞的存活率分别为79.2%、80.3%和81.6%,较野生型细胞64.7%的存活显着升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡,结果显示转基因细胞在复灌标准细胞外液24小时后,稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为19.4%、25.4%和21.4%,与野生型CHO细胞29.9%的死亡率相比,稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显着性的降低。复灌含有2.5mM钙离子的细胞外液24小时后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为83.0%、83.3%和80.9%,较野生型细胞68.0%的存活显着升高。利用Hoechst33342IPI双重荧光染色方法检测细胞死亡,结果显示转基因细胞在复灌含有2.5mM钙离子的细胞外液24小时后,稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为23.2%、28.6%和23.8%,与野生型CHO细胞29.4%的死亡率相比,稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显着性的降低。复灌含有3.8mM钙离子的细胞外液24小时后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞的存活率分别为77.4%、75.2%和73.2%,较野生型细胞54.90%的存活显着升高。利用Hoechst33342和PI双重荧光染色方法检测细胞死亡,结果显示转基因细胞在复灌含有3.8mM钙离子的细胞外液24小时后,稳定转染的NCX1.l、NCX1.4和NCX1.5细胞的死亡率分别为31.2%、35.8%和32.8%,与野生型CHO细胞51.3%的死亡率相比,稳定转染了NCX基因的三种细胞的死亡率都具有显着性的降低。随后,我们还采用钙成像技术实时监测各组细胞在Ca2+paradox过程中胞内[Ca2+]i的动态变化过程,结果显示,灌流无钙液后,野生型细胞内[Ca2+]i未见显着改变,而稳定转染的NCX细胞[Ca2+]i现虽然轻微,但是却具有显着性的降低,这种胞内[Ca2+]i的降低主要由NCX正向转运介导。有钙液复灌1小时后野生型CHO细胞胞内的[Ca2+]i随时间延长而逐渐升高,而NCX转染细胞胞内[Ca2+]i出现较为恒定的平台期。本部分研究提示在钙反常模型中,复灌有钙液可以导致细胞内[Ca2+]i急剧上升,从而激活NCX正向转运,其通过降低胞内的钙离子浓度而发挥细胞保护作用。在本部分研究中,我们以稳定转染NCX基因的细胞株作为平台,从氧化应激损伤,酸中毒损伤和钙超载损伤既相互关联却又不完全相同的三个方面模拟缺血相关病理过程,观察心脏型NCX1.1以及大脑型NCX1.4和NCX1.5在上述疾病模型中所发挥的功能。该部分结果提示,NCX在不同的损伤环境中具有不同的转运方式,从而发挥细胞保护或者起到加重损伤的作用。
张静[10]（2010）在《TRPM7在大鼠海马神经元镁离子稳态和缺氧后内镁离子变化中作用的研究》文中研究说明神经元缺血缺氧后由于细胞内钙离子超载导致神经元丢失已被大多数实验室证实,非选择性的阳离子通道TRPM7激活是其重要的介导通道之一。TRPM7除介导钙离子内流外,在生理状态下还维持细胞内镁离子的稳态。当神经元缺血缺氧诱导TRPM7通道开放导致细胞内钙离子超载时,镁离子是否也随之进入细胞内出现镁离子超载现象?本研究使用原代培养大鼠海马神经元,建立氧糖剥夺／复氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygen, OGD/RO）以及急性化学缺氧（acute chemical ischemia, CI）模型,以镁离子荧光探针Mag-fura-2标记,观察原代培养的海马神经元内镁离子浓度变化规律；以火焰原子吸收光谱法检测海马神经元细胞外液中镁离子含量改变；并用RNA干扰技术（siRNA）负调TRPM7蛋白的表达或者使用TRPM7抑制剂GdCl3或2-APB抑制通道功能,继而检测OGD和CI后海马神经元内镁离子浓度变化。结果显示：（1）OGD1h神经元内镁离子浓度明显升高,与正常状态相比上升了1.51倍（P<0.05）,OGD1h/RO15min、30min以及60min,神经元镁离子水平持续高于正常状态,3个时间点分别与正常状态神经元相比均具有显着性差异（P<0.05）；OGD1h/RO 6h, OGD1h/RO 12h,细胞内镁离子浓度已恢复到正常水平,与正常状态相比无显着性差异；OGD1h/RO 24h,神经元内镁离子浓度水平出乎意料出现下降趋势,与正常状态相比其下降具有显着性差异（P<0.05）。去除细胞外液镁离子时,不影响生理状态下神经元内镁离子浓度,但OGD1h后去除外镁组细胞内镁离子浓度（0.62±0.02 mM）低于正常外液组内镁离子浓度（0.71±0.01 mM）,两组相比较有显着性差异（P<0.05）,且这两组与正常不缺氧组比内镁离子浓度均升高（P<0.05）,这意味着氧糖剥夺一小时后神经元内出现镁离子超载现象,该现象的发生与细胞外镁有关。（2）以氰化钾（KCN）建立CI模型,结果可见神经元内镁离子浓度快速出现上升峰（10s左右）,细胞内镁离子水平高峰在20s内快速下降到基础值水平。正常外液中加入KCN导致的神经元内镁离子升高的上升幅度为101.39%±5.74%（n=30个细胞）,而去除细胞外镁后,KCN导致神经元内镁离子的升高的上升幅度为61.32%±3.50%（n=42个细胞）,两者相比有显着性差异（P<0.05）。结果表明化学缺氧导致神经元内镁离子超载,该超载可能部分来源于细胞外镁。（3）用火焰原子吸收光谱法检测海马神经元OGD1h/RO后0、15、30、60min及6、12、24h时间点细胞外液中镁离子含量改变。结果显示：神经元外镁离子浓度在OGD1h后较正常状态相比大幅下降,两者相比具有显着性差异（P<0.05）,OGD1h/RO后15、30、60min及6、12h,神经元外镁离子浓度虽有下降趋势,但与正常状态相比没有显着性差异；无独有偶,与细胞内镁离子检测结果紧密呼应的是OGD1h/RO 24h,细胞外镁离子水平呈现升高趋势,与正常状态相比,其升高具有显着性差异（P<0.05）。加入TRPM7通道抑制剂2-APB后神经元生理状态下与正常对照组相比没有显着性差异（P>0.05）；然而OGD1h后,神经元外镁离子的浓度（13.58±0.14μg／mL）较正常组（15.43±0.14μg／mL）降低（两者相比有统计学意义P<0.05）,但在加入2-APB后升高至（14.46±0.17μg／mL）（与OGD1h组相比有统计学意义P<0.05）,但仍然低于正常组（加2-APB+OGD1h组与正常组相比有统计学意义P<0.05）；这些结果表明在氧糖剥夺一小时后,神经元外镁可能部分通过TRPM7通道进入细胞内引起细胞内镁超载。（4）SiRNA负性调节海马神经元TRPM7蛋白的表达,OGD1h或CI后检测细胞内镁离子水平均发现：SiRNA组在生理状态下神经元内镁离子浓度（0.43±0.01 mM）下降,与正常对照组（0.51±0.02 mM）相比有显着性差异（P<0.05）降幅14.77%,而干扰对照组与正常对照组相比没有显着性差异（P>0.05）；OGD1h后,SiRNA组神经元内镁离子水平升高幅度与干扰对照组相比降低了24.64%,两者相比有显着性差异（P<0.05）；CI在SiRNA组神经元内镁离子水平升高变化显示与OGD1h相同的结果。这些结果说明了TRPM7可能参与了生理状态下细胞内镁离子稳态的调节,而且也可能介导了氧糖剥夺／化学缺氧引起的神经元内镁离子超载的产生。（5）用TRPM7抑制剂GdCl3或2-APB抑制通道功能,检测OGD1h和CI后海马神经元镁离子浓度变化。结果显示GdCl3和2-APB对神经元生理状态下的细胞内镁离子水平没有影响,与正常对照组相比没有显着性差异；OGD1h后细胞外液加入2-APB,神经元内镁离子水平升高幅度低于单纯OGD1h组18.67%,两者相比有显着性差异（P<0.05）；在CI条件下,细胞外液加入GdCl3或2-APB均使神经元内镁离子的上升幅度低于单纯CI组,其幅度分别降低于20.68%和19.9%,两者分别与单纯CI组相比均有显着性差异（P<0.05）。这些结果说明在神经元氧糖剥夺／化学缺氧中,TRPM7通道可能参与了细胞外镁离子的胞内转运从而引起细胞内镁超载。
二、神经元缺氧坏死与细胞外液中不同钙离子浓度的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经元缺氧坏死与细胞外液中不同钙离子浓度的关系（论文提纲范文）
（1）钙敏感受体在灵芝酸A干预无镁细胞外液孵育海马神经元中的表达及其对MAPK通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
| 学术成果 |
| 附图 |
（2）H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外源性H_2S体外磷酸化实验(~(32)P) |
| 2.1.1 重组质粒的转化 |
| 2.1.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白Rho A的分离与纯化 |
| 2.1.4 体外磷酸化 |
| 2.2 外源性H_2S实验 |
| 2.2.1 大鼠原代海马神经细胞培养与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.2.4 缺氧性损伤模型(Hypoxia-Reoxygenation Protocol) |
| 2.2.5 细胞活力的测量 |
| 2.2.6 神经特异性烯醇化酶(NSE)活性测定 |
| 2.2.7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 |
| 2.2.8 细胞膜蛋白和胞质蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.10 全细胞膜片钳技术 |
| 2.3 内皮源性H_2S实验 |
| 2.3.1 原代脑血管内皮细胞培养 |
| 2.3.2 细胞共培养系统 |
| 2.3.3 流式细胞仪细胞凋亡测定 |
| 2.3.4 神经细胞内钙含量测定 |
| 2.3.5 H_2S浓度的测量 |
| 2.3.6 神经细胞活力和LDH及 NSE的测定 |
| 2.3.7 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.4 动物实验 |
| 2.4.1 质粒转染大鼠(脑立体定位注射) |
| 2.4.2 大鼠脑缺血模型(双侧颈总动脉结扎2VO) |
| 2.4.3 脑组织(海马)HE染色 |
| 2.4.4 脑组织(海马)TUNEL染色 |
| 2.4.5 血清LDH和 NSE测定 |
| 2.4.6 海马组织RhoA和ROCK_2活性测定 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硫化氢(H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.1.1 目的蛋白在大肠杆菌(BL-21)中的表达 |
| 3.1.2 目的蛋白(RhoA~(wild),RhoA~(S188A))的纯化 |
| 3.1.3 NaHS(外源性H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.2 Ser188 介导NaHS对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.2.1 大鼠原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.2 真核质粒(RhoA~(wild)-pEGFP-N1;RhoA~(S188A)-pEGFP-N1)转染原代大鼠神经细胞 |
| 3.2.3 Ser188 介导Na HS诱导大鼠海马神经元Rho A的磷酸化 |
| 3.2.4 Ser188在Na HS诱导神经元中Rho A易位和失活的作用 |
| 3.2.5 RhoA Ser188在NaHS诱导的ROCK_2蛋白表达及其活性抑制的作用 |
| 3.2.6 Rho ASer188 介导Na HS对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用 |
| 3.2.7 Rho A Ser188 介导Na HS对 BKCa通道电流的影响 |
| 3.3 Ser188介导内皮源性H_2S对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.3.1 大鼠原代脑血管内皮细胞(ECs)的培养与鉴定 |
| 3.3.2 内皮源性H_2S对神经元RhoA磷酸化,活性和易位的影响 |
| 3.3.3 内皮源性H_2S对神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.3.4 内皮细胞中CSE产生内皮源性H_2S |
| 3.3.5 Ser188在CSE产生的H_2S诱导大鼠神经元RhoA磷酸化,转运和ROCK_2蛋白表达中的影响 |
| 3.3.6 Ser188在CSE产生的H_2S减轻神经元H/R损伤的作用 |
| 3.3.7 Ser188在CSE产生的H_2S对神经元(H/R损伤)RhoA和ROCK_2活性抑制的作用 |
| 3.3.8 Ser188在CSE产生的H_2S保护神经元H/R损伤的作用 |
| 3.4 Ser188 介导NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用 |
| 3.4.1 大鼠脑定位转染质粒的表达与检测 |
| 3.4.2 大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)模型验证 |
| 3.4.3 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织Rho A磷酸化及其活性的影响 |
| 3.4.4 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织ROCK_2蛋白表达及其活性的影响 |
| 3.4.5 Ser188在NaHS降低大鼠缺血再灌注损伤中LDH、NSE的影响 |
| 3.4.6 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马组织病理学的影响 |
| 3.4.7 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 神经血管单位与缺血性脑中风关系 |
| 参考文献 |
（3）超声刺激机械敏感离子通道Piezo1蛋白对HUVECs生物学效应的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常见英文缩略一览表 |
| 1 引言 |
| 1.1 机械敏感蛋白 |
| 1.2 超声刺激机械敏感蛋白 |
| 1.3 Piezo1蛋白在心血管疾病中的研究 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 Piezo1 蛋白表达抑制HUVECs细胞株构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Piezo1 蛋白在HUVECs的表达检测 |
| 2.2.3 瞬时转染si RNA制备Piezo1 蛋白表达抑制的HUVECs细胞株 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HUVECs中 Piezo1 蛋白水平的表达 |
| 2.3.2 瞬时转染si RNA的 HUVECs中 Piezo1 的含量 |
| 2.4 讨论 |
| 3 超声刺激与细胞外环境对HUVECs内钙离子的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 超声刺激平台搭建 |
| 3.2.3 细胞环境溶液作用于空白HUVECs及钙离子的检测 |
| 3.2.4 超声刺激参数作用于空白HUVECs及钙离子的检测 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 细胞外液钙离子环境引起钙离子内流 |
| 3.3.2 超声刺激功率对细胞形态和细胞内钙离子的影响 |
| 3.3.3 超声刺激时间对细胞形态和细胞内钙离子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 超声刺激对HUVECs通透性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 超声刺激Piezo1抑制组和对照组细胞及钙离子的检测 |
| 4.2.3 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及ATP的检测 |
| 4.2.4 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及MLCK的检测 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 超声刺激对Piezo1抑制组和对照组钙离子的影响 |
| 4.3.2 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组ATP的影响 |
| 4.3.3 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组MLCK的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 5 超声刺激对血管舒张相关因子及ROS的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 超声刺激空白HUVECs及 NO含量的检测 |
| 5.2.2 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及NO含量的检测 |
| 5.2.3 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及cGMP的检测 |
| 5.2.4 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及Ang-Ⅱ的检测 |
| 5.2.5 超声刺激空白HUVECs及 ROS的检测 |
| 5.2.6 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组细胞及ROS的检测 |
| 5.2.7 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 超声刺激对空白HUVECs内 NO含量的影响 |
| 5.3.2 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组内NO含量的影响 |
| 5.3.3 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组内cGMP的影响 |
| 5.3.4 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组内Ang-Ⅱ的影响 |
| 5.3.5 超声刺激对空白HUVECs内 ROS的影响 |
| 5.3.6 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组内ROS的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6 超声刺激对免疫相关炎性因子的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 超声刺激空白HUVECs组样品的RNAsequence信息采集和分析 |
| 6.2.2 超声刺激Piezo1 抑制组与对照组及CXCL5 的检测 |
| 6.2.3 超声刺激Piezo1 抑制组和对照组及LCN2 的检测 |
| 6.2.4 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 超声刺激空白组HUVECs样品的RNAsequence信息分析 |
| 6.3.2 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组细胞内CXCL5 的影响 |
| 6.3.3 超声刺激对Piezo1 抑制组和对照组细胞内LCN2 的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 全文讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 综述 机械敏感通道蛋白Piezo1的研究进展 |
| 1.机械刺激类型 |
| 2.机械敏感通道蛋白Piezo1在疾病中的研究 |
| 3.结语 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的的学术论文及成果 |
| 致谢 |
（4）拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蜘蛛及其毒液 |
| 1.1 蜘蛛 |
| 1.2 蜘蛛毒液的主要组份 |
| 2 蜘蛛毒素的药理学研究 |
| 2.1 抑制谷氨酸转运蛋白对谷氨酸的摄取 |
| 2.2 细胞毒性 |
| 2.3 诱导神经递质发生胞吐作用 |
| 2.4 降解生物体组织 |
| 2.5 调节离子通道 |
| 3 蜘蛛毒素的获取 |
| 3.1 电刺激法获取毒液 |
| 3.2 蜘蛛毒素体外重组 |
| 3.3 重组蛋白的纯化方法 |
| 4 鱼尼丁受体 |
| 4.1 钙离子成像技术 |
| 4.2 昆虫鱼尼丁受体的研究 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 文库制备和转录组测序 |
| 1.5 转录组组装和功能注释 |
| 1.6 实时荧光定量PCR |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序、组装和功能注释 |
| 2.2 毒液多肽毒素和其它毒液成分鉴定 |
| 2.3 拟环纹豹蛛神经毒素的家族分析 |
| 2.4 神经毒素基因结构分析 |
| 2.5 非神经毒性多肽类毒素 |
| 2.6 毒液蛋白酶类 |
| 2.7 毒液蛋白酶抑制剂类 |
| 2.8 Venom allergen 5 |
| 2.9 透明质酸酶 |
| 2.10 组织表达谱分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 拟环纹豹蛛毒腺总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 体外表达载体构建 |
| 1.5 pFastBac~(TM)1重组质粒的构建 |
| 1.6 pPICZ A和pPICZα A重组质粒的构建 |
| 1.7 pET32a和pLicC-MBP重组质粒的构建 |
| 1.8 昆虫杆状病毒表达系统-蛋白表达 |
| 1.9 毕赤酵母表达系统-蛋白表达 |
| 1.10 大肠杆菌表达系统-蛋白表达 |
| 1.11 目的蛋白的检测 |
| 1.12 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.13 融合蛋白的纯化 |
| 1.14 融合蛋白的酶切 |
| 1.15 重组毒素的回收 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核表达载体pFastBac~(TM)1表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.2 真核表达载体pPICZ A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.3 真核表达载体pPICZα A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.4 原核表达载体pET32a表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.5 原核表达载体pLicC-MBP表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.6 融合蛋白PPTX-04的纯化及酶切 |
| 2.7 超滤管回收重组毒素 |
| 2.8 分子筛回收重组毒素 |
| 2.9 HisTrap Excel回收重组毒素 |
| 2.10 MBPTrap HP回收重组毒素 |
| 2.11 柱子联用回收重组毒素 |
| 2.12 重组毒素PPTX-22的制备 |
| 3 讨论 |
| 第四章 神经毒素PPTX-22的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 重组毒素的浓度测定 |
| 1.4 重组毒素生物活性测定 |
| 1.5 神经细胞的分离 |
| 1.6 钙离子成像 |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 神经毒素PPTX-22序列分析 |
| 2.2 生物活性测定 |
| 2.3 重组毒素PPTX-22对细胞膜钙离子通道的影响 |
| 2.4 重组毒素PPTX-22对细胞器膜钙离子通道的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间发表的论文及申请的专利 |
| 附录Ⅲ 攻读学位期间获得的奖励 |
| 致谢 |
（5）VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、颅脑创伤后血脑屏障通透性的变化和VEGF与 VEGI相对改变的观察 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 1.1.2 实验试剂及材料 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 实验统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 脑创伤急性期中不同时间点血脑屏障通透性的观察 |
| 1.2.2 TBI急性期中不同时间点VEGF与 VEGI的相对表达检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、VEGI对脑创伤后急性期神经功能的影响及血脑屏障通透性和创伤侧细胞凋亡的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂及材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VEGI干预对脑创伤急性期神经功能的影响 |
| 2.2.2 VEGI干预对脑创伤急性期对血脑屏障通透性的影响 |
| 2.2.3 VEGI干预对脑创伤急性期脑组织细胞的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、VEGI干预对脑创伤后血管新生的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 3.1.2 实验试剂及材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 实验统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VEGI干预对血管新生相关细胞的作用 |
| 3.2.2 VEGI干预对血管新生相关因子的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于MD-MS技术研究葛根总黄酮及葛根素静脉和鼻腔给药的药动学差异（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 前言 |
| 第一章 葛根的提取纯化工艺研究及其对Bcl-2 mRNA表达的影响 |
| 第一节 葛根提取工艺研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 葛根纯化工艺研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 葛根纯化放大工艺研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四节 葛根提取物的化学成分分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五节 葛根素及葛根提取物对Bcl-2 mRNA表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 微透析及HPLC-MS/MS方法建立 |
| 第一节 微透析探针回收率体外实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 微透析探针在体回收率研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 HPLC-MS/MS方法学的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 葛根素不同途径给药大鼠血液及嗅球部位药动学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 葛根素不同途径给药MCAO模型大鼠血液及嗅球部位药动学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 葛根总黄酮不同途径给药MCAO模型大鼠血液及嗅球部位葛根素药动学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 葛根素鼻腔给药入脑机理研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）颅脑损伤后颅内局部脑代谢变化的微透析实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究背景 |
| 研究对象与方法 |
| 研究方法 |
| 统计方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 实验中可能预见的问题及解决方案 |
| 微透析技术的展望 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）(+)儿茶素对神经元缺血损伤的保护作用及其对酸敏感离子通道影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 主要缩略词对照 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠皮层神经元的体外培养与鉴定 |
| 2.1.1 皮层神经元原代培养 |
| 2.1.2 NSE(神经元特异性烯醇化酶,Neuronspecific enolase,)免疫化学染色法对神经元纯度鉴定 |
| 2.2 (+)儿茶素对酸环境下神经元损伤的保护作用的研究 |
| 2.2.1 酸环境下皮层神经元的细胞存活率与时间依赖性的研究 |
| 2.2.2 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h的一般形态学观察和细胞存活率的测定 |
| 2.2.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hLDH含量的测定 |
| 2.2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hNOS含量的测定 |
| 2.3 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用 |
| 2.3.1 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复皮层神经元酸损伤的一般形态学观察和细胞存活率的测定 |
| 2.3.2 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复损伤LDH含量的测定 |
| 2.3.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4hNOS含量的测定 |
| 2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸敏感离子通道电流的影响 |
| 2.4.1 电生理记录方法 |
| 2.4.2 药品给药方法 |
| 2.4.3 信号采集 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 新生大鼠皮层神经元的体外培养与纯度鉴定 |
| 4.1.1 大鼠皮层神经元原代培养的形态学观察 |
| 4.1.2 NSE免疫化学染色对神经元纯度鉴定 |
| 4.2 (+)儿茶素对酸环境下神经元损伤的保护作用 |
| 4.2.1 酸环境下皮层神经元的细胞存活率与时间依赖性 |
| 4.2.2 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h细胞存活率的影响 |
| 4.2.3 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h LDH释放的影响 |
| 4.2.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤4h NOS含量的影响 |
| 4.2.5 (+)儿茶素对皮层神经元酸损伤形态学观察比较 |
| 4.3 (+)儿茶素对氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用 |
| 4.3.1 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤细胞存活率的影响 |
| 4.3.2 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤LDH释放的影响 |
| 4.3.3 (+)儿茶素对皮层神经元氧糖剥夺再恢复(OGD/R)损伤细胞外液NOS含量的影响 |
| 4.4 (+)儿茶素对皮层神经元酸敏感离子通道电流的影响 |
| 4.4.1 皮层神经元ASICs电流特点 |
| 4.4.2 (+)-catechin对ASICs电流的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 附录 图片 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 脑缺血与非谷氨酸依赖性阳离子通道的研究进展 |
| 1 酸敏感离子通道与脑缺血损伤 |
| 1.1 酸敏感离子通道 |
| 1.2 ASIC1a的生理学及药理学特点 |
| 1.3 ASIC1a/2a与脑缺血损伤 |
| 2 瞬时受体电位通道与脑缺血损伤 |
| 2.1 瞬时受体电位通道 |
| 2.2 TRPM7的生理学特点 |
| 2.3 TRPM2的生理学特点 |
| 2.4 TRPM2/7与脑缺血损伤 |
| 3 NCX与脑缺血损伤 |
| 3.1 钠钙交换体的生理学特点 |
| 3.2 钠钙交换体与脑缺血损伤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）钠钙交换体NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5亚型高表达细胞株的建立及生理、病理功能研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 NCX1 .1 、NCX1 .4和NCX1 .5稳定转染细胞株的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. NCX质粒鉴定 |
| 2. NCX蛋白表达 |
| 3. NCX蛋白功能检测 |
| 4. NCX抑制剂KB-R7943对I_(NCX)的影响 |
| 小结 |
| 第二部分 蛋白磷酸化对NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5反向转运活性的影响 |
| 前言 |
| 第一节 PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型和稳定转染的CHO细胞中NCX反向转运活性的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1. PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)对野生型CHO-K1细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 2. PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.1细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 3. PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.4细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 4. PKC激动剂Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.5细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 5. 细胞外液中加入5mM EGTA蛰合Ca~(2+)以后,观察PKC激动剂Phorbol 12-myristate13-acetate(PMA)诱导的稳定转染的NCX细胞中[Ca~(2+)]_i的改变 |
| 小结 |
| 第二节 PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对野生型和稳定转染的CHO细胞中NCX反向转运活性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)对野生型CHO-K1细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 2. PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.1细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 3. PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.4细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 4. PKA激动剂8-Bromoadenosine 3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)和NCX抑制剂KB-R7943对稳定转染的NCX1.5细胞中[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 5. 细胞外液中加入5mM EGTA螫合Ca~(2+)以后,观察PKA激动剂8-Bromoadenosine3’,5’-cyclic momophoshate(8-Br cAMP)诱导的稳定转染的NCX细胞中[Ca~(2+)]_i的改变 |
| 小结 |
| 第二部分 小结 |
| 第三部分 NCX在缺血相关病理模型中作用的研究 |
| 前言 |
| 第一节 H_2O_2损伤模型中NCX作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. H_2O_2损伤模型中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1. 1、NCX1. 4和NCX1. 5细胞生存率的的存活率及KB-R7943对细胞存活率的影响 |
| 2. H_2O_2损伤模型中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞死亡率的检测 |
| 3. H_2O_2损伤模型中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞[Ca~(2+)]_i的变化情况 |
| 小结 |
| 第二节 酸中毒模型中NCX作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. 酸中毒模型(pH6.4)中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1. 1、NCX1. 4和NCX1. 5细胞的存活率及KB-R7943对细胞存活率的影响 |
| 2. 酸中毒模型(pH6.4)中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞死亡率的检测 |
| 3. 酸中毒模型(pH6.4)中野生型CHO细胞及稳定转染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5细胞[Ca~(2+)]_i的变化情况 |
| 小结 |
| 第三节 钙反常(Ca~(2+)-Paradox)模型中NCX作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.1.8 mM胞外Ca~(2+)引起的Ca~(2+)-Paradox损伤 |
| 2.2.5 mM胞外Ca~(2+)引起的Ca~(2+)-Paradox损伤 |
| 3.3.8 mM胞外Ca~(2+)引起的Ca~(2+)-Paradox损伤 |
| 小结 |
| 第三部分 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）TRPM7在大鼠海马神经元镁离子稳态和缺氧后内镁离子变化中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 氧糖剥夺/复氧和化学缺氧大鼠海马神经元内镁离子浓度变化规律 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氧糖剥夺/复氧和化学缺氧时大鼠原代培养海马神经元外镁离子浓度变化规律 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TRPM7在镁离子稳态以及氧糖剥夺/复氧和化学缺氧时大鼠原代培养海马神经元内镁离子超载中的作用研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 综述 |
| 附录一 正常/过表达TRPM7的HEK293细胞在镁离子稳态以及氧糖剥夺/化学缺氧中内镁离子变化研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录二 List of Abbrivations |
| 附录三 在学期间撰写的论文 |
| 致谢 |
四、神经元缺氧坏死与细胞外液中不同钙离子浓度的关系（论文参考文献）
- [1]钙敏感受体在灵芝酸A干预无镁细胞外液孵育海马神经元中的表达及其对MAPK通路的影响[D]. 杨顺波. 佳木斯大学, 2021(12)
- [2]H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用[D]. 陈野. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]超声刺激机械敏感离子通道Piezo1蛋白对HUVECs生物学效应的调控作用[D]. 刘晓洁. 郑州大学, 2020(02)
- [4]拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究[D]. 黄立鑫. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究[D]. 郑智通. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]基于MD-MS技术研究葛根总黄酮及葛根素静脉和鼻腔给药的药动学差异[D]. 李鹏跃. 北京中医药大学, 2014(04)
- [7]颅脑损伤后颅内局部脑代谢变化的微透析实验研究[D]. 张晓丽娜. 昆明医学院, 2011(10)
- [8](+)儿茶素对神经元缺血损伤的保护作用及其对酸敏感离子通道影响的研究[D]. 张建东. 郑州大学, 2011(04)
- [9]钠钙交换体NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5亚型高表达细胞株的建立及生理、病理功能研究[D]. 龙雁. 北京协和医学院, 2010(12)
- [10]TRPM7在大鼠海马神经元镁离子稳态和缺氧后内镁离子变化中作用的研究[D]. 张静. 华中科技大学, 2010(09)