一、睫状神经营养因子在视神经损伤修复中的作用（论文文献综述）
刘雅宁[1]（2021）在《AQP5通过激活Akt信号通路促进角膜上皮损伤修复和神经再生》文中研究说明目的水通道蛋白（aquaporins,AQPs）作为一种跨膜蛋白,在维持细胞水稳态方面起着重要作用。近年来已被证实在多种组织中参与细胞间粘附、细胞迁移、细胞增殖等多种细胞功能,本研究旨在探讨水通道蛋白5（aquaporin 5,AQP5）在角膜上皮损伤修复中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技术构建以C57BL/6N小鼠为背景的AQP5基因敲除(AQP5-/-)小鼠。选取相同周龄的C57BL/6N小鼠作为AQP5+/+小鼠与AQP5-/-小鼠进行实验。通过对小鼠进行角膜上皮刮除术,建立AQP5+/+和AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤模型。使用荧光素钠、β-tubulin III和Ki-67分别作为角膜上皮缺损、角膜神经和角膜上皮增殖的标志物对小鼠角膜进行染色。用蛋白质印迹法和免疫荧光染色对角膜上皮神经再生相关信号磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt,p-Akt）和神经生长因子（nerve growth factor,NGF）进行检测。通过外源性给予NGF和Akt抑制剂（Akt inhibitor,Akti）对AQP5-/-小鼠进行干预诱导,观察小鼠角膜上皮损伤修复速度和神经再生情况。结果（1）AQP5在AQP5+/+小鼠角膜上皮细胞的细胞膜中广泛表达,而在AQP5-/-小鼠角膜上皮细胞中几乎不表达。并且与AQP5+/+小鼠相比,AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤修复速度和神经再生速度明显延迟。（2）对小鼠角膜进行神经染色和敏感度测量发现,与AQP5+/+小鼠相比,AQP5-/-小鼠神经纤维密度和角膜敏感度均明显下降。（3）与AQP5+/+小鼠相比,无论是否对小鼠进行角膜上皮刮除术,AQP5-/-小鼠角膜上皮中Ki-67阳性细胞数量、NGF和p-Akt表达水平均明显减少,提示了AQP5基因敲除后,小鼠角膜上皮细胞增殖能力和神经再生能力可能存在缺陷,并且可能通过影响Akt信号通路激活进而抑制角膜上皮损伤修复速度和神经再生。（4）对AQP5-/-小鼠外源性给予NGF进行干预治疗,发现NGF治疗组的小鼠角膜上皮损伤修复和神经再生速度显着快于PBS处理组,并且伴有p-Akt表达水平的增加。（5）对AQP5-/-小鼠外源性给予NGF进行干预治疗,AQP5-/-小鼠角膜神经纤维密度和角膜敏感度明显增加。（6）Akti阻断了NGF对AQP5-/-小鼠的角膜上皮损伤修复和神经再生速度的促进作用。结论本研究发现AQP5-/-小鼠角膜上皮损伤修复速度的抑制是由于角膜上皮细胞增殖和神经再生的明显缺陷所致。这一结果为水通道蛋白参与细胞增殖和神经再生的过程提供了证据,并提示AQP5是加速角膜缺损修复的一种可能的治疗靶点。
陈亭[2]（2021）在《大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化》文中提出目的:建立纯度良好的视网膜神经节细胞（RGCs）培养模型检测大鼠出生后RGCs发育过程中的Jarid1b的表达变化;建立大鼠动物模型来观察视神经损伤后H3K4me3、Jarid1b的表达趋势,推测Jarid1b可能在视神经损伤后再生修复过程中发挥一定功能,为视神经损伤后的临床诊疗提供一定的基础依据。方法:首先选取出生6天（P6）的乳鼠,麻醉后取其眼球,解剖获得乳鼠视网膜组织,经消化、筛选及纯化制得RGCs,将其悬浮后于24孔板中铺板,并通过免疫细胞化学方法鉴定其纯度。1.提取P6（出生6天）和成年大鼠的RGCs,并采用荧光定量PCR法检测Jarid1b的核酸表达水平的变化。2.选取清洁成年SD大鼠（n=45）损伤其左眼视神经以构建视神经损伤模型,右眼暴露视神经15秒以构建对照组模型。3.视神经损伤的第3天、第7天、第14天提取RGCs细胞、收集损伤组和对照组视神经组织制备组织切片;应用荧光定量PCR法检测损伤组和对照组中Jarid1b的核酸表达水平变化,应用免疫组化检测两组视神经中Jarid1b和H3K4me3的表达,并进行统计学分析。结果:1.光学显微镜下观察提取出的p6乳鼠RGCs,体外存活时间为7天左右,为后续细胞研究提供了基础。通过使用该培养方法筛选得出的RGCs阳性收益好,纯度较高,为进行RGCs相关的实验研究提供基础。2.通过qRT-PCR观察到Jarid1b的mRNA表达量在大鼠初生时随发育逐渐降低。3.视神经急性损伤后各时间点Jarid1b的表达均低于正常对照组,对照组Jarid1b表达无明显变化。4.视神经急性损伤后各时间点H3K4me3的表达均高于正常对照组。对照组H3K4me3的表达无明显变化。结论:1.该原代培养方法获得的大鼠RGCs阳性筛选效益较好。培养出的RGCs生长良好,纯度较高,初生6天乳鼠的RGCs体外存活时间可达7d,可以用于进一步的基础研究。2.Jarid1b在调控RGCs的发育、分化及凋亡等方面可能发挥着不同作用。3.视神经损伤后,H3K4me3及Jarid1b表达趋势提示:（1）Jarid1b与H3K4me3的表达变化在视神经损伤过程中关系密切;（2）推测Jarid1b表达变化是视神经损伤后抑制RGCs轴突再生的机制之一。
惠鹏[3]（2020）在《microRNA-200a对慢性高眼压小鼠视网膜的保护作用及其机制研究》文中研究表明青光眼是一类多种病因造成的以视神经改变及视野损害为特征的视神经退行性疾病的统称,目前已成为全球首位不可逆性的致盲性眼病。虽然青光眼的发病机制一直是研究的热点,但到目前为止青光眼的发病机制仍不明确。已有研究表明micro RNAs（mi Rs）参与调节眼压变化。然而,mi R-200a在青光眼中的作用尚未得到很好的研究。目的:探究mi R-200a通过调控FGF7对慢性高眼压小鼠视网膜的作用及其相关机制,为青光眼疾病治疗提供新靶点。方法:首先,利用微阵列表达谱筛选出青光眼相关差异性表达基因,利用生物信息学分析确立后续研究的基因FGF7。进一步应用生物信息学分析和双荧光素酶基因检测法验证mi R-200a与FGF7的靶向调控关系。随后对慢性高眼压小鼠进行分组进行体内、体外研究青光眼的相关视网膜神经损伤改变。分别应用HE染色的实验方法,研究上调的mi R-200a或下调的FGF7对视网膜的结构和形态的影响。应用免疫组化、TUNEL法和MTT法,研究上调的mi R-200a或下调的FGF7对CD11b和i NOS表达、视网膜神经节细胞凋亡、Müller细胞存活。最后利用RT-q PCR和Western Blot法检测各组中,mi R-200a、FGF7及MAPK信号通路（ERK、JNK、p38）中的m RNA及其磷酸化后蛋白表达。结果:mi R-200a在慢性高眼压小鼠的视网膜中表达减少,同时FGF7被强力诱导表达增加。因此,我们推测FGF7受mi R-200a负调控。在体内、体外实验中,下调mi R-200a可以增加CD11b和i NOS的表达,促进RGCs的凋亡,刺激Müller细胞失活。然而,在FGF7抑制后,mi R-200a下调引起的上述变化被逆转。下调mi R-200a可以通过上调FGF7激活MAPK信号通路,使ERK、JNK、p38和Bax表达升高和Bcl-2表达降低。因此,证明mi R-200a可抑制FGF7介导的MAPK信号通路。结论:我们的研究证明在慢性高眼压小鼠视网膜中,mi R-200a可以通过靶向抑制FGF7介导的MAPK信号通路,对青光眼造成的视神经损害起神经保护作用。使得mi R-200a可能成为青光眼疾病治疗的新靶点。
张婵媛[4]（2020）在《JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究》文中进行了进一步梳理目的:通过提取初生SD大鼠视网膜建立视网膜神经节细胞（RGCs）的原代培养模型并对其纯度进行鉴定,检测组蛋白去甲基化酶JARID1B在大鼠出生后RGCs发育过程中的表达,研究JARID1B在其发育过程中的变化;建立过表达JARID1B的RGCs细胞模型,初步探索其对体外培养RGCs存活的影响。为视功能恢复及视神经相关疾病的基础研究提供一种体外实验体系,并为JARID1B在RGCS发育及再生中起重要作用提供依据。方法:1.首先通过培育OX-7杂交瘤细胞提取含Thy1.1抗体上清液用于阳性筛选RGCs;然后选取成年SD大鼠雌性12只,雄性6只,2:1交配,选取出生7d（P7）以内的乳鼠,选用木瓜蛋白酶对其视网膜组织进行消化,制备RGCs细胞悬液,以巨噬细胞多克隆抗体对所得细胞进行初步筛选,再以山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗鼠IgG（H+L）+含Thy-1.1抗体上清液依次进行阴性、阳性选择,将所得RGCs悬浮后铺板于24孔细胞培养板（提前用鼠层粘连蛋白和多聚-D-赖氨酸预处理）中进行培养,培养72h后采用抗鼠Thy-1.1抗体通过免疫细胞化学方法鉴定其纯度。2.用Western Blots检测P6（出生6d）、P14（出生14d）、成鼠视网膜组织中H3K4me3蛋白的表达;分别提取P3、P6、P14、10W（出生10W）、20W（出生20W）大鼠的RGCs,利用qRT-PCR及免疫荧光方法检测JARID1B及其相关分子的mRNA及蛋白表达变化水平及趋势。3.利用Cumate-pLenti-JARID1B-SV40-GFP慢病毒质粒转染培育3天的P6 RGCS使其过表达JARID1B,空病毒载体组作为对照,观察其对体外培养条件下自然凋亡（或坏死）的RGCs存活的影响。4.本文采用SPSS软件进行统计学分析,均通过方差齐性检验,配对资料采用配对t检验,不同组间比较采用独立样本t检验,检验水准为0.05,P<0.05说明差异有统计学意义。结果:1.OX-7杂交瘤细胞培育结果良好,所提取出的上清液含Thy-1.1抗体浓度高,用于阳性筛选大鼠RGCs效益好,收益率达1.5万个细胞/视网膜,连续观察培养RGCs无污染等现象,且可长期贮存,易于推广。2.此抗体筛选方法培养出的RGCs生长良好,纯度较高,体外可存活9天;P3RGCs存活时间相对更长,高密度接种的RGCs形成的细胞间突起连接更多,死亡速度更慢。3.WB检测H3K4me3蛋白在大鼠视网膜发育的不同阶段（P6、P14、成鼠）表达无显着差异;qRT-PCR检测JARID1B的mRNA表达量在大鼠初生时随发育逐渐增高,在P14后的某一时间点到达高峰,至20W（老年期）下降;细胞免疫荧光检测其蛋白表达证实了转录水平与翻译水平的统一。4.以慢病毒作为载体使体外培养的RGCs过表达JARID1B,观察到体外培养条件下会自然凋亡（或坏死）的RGCs存活时间延长,同一时间点镜下存活细胞较对照组多,且形态更稳定。结论:1.通过培育OX-7杂交瘤细胞提取的含Thy-1.1抗体上清液用于大鼠RGCs阳性筛选效益好,易于推广。培养出的RGCs生长良好,纯度较高,P6 RGCs体外存活时间可达9d,可以用于进一步的基础研究。2.JARID1B很有可能参与了RGCs的分化、成熟、凋亡过程,在RGCs发育过程的不同阶段发挥着不同的作用;H3K4me3与JARID1B在RGCs发育中的相互作用需要进一步研究。3.JARID1B过表达可使体外培养的RGCs存活时间延长,并维持RGCs形态及轴突连接,显示了JARID1B在维持RGCs活性、抑制RGCs凋亡乃至促进RGCs再生方面的可能潜力。
李贺[5]（2020）在《靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制》文中研究说明目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显着促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经回路重建和功能恢复变成可能。因而,找准靶点基因提升受损中枢神经元的内在再生能力是治疗中枢神经损伤的关键所在。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点（provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1）为原癌基因,可编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是许多细胞因子及生长因子细胞内信号通路的共同下游效应分子,通过磷酸化下游蛋白质丝氨酸/苏氨酸位点,在细胞增殖、存活及凋亡等过程中发挥重要作用。基于Pim-1是多个信号通路共同下游效应分子,且对细胞的增殖及存活具有重要作用,本研究首先观察Pim-1在体外受损中枢神经元样细胞内的表达变化,睫状神经营养因子（CNTF）和神经突起素（Neuritin,Nrn1）调控下游信号通路对Pim-1表达的影响,以及这种影响对受损神经元的作用及相关机制。以Pim-1基因为靶点,用重组慢病毒（recombinant lentivirus）载体过表达Pim-1,或用Pim-1 siliencer特异性干扰Pim-1表达,探讨直接调控Pim-1表达对体外受损神经元样细胞的活性和突起再生的作用,为临床治疗中枢神经元损伤提供新的方法及其实验和理论依据。本研究还基于长链非编码RNA（long non-coding RNA,Lnc RNA）调控神经发育和损伤的相关研究以及Lnc-Pim1与Pim-1基因位点、序列的密切关系,观测Lnc-Pim1在体外中枢神经元样细胞的序列全长、表达定位、损伤后表达变化、与Pim-1相互作用关系,并以Lnc-Pim1基因为靶点,用重组慢病毒载体过表达Lnc-Pim1,或用Lnc-Pim1siliencer特异性干扰Lnc-Pim1表达,探讨调控Lnc-Pim1表达对体外受损神经元样细胞的修复作用,同时还应用CHIRP-MS和RNA-seq技术探究Lnc-Pim1发挥作用的初步分子机制。方法:（1）在体外用20μmol/ml反式视黄酸（RA）将Neuro-2a细胞诱导成为神经元样细胞（N-2a-N）;用50μmol/L去铁胺亚磺酸盐（DFO）抑制Neuro-2a细胞增殖;用1mmol/L丙烯酰胺（ACR）损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、PBS组、300μg/L CNTF组、500μg/L Nrn1组。用Image J 6.0测量细胞突起长度,用CCK-8法检测细胞活性。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达,Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。Western blotting检测调节Pim-1活性的相关信号转导分子（Stat-3、p-Stat-3、Erk1/2、p-Erk1/2）,细胞存活、凋亡相关分子（Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2）及轴突再生相关分子GAP-43的表达变化。（2）用RACE法获得N-2a-N细胞内Lnc-Pim1全长序列。用Phylo CSF、CPC和CNCI软件对Lnc-Pim1编码能力进行预测。用FISH法和核质分离技术检测Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内的亚细胞定位。用Real-time PCR检测不同时间点受损N-2a-N细胞中Lnc-Pim1的表达变化。（3）构建Pim-1、Lnc-Pim1重组慢病毒载体,用Real-time PCR测定病毒的滴度。（4）设计Pim-1、Lnc-Pim1特异性干扰试剂Pim-1 siliencer和Lnc-Pim1 siliencer,采用Real-time PCR检测不同浓度干扰试剂对N-2a-N细胞内Pim-1、Lnc-Pim1表达的影响。（5）用MOI值为40携带杀稻瘟菌素抗性的Pim-1重组慢病毒载体感染Neuro-2a细胞,用80μg/ml的杀稻瘟菌素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Pim-1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用200nmol/ml的阴性对照物（Negtive control,NC）silencer或Pim-1 siliencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Pim-1 silencer组,并于转染48 h后检测。倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,并对细胞突起长度进行测量、统计。用CCK-8检测各组细胞活性,用Real-time PCR及Western blotting检测各组Pim-1基因及蛋白的表达,用Western blotting检测各组GAP-43蛋白表达。（6）用MOI值为40携带嘌呤霉素抗性Lnc-Pim1的重组慢病毒感染Neuro-2a细胞,用20μg/ml的嘌呤霉素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Lnc-Pim1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Lnc-Pim1 silencer组,并于转染48 h后检测。用CCK-8法检测各组细胞活性,倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,用Image J对细胞突起长度进行测量、统计。用Real-time PCR检测Lnc-Pim1的表达,用Western blotting检测Erk1/2、p-Erk1/2的表达。（7）N-2a-N细胞用重组慢病毒载体分别过表达Pim-1和Lnc-Pim1,用200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer分别敲低Pim-1和Lnc-Pim1的表达,用Real-time PCR检测过表达或敲低Pim-1、Lnc-Pim1对彼此基因表达的影响。（8）用CHIRP-MS技术检测正常N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的互作蛋白,用RNA-seq技术检测正常N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达或敲低所导致的差异性表达基因,分别对互作蛋白和差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析。结果:（1）细胞免疫荧光显示N-2a-N细胞表达神经元标志分子β-ⅢTubulin和Neurofilament-200,Pim-1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质。50μmol/L DFO能有效抑制Neuro-2a细胞的增殖。用1mmol/L的ACR成功建立N-2a-N细胞突起损伤模型。N-2a-N细胞损伤后,Pim-1基因表达呈现先降低、后升高、再降低的趋势。与PBS组相比,CNTF组和Nrn1组最长神经突起所占比例明显增加,细胞内信号转导分子Erk1/2、p-Erk1/2、Stat3、p-Stat3、Pim-1表达上调,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3、Bax表达下调,抗凋亡相关分子Bcl-2表达上调,神经突起生长相关分子GAP-43表达上调。（2）RACE法获得的N-2a-N细胞内Lnc-Pim1序列全长为2262个碱基;Phylo CSF、CPC和CNCI软件证实Lnc-Pim1具有较低的编码蛋白潜能;FISH法和核质分离技术证实Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内主要表达于细胞质,少部分表达在细胞核。N-2a-N细胞损伤后,Lnc-Pim1基因表达呈现出先降低、后升高、再降低的趋势,变化的时相点早于Pim-1。（3）成功构建LV-Pim-1和LV-Lnc-Pim1过表达载体,LV-Pim-1滴度为2.64×108TU/ml,LV-EGFP滴度为6.82×108TU/ml;LV-Lnc-Pim1滴度为3.65×108TU/ml,LV-mcherry滴度为1.18×109TU/ml。（4）200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml LV-Lnc-Pim1silencer可分别特异性干扰N-2a-N细胞内Pim-1和LV-Lnc-Pim1的表达。（5）MOI值为40的Pim-1重组慢病毒载体具有较高的感染率,且不影响Neuro-2a细胞活性;80μg/ml的杀稻瘟菌素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞。病毒感染的Neuro-2a细胞,经纯化5代后其感染率可达85%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Pim-1表达水平。Pim-1过表达可增强受损N-2a-N细胞的活力,上调GAP-43蛋白的表达,进而促进受损N-2a-N细胞突起再生。200nmol/ml Pim-1 silencer可导致N-2a-N细胞内Pim-1 m RNA和蛋白表达下调、细胞活性减弱、GAP-43蛋白表达下调,N-2a-N细胞突起的生长受到显着抑制。（6）MOI值为40的Lnc-Pim1重组慢病毒具有较高的感染率且不影响Neuro-2a细胞活性;20μg/ml的嘌呤霉素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞;病毒感染的Neuro-2a细胞经纯化5代后其感染率可达到90%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Lnc-Pim1表达水平。Lnc-Pim1过表达可激活Neuro-2a细胞Erk1/2信号通路,具有促进细胞分化的潜能,并能促进受损N-2a-N细胞突起再生。Lnc-Pim1silencer可敲低N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的表达,抑制N-2a-N细胞突起的生长,不影响细胞活性。（7）N-2a-N细胞Pim-1过表达导致Lnc-Pim1表达下调,Pim-1表达下调对Lnc-Pim1的表达无显着性影响;Lnc-Pim1过表达可促进Pim-1表达上调,Lnc-Pim1表达下调对Pim-1表达无显着影响。（8）CHIRP-MS共检测出N-2a-N细胞内183个Lnc-Pim1特异性的互作蛋白,GO和KEGG富集分析显示Lnc-Pim1特异性的互作蛋白主要分布在N-2a-N细胞的细胞质、少部分分布在细胞核。这些互作蛋白与N-2a-N细胞内基因和蛋白的表达调控、细胞间黏附、外泌体分泌、蛋白酶体活性、物质代谢等多种生物学过程相关。在这些互作蛋白中,Tubulin与Histone H2的可信度值最高。RNA-seq结果显示N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达导致140个差异表达的基因,其中93个表达上调,47个表达下调;N-2a-N细胞Lnc-Pim1敲低导致982个差异表达的基因,其中732个表达上调,250个表达下调。GO和KEGG富集分析显示MAPK和PI3K/Akt信号通路可能在Lnc-Pim1对N-2a-N细胞突起生长的效应中起重要作用。过表达和敲低Lnc-Pim1后,一些通路上共表达的Ccl2、Ccl5、Ghr、Hgf和Il1b基因可能是Lnc-Pim1作用的靶基因。结论:（1）Pim-1、Lnc-Pim1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1和Lnc-Pim1的需要。（2）神经营养因子CNTF、Nrn1可激活受损N-2a-N细胞Erk1/2及Stat3信号通路,上调Pim-1,进而增强细胞活性、减少细胞凋亡、上调GAP-43表达,从而促进受损N-2a-N细胞突起再生。（3）Pim-1过表达能够增强受损N-2a-N细胞活性、上调GAP-43表达,进而促进突起再生。敲低N-2a-N细胞Pim-1的表达,细胞活性、GAP-43表达和突起生长受到明显抑制。（4）Lnc-Pim1过表达可促进受损N-2a-N细胞突起再生,还可能具有促进Neuro-2a细胞分化的作用。Lnc-Pim1表达下调抑制N-2a-N细胞突起生长。（5）Lnc-Pim1过表达可能顺式增强Pim-1表达,Pim-1过表达可抑制Lnc-Pim1表达。（6）N-2a-N细胞中一些Lnc-Pim1的互作蛋白及受Lnc-Pim1调节的基因,为下一步研究Lnc-Pim1作用机制提供了初步实验基础。总之,N-2a-N细胞的Pim-1、Lnc-Pim1主要表达于细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1、Lnc-Pim1的需要;外源性CNTF或Nrn1经上调Pim-1表达以及Pim-1、Lnc-Pim1经重组LV载体过表达,均能促进受损N-2a-N细胞突起的再生,并初步阐明了一些相关作用机制。
袁容娣[6]（2020）在《PirB在视神经损伤修复与再生中的作用机制研究》文中提出研究背景和意义中枢神经系统（central nervous system,CNS）损伤后的修复与再生,一直是医学研究领域的热点和难点。视神经（optic nerve,ON）是CNS的一部分,眼外伤、青光眼等疾病均可导致视神经损伤,但目前仍缺乏治疗的有效手段,常引起患者视功能障碍甚至失明。微环境中大量存在的抑制性髓鞘磷脂相关因子（Myelin-associated inhibitor,MAI）,是视神经损伤后再生困难的主要原因之一。视神经髓鞘通常包绕视神经轴突,当视神经损伤后暴露在大量MAI的环境中,MAI特异性地与视神经轴突上的受体结合,导致生长锥板状伪足和丝状伪足细胞骨架不稳定,从而阻碍视神经再生。在众多MAI中,少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）、勿动蛋白（Nogo-A）和髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein,MAG）,对神经元轴突再生发挥主要的抑制作用。在CNS中这三个MAI有两个已知的共同受体,即抑制分子受体（nogo-66 receptor,Ng R）和配对免疫球蛋白样受体B（paired immunoglobulin-like receptor B,PirB）。但有研究发现,NgR在CNS再生中的髓磷脂相关抑制作用十分有限,单一的NgR基因敲除并不能显着降低MAI对神经元轴突生长的抑制作用,而单一的PirB拮抗却可以减少这种抑制。我们推测,在中枢神经系统中,PirB可能在抑制轴突生长上占据主导地位。然而这方面的研究特别是PirB在视神经损伤后有何变化尚不清楚,其作用机制也不明确。本研究在观察到视神经损伤后视网膜中PirB表达发生变化的基础上,通过利用干扰病毒抑制PirB表达等手段,探讨其保护视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells,RGCs）、促进轴突生长及视神经损伤后视功能恢复的作用和机制。本研究的结果可以为视神经损伤修复的临床治疗提供新的靶点和方法。研究目标:通过体内、体外实验,模拟视神经损伤模型,明确PirB在视神经损伤修复再生中的作用及可能机制。研究方法:1.制作SD大鼠视神经钳夹损伤模型,免疫荧光染色观察伤后1、3、7d视网膜上PirB的表达情况,利用q RT-PCR和Western blotting方法检测钳夹伤后1,3,7,14d视网膜中PirB的m RNA和蛋白水平。2.体外培养原代RGC细胞,分别用MAG、Nogo-A、OMgp抑制其轴突生长,再用AD shRNA PirB干扰RGC的PirB表达,用免疫荧光染色法检测RGC细胞轴突的长度。3.体外培养原代Müller细胞,用AD shRNA PirB干扰其PirB表达,利用免疫荧光染色、q RT-PCR和Western blotting方法验证病毒对Müller细胞中PirB的干扰效率;再用Western blotting方法检测Müller细胞干扰了PirB后P-JAK、P-Stat3、P-SHP1、SHP1、SHP2、P-SHP2以及NGF、CNTF、BDNF等神经生长因子的表达变化;接着将Müller细胞与损伤的RGC共培养,用免疫荧光的方法检测RGC轴突再生的情况;最后用si RNA CNTF干扰Müller细胞的CNTF表达,通过免疫荧光染色检测共培养的RGC轴突再生情况。4.在动物实验来进一步验证PirB在体外细胞实验中的作用。将AAV shRNNA PirB注射到SD大鼠玻璃体腔中21d,Western blotting方法检测PirB的干扰效率;用干扰了视网膜PirB表达的大鼠制备视神经钳夹伤模型,分别于伤后7、14、28d行视网膜铺片,计数CTB阳性标记的RGC数目;免疫荧光染色观察大鼠视神经钳夹伤后7、14、28d视神经中GAP43的表达;用视觉电生理FVEP检测视神经钳夹伤后28d后的N2、N1-P1、N2-P2等视功能指标。研究结果1.正常情况下PirB主要在视网膜RGC中表达,视神经钳夹伤后视网膜的PirB荧光从GCL层向ONL层激活,RGC和Müller细胞的PirB明显激活;RGC和Müller细胞的PirB激活具有时间依赖性,荧光表达随着钳夹伤时间的延长而逐渐增强。钳夹伤后视网膜组织PirB的mRNA和蛋白水平都较Blank、Sham组显着升高。2.AD shRNA PirB可以有效敲低体外培养的RGC细胞的PirB表达,但对MAG、Nogo-A、OMgp这三种MAI抑制的轴突的生长都没有明显的促进作用。3.体外培养的Müller细胞表达PirB,用AD shRNA PirB敲低其PirB的表达后,可以促进Müller细胞中P-SHP1、P-Stat3、CNTF的蛋白表达;敲低PirB表达的Müller细胞与RGC细胞共培养,可以明显促进RGC轴突损伤后再生,并且这种促再生作用可以被si RNA CNTF逆转。4.敲低SD鼠视网膜PirB的表达,可以促进钳夹伤后视神经轴突GAP43荧光表达;但对视网膜RGC细胞的存活没有明显的保护作用,AAV shRNA PirB组和AAV shRNA对照组在视神经钳夹伤后7,14,28d的视网膜RGC计数,差异没有统计学意义;敲低SD鼠视网膜PirB的表达,对钳夹伤后28d的FVEP的N2,N1-P1,N2-P2值未见明显改善。研究结论1.视神经损伤后视网膜RGC和Müller细胞的PirB表达升高,提示PirB在视神经损伤后的病理变化中扮演了重要的角色。2.Müller细胞中的PirB在MAI抑制轴突生长的作用中可能比RGC细胞中的PirB更重要。其机制可能与通过PirB-SHP1-JAK/Stat3-CNTF途径调节CNTF的表达有关。3.抑制视网膜的PirB表达,可以显着促进视神经钳夹伤后的轴突再生,但不具有RGC保护效应,且在本研究中未显现出对视功能恢复有显着的改善,提示只促进视神经再生而不保护RGC的存活导致PirB治疗作用有限。
韩卫[7]（2020）在《Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究》文中研究说明研究背景视觉信息占人类获取外界信息总量的85%,良好的视觉对人类的工作、生活至关重要。视神经是由视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）的轴突汇聚而成。创伤造成的轴突损伤和RGC凋亡是视力不可逆丧失的常见原因。与中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的其他细胞类似,RGC轴突的再生能力极差。这主要归因于:轴突内在的再生能力较差;损伤造成胶质瘢痕对轴突再生的阻遏作用。科学研究证实,细胞微管骨架剪切酶Fidgetin Like 2（FL2）能够影响中枢神经元轴突的再生,抑制FL2的活性可以明显促进脊髓背侧神经元轴突的再生,甚至可以跨越胶质瘢痕。作为细胞骨架的重要成分,微管对哺乳动物细胞的形态、运动、复制、迁徙具有重要功能。对中枢神经元来说,适度的微管稳定能够促进轴突的再生和抑制细胞凋亡。RGC与脊髓背侧的神经元类似,均属于中枢神经元细胞,而近期的诸多证明显示FL2在RGC的胞浆内广泛表达,因此抑制RGC中FL2的表达是否可以促进RGC细胞轴突的再生,进而使机体在视神经损伤后视觉得到有效恢复,值得进一步探讨。在以上研究的基础上,本论文从体内及体外两个方面进行研究,分析FL2-siRNA对RGC存活及轴突再生的影响,以期给予临床一定启发。第一部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究目的:视神经损伤后出现的视神经纤维丢失及视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性凋亡,引起视功能不可逆的下降。本研究通过对体外培养的RGC-5细胞系进行靶向基因沉默,探讨Fidgetin Like 2-siRNA对RGC-5细胞存活及轴突再生的影响。材料与方法:采用RGC-5细胞株,进行体外培养,选取第三代细胞作为研究对象,在高糖DMEM培养基中培养24h后,将其分成以下三组:Control组（细胞不做任何处理）、U-FIGN组（Fidgetin Like2的过表达质粒转染RGC-5细胞）、D-FIGN组（Fidgetin Like 2-siRNA沉默FL2在RGC-5细胞中的表达）。具体检测项目如下:RT-PCR检测各组FL2 mRNA的浓度;免疫组织化学染色观察各组细胞内FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达;免疫荧光观察各组细胞内FL2、GFAP、GAP-43及突触素（Synaptophysin,SYN）的表达;线粒体膜电位测定各组细胞线粒体膜电位;ATP合成能力检测;TUNEL检测各组细胞凋亡;CCK-8检测各组细胞增殖;透射电镜检测各组细胞器变化;划痕实验及Transwell实验检测各组细胞迁移能力;Western-blot检测各组细胞FL2、GFAP、GAP-43及突触素SYN表达。结果:RT-PCR检测:各组之间FL2 mRNA的蛋白表达趋势为D-FIGN<Control<U-FIGN。免疫组织化学染色:FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN 组。免疫荧光检测:FL2蛋白与GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组;GAP-43及SYN的表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。线粒体膜电位分析:FL2低表达细胞的线粒体膜电位呈现出红色荧光,随着FL2含量增加,细胞红色荧光逐步向绿色荧光转变,线粒体能量逐步从高能量状态向低能量状态转变;ATP合成能力:各组之间数据趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。FL2的过表达可以降低线粒体ATP合成能力,发生细胞内能量供应不足现象,导致细胞死亡。细胞凋亡及增殖:结果提示各组细胞的早期凋亡趋势为D-FIGN（0.81%±0.52）<Control（1.67%±0.71）<U-FIGN（2.12%±0.95）。细胞增殖趋势为 U-FIGN组<Control 组<D-FIGN 组。透射电镜:对照组及D-FIGN组细胞器形态较为正常,线粒体及高尔基体整体形态正常,周围溶酶体及脂质沉淀的分布较少,而在FL2过表达后,细胞内部明显充斥溶酶体及脂质沉淀,细胞炎性效应明显,同时线粒体肿大,提示中毒现象发生。细胞迁移:划痕实验、Transwell试验各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN 组。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组。GAP-43及SYN各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。结论:（1）实验过程中,FL2成功在RGC-5细胞内过表达或沉默;FL2具有一定致炎效应,它的过表达会导致RGC-5细胞炎性侵润程度加重,加剧RGC-5细胞的死亡。（2）FL2的过表达可以降低RGC-5细胞内线粒体ATP合成能力及膜电位变化,进而发生细胞内能量供应不足的现象,线粒体氧化还原状态失常、呼吸链解偶联,细胞无法得到足够的能量供给,发生凋亡或坏死。FL2沉默后线粒体功能有所改善,对RGC-5细胞具有保护作用。（3）在RGC-5细胞内,FL2过表达可以促进GFAP蛋白表达,激活星形胶质细胞,使得视神经损伤加剧,FL2沉默后,神经生长因子蛋白GAP-43表达增多,有利于细胞的存活及轴突再生过程。第二部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究目的:视神经损伤可导致视网膜神经节细胞（RGCs）的缺失、凋亡,引起不同程度的视力障碍。本研究通过钳夹视神经建立小鼠视神经损伤模型并加以干预,观察FL2-siRNA对视神经组织及RGC细胞损伤后的保护作用。材料与方法:本实验选取YFP小鼠45只作为研究对象,行双眼视神经钳夹伤手术,以建立视神经损伤模型。将小鼠分成三组:I-FIGN组（玻璃体腔内注射FL2-siRNA,1×10-3g/L,5μL）、P-FIGN（玻璃体腔内注射FL2的过表达质粒,1×10-3g/L,5μL）、Control组（玻璃体腔内注射生理盐水,5μL）;具体观察项目如下:HE染色观察各组小鼠视网膜组织形态;RGC细胞存活率检测;免疫荧光检测分析各组小鼠视网膜组织内FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达;视交叉及对侧神经元轴突退行性改变观察;甲苯胺蓝染色观察视神经的退行性改变情况;Western-blot检测分析FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达。结果:HE染色:Control组细胞炎性反应严重,细胞间的层次清晰性差,整体结构逐渐混乱,细胞间连接性差;在注射FL2-siRNA后,细胞的层次逐渐加强,轮廓明显,整体结构比较规则;而P-FIGN组,细胞明显凌乱,较Control组而言,细胞间连接较差。细胞存活率:各组细胞的存活率为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组;免疫荧光检测:FL2及GFAP各组表达趋势Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43 及 SYN 的表达趋势为 P-FIGN<Control 组<Ⅰ-FIGN 组。神经元退行性改变:对照组小鼠视神经轴突部分呈念珠状,视神经纤维周围出现浑浊。当FL2表达浓度降低后,视神经轴突的念珠状有所减轻,炎症反应减轻;FL2过表达后,其神经轴突的念珠状继续延伸,逐步恶化,神经轴突向碎片状转变,视神经的退行性病变较为严重。甲苯胺蓝染色:对照组小鼠细胞的轴突为深蓝色,髓鞘多为圆形和椭圆形,细胞大小适中同时分布较为均匀,FL2低表达后,其排列更加规则;而在FL2过表达后,神经节细胞的轴突出现肿胀变形并聚集成团,神经纤维的排列亦较为混乱。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43及SYN各组表达趋势为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组。结论:（1）小鼠视神经夹伤模型制备成功,FL2成功在RGC细胞内过表达或抑制表达,FL2会促进小鼠视网膜组织炎性反应,激活星形胶质细胞,损伤视神经、降低神经生长因子蛋白表达含量,抑制RGC细胞的存活以及轴突的发育过程。（2）FL2可降低RGC细胞的存活率,加速视神经节细胞的死亡,同时对视神经轴突的退行性改变具有促进作用,导致轴突团簇肿胀,呈现念珠状甚至是碎片状。FL2沉默后,RGC细胞的存活率升高,神经节细胞的形态更加规则,轴突的发育状况好转,与体外研究结论一致。FL2-siRNA可作为治疗视神经损伤药物的新方向,值得临床参考。
李越[8]（2019）在《新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用》文中研究说明现代战争中各种火器的强大动能极易导致周围神经缺损,平时周围神经损伤则常见于交通事故、肿瘤切除、炎性疾病、先天性畸形等因素。缺损性周围神经损伤不仅难以修复,也给病人及社会带来沉重负担。与再生能力低下的中枢神经系统损伤相比,长度小于0.5cm的周围神经缺损可采用神经吻合术进行处理,预后往往较好。当神经缺损大于4cm时则首先采用自体神经移植进行修复,但以自体神经为供体不仅来源受限、匹配困难,也存在很多后遗症,且修复效果也并非尽如人意。同种异体神经虽已开展临床应用研究,但修复效果远不如自体神经,亦存在免疫排斥问题。近年来快速发展的组织工程神经技术为神经缺损修复带来了新希望,其优点在于:一是可以作为自体神经和同种异体神经的替代物,二是可以修复更长的神经缺损,三是可以根据神经缺损长度和直径“量身定做”。虽已有少量组织工程神经用于临床,但存在神经再生缓慢、神经结构和功能恢复欠佳等问题。从以往组织工程神经及其修复周围神经缺损的研究来看,目前学者正从以下几个方面对组织工程神经技术进行改进:一是支架材料的合成、筛选与神经导管制作,目前认为PLGA是较为理想的支架材料;二是选择更适宜的种子细胞,以往曾用种子细胞有ESCs、NSCs、BMSCs、ADSCs、DPSCs、SCs、OECs等多种,表皮神经嵴干细胞（Epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs）易于获取、自我更新能力强、且具有多向分化、分泌神经营养因子、致瘤风险低等优点,显示了较好的应用前景;三是选择更优秀的细胞外基质,以强化移植修复过程中对神经再生的诱导和促进作用。同时,人们还发现,炎性免疫反应对于神经缺损的修复有十分重要的影响,这也成为近年研究的一个热点,对其进行探讨将有助于从机制上突破现有神经缺损修复的困境。炎性免疫反应在组织创伤修复过程中具有重要作用,深刻影响着神经再生的病理生理过程。炎性免疫反应是由免疫活性细胞和炎性细胞因子构成的复杂网络,近年来人们逐渐认识到巨噬细胞是这一网络中关键的免疫活性细胞,它在神经缺损修复过程中既能向M1型极化从而产生神经毒性,也能向M2型极化而利于神经损伤修复。目前认识到炎性细胞因子主要有两类,一类是促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等,可加剧炎性反应;另一类是抗炎因子,如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1等,则可以抑制炎性反应。本研究在课题组既往建立的人工神经制备方法基础上,提出以EPI-NCSCs这样一种从自体毛囊获得的神经干细胞,结合PLGA支架及ECM细胞基质构建出新型组织工程神经,观察其桥接移植的修复效果,并着重从其对炎症反应调控的角度,研究其作用机制。首先将新型组织工程神经桥接于大鼠坐骨神经（Sciatic nerve,SN）缺损处（缺损总长度为15mm,该长度相当于人体神经缺损12.8-14.2cm）。再于桥接后9周内分别采用不同指标,观察新型组织工程神经在移植修复过程中对巨噬细胞的极化状态、炎性因子表达变化的调控及其对于缺损坐骨神经结构和功能的修复作用。拟解决的关键科学问题是:新型组织工程神经对局部神经组织内的巨噬细胞极化是否具有调节作用?新型组织工程神经能否调控局部炎性细胞因子的表达?调控后的炎性免疫微环境是否更有利于周围神经缺损的移植修复?材料与方法1.EPI-NCSCs培养与组织工程神经制作及坐骨神经桥接（1）细胞培养:EPI-NCSCs取自GFP转基因大鼠毛囊中,用DMEM/F12/FBS/bFGF培养液原代培养,PBS液洗涤覆有细胞的载玻片后,用Nestin/SOX10一抗工作液4℃孵育过夜,PBS漂洗后用Cy5-IgG/Alexa-Flour-594-IgG二抗工作液37℃避光孵育,然后计算SOX10+/Nestin+细胞数量。（2）PLGA支架:将PLA/PGA按85/15的比例混匀后溶于三氯甲烷制备5%溶液,玻璃培养皿中蒸发形成厚约25um的PLGA膜,然后卷膜制成PLGA导管,γ射线照射灭菌,用前以DMEM/F12浸润。（3）常规麻醉SD大鼠,暴露右侧坐骨神经,切除10mm坐骨神经,残端回缩形成长约15mm缺损。然后用PLGA导管套接于神经断端,注入25μL EPI-NCSCs/ECM,8-0缝线缝合断端,逐层缝合肌肉皮肤。2.调控巨噬细胞极化（1）免疫荧光鉴定:同上麻醉SD大鼠,暴露并取出长约20 mm坐骨神经,切为20μm冰冻切片,入TritonX-100 15分钟,山羊血清封闭1小时,用CD68/iNOS一抗（M1型巨噬细胞）和CD206/Arginase-1一抗（M2巨噬细胞）4℃孵育过夜,TRITC-IgG/FITC-IgG二抗避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,避光孵育30分钟。（2）成纤维细胞和SCs免疫荧光鉴定:SD大鼠麻醉后取出坐骨神经,制成20μm冰冻切片,用Vimentin一抗（成纤维细胞）和S-100一抗（SCs）孵育,二抗工作液为TRITC-IgG/FITC-IgG（1:200）,细胞核用Hoechst33342染色。3.炎性细胞因子调节（1）Western-blot测定:将所取坐骨神经匀浆后提取总蛋白,然后定量蛋白浓度,再进行SDS-PAGE电泳、转膜,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α/actin一抗孵育,再用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育,PVDF膜曝光后用Image J图像分析软件测算条带灰度值,actin内参作对照。（2）免疫组化染色:SD大鼠麻醉、取出坐骨神经后制作4μm石蜡切片,脱蜡水化后经3%过氧化氢室温10分钟,山羊血清封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,再用山羊抗兔/鼠IgG二抗孵育,链霉亲和素-过氧化物酶30分钟,DAB显色,光镜观察分析。（3）免疫荧光染色:SD大鼠麻醉、灌注固定、取出坐骨神经后后制作20μm冰冻切片,入0.3%TritonX-100室温15分钟,山羊血清室温封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,二抗TRITC-IgG/FITC-IgG避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,荧光显微镜下拍照与分析。4.缺损坐骨神经修复（1）组织学观察:术后9周时麻醉、固定大鼠、取出坐骨神经行石蜡包埋,切4μm切片,HE染色,光学显微镜观察分析。（2）运动终板检测:术后9周取腓肠肌制作30μm冰冻切片,AChE染色,光学显微镜观察,Image ProPlus图像软件分析。（3）感觉功能评估:术后9周时将大鼠两侧后足浸入50℃热水中,记录两侧后足的回缩反射时间,痛温觉用LFRT表示。（4）运动功能评估:术后9周时记录大鼠后足足印迹,分别测量TS、ITS、PL,然后根据公式计算SFI。（5）神经电生理检测:术后9周时麻醉大鼠,暴露实验侧和正常侧坐骨神经,双钩状电极（极间距2 mm）刺激,双极针形电极记录,刺激间期0.25 ms,刺激强度10mA,刺激频率1Hz,每只大鼠重复记录5次,结果用PowerLab软件分析。（6）腓肠肌湿重恢复检测:术后9周时,麻醉大鼠后切取实验侧和正常侧腓肠肌,吸去血迹后立即用电子天平称重,结果以实验侧腓肠肌重量/正常侧腓肠肌重量×100%表示。5.统计学分析以SPSS（版本22.0）数据统计软件进行统计分析,以均数±标准差表示,以独立样本t检验进行组间比较,P<0.05表示存在显着性差异,P<0.01表示存在极显着性差异。结果1.从GFP大鼠毛囊中获得EPI-NCSCs,经SOX10和Nestin双标鉴定,其纯度高达99.23±2.1%,移植到缺损10mm坐骨神经后,至少在宿主组织内存活9周。所制作的PLGA导管管壁表面为网状结构,间有很多直径约6μm左右的微孔,从而为EPI-NCSCs粘附生长提供了结构基础,也为种子细胞获得环境营养提供了结构保障。2.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1周,可明显提高M2巨噬细胞的比例,降低M1巨噬细胞的数量。桥接后3周时,有利于神经再生的SCs数量和活性被显着提高,而阻碍神经再生的成纤维细胞数量和活性则被明显降低。在所用组织工程神经各成分中,种子细胞EPI-NCSCs在这些有益效应中发挥了关键作用。3.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1、3、7、14、21天,Western-blot、免疫荧光和免疫组化实验证实,宿主组织抗炎因子IL-4和IL-13的表达呈逐渐增强的趋势,而促炎因子IL-6和TNF-α则呈逐渐下降的趋势。抗炎因子水平的提高和促炎因子水平的下降,为坐骨神经损伤后的神经纤维再生提供了更适宜的炎性免疫微环境。4.术后9周时,形态组织学观察证实组织工程神经桥接恢复了缺损坐骨神经的连续性,且神经直径更粗,组织结构更致密,神经纤维成分更多,运动终板数量更多体积也更大。LFRT测定表明感觉功恢复更好。SFI评估显示明显提高了运动功能的恢复水平。与此同时,肌肉湿重恢复率明显优于对照组动物。神经电生理检查证实电位的潜伏期缩短,电位幅度提高,说明神经传导速度更快,对刺激反应更强。结论本研究制备的组织工程神经中的种子细胞EPI-NCSCs至少可在宿主组织内存活9周。组织工程神经在移植过程中一方面促使宿主组织内巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子（IL-4,IL-13）表达,增加有利于神经纤维再生的SCs数量;另一方面降低M1巨噬细胞的数量,抑制促炎因子（IL-6,TNF-α）的表达,降低抑制神经纤维再生的成纤维细胞数量。组织工程神经调控的局部炎性免疫微环境提高了长节段缺损坐骨神经结构与功能的恢复水平。
张胜男[9]（2019）在《视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达及RGCs的原代培养和鉴定》文中研究说明目的:通过建立大鼠视神经损伤模型,研究视神经损伤后轴突中Jarid1b及H3K4me3的表达变化,以了解Jarid1b是否在视神经损伤中发挥一定的作用;建立视网膜神经节细胞（RGCs）的原代培养模型,观察光镜下的细胞形态,并对其纯度进行免疫细胞化学方法鉴定,为RGCs的生理功能或生物学特性研究提供一定的基础。方法:1.选取清洁级成年SD大鼠15只,雌雄不限,每只大鼠均以左眼作为损伤眼,使用显微血管夹在眼球后方约2mm处垂直视神经钳夹约15s,以损伤视神经;以右眼作为对照眼,暴露视神经15s,不进行损伤。损伤或暴露视神经后对大鼠双眼进行眼部检查和FVEP检测,并与损伤前的FVEP结果进行对照,以确保视神经损伤模型成功。在视神经损伤后第3 d、7 d、14 d,分别随机处死每组中的5只大鼠,取左眼和右眼视神经组织制作病理切片分别作为急性损伤组和正常对照组。对切片进行免疫组化染色后,计算两组Jarid1b和H3K4me3的阳性表达率,进行统计学分析。2.选取出生7d以内的SD大鼠,麻醉后摘除眼球,分离出视网膜组织,用木瓜蛋白酶进行充分消化,制成RGCs悬液,以兔抗大鼠巨噬细胞多克隆抗体、山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗鼠IgG（H+L）、Thy-1抗体等对RGCs进行筛选和纯化,在多聚-D-赖氨酸和鼠层粘连蛋白预处理过的24孔细胞培养板中进行培养,并采用抗鼠Thy-1单克隆抗体对培养3d的RGCs进行免疫细胞化学方法鉴定。3.本文采用SPSS22.0进行统计学分析,相同天数不同组内比较采用独立样本t检验,相同组内不同天数比较采用方差分析,急性损伤组内不同天数两两比较采用LSD-t检验,检验水准为0.05,P<0.05说明差异有统计学意义。结果:1.正常对照组视神经轴突中Jarid1b表达中等,不同时间点的表达基本无明显改变。急性损伤组内各时间点Jarid1b的表达均明显低于正常对照组,第3d下降且达到高峰,之后逐渐上升,第7d、14d时Jarid1b表达仍低于正常对照组水平。2.正常对照组视神经轴突中H3K4me3表达较高,不同时间点的表达基本无明显改变。急性损伤组内各时间点H3K4me3的表达均明显高于正常对照组,在第3d升高,在第7d达到高峰,之后逐渐下降,第14d时H3K4me3表达仍高于正常对照组水平。3.光学显微镜下观察RGCs,24h后细胞基本完全贴壁,48h后细胞体积增大,多数细胞可长出突起。第35d,细胞突起继续增多增长。第6d,部分细胞出现死亡。第7d,细胞数目明显减少,绝大多数细胞死亡。4.在荧光显微镜下,RGCs可被Thy-1抗体标记成红色,纯度可达87.26%。结论:1.视神经损伤后,轴突中Jarid1b表达下降,H3K4me3表达升高,提示:（1）在视神经损伤中,H3K4me3的表达变化与Jarid1b的表达变化相关;（2）Jarid1b的低表达状态可能是抑制RGCs轴突再生的机制之一;（3）Jarid1b有望成为新的靶点对视神经损伤后修复和再生机制进行深入研究。2.通过此方法培养出的RGCs生长良好,体外存活时间可达7d,纯度较高,可以用于进一步的研究。
于莎莎[10]（2017）在《延迟性经巩膜电刺激对大鼠视神经钳夹伤的神经保护机制研究》文中研究说明研究目的外伤性视神经病变（traumatic optic neuropathy,TON）是临床上较为常见的致盲性眼外伤。本研究选择可重复多次应用的经巩膜电刺激（trans-sclera electrical stimulation,TsES）方式,在大鼠视神经钳夹伤（optic nerve crush,ONC）中研究延迟性TsES治疗对视网膜的神经保护作用,对这种治疗方式可能的神经保护作用机制进行深入研究。方法首先建立大鼠ONC伤动物模型。在ONC前7天经视上丘荧光金（Fluoro-gold,FG）逆行性标记视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）;之后在大鼠球后视神经1.5mm处钳夹视神经5秒制作ONC模型,在ONC后1天、3天、7天和14天,记录大鼠视网膜电图（electroretinography,ERG）;对应时间点处死大鼠,取眼球做视网膜铺片,计数FG标记的存活RGC数量,计算RGC存活率,计数活化小胶质细胞数量;进一步通过免疫荧光组化方法,观察视网膜iba-1,GFAP的表达,同时检测8-羟基鸟嘌呤（8-hydroxyguanine,8-OHG）,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD-2）和醌氧化还原酶-1（quinone oxidoreductase 1,NQO-1）在视网膜中表达。Western检测,凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）,SOD-2 以及 NQO-1 表达的变化。第二,比较延迟性TsES在ONC模型中的作用。在大鼠ONC模型基础上,在ONC第3天,巩膜表面外置一对金电极给予电刺激治疗,电流强度分别为:0 μA（pad 对照组）、50 μA、100 μA 和 150 μA,电刺激频率为 20Hz,2.5ms/phase duration,单次治疗时间持续30分钟,电流为交流电。在ONC后第7天和第14天,记录大鼠ERG,处死大鼠做视网膜铺片,计数FG标记的存活RGC数量,比较不同组RGC存活数量以及存活率,比较各组活化小胶质细胞数量;第三,对延迟性TsES的视神经保护作用机制的探讨。在ONC第3天,给予电刺激治疗,电流强度为:100 μA,刺激频率为20Hz,2.5ms/phase duration,治疗时间持续30分钟,电流为交流电。在ONC后7天和14天处死大鼠。视网膜切片标本免疫荧光染色:检测iba-1和GFAP,SOD-2和NQO-1,促存活因子磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphor-serine/threonine protein kinase（p-AKT））,神经营养因子脑源性神经营养因子（brain derived neurothrophic factor,BDNF）,成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-2 FGF-2）在视网膜上表达的变化。进一步用Western检测TsES治疗对不同信号因子表达的影响,包括p-AKT,SOD-2 等。研究结果首先:大鼠ONC后1天、3天、7天和14天,FG标记RGC的存活率分别为:100%、98%、40%和15%。在ONC后3天开始小胶质细胞活化,在损伤后7天和14天小胶质细胞数量明显增多,2周可达464.01±75.45个/mm2。iba-1和GFAP表达均随着损伤时间而增强。免疫荧光染色结果表明ONC后1天和3天氧化损伤标志物8-OHG上调,抗氧化酶SOD-2下降。Western结果表明ONC后3天时凋亡诱导因子AIF相比正常组表达明显升高,ONC后1天NQO-1表达开始上调,3天时表达最高,之后开始下降。ERG结果为:视神经钳夹伤后7天和14天:PhNR幅值从视神经钳夹伤后1天就已经明显降低,伤后7天和14天,RGC细胞大量死亡,伴随着PhNR幅值明显降低,相比正常组差异有统计学意义。第二:荧光金标记RGC在ONC后7天时,模型组RGC存活率为34%,pad 对照组 36%,50 μA TsES 组 42%,100 μA TsES 组 50%,150 μATsES 组 39%。100 μA TsES组RGC存活率最高,与对照组比较差异有统计学意义。伤后2周时,模型组RGC存活率为13%,pad对照组组13%,50 μATsES组为14%,100μA TsES组为17%,150 μA TsES组为21%,其中150 μA TsES组与对照组相比差异有统计学意义,而150 μA TsES组与100 μA ONC组相比,差异较小,没有统计学意义。在ONC后7天时,TsES治疗组小胶质细胞活化数量相比对照组较低,差异有统计学意义。ERG结果表明延迟性TsES能够改善视神经损伤急性期视网膜的功能。其中以100 μA TsES组最为明显,1周时100 μA TsES组PhNR幅值高于对照组,差异有统计学意义,2周时100 μATsES组PhNR幅值高于其余各组,差异有统计学意义。第三:与对照组相比,延迟性ONC治疗组,在视神经损伤后1周:胶质细胞表达iba-1较对照组偏低。RGC层SOD-2和NQO-1的表达升高;视网膜RGC层、内丛状层和内核层p-AKT表达相比对照组增加;RGC层和内核层中BDNF表达相比对照组增加;视网膜RGC层、内丛状层和内核层,FGF-2表达相比对照组增加。此外,在ONC后2周,这种趋势降低。Western结果表明视神经损伤后1周视网膜p-AKT、SOD-2、bax和AIF的表达各组间差异较小,没有统计学意义。结论本研究通过SD大鼠球后视神经1.5mm处钳夹5秒建立大鼠ONC模型方法稳定可靠,适用于研究视神经损伤和神经保护机制。延迟性经巩膜外置金电极在大鼠ONC模型具有神经保护作用,其中电刺激的参数:电流强度100 μA,20Hz交流电,双相波,2.5ms/phase duration,电刺激30min,神经保护效果较好,可用于长期电刺激治疗的研究中。延迟性TsES神经保护作用主要的机制可能是上调Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化酶NQO1和SOD-2在视网膜的表达;上调PI3K/AKT信号通路中p-AKT的表达;上调视网膜神经营养因子BDNF和FGF-2的表达。
二、睫状神经营养因子在视神经损伤修复中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、睫状神经营养因子在视神经损伤修复中的作用（论文提纲范文）
（1）AQP5通过激活Akt信号通路促进角膜上皮损伤修复和神经再生（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器设备 |
| 1.2 实验耗材 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 免疫荧光染色 |
| 2.3 蛋白质印记法(western blot) |
| 2.4 角膜神经染色 |
| 2.5 角膜敏感度测量 |
| 2.6 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR) |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 3.1 AQP5敲除小鼠基因型鉴定 |
| 3.2 AQP5在小鼠角膜上皮中的表达与定位 |
| 3.3 AQP5敲除抑制小鼠角膜上皮损伤修复速度 |
| 3.4 AQP5敲除抑制小鼠角膜上皮细胞增殖和角膜神经再生 |
| 3.5 AQP5通过影响NGF调控角膜神经的再生 |
| 3.6 AQP5敲除抑制Akt信号通路的激活 |
| 3.7 在AQP5~(-/-)小鼠中,NGF促进角膜上皮损伤修复和神经再生 |
| 3.8 在AQP5~(-/-)小鼠中,NGF通过激活Akt信号通路促进角膜上皮损伤修复和神经再生 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 水通道蛋白在眼中的表达及其与眼部疾病关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠RGCs的原代培养和鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料及准备 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备、仪器 |
| 1.4 其余试剂、仪器 |
| 1.5 试剂准备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验准备 |
| 2.2 解剖视网膜组织及消化 |
| 2.3 组织研碎 |
| 2.4 细胞接种 |
| 2.5 细胞消化 |
| 2.6 铺板 |
| 2.7 纯度鉴定 |
| 结果 |
| 1 RGCs的形态学观察情况 |
| 2 鉴定结果 |
| 讨论 |
| 1 RGCs培养方法总结与改进 |
| 2 RGCs培养基、培养板处理及纯度鉴定 |
| 3 存在问题及解决方案 |
| 第二部分 Jarid1b在大鼠RGCs发育过程中的表达变化 |
| 材料与方法 |
| 1 标本采集与保存 |
| 2 主要试剂及耗材 |
| 3 主要设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 qRT-PCR检测大鼠发育过程中RGCs中的Jarid1b的表达变化 |
| 5 统计分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测大鼠RGCs发育中Jarid1b的mRNA表达情况 |
| 讨论 |
| 第三部分 视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物和饲养环境 |
| 2 实验试剂及药品 |
| 3 使用实验设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 qRT-PCR检测视神经损伤后大鼠RGCs中的Jarid1b的表达变化 |
| 4.2 免疫组化分析视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 5 统计分析 |
| 结果 |
| 1 RT-qPCR检测视神经损伤后RGCs中Jarid1b的表达变化 |
| 2 大鼠视神经轴突中Jarid1b的表达变化 |
| 3 大鼠视神经轴突中H3K4me3表达变化 |
| 讨论 |
| 1 视神经损伤动物模型方法总结 |
| 2 损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化 |
| 3 问题与总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经再生机制研究进展 |
| 引言 |
| 1 炎症刺激促进视神经再生 |
| 2 提供外源神经营养因子 |
| 3 抑制视神经再生的内在抑制因子 |
| 4 激活细胞内信号通路 |
| 5 改善视神经抑制性细胞外环境 |
| 6 视神经损伤后靶神经的再支配 |
| 结论 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）microRNA-200a对慢性高眼压小鼠视网膜的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 青光眼概述 |
| 1.2 青光眼发病机制的研究现状 |
| 1.2.1 RGC在青光眼发病机制中的研究现状 |
| 1.2.2 Müller细胞在青光眼发病机制中的研究现状 |
| 1.2.3 小胶质细胞在青光眼发病机制中的研究现状 |
| 1.3 FGF7概述及研究现状 |
| 1.4 microRNA概述 |
| 1.5 microRNA在神经退行性疾病发病机制中的研究现状 |
| 1.6 microRNA在青光眼发病机制中的研究现状 |
| 1.7 microRNA-200a在神经退行性疾病发病机制中的研究现状 |
| 第2章 microRNA-200a对慢性高眼压小鼠视网膜的作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 青光眼基因表达芯片的获取及其与正常组的差异分析 |
| 2.2.2 青光眼已知基因的检索及基因间的相互作用分析 |
| 2.2.3 预测调控FGF7的miRNAs |
| 2.2.4 慢性高眼压小鼠模型的建立 |
| 2.2.5 视网膜组织提取 |
| 2.2.6 逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR) |
| 2.2.7 质粒小提 |
| 2.2.8 ARPE-19细胞的培养 |
| 2.2.9 细胞转染 |
| 2.2.10 双荧光素酶基因检测 |
| 2.2.11 动物转染分组 |
| 2.2.12 石蜡切片制备 |
| 2.2.13 苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色 |
| 2.2.14 免疫组织化学 |
| 2.2.15 TUNEL(TdT-mediated d UTP-biotin nick end-labeling)检测 |
| 2.2.16 Müller细胞的培养 |
| 2.2.17 MTT法检测 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 FGF7参与青光眼的发生发展 |
| 2.3.2 miR-200a在慢性高眼压小鼠视网膜的表达 |
| 2.3.3 FGF7是miR-200a的靶基因 |
| 2.3.4 上调的miR-200a或下调的FGF7可减轻视网膜的结构和形态改变 |
| 2.3.5 上调的miR-200a或下调的FGF7 抑制了CD11b和 iNOS的表达 |
| 2.3.6 上调的miR-200a或下调的FGF7 能抑制RGCs的凋亡 |
| 2.3.7 上调的miR-200a或下调的FGF7 促进Müller细胞的存活 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 microRNA-200a对慢性高眼压小鼠视网膜的保护作用机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 慢性高眼压小鼠模型的建立 |
| 3.2.2 动物转染分组 |
| 3.2.3 视网膜组织提取 |
| 3.2.4 逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR) |
| 3.2.5 Western Blot及显色 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠视网膜神经节细胞的原代培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料与准备 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 OX-7杂交瘤细胞培育情况 |
| 2 RGCs形态及生长情况观察 |
| 3 免疫荧光鉴定结果 |
| 讨论 |
| 1 RGCs原代培养方法的选择与改进 |
| 2 原代培养鉴定方法及时机的选择 |
| 3 原代培养过程中经验与问题 |
| 第二部分 JARID1B在大鼠视网膜神经节细胞发育中的表达 |
| 材料与方法 |
| 1 标本采集与保存 |
| 2 主要试剂及耗材 |
| 3 主要设备及仪器 |
| 4 实验方法 |
| 结果 |
| 1 WB检测H3K4me3 蛋白在大鼠视网膜发育中的表达变化 |
| 2 q RT-PCR检测大鼠RGCs发育过程中JARID1B及相关分子的m RNA表达情况 |
| 3 免疫荧光染色检测大鼠RGCs发育过程中JARID1B蛋白表达结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 JARID1B对体外RGCs存活影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 调控Pim-1表达修复受损神经元样细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)实验细胞系 |
| (二)主要实验试剂 |
| (三)主要溶液配制 |
| (四)主要设备 |
| (五)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)Neuro-2a细胞成功诱导成神经元样细胞(N-2a-N) |
| (二)成功建立ACR损伤N-2a-N细胞突起模型 |
| (三)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞突起的再生 |
| (四)CNTF和 Nrn1 增强受损细胞的活性并减少其凋亡 |
| (五)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞内Pim-1 的表达 |
| (六)CNTF和 Nrn1 上调Pim-1 相关信号转导分子的表达 |
| (七)CNTF和 Nrn1 调控N-2a-N细胞突起再生的分子基础 |
| (八)成功构建Pim-1 重组慢病毒载体(LV-Pim-1) |
| (九)Pim-1重组慢病毒载体包装 |
| (十)抗性筛选LV-Pim-1 感染的Neuro-2a细胞 |
| (十一)抗性筛选后Neuro-2a细胞中Pim-1 的表达 |
| (十二)Pim-1 过表达具有修复受损N-2a-N细胞的作用 |
| (十三)沉默Pim-1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| 四、讨论 |
| (一)体外神经元突起损伤模型制备 |
| (二)CNTF、Nrn1 上调Pim-1 表达促进受损神经元样细胞突起再生 |
| (三)Pim-1促进受损神经元样细胞突起再生 |
| 第二部分 Lnc-Pim1 修复受损神经元样细胞的作用及机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)主要实验试剂 |
| (二)主要实验设备 |
| (三)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)N-2a-N细胞Lnc-Pim1 序列全长 |
| (二)预测Lnc-Pim1 的编码能力 |
| (三)Lnc-Pim1 在细胞中的表达定位 |
| (四)Lnc-Pim1 在受损N-2a-N细胞表达的时相变化 |
| (五)成功构建Lnc-Pim1 重组慢病毒载体质粒 |
| (六)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体包装 |
| (七)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体感染及抗性筛选 |
| (八)Neuro-2a细胞Lnc-Pim1 过表达促进突起生长并激活Erk1/2 通路 |
| (九)Lnc-Pim1 过表达促进受损N-2a-N细胞突起再生 |
| (十)敲低Lnc-Pim1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| (十一)Lnc-Pim1 过表达促进Pim-1 表达上调 |
| (十二)N-2a-N细胞内Lnc-Pim1 的互作蛋白 |
| (十三)调控Lnc-Pim1 表达所导致的差异性基因表达 |
| 四、讨论 |
| (一)Lnc-Pim1 及其在神经元样细胞的表达和损伤后的变化 |
| (二)神经元样细胞Lnc-Pim1与Pim-1 的相互关系 |
| (三)Lnc-Pim1 过表达促进神经元样细胞突起再生及相关机制 |
| 全文小结 |
| 创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述(已发表) LncRNA在视网膜发育和病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 荣誉与奖励 |
| 致谢 |
（6）PirB在视神经损伤修复与再生中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 视神经钳夹伤后视网膜中的PirB表达变化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 干扰RGC的 Pir B表达对轴突再生的作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Pir B在 Müller细胞调节RGC轴突生长中的作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 干扰SD大鼠视网膜Pir B表达对视神经钳夹伤后再生的作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 PirB蛋白在中枢神经损伤修复中作用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 配对免疫球蛋白样受体B在视神经损伤与修复中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经损伤后修复与再生研究论述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 新型组织工程神经制作与大鼠坐骨神经长段缺损损伤模型的建立 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 组织工程神经对坐骨神经缺损损伤后巨噬细胞极化及炎性细胞的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 组织工程神经修复坐骨神经缺损过程中对炎性细胞因子的调节作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 组织工程神经对坐骨神经长段缺损的结构和功能修复作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞极化在神经系统损伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（9）视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达及RGCs的原代培养和鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要设备及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立视神经损伤模型 |
| 2.2 视神经组织病理切片 |
| 2.3 免疫组化步骤 |
| 3 染色结果分析 |
| 4 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 大鼠视神经轴突中Jarid1b的表达 |
| 2 大鼠视神经轴突中H3K4me3的表达 |
| 讨论 |
| 第二部分 大鼠视网膜神经节细胞的原代培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及饲养环境 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备及仪器 |
| 1.4 其他试剂及仪器 |
| 1.5 主要试剂配制及储存 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 准备 |
| 2.2 视网膜组织取材 |
| 2.3 视网膜组织消化 |
| 2.4 视网膜组织研碎 |
| 2.5 筛选细胞 |
| 2.6 胰蛋白酶消化 |
| 2.7 细胞铺板 |
| 2.8 细胞鉴定 |
| 结果 |
| 1 形态学观察 |
| 2 免疫荧光鉴定结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经损伤后修复和再生机制研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（10）延迟性经巩膜电刺激对大鼠视神经钳夹伤的神经保护机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、大鼠视神经钳夹伤模型的建立和验证 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验所需主要试剂和溶液的配制 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.1.6 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 视网膜铺片: 视网膜神经节细胞/小胶质细胞 |
| 1.2.2 视网膜切片组织病理学变化 |
| 1.2.3 视网膜Iba-1表达 |
| 1.2.4 视网膜GFAP表达 |
| 1.2.5 视网膜氧化损伤标志物8-OHG表达 |
| 1.2.6 视网膜超氧化物歧化酶SOD-2表达 |
| 1.2.7 视网膜醌氧化还原酶-1 NQO-1表达 |
| 1.2.8 视网膜凋亡诱导因子AIF表达 |
| 1.2.9 大鼠视网膜电图 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 大鼠视神经钳夹伤动物模型的选择 |
| 1.3.2 大鼠视神经钳夹伤模型中视网膜神经节细胞标记和计数方法 |
| 1.3.3 视网膜胶质细胞在大鼠视神经钳夹伤模型的作用 |
| 1.3.4 视网膜AIF和NQO-1在大鼠视神经钳夹伤模型的作用 |
| 1.3.5 全视野闪光视网膜电图在大鼠视神经钳夹伤模型中的应用 |
| 1.4 小结 |
| 二、延迟性经巩膜电刺激对大鼠视神经钳夹引起视网膜损伤的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验所需主要试剂以及溶液的配置方法 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 经巩膜电刺激装置的调试和参数设定 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.1.7 统计学分析方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 视网膜铺片:视网膜神经节细胞/小胶质细胞 |
| 2.2.2 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜神经节细胞数量 |
| 2.2.3 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜神经节细胞存活率 |
| 2.2.4 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜活化小胶质细胞数量 |
| 2.2.5 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜组织病理学变化 |
| 2.2.6 延迟性经巩膜电刺激治疗对于视网膜功能的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 电刺激方式的选择 |
| 2.3.2 电刺激对视网膜神经节细胞的影响 |
| 2.3.3 电刺激对视神经损伤急性期视网膜功能的影响 |
| 2.3.4 电刺激对视网膜小胶质细胞和Muller细胞活性的影响 |
| 2.4 小结 |
| 三、延迟性经巩膜电刺激对大鼠视神经钳夹伤神经保护作用机制的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.1.3 实验所需主要试剂以及溶液的配置方法 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 经巩膜电刺激装置的调试和参数设置 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.1.7 统计学分析方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜Iba-1表达 |
| 3.2.2 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜GFAP表达 |
| 3.2.3 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜SOD-2表达 |
| 3.2.4 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜NQO-1表达 |
| 3.2.5 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜p-AKT表达 |
| 3.2.6 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜BDNF表达 |
| 3.2.7 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜FGF-2表达 |
| 3.2.8 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜AIF表达 |
| 3.2.9 延迟性经巩膜电刺激治疗后视网膜BAX变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 延迟性经巩膜电刺激能够激活视网膜神经节细胞 |
| 3.3.2 延迟性经巩膜电刺激促进视网膜神经营养因子的表达 |
| 3.3.3 延迟性经巩膜电刺激上调Nrf2-ARE通路下游抗氧化酶的表达 |
| 3.3.4 电刺激的增加脉络膜视网膜血流量 |
| 3.3.5 电刺激对于视皮层电活动以及神经元可塑性的影响 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述一 神经保护及再生治疗方法的研究进展 |
| 综述二 刺激在神经损伤以及视网膜退行性病变中的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、睫状神经营养因子在视神经损伤修复中的作用（论文参考文献）
- [1]AQP5通过激活Akt信号通路促进角膜上皮损伤修复和神经再生[D]. 刘雅宁. 青岛大学, 2021(02)
- [2]大鼠RGCs发育过程中Jarid1b表达变化及视神经损伤后Jarid1b和H3K4me3的表达变化[D]. 陈亭. 青岛大学, 2021(02)
- [3]microRNA-200a对慢性高眼压小鼠视网膜的保护作用及其机制研究[D]. 惠鹏. 吉林大学, 2020(03)
- [4]JARID1B在大鼠RGCs发育过程中的表达及对体外RGCs存活影响的研究[D]. 张婵媛. 青岛大学, 2020(01)
- [5]靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制[D]. 李贺. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]PirB在视神经损伤修复与再生中的作用机制研究[D]. 袁容娣. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [7]Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究[D]. 韩卫. 郑州大学, 2020(02)
- [8]新型组织工程神经调节的炎性微环境对大鼠SN长段缺损的修复作用[D]. 李越. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
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