一、癌旁非典型增生组织端粒酶活性的间接定量检测（论文文献综述）
叶善平[1]（2021）在《miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究》文中提出背景:肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一,其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四,其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性,大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区,而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好,但多数患者在首诊时已处于进展期,而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展,但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此,研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程,进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的,短而高度保守,长度约为18-25个核苷酸的小RNA,呈单链状,不能编码蛋白质,在有核生物中表达较广。miRNA在体内主要起调控作用,通过与m RNA的3’端非编码序列发生碱基配对而起抑制作用,从而实现在转录后阶段调控基因表达。自从第一个miRNA被报道以后,陆续发现并研究了许多miRNA,但对于理解肿瘤发生发展的机制仍是冰山一角。许多研究表明miRNAs与HCC的起病、侵袭、转移及预后关系紧密。其中部分miRNAs在HCC中高表达,起着癌基因的作用,部分miRNAs在HCC中低表达,起着抑癌基因的作用。miR-557是近年来新发现的miRNA,它在胰腺癌、三阴乳腺癌、肺癌中均呈低表达,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤侵袭、转移等多种生物学过程的调控。而miR-557在肝癌中的生物学功能尚不清楚。我们首先通过生物学信息学发现miR-557在肝癌中低表达。因此,我们推测miR-557在肝癌的起病和进展中存在重要影响,其在肝癌中的功能和分子机制有待深入探索。据此,本课题首先检测了miR-557在肝癌组织及不同肝癌细胞中的表达水平,分析其与HCC患者临床病理参数及生存的关系;然后运用体内体外实验研究了miR-557对肝癌细胞株生物学行为的影响;再通过生物信息学预测并在实验中验证了miR-557通过靶向抑制RAB10的表达而影响肝癌细胞增殖、体内成瘤、迁移、侵袭、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、克隆形成的能力和影响细胞周期的分布;Wnt/β-catenin信号通路是HCC起病发展中极为重要的一条途径,研究表明许多miRNA影响HCC进展是通过Wnt/β-catenin信号途径实现的,最后我们初步探讨了miR-557能否调控Wnt/β-catenin信号途径。本研究具体包括以下三部分:第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系;第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响;第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究。第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系目的:探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。结果:1、生物信息学分析GSE108724数据集发现,与癌旁非肿瘤组织相比,miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现,与原位HCC相比,肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显着低于配对的癌旁非瘤组织。3、34例HCC组织标本中,miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者,在>5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者,在TNM III/IV的HCC患者中的表达水平低于I/II期HCC的患者,在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。4、相比正常肝细胞L02,miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、Hep G2、SMMC-7721中表达均下调,其中MHCC-97H细胞表达最低,Huh7细胞表达最高。结论:miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达,且与患者恶性生物学特征及不良的预后显着相关。第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响目的:探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。方法:1、在体外运用miR-557 mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞,运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lvsponge-NC转染Huh7细胞,并用RT-qPCR验证转染效率。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。结果:1、运用miR-557 mimics或Lv-miR-557可以显着升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平,运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显着降低Huh7细胞中miR-557的表达水平,细胞可用于下一步实验。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、与NC组相比,上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。4、细胞周期实验表明,上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。5、体内实验表明,上调miR-557表达后会抑制MHCC-97H细胞在裸鼠皮下成瘤的能力;下调miR-557后使得Huh7细胞的裸鼠皮下成瘤能力进一步加强。结论:上调miR-557的表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转化、体内生长及诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制miR-557的表达则呈相反趋势。第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究目的:探讨miR-557在肝癌中的潜在作用机制及下游信号通路。方法:1、通过在线生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测了miR-557的靶基因。2、双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与RAB10的靶向调控关系。3、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用RT-qPCR和WB实验检测RAB10在m RNA和蛋白表达水平的变化。4、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测肝癌组织及癌旁组织中RAB10蛋白的表达水平,RT-qPCR检测34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10 m RNA的表达水平,并分析与miR-557的相关性。5、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,分析促进/干扰RAB10的表达能否逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。7、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。结果:1、通过生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测miR-557的靶基因为RAB10。2、双荧光素酶基因报告实验验证了miR-557能够靶向抑制RAB10的表达3、RT-qPCR检测miR-557表达上调的MHCC-97H细胞和miR-557表达下调的Huh7细胞中潜在靶基因的变化,其中RAB10变化显着,WB实验验证了RAB10的变化。4、IHC检测了34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10的表达水平,结果提示癌组织中RAB10的表达水平高于癌旁非瘤组织;RT-qPCR得出同样的结果,并与miR-557呈负相关。5、促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、上调miR-557的表达可减少GSK-3β磷酸化、增加β-catenin磷酸化和减少Non-p-β-catenin入核,从而抑制Wnt/β-catenin信号;下调miR-557的表达则出现相反的结果;促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557mimics/inhibitors对HCC中Wnt/β-catenin信号的影响。结论:miR-557通过靶向抑制RAB10的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路的活性进而影响肝癌细胞的生物学行为。
任珍珍[2]（2020）在《ATAD2在食管鳞状细胞癌中的表达及其在食管癌发生发展中的作用的研究》文中进行了进一步梳理食道癌是全世界最恶性肿瘤之一,是世界上第六大癌症相关死亡原因,在中国居第三位。食管癌主要包括食管腺癌和食管鳞癌两种主要亚型。我国是食管癌的高发国家,其主要病理类型为食管鳞癌,约占所有食管癌的90%。随着近年来医学的迅速发展,针对食管癌的手术治疗、化疗、放疗等技术取得了一定进展,但由于食管癌病程进展快、转移范围广,其5年生存率仍处于较低水平。三磷酸腺苷酶家族蛋白2（ATPasefamily AAA domaincontaining 2,ATAD2）,也被称为AAA+核协同调节癌相关蛋白（AAA+nuclear co-regulatory cancer-related protein,ANCCA）或PRO2000,是AAA+蛋白家族的成员之一。ATAD2蛋白包含一个溴域和一个ATP酶域。ATAD2的编码基因位于染色体8q24.13,这是一个在癌症中经常被放大的区域。与此一致的是,ATAD2被发现在多种癌症类型中显着过表达,如乳腺癌、肺癌、前列腺癌和肝癌等。相关研究表明,ATAD2作为辅助调节因子,参与包括C-MYC、RB-E2F、EZH2等多个基因介导的转录调控,从而调节多种细胞活动,在肿瘤发生中发挥重要作用。目的探究ATAD2在食管鳞状上皮细胞癌组织中的表达情况,通过结合患者临床病理资料,统计分析ATAD2表达水平与临床病理学特征之间的关联。初步探究ATAD2对ESCC细胞生物学功能的影响,为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供新的思路,也为进一步探究ATAD2在食管鳞癌中的作用机制提供实验基础。方法1.免疫组织化学方法检测食管鳞癌患者组织中ATAD2的定位及表达情况通过免疫组织化学方法检测120例食管标本中ATAD2蛋白的表达水平,其中包括60例食管鳞癌组织、30例食管癌旁组织和30例食管不典型增生组织。2.分析ESCC组织中ATAD2的表达情况与患者病理特征的关联结合患者的临床病理资料,统计标本中ATAD2表达水平与患者的临床病理学特征的关联性,为探究ATAD2的表达与食管鳞癌的发生发展的关系提供基础。3.初步探究ATAD2的表达对ESCC细胞生物学功能的影响（1）利用针对ATAD2基因构建的小干扰RNA（siRNA）抑制ESCC细胞系中ATAD2的表达,为防止脱靶效应的出现,构建两个siRNA并转染ESCC细胞,其转染效果通过Western Blot判定。（2）CCK-8检测细胞增殖能力统计分析敲低ATAD2基因表达后ESCC细胞系的增殖能力的变化,评估敲低ATAD2对食管癌细胞增殖能力的影响。（3）Transwell实验检测ESCC细胞迁移和侵袭能力统计分析ATAD2基因表达受到抑制后ESCC细胞迁移和侵袭能力的变化,评估敲低ATAD2对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响。（4）凋亡实验及流式细胞术siRNA转染ESCC细胞系后,通过流式细胞术检测转染前后凋亡细胞数量变化,评估抑制ATAD2表达对食管鳞癌细胞凋亡能力的影响。结果1.ATAD2在ESCC患者组织中的表达水平显着高于癌旁组织和非典型增生食管组织（P<0.05）,且ATAD2在癌旁组织、非典型增生食管组织和食管鳞癌组织中的表达率呈逐渐递增的趋势（P<0.05）,ATAD2的高表达与ESCC的分化程度和远处淋巴结转移状态相关（P<0.05）。2.在ESCC细胞系EC109和KYSE30细胞中敲减ATAD2的表达后,显着抑制了 ESCC细胞的增殖能力（P<0.05）,同时其迁移和侵袭能力也显着下降（P<0.05）,此外,ATAD2表达受到抑制后,促进了 ESCC细胞的凋亡（P<0.05）。结论1.ATAD2在食管鳞癌组织中表达升高,并与食管鳞癌的分化程度和淋巴结转移具有明显相关性。2.抑制ATAD2蛋白的表达后,ESCC细胞的增殖能力下降,迁移和侵袭能力减弱,并促进ESCC细胞的凋亡,为食管鳞癌的治疗提供新的思路。
刘文静[3]（2020）在《Hsacirc1483在胃癌组织中的表达及其靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究》文中提出研究背景:环状RNAs（circular RNAs,circRNAs）是通过反向剪接形成的单链共价封闭的环状RNA分子,其没有5’端帽子和3’端多聚A尾结构,表达稳定,不受RNA核酸外切酶和RNaseR降解;含量丰富,是相应的线性mRNAs的10倍以上;具有组织和发育阶段的特异性。现已证实在多种肿瘤组织及细胞中存在特异性circRNAs表达,与肿瘤患者TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯等临床病理参数及预后密切相关,可作为相关肿瘤预警标记物及分子治疗靶点。CircRNAs是重要的调控因子,可以通过多种机制,例如与靶蛋白直接结合,影响靶基因与启动子的结合能力,调控靶蛋白亚细胞定位,内源竞争RNA（ceRNA）等多种机制调控靶基因表达,参与多种肿瘤细胞生物学行为的调控。目前胃癌组织中特异性表达circRNAs尚不明确,其对胃癌细胞生物学行为的影响尚不清楚。Hsacirc1483位于人类5号染色体,具有核糖体结合位点,在正常脑组织、恶性胶质瘤细胞中均存在表达,其与胃癌发病风险及生物学行为的关系如何,目前尚无报道。功能预测表明hsacirc1483表达可能与DHX29基因有关,可与RNA结合蛋白EIF4A3结合。研究表明DHX29是一种RNAJ解旋酶,其基因敲出后可减低蛋白翻译和细胞增殖受抑。EIF4A3基因编码DEAD-box蛋白家族是调控胚胎发育、精子生成及细胞生长分裂中关键因子。因此hsacirc1483表达可能参与细胞分化、增殖。Hsacirc1483究竟能否调控胃癌细胞的增殖分化,目前尚不清楚。Let-7c是let-7家族成员之一。研究表明let-7c是调控细胞分化、增殖的作用因子。例如,let-7低表达可诱导CD8 T细胞向细胞毒性T淋巴细胞转化,介导TCR信号通路,促进细胞增殖,激发机体抗肿瘤免疫应答。在急性粒细胞白血病中,let-7c通过抑制靶基因PBX2,促进白血病细胞由粒系向单核系转化,诱导细胞的成熟表型转化。Let-7b通过下调靶基因基质金属蛋白酶1（MMP1）表达,抑制牙尖干细胞的成骨分化能力,降低成骨标志物转录水平的表达。近年发现let-7c表达受到其他非编码RNA调控。本课题组前期通过生物信息学预测分析表明hsacirc1483可对let-7c进行上游调控,该预测结果有待进一步证实。胃蛋白酶原C（Pepsinogen C,PGC）基因是胃黏膜终末分化基因。本室前期研究聚焦于PGC 3’-UTR区的调控机制,经荧光素酶实验验证,筛选出5种miRNAs以PGC为靶标,进一步血清学验证发现血清let-7c与血清PGC的蛋白表达显着负相关,表明PGC基因可能是let-7c的下游靶基因,提示let-7c可能参与胃黏膜细胞的分化调控,该研究结果有待进一步证实。研究目的:1、探讨hsacirc1483在胃癌组织及癌旁组织的差异表达及其与临床病理参数以及PGC基因表达的相关性,明确hsacirc1483对胃癌的诊断价值。2、探讨hsacirc1483对胃癌细胞生物学行为的影响。3、探讨hsacirc1483能否通过与let-7c靶向结合,参与调控胃癌细胞分化的机制。研究方法:第一部分:Hsacirc1483在胃癌与癌旁组织的差异表达及其与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性1、收集中国医科大学附属一院2013年11月至2017年9月收治的胃癌手术患者癌组织及癌旁正常组织标本57对。通过病历记录收集所有研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒等相关临床病理资料,包括TNM分期、淋巴结转移、生长方式、脉管侵犯、Lauren分型等。本研究得到中国医科大学附属一院伦理委员会批准。2、通过组织总RNA提取、cDNA第一链合成和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术,检测hsacirc1483与PGC mRNA的组织表达情况。以2-△ct表示hsacirc1483与PGC mRNA的相对表达量,△CT=CT目的基因-CT内参基因。3、采用Mann-Whitney U非参数检验分析hsacirc1483的组织表达在胃癌及癌旁组织两组间的差异性。利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析hsacirc1483组织表达区分胃癌的敏感度及特异度。采用Spearman’s correlation coefficient方法分析hsacirc1483与PGC表达的相关性。第二部分Hsacirc1483表达对胃癌细胞生物学行为的影响1、hsacirc1483过表达质粒构建:选取GV486为hsacirc1483的过表达质粒载体,并经酶切确定。化学合成hsacirc1483基因序列,用KpnI/BamHI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2、基线低表达和中等程度表达的hsacirc1483胃癌细胞系的筛选:通过细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,检测hsacirc1483在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,选取hsacirc1483相对低表达和中等程度表达的三株胃癌细胞系HGC27、BGC823、AGS进行后续实验。3、细胞转染效率检测:应用细胞培养技术、细胞瞬时转染技术,将构建的hsacirc1483过表达质粒瞬时转染至所选取的HGC27、BGC823、AGS细胞系中,转染24h后更换细胞培养基,并在荧光显微镜下观察绿色荧光,质粒的转染效率达50%以上进入下一轮实验。4、Hsacirc1483过表达细胞分化相关指标表达检测:胃癌细胞系在转染hsacirc1483过表达质粒或对照质粒24h后,收集细胞沉淀。利用细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,鉴定hsacirc1483在胃癌细胞中的过表达效率及检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平。同时,通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。5、Hsacirc1483过表达细胞增殖检测:胃癌细胞中hsacirc1483过表达质粒或对照质粒瞬时转染24h后,将细胞消化离心,铺96孔板,分别在铺板后的24h、48h、72h进行细胞增殖毒性检测（CCK-8）。6、统计分析:hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA的相对表达量以2-△△ct表示,△△CT=（CT目的基因-CT内参基因）实验组-（CT目的基因-CT内参基因）对照组。对照组中目的基因mRNA表达设为单位1。采用Graphpad Prism6进行统计分析和图形处理。以配对样本T检验比较两组的差异表达。所有数据均采用均数±标准差表示。第三部分Hsacirc1483靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究1、双荧光素酶实验:在3’UTR报告基因系统中,将hsacirc1483 3’UTR区域构建至报告基因luciferase的下游,观察过表达let-7c后荧光素酶的活性变化,以定量反映let-7c对hsacirc1483的抑制作用。荧光素酶实验设立4组:hsacirc1483+let-7c、hsacirc1483-nc+let-7c、hsacirc1483-mut+let-7c、hsacirc1483-mut+let-7c-nc,组间比较hsacirc1483 3’-UTR是否通过与let-7c靶向互补结合,导致荧光素酶活性降低。2、基线中等程度表达、高表达的let-7c胃癌细胞系的筛选:通过细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,检测let-7c在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,选取let-7c中等程度表达、高表达的三株胃癌细胞系HGC27、AGS、BGC823进行后续实验。3、细胞转染效率检测:应用细胞培养、细胞瞬时转染,将let-7cmimics转染到BGC823、AGS细胞系中,let-7c inhibitor转染至HGC27、BGC823细胞系中。瞬时转染6h后更换细胞培养基,在荧光显微镜下观察绿色荧光,其转染效率达50%以上进入下一轮实验。4、let-7c过表达及沉默细胞分化相关指标表达检测:let-7c转染胃癌细胞系48h后,收集细胞沉淀,利用细胞总RNA提取、反转录和Real-time PCR方法,鉴定胃癌细胞中let-7c的过表达效率和沉默效率以及检测hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平。同时,通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。5、Hsacirc1483与let-7c共同过表达胃癌细胞分化相关指标表达检测:将hsacirc1483过表达质粒和let-7c mimics同时瞬时转染至BGC823、AGS细胞系中,48h后收集细胞沉淀,与hsacirc1483单独过表达相比较,检测胃癌细胞PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA表达水平的变化。通过细胞蛋白提取、SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验检测PGC、SOX2、CDX2、TFF2蛋白表达。6、统计分析:细胞中hsacirc1483、PGC、SOX2、CDX2、TFF2 mRNA及let-7c的相对表达量以2-△△ct表示,△△CT=（CT目的基因-CT内参基因）实验组-（CT目的基因-CT内参基因）对照组。采用Graphpad Prism 6进行统计分析和图形处理。以配对样本T检验比较两组的差异表达,所有数据均采用均数±标准差表示。研究结果:第一部分:Hsacirc1483在胃癌与癌旁组织的差异表达及其与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性1、57对胃癌组织和癌旁组织检测结果发现hsacirc1483表达在胃癌及癌旁组织间存在显着差异。相对于胃癌旁正常组织(ANT 2-△CT1.53×10-5,(6.61×10-6,8.31×10-4)),胃癌组中hsacirc1483的表达显着降低(GC 2-△CT6.92×10-6,(3.17×10-6,1.90×10-4))（P<0.001）。2、为了进一步评估hsacirc1483在胃癌中的诊断效能,我们分析了ROC曲线下面积、敏感度及特异度。结果显示hsacirc1483区分胃癌组织和癌旁正常组织的ROC曲线下面积是65.19%（95%CI 0.55,0.75,P<0.001）,以7.20×10-6为cutoff值,敏感度50.90%,特异度75.4%。3、为了探讨hsacirc1483组织表达与PGC基因的相关性,我们利用Spearman’s correlation coefficient方法进行了相关性分析。结果表明在胃癌组织和癌旁正常组织中,hsacirc1483表达与胃黏膜分化基因PGC mRNA表达水平均呈显着正相关（胃癌组织:r=0.31,P=0.049,癌旁组织:r=0.38,P=0.01）第二部分:Hsacirc1483表达对胃癌细胞生物学行为的影响1、细胞筛选:通过Real-time PCR检测hsacirc1483在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45三代胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,筛选出hsacirc1483相对低表达的胃癌细胞系HGC27和中等程度表达的细胞系BGC823、AGS。2、Hsacirc1483过表达效率:在BGC823、HGC27、AGS细胞系中,hsacirc1483过表达质粒的转染效率均高于50%。BGC823细胞系中hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的25000倍（P<0.05）,HGC27细胞系中,hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的1200倍（P<0.05）。AGS细胞系中,hsacirc1483质粒的过表达效率是对照组的20571倍（P<0.01）。3、Hsacirc1483过表达对细胞增殖能力的影响:在BGC823细胞系中分别转染hsacirc1483过表达质粒和对照质粒,,观察两组细胞的增殖能力。结果发现与对照组相比,hsacirc1483过表达组的胃癌细胞的增殖能力无明显变化,两组无统计学差异（P>0.05）。4、过表达hsacirc1483对胃癌细胞分化指标表达的影响（1）BGC823细胞系过表达hsacirc1483,PGC mRNA表达为1.52±0.14,SOX2 mRNA表达为1.90±0.23,均较对照组（mRNA表达设为单位1）显着升高（P<0.05）,TFF2 mRNA表达为0.82±0.03,较对照组显着降低（P<0.05）,未检测到CDX2转录水平的表达。BGC823细胞系转染hsacirc1483过表达质粒后,过表达组中TFF2蛋白表达的灰度值为0.09±0.08,较对照组（灰度值0.12±0.09）显着降低（P<0.05）,未检测到PGC、SOX2、CDX2蛋白表达。（2）HGC27细胞系过表达hsacirc1483后,PGC mRNA表达为1.36±0.12,较对照组显着升高（P<0.05）。（3）AGS细胞系转染hsacirc1483过表达质粒后,PGC蛋白表达的灰度值为0.47±0.01,较对照组（灰度值0.21±0.01）显着升高（P<0.001）;CDX2蛋白表达的灰度值为0.13±0.04,较对照组（灰度值0.29±0.08）显着降低（P<0.05）,TFF2蛋白表达的灰度值为0.04±0.01,较对照组（灰度值0.19±0.04）显着降低（P<0.05）。第三部分Hsacirc1483靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究1、双荧光素酶报告实验:与对照组（circRNA-nc+let-7c,荧光素酶活性设定为单位1）相比,野生质粒hsacirc1483+let-7c共转染,质粒的荧光素酶活性显着降低（hsacirc1483+let-7c vs circRNA-nc+let-7c:0.6 vs1,P<0.05）;突变质粒hsacirc1483-mut+let-7c共转染,质粒的荧光素酶活性无明显变化（hsacirc1483-mut+let-7c vs circRNA-nc+let-7c:1.05 vs 1,P>0.05）;野生质粒hsacirc1483+let-7c-NC共转染、突变质粒hsacirc1483-mut+let-7c-NC共转染,两组质粒的荧光素酶活性均无明显变化（hsacirc1483+let-7c-NC vs circRNA-nc+let-7c:1.08 vs1,hsacirc1483-mut+let-7c-NC vs circRNA-nc+let-7c:1.08 vs1,P>0.05）。双荧光素酶实验结果表明let-7c可以通过与hsacirc1483 3’-UTR靶向结合,抑制其荧光素酶活性。2、胃癌细胞中hsacirc1483与let-7c的调控关系（1）细胞筛选:通过Real-time PCR检测let-7c在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中以及在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达量,筛选出三株胃癌细胞系:let-7c相对高表达的细胞系HGC27;中等程度表达的细胞系AGS、BGC823。（2）let-7c过表达及沉默效率:在BGC823、AGS细胞系中转染let-7c mimics,BGC823、HGC27细胞系中转染let-7c inhibitors,6h后观察转染效率,48h检测过表达或沉默效率。结果显示,BGC823细胞系中,let-7c过表达效率是对照组的130倍（P<0.05）。AGS细胞系中,let-7c过表达效率是对照组的460倍（P<0.05）。BGC823和HGC27细胞系中沉默let-7c后,其表达分别较对照组降低31%（0.56±0.18 vs 1,P<0.05）、10%（0.87±0.08 vs 1,P>0.05）。（3）过表达let-7c后,BGC823细胞系hsacirc1483表达为0.23±0.18,较对照组（设定为单位1）显着降低（p<0.05）;AGS细胞系中,hsacirc1483表达较对照组显着降低（0.54±0.40 vs 1,P<0.05）。沉默let-7c后,BGC823细胞系hsacirc1483表达显着升高（1.78±0.38 vs 1,P<0.05）,HGC27细胞系hsacirc1483表达亦显着升高（1.71±0.36 vs 1,P<0.05）。（4）过表达hsacirc1483后,BGC823细胞系中,let-7c表达为0.88±0.02,较对照组显着降低（P<0.05）。HGC27过表达hsacirc1483,let-7c表达为0.72±0.08,较对照组显着降低（P<0.05）。3、let-7c对胃癌细胞分化指标表达水平的影响（1）BGC823细胞系过表达let-7c,PGC mRNA表达为0.49±0.05,较对照组显着降低（P<0.01）,TFF2 mRNA为1.75±0.13,较对照组显着升高（P<0.05）;SOX2 mRNA为0.71±0.03,较对照组显着降低（P<0.05）,未检测到CDX2 mRNA表达。BGC823细胞系过表达let-7c后,TFF2蛋白表达的灰度值为0.44±0.06,较对照组（灰度值为0.25±0.15）显着升高（P<0.05）,未检测到PGC、SOX2、CDX2蛋白表达。（2）AGS细胞系过表达let-7c,PGC mRNA表达为0.87±0.05,较对照组显着降低（P<0.05）。沉默let-7c后,BGC823细胞系PGC mRNA表达为2.40±1.58,较对照组呈升高趋势（P>0.05）;HGC27细胞系中PGC mRNA表达为1.73±0.53,较对照组呈升高趋势（P>0.05）。AGS细胞系过表达let-7c后,PGC蛋白表达的灰度值为0.02±0.00,较对照组（灰度值为0.07±0.01）显着降低（P<0.05）,CDX2、TFF2蛋白表达的灰度值分别为0.84±0.04、0.60±0.06,均较对照组（CDX2灰度值为0.30±0.06,TFF2灰度值为0.17±0.01）明显升高（P<0.05）。4、共同过表达hsacirc1483和let-7c对胃癌细胞分化指标表达的影响（1）BGC823细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,PGC、SOX2mRNA水平（PGC:0.68±0.05,P<0.01;SOX2:0.37±0.06）较对照组（hsacirc1483单独过表达,设定为单位1）时均显着降低（P<0.01）,TFF2 mRNA水平（1.37±0.01）较hsacirc1483单独过表达时显着升高（P<0.001）。BGC823细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,TFF2蛋白表达灰度值为0.58±0.23,较hsacirc1483单独过表达（灰度值为0.45±0.18）明显升高（P<0.05）。（2）AGS细胞系中,hsacirc1483和let-7c同时过表达后,PGC蛋白表达的灰度值为0.27±0.02,较hsacirc1483单独过表达（0.47±0.01）明显降低（P<0.05）,CDX2、TFF2蛋白表达的灰度值分别为0.60±0.01,0.34±0.00,较hsacirc1483单独过表达（CDX2灰度值为0.13±0.04,TFF2灰度值为0.04±0.01）明显升高（P<0.01）。结论:1、Hsacirc1483在胃癌组织中表达显着降低,对于区分胃癌具有较高的诊断效能。2、Hsacirc1483的组织表达与PGC mRNA表达水平呈显着正相关。3、Hsacirc1483过表达对胃癌细胞增殖能力无明显影响。4、Hsacirc1483能够靶向结合let-7c,二者存在负向调控关系。5、Hsacirc1483可通过靶向结合let-7c,上调PGC mRNA和蛋白表达,上调SOX2 mRNA表达,下调CDX2蛋白表达,下调TFF2 mRNA和蛋白表达,参与胃癌细胞分化调控。
马影,张丹,聂聪,杨宇琴,玉业英,柯尊晖,赵晋,郭忠[4]（2017）在《端粒酶与口腔恶性肿瘤》文中提出端粒酶是一种具有逆转录活性的核蛋白酶,可维持端粒正常的生理功能,而端粒酶活性表达与口腔恶性肿瘤的发生、发展有密切的关系,并为人们治疗口腔恶性肿瘤以及其他肿瘤提供新思路与新方法.文章将对端粒酶生物学特性及其在口腔恶性肿瘤中的研究进展做一综述.
魏东[5]（2014）在《Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖的效应及其WWOX信号通路的分子机制》文中进行了进一步梳理[研究目的]1.探讨Bmi-1、WWOX及PUMA基因在胆囊癌组织和慢性胆囊炎伴轻-中度非典型增生组织及正常胆囊组织中的表达差异,分析Bmi-1/WWOX/PUMA表达与胆囊癌临床病理因素的关系,有望揭示其表达差异在胆囊癌发生、发展中的作用及其临床意义,为后续研究胆囊癌的发生机制奠定基础。2.通过体外RNAi干扰技术成功构建靶向shRNA-Bmi-1重组载体抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的效应,探讨Bmi-1调控WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路调节胆囊癌细胞生长的分子机制。3.通过体外成功构建pcDNA3.0-WWOX真核表达载体,探讨过表达WWOX基因对胆囊癌细胞增殖,凋亡及细胞周期的影响,进一步研究WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路调控胆囊癌细胞生长的分子机制,为研究Bmi-1/WWOX通路间是否存有反馈环路奠定基础。4.成功建立了人胆囊癌BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型,通过体内试验评估靶向抑制Bmi-1对移植瘤的治疗效果,进一步探讨其对胆囊癌细胞生长的影响及调控Bmi-1/WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路的分子机制,验证体外实验结果。5.本课题通过临床相关研究,体外及裸鼠体内试验研究,全面系统阐述Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的效应及其WWOX信号通路的分子机制,将有助于胆囊癌标志物的筛选及病情的预后和评估,为胆曩癌的早期诊断、分子靶向治疗提供理论依据和实验数据。[研究方法]1.临床相关研究：收集临床病理资料完整的原发性胆囊腺癌病人手术标本存档石蜡块55例,收集同期慢性胆囊炎伴轻-中度非典型增生组织标本30例及正常胆囊组织标本22例（均来自于肝内胆管结石或肝脏肿瘤行右半肝切除患者,胆囊内无结石及肿瘤侵袭）作对照,其中每组病例包括新鲜组织各5例。应用IHC-Max Vision法、RT-PCR及Real-time PCR等技术检测上述标本中Bmi-1/WWOX/PUMA mRNA及蛋白的表达差异,分析三者表达与胆囊癌临床病理因素的关系及意义。2.体外研究,以原癌基因Bmi-1mRNA为靶点：通过体外RNAi干扰技术成功构建shRNA-Bmi-1重组载体转染胆囊癌GBC-SD细胞,应用倒置荧光显微镜及流式细胞技术评价其转染效率,以RT-PCR及Westernblot检测转染后胆囊癌细胞转录和翻译水平的变化,筛选出最佳干扰作用的Bmi-1靶序列重组质粒为后续实验组。通过倒置显微镜观察、Brdu实验、Annexin V/7-AAD单染和双染实验、透射电镜及细胞周期检测技术分析靶向shRNA抑制Bmi-1对胆囊癌细胞增殖活性、凋亡进程及细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系,进一步通过Real-time PCR, Western Blot,免疫荧光染色及流式细胞检测等技术探讨靶向shRNA抑制Bmi-1表达对WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2/Caspase-3通路影响的分子机制。3.体外研究,以抑癌基因WWOXmRNA为靶点：提取GBC-SD细胞总RNA,采用RT-PCR扩增WWOX全序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.0中,通过限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定,成功构建pcDNA3.0-WWOX重组真核表达载体。按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD细胞为空白对照。以RT-PCR、Westemblot及免疫荧光技术检测转染后胆囊癌细胞转录和翻译水平的变化,以MTT法、AnnexinV/7-AAD双染、TUNNEL法、细胞周期检测技术、透射电镜技术、线粒体跨膜电位检测技术分析过表达WWOX对胆囊癌细胞增殖活性、凋亡及细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系,进一步通过Real-time PCR, Western Blot,免疫荧光染色及流式细胞检测等技术探讨pcDNA3.0-WWOX真核表达载体对WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路调控的分子机制。4.体内试验研究：以体外实验结果为基础,通过建立人胆囊癌BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型,应用shRNA-Bmi-1重组质粒在移植瘤周围及瘤内多点注射,实验终止绘制移植瘤生长曲线,计算瘤体抑制率,通过标本解剖和组织病理检测手段探讨靶向shRNA抑制Bmi-1表达对裸鼠皮F移植瘤的抗瘤效果,通过Max Vision去、TUNEL法、透射电镜、RT-PCR及Western Blot等检测技术进一步探讨Bmi-1对胆囊癌细胞生长的影响及调控WWOX通路关键基因表达的分子机制。[研究结果11.临床相关研究结果（1）IHC-MaxVision检测结果显示：Bmi-1、WWOX及PUMA蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达分别为83.6%（46/55）、38.2%（21/55）和34.5%（19/55）,其中Bmi-1蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达明显高于慢性胆囊炎伴非典型增生组织及正常胆囊组织,而WWOX及PUMA蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达明显低于慢性胆囊炎伴非典型增生组织及正常胆囊组织（P<0.05）。（2）Bmi-1、WWOX及PUMA表达差异与临床病理因素的关系结果：Bmi-1、WWOX蛋白表达水平与胆囊癌的病理分期、分化程度及淋巴结转移有关（P<0.05）,与胆囊癌患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、是否伴有肝硬化及胆囊结石无相关性（p>0.05）。PUMA蛋白表达水平与胆囊癌分化程度及淋巴结转移有关（P<0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤大小、临床病理分期、肿瘤部位、是否伴有肝硬化及胆囊结石均无相关性（p>0.05）。（3） Realtime PCR和RT-PCR检测结果：Bmi-1mRNA表达为胆囊癌组织>慢性胆囊炎伴非典型增生组织>正常胆囊组织；而WWOX及PUMAmRNA表达为胆囊癌组织<慢性胆囊炎伴非典型增生组织<正常胆囊组织（P<0.05）。实验表明Bmi-1、WWOX及PUMA基因可能参与胆囊癌发生、发展过程,慢性胆囊炎伴非典型增生组织中Bmi-1持续高表达或WWOX/PUMA持续低表达警示胆囊癌发生的可能。2.以原癌基因Bmi-1mRNA为靶点的体外研究结果（1） shRNA-Bmi-1重组载体的构建及筛选结果：shRNA-Bmi-1重组载体构建后经基因测序证明所获得的4组Bmi-1基因扩增序列正确。应用倒置荧光显微镜及流式细胞技术检测细胞转染效率70%左右；将4组质粒分别转染胆囊癌GBC-SD细胞48h后,通过RT-PCR及Westernblot检测筛选出第四组序列在转录和翻译水平抑制显着,为后续实验组（即为shRNA-Bmi-1组）。（2）靶向shRNA干扰Bmi-1表达对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响结果：通过RT-PCR及Westernblot检测显示靶向抑制Bmi-1,其mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组（p<0.05）；而对照组间表达量无显着差异（p>0.05）。倒置显微镜观察发现shRNA-Bmi-1对胆囊癌细胞的影响随时间的推移,增殖抑制率较对照组明显,其中以转染后72h抑制效果最显着,细胞死亡最多。Brdu检测显示shRNA-Bmi-1组细胞增殖活性较对照组降低,细胞增殖力呈时间依存性,随时间推移增殖力明显减弱,于转染72h细胞增殖抑制最强（p<0.05）。AnnexinV/7-AAD单染和双染检测显示转染shRNA-Bmi-1重组质粒24h-48h-72h后,shRNA-Bmi-1组细胞凋亡率均随时间推移明显增加（24h<48h<72h）,且与晚期凋亡增加为主（p<0.05）。透射电镜检测发现shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞浓缩、核固缩形成凋亡小体。细胞周期检测显示shRNA-Bmi-1转染组G0/G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少,细胞阻滞于G0/G1,细胞凋亡率明显增高,增殖指数降低（p<0.05）。（3）靶向shRNA干扰Bmi-1表达调控WWOX通路的分子机制研究结果：通过Real-time PCR、Western Blot及免疫荧光染色技术检测显示shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞Bmi-1mRNA及蛋白表达量及蛋白荧光强度较对照组减少,而WWOX、P73、PUMAmRNA及蛋白表达量较对照组均明显增加,蛋白荧光表达强度明显增强（p<0.05）；流式细胞仪技术检测显示shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞Bax及Caspase-3蛋白表达较对照组增加,而Bcl-2蛋白表达较对照组减少（p<0.05）。3.以抑癌基因WWOX mRNA为靶点的体外实验研究结果（1）WWOX基因真核表达载体的构建：pcDNA3.0-WWOX重组质粒经双酶切鉴定及基因测序证明所获得的WWOX基因扩增序列正确。（2）pcDNA3.0-WWOX重组质粒对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期影响结果：RT-PCR及Westernblot检测显示pcDNA3.0-WWOX转染48小时后WWOXmRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组（p<0.05）；对照组间mRNA及蛋白表达量无显着差异（p>0.05）。免疫荧光检测结果显示pcDNA3.0-WWOX组细胞WWOX蛋白荧光强度在细胞核周围明显强于各对照组,而对照组间细胞WWOX蛋白荧光强度变化不明显。倒置显微镜观察发现pcDNA3.0-WWOX组贴壁的GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而对照组细胞呈正常增殖状态,贴壁生长良好。MTT法检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显着,对照组细胞增殖抑制不明显（P<0.05）。BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率较对照组降低（P<0.05）。Annexin V/7-AAD双染检测发现pcDNA3.0-WWOX组胆囊癌细胞早、晚期凋亡率较对照组增高（p<0.05）；而对照组间早、晚期凋亡率未见显着差异（P>0.05）。TUNNEL法检测显示转染pcDNA3.0-WWOX重组质粒24h/48h/72h后,胆囊癌细胞凋亡比率较对照组增加,以转染48h后更为明显（p<0.05）。细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0/G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少,细胞凋亡率增高,增殖指数降低（p<0.05）；而对照组间未见显着性差异（p>0.05）。JC-1染色检测细胞线粒体跨膜电位（△Ψm）显示过表达WWOX基因胆囊癌细胞线粒体内绿色荧光信号显着高于空载体、脂质体及空白对照组,提示WWOX诱导胆囊癌细胞早期凋亡为主（p<0.05）。透射电镜观察pcDNA3.0-WWOX组细胞典型的凋亡形态学改变,出现核固缩、碎裂形成凋亡小体。（3）pcDNA-WWOX重组质粒对WWOX通路关键基因的影响结果：通过Real-time PCR,Western Blot及免疫荧光染色检测显示特异性上调WWOX表达,胆囊癌细胞中P73、PUMA在转录及翻译水平的表达量均较对照组增加（p<0.05）；流式细胞仪检测发现特异性上调WWOX表达,胆囊癌细胞中Bax蛋白表达水平较对照组明显增加,而Bcl-2蛋白表达水平较对照组减少（p<0.05）。4.移植瘤体内试验研究结果裸鼠皮下接种GBC-SD细胞株5-7天后成瘤率为100%。shRNA-Bmi-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,治疗6周实验终止时各实验组体积较治疗前增大,但shRNA-Bmi-1组移植瘤体积明显小于各对照组（shRNA-Scramble组、Lipofectamine组、GBC-SD组）,其瘤体抑制率为60.6%（p<0.05）,对照组间体积无明显差异（P>0.05）。HE染色显示shRNA-Bmi-1组细胞坏死明显,细胞形态模糊,见炎性细胞浸润,组织结构不清晰,而各对照组细胞异型性明显,炎性细胞较少,组织结构清晰。MaxVision染色发现shRNA-Bmi-1组移植瘤组织中Ki67及VEGF蛋白表达较对照组减弱,提示shRNA-Bmi-1组肿瘤新生血管生成减少、细胞增殖抑制明显。TUNEL及透射电镜检测显示靶向shRNA抑制Bmi-1体内可诱导胆囊癌细胞凋亡,与体外实验相符合。通过Real-time PCR、Western Blot及免疫组织化学检测发现靶向shRNA干扰Bmi-1表达可特异性促进Bmi-1mRNA的降解及抑制其蛋白的表达,同时促进下游通路中关键基因WWOX/P73/PUMA/Bax表达,抑制Bcl-2的表达水平。[研究结论]1. Bmi-1、WWOX及PUMA的表达参与胆囊癌的发生发展过程,Bmi-1阳性表达率越高,或WWOX、PUMA阳性表达越低或表达缺失,提示肿瘤恶性程度增加、转移增快,Bmi-1、WWOX及PUMA的表达差异可能参与肿瘤的侵袭及演进。应用免疫组化联合检测胆囊癌组织中的Bmi-1、WWOX及PUMA的表达将有利于协助胆囊癌的早期诊断,有助于对其预后进行合理评估。2.体外成功构建了shRNA-Bmi-1重组载体。靶向沉默Bmi-1表达能有效促进胆囊癌细胞Bmi-1mRNA降解及抑制其蛋白表达,能特异性抑制胆囊癌细胞增殖,诱导其凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,从而引起细胞DNA合成受阻,研究提示Bmi-1参与调控胆囊癌细胞的增殖和凋亡,维持细胞周期的运行,是抑制细胞凋亡和促进细胞异常增殖的重要因素。同时靶向沉默Bmi-1表达能有效促进WWOX通路中的关键基因WWOX/P73/PUMA/Bax/Caspase-3的表达,抑制Bcl-2蛋白表达,其作用可能与调控胆囊癌细胞生长效应的机制相关,Bmi-1及其Bmi-1/WWOX通路参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长。3.体外成功构建了pcDNA3.0-WWOX真核表达载体。过表达WWOX可有效抑制胆囊癌细胞WWOXmRNA降解、促进其蛋白表达,能有效抑制胆囊癌细胞的增殖活性、诱导其凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期。同时上调并促进P73蛋白在胆囊癌细胞质中螯合积累,促进PUMA、Bax及抑制Bcl-2的转录和翻译过程,其作用可能是调控胆囊癌细胞生长的重要机制之一。WWOX/P73/PUMA通路通过调控线粒体依赖的凋亡途径来调节胆囊癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的变化,进一步证实了WWOX通路调控胆囊癌细胞的分子机制。4.成功建立胆囊癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。靶向沉默Bmi-1表达能诱导胆囊癌移植瘤细胞凋亡,显着抑制肿瘤的生长及新生血管的形成,影响裸鼠皮下移植瘤Bmi-1/WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路关键基因的表达,与体外实验相符合。体内实验进一步验证了Bmi-1/WWOX通路参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长。5.Bmi-1及WWOX可能为胆囊癌基因靶向治疗提供潜在的分子靶标,通过靶向沉默Bmi-1表达和特异性性上调WWOX的表达可能是胆囊癌联合基因治疗的潜在治疗手段之一,阻断Bmi-1/WWOX通路对胆囊癌靶向性治疗策略具有重要意义,同时也为探索胆囊癌早期诊断及多分子联合靶向治疗提供了新的实验依据。
刘光明[6]（2013）在《DEK在膀胱尿路上皮癌中的表达及肾移植术后尿路上皮癌特点》文中提出第一部分：DEK在膀胱尿路上皮癌中的表达目的：探讨核蛋白DEK在正常膀胱粘膜组织和UCC组织中的表达情况。明确DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌、非典型增生和内翻性乳头状瘤和癌旁组织中的表达差异,探讨DEK表达和膀胱尿路上皮癌预后的关系。方法：1、应用免疫组化PV两步法检测DEK蛋白在68例膀胱尿路上皮癌、7例内翻性乳头状瘤、5例不典型增生和14例正常粘膜组织中的表达情况,以在细胞核出现棕黄色颗粒为阳性,显微镜下观察并计数阳性染色细胞数,其表达以细胞染色的比例和强度进行判断。同时检测E-cadherin和Ki-67的表达情况,并研究其和DEK的相关性。2、Real-time PCR检测DEK蛋白在基因水平的表达。3、采用Western Blot方法检测DEK蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。4、对68例膀胱尿路上皮癌患者进行随访分析,检测其肿瘤无瘤生存期和DEK蛋白表达的关系。结果：1、免疫组化研究显示DEK在正常粘膜中为低表达,而在膀胱尿路上皮癌、内翻性乳头状瘤、不典型增生中为高表达。2、DEK在原位癌和高级别膀胱尿路上皮癌的转移淋巴结中呈高表达。3、随着临床分期、病理分级的增加,DEK的表达有降低的趋势,但这种降低并不是其代表预后良好的标志。DEK阳性表达与肿瘤分级分期一样,是膀胱癌无瘤生存的独立的预后因素。于DEK阴性的患者比较,DEK阳性患者无瘤生存期较短。4、DEK的表达和E-cadherin具有负相关,提示DEK、β-catenin和E-cadherin之间存在着直接和间接的作用机制联系,DEK和E-cadherin作为肿瘤异常表达信号的一条通路,在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。5、DEK于Ki-67比较,在恶性潜能和低级别尿路上皮癌中DEK表达更高。二者之间显着相关,DEK能够反应细胞的增殖状态。6、实时定量PCR和western-blot显示配对的膀胱癌组织和癌旁组织中的DEK的表达水平高于癌旁组织。结论：1、DEK、E-cadherin和Ki-67和膀胱尿路上皮癌关系密切,DEK的表达在膀胱尿路上皮癌中和分期分级密切相关,是膀胱癌发生中的早期事件。2、DEK在低分级的膀胱尿路上皮癌中呈高表达,DEK对于非典型增生和尿路上皮癌的鉴别没有诊断价值,DEK和膀胱尿路上皮癌的无瘤生存期明显相关。3、联合DEK和Ki-67免疫组化检测对于膀胱尿路上皮癌的预后有一定价值。第二部分肾移植术后尿路上皮癌特点的国内外差异及原因初步探讨目的：对肾移植受体发生上尿路肿瘤的情况进行分析,探讨其发病特点、临床表现及防治措施。方法：回顾性分析1998年8月至2011年12月2572例肾移植患者资料,共有24例（1.01%）泌尿系肿瘤,男性10例,女性14例。。肾移植手术时年龄49.3±11.6岁（24-68岁）,移植术后首次诊断肿瘤年龄55.6±9.8岁（32-70）岁。肿瘤诊断距移植手术时间为2-180个月,中位数为54个月。其中上尿路肿瘤21例,包括肾癌1例,尿路上皮癌20例,肿瘤诊断时间为2-180个月,中位数为54个月,有中药服用史者18例（75%）,对其发病特点、病理类型和手术治疗等进行分析,并结合国内外文献讨论其特点。本组手术治疗24例,2例出现转移行吉西他滨联合顺铂方案化疗。结果：膀胱尿路上皮癌2例,腺性膀胱炎1例,肾乳头状细胞癌1例,肾盂输尿管癌双侧病变5例,单侧病变例15例,其中两个器官以上多发尿路上皮癌8例。4例出现淋巴结转移和远处转移。尿路上皮癌伴肉瘤样癌3例,局部伴鳞癌4例。随访时间4-94个月,中位时间61个月,存活20例,死亡4例,其中1例伴有移植肾横纹肌肉瘤。文献检索显示,国外的同类病例以膀胱癌为主,上尿路肿瘤比较少见。结论：国内肾移植患者发生尿路上皮癌后的肿瘤特点为上尿路肿瘤为主,呈现多发性、“蚕食式”尿路上皮多病灶复发、双侧、罕见肿瘤类型多见的特点和马兜铃肾病相关肿瘤特征相一致；因治疗肾功能不全而长期服用蒽醌类缓泻药和肾移植术后尿路上皮癌有关；对于高危上尿路尿路上皮癌患者推荐选择性双侧上尿路预防性切除。
范福玲[7]（2010）在《Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系》文中研究表明背景与目的：肿瘤的致病因素众多,但追根溯源是基因及细胞相关代谢酶发生了改变。食管癌是肿瘤的一种类型,也是经过多阶段的演进过程,多基因改变和参与,以及相关代谢酶的基因改变和（或）DNA错配修复酶的异常改变。原癌基因Bmi-1（Blymphoma Mo MLV insertion region, Bmi-1）是多梳基因（Polycomb group genes）家族中重要的调节基因,多梳基因由多种转录抑制子组成,转录抑制子与细胞周期和增殖有关,因此,PcG是一类重要的与发育相关的基因。原癌基因Bmi-1又是PcG基因家族的核心成员之一,其最初发现与另一种癌基因c-myc协同作用促使细胞转化和肿瘤的形成。近年来研究发现Bmi-1作为一种广泛表达核蛋白跟肿瘤发生、发展、侵袭、预后等病理指标相关性很高。端粒是染色体末端的一种特殊结构,它是由许多简单短重复序列和端粒结合蛋白（telomere end-binding protein,TEBP）组成。在正常人体细胞中,可随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒是细胞必需的遗传组分,因为它能够保护和补偿染色体末端遗传信息的丢失,保护它不会被核酸酶识别而免遭降解。端粒的存在是为了维持染色体的稳定。没有端粒,末端将暴露,易被外切酶水解。端粒不是用DNA聚合酶来合成的,是用端粒酶来合成的。端粒酶是合成端粒DNA的特殊逆转录酶,具有RNA依赖性和DNA多聚酶性质的核糖体蛋白复合体,能以自身RNA为模板,不断合成端粒酶DNA序列,保持染色体端粒的完整性。正常体细胞每分裂一次,端粒的长度就会缩短,最终缩短到一定的长度后细胞衰老。当端粒酶存在且被激活的状态下,端粒酶作用于端粒,使端粒的长度不在缩短,因而细胞发生永生化。尤其是在恶性、晚期肿瘤中,端粒酶活性增强,使大量的癌细胞无休止的增殖,导致细胞的恶化转移。目前大量研究发现,端粒酶的激活是促进肿瘤发生、增殖及转移的一个重要因素,端粒酶的表达水平跟恶性肿瘤发生、发展、浸润、转移及预后密切相关。在大多恶性性肿瘤中,Bmi-1在肿瘤的发生发展中起到了显着的作用,过度表达Bmi-1可以激活端粒逆转录酶的转录,从而提高了端粒酶的活性,而端粒酶是目前研究已趋成熟的一个酶,越来越多的研究证实端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制,而在肿瘤中重新被激活,激活的端粒酶可能参与恶性转化。目前研究表明,激活的端粒酶与多种肿瘤的发生发展关系密切。因此Bmi-1和端粒酶在肿瘤的发生发展过程中有可能是协同效应。食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2%。我国是食道癌高发区,北方较南方多见,其中河南省发病率最高,其中以食管鳞状细胞癌（鳞癌）最多见,发病年龄大多在40岁以上,但近年来40岁以下发病者有增长趋势,发病年龄有年轻化的趋势,因此成了近年来我们研究的热点。关于Bmi-1和端粒酶各自在肿瘤细胞中的表达情况以及它们与细胞凋亡的关系,国内外已有报道,但未见在食管癌组织中同时检测Bmi-1和端粒酶的表达以及与肿瘤细胞凋亡的关系报道,值得进一步研究探讨。本研究应用了免疫组织化学SP法检测了Bmi-1和端粒酶在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织及食管鳞癌组织中的表达情况；用TUNEL方法分析了食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡情况,以研究Bmi-1和端粒酶与食管鳞癌发生、发展、浸润、转移及预后的关系,同时探讨Bmi-1、端粒酶与食管癌细胞凋亡的关系。以期寻找食管癌早期诊断和判断预后的分子指标。方法：1.采用免疫组化SP法分别对65例食管鳞癌组织、38例癌旁非典型增生组织及25例正常粘膜上皮组织中Bmi-1、端粒酶的表达进行检测；用TUNEL方法检测了在食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡情况。2.统计学处理：采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理,Bmi-1和端粒酶的表达强度的比较采用χ2检验,两变量之间的关系分析采用spearman等级相关分析表示,检验标准以a=0.05为显着性检验水准。凋亡指数（apoptosis index, AI）的比较采用方差分析及t检验,a=0.05有显着性意义。结果：1.在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织和食管鳞癌组织中,Bmi-1阳性表达率依次升高,分别为20.00%（5/25）、47.74%（17/38）和64.62%（42/65）,三者两两相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中,Bmi-1阳性表达率与年龄、性别、肿瘤的直径、浸润深度、分化程度无关,而与有无淋巴结转移以及TNM分期有关。无淋巴结转移组Bmi-1阳性表达率低于有淋巴结转移者（χ2=6.460,P=0.011）；Ⅰ-ⅡA组Bmi-1阳性表达率低于ⅡB-Ⅲ组（χ2=9.432,P=0.002）。2.在正常食管粘膜上皮组织、癌旁非典型增生组织和食管鳞癌组织中,端粒酶蛋白阳性表达率依次升高,为12.00% （3/25）、52.63%（20/38）和92.31%（60/65）,三者两两相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。在癌组织中,端粒酶阳性表达率与年龄、性别、肿瘤的直径、浸润深度、分化程度无关,而与有无淋巴结转移、以及TNM分期有关。无淋巴结转移者端粒酶阳性表达率低于有淋巴结转移者（χ2=8.125,P=0.004）；Ⅰ-ⅡA组Bmi-1阳性表达率低于ⅡB-Ⅲ组（χ2=8.125,P=0.004）。3.食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡与Bmi-1表达有关。Bmi-1阳性表达组中肿瘤细胞AI为（5.35±2.33）%,低于阴性表达组（13.41±5.62）%,差异有统计学意义（P<0.01）。4.食管鳞癌组织中肿瘤细胞的凋亡与端粒酶表达有关。端粒酶阳性表达组中肿瘤细胞AI为（6.35±2.33）%,低于阴性表达组（15.52±5.94）%,差异有统计学意义（P<0.01）。5.Bmi-1、端粒酶在食管鳞癌组织中的表达相关性经统计学分析显示两者呈正相关（P<0.05）。结论：1.Bmi-1、端粒酶的异常表达与食管鳞癌的发生发展关系密切,且两者可能在食管鳞癌的发生、发展中起协同作用。2.Bmi-1、端粒酶在食管鳞癌组织中的异常表达与淋巴结转移和TNM分期有关；提示Bmi-1、端粒酶的异常表达可能参与浸润、转移的过程。
战淑慧[8]（2007）在《胃癌组织中幽门螺杆菌感染与hTERT、hMSH2和p27蛋白表达的相关性研究》文中指出目的通过、病理学和多种分子生物学技术探讨端粒酶及其它相关因素如幽门螺杆菌在胃癌的发生和发展中的作用与机制,为胃癌的致病机理和防治寻找有价值的实验和理论依据。方法93例胃癌组织为实验组,其对应标本的切口边缘正常组织（距肿瘤组织至少5cm）为对照组,免疫组化法检测胃癌及癌旁组织hTERT、hMSH2和p27蛋白的表达情况及Hp感染的存在。结果1.胃癌组织hTERT阳性率为79.6%,明显高于癌旁组织22.6%（P＜0.01）;Hp感染组hTERT蛋白表达阳性率高于非感染组（P＜0.01）。2.胃癌组织hMSH2阳性率为65.6%,明显高于癌旁组织38.7%（P＜0.01）;Hp感染组hMSH2基因蛋白表达阳性率低于非感染组（P＜0.05）。3.胃癌组织中p27表达阳性者为46.2%,明显低于癌旁组织（80.6%）（P＜0.01）;Hp感染组P27蛋白表达阳性率低于非感染组（P＞0.05）。结论抑癌基因p27表达的下调以及Hp诱导的端粒酶的表达增高和错配修复基因hMSH2的表达异常可能与胃癌的发生有关。
彭春雷[9]（2007）在《端粒酶的研究和应用进展》文中研究指明
高义军[10]（2006）在《端粒酶逆转录酶与口腔黏膜下纤维性变癌变关系的初步研究》文中研究表明研究背景 口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种慢性、隐匿性、具有癌变倾向的口腔黏膜病，主要病理变化包括上皮组织萎缩、黏膜固有层、黏膜下层胶原纤维堆积、变性和血管闭塞、减少，临床上常表现为口干、灼痛、进刺激性食物疼痛、进行性张口受限、吞咽困难等症状。大量研究表明：嚼槟榔是OSF主要的致病因素，全世界约有6亿槟榔咀嚼者，WHO将OSF列为癌前状态，OSF癌变率高达7.6％，成为口腔部位最重要的癌前病损之一。病例对照研究表明：吸烟、嚼槟榔习惯与OSF癌变关系密切，OSF癌变机制目前还不清楚，可能与槟榔的致癌成分槟榔碱、烟草、抑癌基因P53基因的失活、细胞因子、有关酶的改变如环氧合酶-2、赖氨酰氧化酶、端粒酶、诱导型NO合成酶等以及基因多态性、创伤、细胞免疫等关系密切，确切机制有待进一步研究。 近年来端粒酶（Telomerase）成为肿瘤研究的热点。端粒酶通过催化端粒合成，保持端粒长度而维持细胞持续分裂能力，人端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，主要由结构RNA（hTR）成分和催化亚单位端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase hTERT）成分组成，端粒酶活性由其重要组分hTERT决定。近期研究发现，人类大多数恶性肿瘤及永生化细胞中，端粒酶活性显着增高，端粒酶活性的激活与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究表明，hTERT在口腔粘膜癌前病变和口腔鳞癌中均有异常表达，且在口腔粘膜轻
二、癌旁非典型增生组织端粒酶活性的间接定量检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、癌旁非典型增生组织端粒酶活性的间接定量检测（论文提纲范文）
（1）miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文略缩词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.1.1 肝细胞性肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝细胞性肝癌的危险因素 |
| 1.1.3 肝细胞性肝癌的筛查 |
| 1.1.4 肝细胞性肝癌的诊断 |
| 1.1.5 肝细胞性肝癌的分期 |
| 1.1.6 肝细胞性肝癌的治疗 |
| 1.1.7 肝细胞性肝癌的生物学 |
| 1.2 microRNAs(miRNAs) |
| 1.2.1 miRNA概述 |
| 1.2.2 miRNA与 HCC |
| 1.2.3 miRNA-557与HCC |
| 1.3 上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT) |
| 1.3.1 EMT概述 |
| 1.3.2 EMT和 miRNAs |
| 1.3.3 EMT和 HCC |
| 1.4 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 |
| 1.4.2 Wnt/β-catenin信号通路与HCC |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路与miRNAs |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 miR-557 在肝癌中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 miR-557在GSE108724 的表达情况 |
| 2.3.2 miR-557在GSE26323 的表达情况 |
| 2.3.3 miR-557 在肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3.4 miR-557 在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.3.5 miR-557 在肝癌组织中的表达水平与患者生存时间的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 miR-557 对肝癌细胞体内外生物学行为的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 mimics和 inhibitors可以显着影响miR-557 的表达 |
| 3.3.2 miR-557 抑制肝癌细胞增殖 |
| 3.3.3 miR-557 抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.3.4 miR-557 过表达和敲减均影响肝细胞癌的细胞周期分布 |
| 3.3.5 miR-557 抑制肝癌细胞EMT |
| 3.3.6 慢病毒稳转株的筛选及miR-557 对细胞克隆形成的影响 |
| 3.3.7 miR-557 对肝细胞癌克隆形成和裸鼠皮下成瘤的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 miR-557 通过靶向RAB10 抑制Wnt/β-catenin信号的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 生物信息学预测miR-557 的靶基因 |
| 4.3.2 双荧光素酶报告实验验证miR-557与RAB10 的靶向性 |
| 4.3.3 miR-557 负性调控RAB10 的表达水平 |
| 4.3.4 RAB10 在肝癌组织中表达及其与miR-557 的相关性 |
| 4.3.5 促进或干扰RAB10 的表达会影响 miR-557对HCC细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.6 miR-557 抑制肝细胞性肝癌Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 总结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 综述 MicroRNA 在肝细胞癌中的作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）ATAD2在食管鳞状细胞癌中的表达及其在食管癌发生发展中的作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 组织石蜡切片 |
| 1.2 食管鳞癌细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要耗材仪器 |
| 1.5 引物序列 |
| 1.6 siRNA序列 |
| 1.7 抗体稀释及组织切片制备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫组化 |
| 2.2 食管鳞状细胞癌细胞系培养 |
| 2.3 RNA提取及纯度测定 |
| 2.4 RNA逆转录成cDNA |
| 2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.6 siRNA转染ESCC细胞 |
| 2.7 细胞总蛋白提取及BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.8 Western blot |
| 2.9 CCK-8细胞增殖实验 |
| 2.10 Transwell细胞迁移实验 |
| 2.11 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.12 细胞凋亡实验 |
| 2.13 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 ATAD2在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达差异 |
| 2 ATAD2的表达水平与患者临床病理学特征的关联性 |
| 3.小干扰RNAsi-ATAD2#l、si-ATAD2#2转染食管鳞癌细胞系后ATAD2的表达 |
| 4 敲低ATAD2的表达后对ESCC细胞增殖能力的影响 |
| 5 敲低ATAD2的表达后对ESCC细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 6 敲低ATAD2的表达后对ESCC细胞凋亡的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ATAD2在癌症发生发展中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）Hsacirc1483在胃癌组织中的表达及其靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Hsa_circ_1483 在胃癌与癌旁组织的差异表达及其与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 病例来源 |
| 2.2 材料试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Hsa_circ_1483 在胃癌与癌旁组织的差异表达及其诊断效能评估…… |
| 3.1.1 Hsa_circ_1483 在胃癌与癌旁组织的差异表达 |
| 3.1.2 Hsa_circ_1483 诊断效能评估 |
| 3.2 Hsa_circ_1483 表达与胃癌临床病理参数的相关性 |
| 3.3 Hsa_circ_1483 表达与胃黏膜分化基因PGC表达的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 Hsa_circ_1483 表达对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 胃癌细胞筛选 |
| 3.2 过表达hsa_circ_1483 对胃癌细胞生物学效应的影响 |
| 3.2.1 Hsa_circ_1483 过表达质粒的转染效率 |
| 3.2.2 Hsa_circ_1483 过表达质粒的过表达效率 |
| 3.2.3 过表达hsa_circ_1483 对胃癌细胞增殖效应的影响 |
| 3.2.4 过表达hsa_circ_1483 对胃癌细胞分化指标表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Hsa_circ_1483 靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 材料试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 胃癌细胞中hsa_circ_1483与let-7c的调控关系 |
| 3.1.1 hsa_circ_1483与let-7c靶向结合位点的预测 |
| 3.1.2 双荧光素酶报告实验结果 |
| 3.1.3 胃癌细胞中hsa_circ_1483与let-7c的调控关系 |
| 3.2 let-7c对胃癌细胞分化的影响 |
| 3.3 共同过表达hsa_circ_1483和let-7c对胃癌细胞分化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）端粒酶与口腔恶性肿瘤（论文提纲范文）
| 1 端粒酶的生物学特性 |
| 1.1 端粒酶的结构及功能 |
| 2 端粒酶与口腔恶性肿瘤的关系 |
| 2.1 端粒酶在口腔恶性肿瘤中的表达 |
| 2.2 端粒酶在口腔恶性肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.3 端粒酶与口腔恶性肿瘤的侵袭与转移 |
| 2.4 端粒酶与口腔恶性肿瘤放化疗的反应性 |
| 2.5 端粒酶在口腔恶性肿瘤治疗中的作用 |
| 3 总结 |
（5）Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖的效应及其WWOX信号通路的分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第一部分：Bmi-1、WWOX、PUMA在人胆囊癌组织中的表达状态、相关性及临床意义研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果及分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：靶向shRNA干扰Bmi-1表达对GBC-SD细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及其调控WWOX通路的分子机制 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果及分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：WWOX真核表达载体的构建及对人胆囊癌细胞生长的影响及其下游通路调控机制的研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果及分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分：靶向沉默Bmi-1表达对胆囊癌裸鼠移植瘤生长的影响及其机制的研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果及分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本课题的创新点 |
| 附录 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间主要发表论文 |
| 博士研究生期间的主要研究课题 |
| 傅士研究生期间主要获奖情况 |
| 博士研究生期间主要学习经历 |
| 博士研究生期间主要学术活动 |
| 基金资助项目 |
| 致谢 |
| 查新咨询报告书 |
（6）DEK在膀胱尿路上皮癌中的表达及肾移植术后尿路上皮癌特点（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、DEK蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 DEK、E-cadherin和Ki-67在膀胱尿路上皮癌中的表达结果 |
| 1.2.2 DEK表达与膀胱尿路上皮癌临床病理参数关系结果 |
| 1.2.3 DEK、E-cadherin和Ki-67表达的相关分析结果 |
| 1.2.4 DEK表达表达与预后分析结果 |
| 1.2.5 实时定量PCR研究检测DEK基因水平表达结果 |
| 1.2.6 Western-blotting检测DEK表达结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、肾移植术后尿路上皮癌特点的国内外差异及原因初步探讨 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 治疗方法 |
| 2.1.3 国内外肾移植术后尿路上皮癌相关文献检索方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 DEK和肿瘤研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 Bmi-1、端粒酶与肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读硕士研究生学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）胃癌组织中幽门螺杆菌感染与hTERT、hMSH2和p27蛋白表达的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究论文 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 hTERT蛋白、hMSH2蛋白和p27在胃癌、癌旁组织中的表达 |
| 2.2 胃癌组织中hTERT、hMSH2与p27蛋白表达与临床病理特征关系 |
| 2.3 Hp感染与胃癌组织中hTERT、hMSH2与P27蛋白的表达 |
| 2.4 图片 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）端粒酶逆转录酶与口腔黏膜下纤维性变癌变关系的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词论文 |
| 正文 |
| 前言 |
| 第一章 口腔粘膜下纤维性变及其癌变组织中端粒酶逆转录酶表达及其意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图片 |
| 第二章 槟榔碱及尼古丁对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 在读期间主要研究成果 |
四、癌旁非典型增生组织端粒酶活性的间接定量检测（论文参考文献）
- [1]miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究[D]. 叶善平. 南昌大学, 2021(01)
- [2]ATAD2在食管鳞状细胞癌中的表达及其在食管癌发生发展中的作用的研究[D]. 任珍珍. 郑州大学, 2020(02)
- [3]Hsacirc1483在胃癌组织中的表达及其靶向结合let-7c参与胃癌细胞分化调控的分子机制研究[D]. 刘文静. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]端粒酶与口腔恶性肿瘤[J]. 马影,张丹,聂聪,杨宇琴,玉业英,柯尊晖,赵晋,郭忠. 西北民族大学学报(自然科学版), 2017(02)
- [5]Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖的效应及其WWOX信号通路的分子机制[D]. 魏东. 昆明医科大学, 2014(11)
- [6]DEK在膀胱尿路上皮癌中的表达及肾移植术后尿路上皮癌特点[D]. 刘光明. 天津医科大学, 2013(12)
- [7]Bmi-1和端粒酶在食管鳞癌中表达与细胞凋亡的关系[D]. 范福玲. 郑州大学, 2010(05)
- [8]胃癌组织中幽门螺杆菌感染与hTERT、hMSH2和p27蛋白表达的相关性研究[D]. 战淑慧. 青岛大学, 2007(03)
- [9]端粒酶的研究和应用进展[J]. 彭春雷. 科技信息(学术研究), 2007(01)
- [10]端粒酶逆转录酶与口腔黏膜下纤维性变癌变关系的初步研究[D]. 高义军. 中南大学, 2006(01)