一、大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达(论文文献综述)
刘迪[1](2021)在《褪黑素介导生物钟基因调控鹅产蛋节律行为》文中研究说明鹅产蛋量低,一般年产蛋量仅为30-50个,不仅严重阻碍了鹅产业规模发展与壮大,也导致了鹅苗成本居高不下,养殖效益难以保证。因此说提高鹅产蛋量已成为鹅产业发展中迫切需要解决的问题之一。鹅的排卵一产蛋周期长,且具有明显的时间偏好。褪黑素是松果体分泌的一种吲哚类激素,作为内源生物钟的重要调控因子,可参与多种节律行为生理过程调节。但褪黑素是否可介导生物钟基因对鹅的产蛋行为产生影响目前尚不清楚,本研究以扬州鹅为研究对象,在阐明扬州鹅产蛋节律和褪黑素昼夜分泌规律基础上,探讨时钟基因在松果体及卵巢等内分泌组织中的节律性表达规律,初步揭示褪黑素调控鹅卵巢颗粒细胞增殖和生物钟节律机制,为缩短种鹅产蛋周期,提高产蛋性能,选育高产品种提供了理论依据。1扬州鹅产蛋节律与褪黑素昼夜分泌规律为揭示扬州鹅产蛋节律与褪黑素昼夜分泌规律,对产蛋高峰期中鹅进行连续24h(1次/h)产蛋行为观察,结果发现:扬州鹅产蛋具有明显的时间偏好性,主要集中在凌晨4:00-早晨7:00;产蛋间隔众数为46-48h。同时对血液中褪黑素的分泌规律进行检测,呈现出昼低夜高的分泌特点,与预期一致。并分别通过实时荧光定量PCR和免疫组化分别对松果体、下丘脑、垂体和卵巢褪黑素受体mRNA和蛋白MEL1A进行测定,结果显示与褪黑素呈现相同的表达趋势。2时钟基因在松果体和内分泌组织中的表达规律松果体和下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)均存在生物钟震荡钟基因,其中松果体属于扬州鹅的主钟振荡器,为确定生物钟发条机制在松果体和内分泌组织中存在的位置,运用实时荧光定量PCR技术检测正调控时钟基因(Clock、Bmall和Bmal2)和负调控时钟基因(Cry1、Cry2、Per2和Per3)在扬州鹅松果体、下丘脑、垂体及卵巢四个组织中48h内不同时间点的表达规律,并运用余弦定理检验其表达是否呈现显着性节律震荡,结果显示:正调控时钟基因表现出白天上升,夜间下降表达形式,而负调控时钟基因表现出白天下降,夜间上升表达形式,且在鹅产蛋集中分布区(凌晨4:00-早晨7:00),其表达量在峰值相位振荡;余弦特征检验结果显示,除了Bmall基因外,在松果体中其他基因均表现出显着的节律性(P<0.05),在卵巢中除了 Cry1基因外均表现出显着的节律性(P<0.05),而在下丘脑和垂体中均有多个基因未表现出节律性,因此说在松果体和卵巢中存在较明显的生物钟分子震荡机制,而在下丘脑和垂体表现出的生物钟分子震荡机制相对较弱。3褪黑素调控鹅卵巢颗粒细胞增殖和生物钟节律机制为探讨褪黑素对鹅卵巢颗粒细胞的增殖情况及生物钟节律分子机制的影响,体外分离培养卵巢颗粒细胞,采用20 μmol/L浓度的褪黑素分别处理卵巢颗粒细胞24h,结果显示:褪黑素提高了 Clock、Bmal1、Bmal2、Per2、Cry1等时钟基因的表达和节律性振幅,促进了增殖基因C-myc的节律性表达。转录组初步解析褪黑素对鹅卵巢颗粒细胞增殖相关机制,差异表达基因在第二信使cAMP、cGMP-PKG信号通路显着富集,并发现其共同差异基因CNGB1参与节律调节,即褪黑素抑制CNGB1表达,促进时钟基因Per2、Per3基因表达,调控颗粒细胞增殖。综上,本研究发现了扬州鹅产蛋时间偏好(凌晨4:00-早晨7:00)、产蛋间隔众数为46-48h以及褪黑素昼低夜高的分泌特点;证实了松果体和卵巢中存在较明显的生物钟分子震荡机制,且在鹅产蛋高峰期,其时钟基因表达量在峰值相位振荡,同时初步阐明了褪黑素可能介导CNGB1表达,促进节律基因表达,从而调控鹅的生殖行为。
任梅荣[2](2021)在《基于Wnt/β-catenin通路探讨左归丸对先天肾虚仔鼠免疫功能的影响及其机制研究》文中指出目的研究先天肾虚影响免疫功能的理论机制;采用复合应激法,复制仔鼠先天肾虚模型,基于Wnt/β-catenin信号通路,从胸腺角度研究补肾填精代表方之一的左归丸对仔鼠免疫功能的影响及其作用机制。方法1.理论研究:阐明先天肾虚的病因病机及表现,探讨先天肾虚影响免疫功能的理论机制,探求先天肾虚的治疗方法。2.动物实验:3月龄SPF级SD发情期大鼠60只,雌雄SD大鼠按照2:1的比例每晚合笼制备30只孕鼠,将孕鼠随机分为正常组、模型组、胸腺肽组(0.003g/kg)、左归丸高剂量组(800g/L)和左归丸低剂量组(200g/L),每组6只。正常组不造模给予生理盐水灌胃;模型组造模给予生理盐水灌胃;胸腺肽组造模给予胸腺肽胶囊溶液灌胃;左归丸高剂量组和左归丸低剂量组造模给予左归丸悬浊液灌胃。采用复合应激法刺激孕鼠,直至仔鼠出生。提取新生仔鼠出生当天胸腺和脾脏,计算仔鼠的胸腺指数和脾脏指数,运用流式细胞学技术检测仔鼠胸腺和脾脏内T细胞的分型,运用RT-PCR和Western Blot技术检测Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白在仔鼠胸腺组织内的表达。用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析,结果用均数加减标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。3.细胞实验:培养SD仔鼠胸腺上皮细胞(TECs),通过广谱细胞角蛋白(PCK)免疫荧光染色进行细胞类型的鉴定。CCK-8法测定左归丸含药血清和Wnt4抑制剂(ICG-001)对细胞增值率的影响,Western Blot检测不同ICG-001浓度的抑制效果,两者结合判断左归丸含药血清和ICG-001的最佳实验浓度。将分离培养的TECs分为:对照组、补肾组、Wnt抑制剂对照组、Wnt抑制补肾组。处理24小时后,运用RT-PCR和Western Blot技术检测Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达,运用Elisa技术检测胸腺素β4(TMSβ4)与胸腺素α1(Tα1)的含量。结果1.先天肾虚为母代肾虚影响子代而致,先天肾虚正气衰弱,以虚为主,表现出肾相应生理功能的障碍和人体免疫紊乱。2.先天肾虚存在人体的阴阳、气血津液、五脏功能的失调,进而影响人体的免疫功能。2.动物实验:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺指数和脾脏指数下降(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组仔鼠胸腺指数和脾脏升高(P<0.05)。流式细胞检测显示:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺内SP细胞数上升(P<0.05),模型组仔鼠胸腺内CD4+/CD8+上升(P<0.05),脾脏内CD4+/CD8+下降(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组和左归丸低剂量组胸腺内SP细胞数下降(P<0.05),胸腺内CD4+/CD8+下降(P<0.05),脾脏内CD4+/CD8+上升(P<0.05)。RT-PCR和Western Blot检测显示:与正常组比较,模型组仔鼠胸腺内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达减少(P<0.05);与模型组比较,胸腺肽组、左归丸高剂量组和左归丸低剂量组胸腺内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的表达增加(P<0.05)。3.细胞实验:PCK免疫荧光染色确定纯化的细胞为TECs。CCK-8检测显示:25μM浓度以下的抑制剂ICG-001和10%,20%的左归丸含药血清不影响细胞增值率,Western Blot检测显示:25μM浓度以上的抑制剂ICG-001可以抑制TECs内Wnt4的表达。结合两者选取25μM的ICG-001和20%的左归丸含药血清作为实验的药物浓度。Elisa结果显示:与对照组比较,Wnt抑制剂对照组内TMSβ4和Tα1的含量减少(P<0.05),补肾组内TMSβ4和Tα1的含量增加(P<0.05);Wnt抑制对照组比较,Wnt抑制补肾组内TMSβ4和Tα1的含量增加(P<0.05)。RT-PCR和Western Blot检测结果显示:与对照组比较,Wnt抑制剂对照组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量减少(P<0.05),补肾组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量增加(P<0.05);与抑制剂对照组比较,Wnt抑制剂补肾组内Wnt4、β-catenin、Foxn1基因和蛋白的含量增加(P<0.05)结论1.先天肾虚存在机体的阴阳、气血津液、五脏功能异常,进而影响机体的免疫状态。通过母代补肾填精法预防子代先天肾虚,或是治疗先天肾虚的新方法之一。2.复合应激法能够成功复制先天肾虚模型。3.胸腺内Wnt/β-catenin信号通路表达异常影响T细胞分化发育和迁徙,这可能是先天肾虚仔鼠免疫紊乱的机制之一。4.左归丸能够通过激活胸腺内Wnt/β-catenin信号通路,增加Foxn1的表达,促进TECs分泌胸腺肽,调控T细胞分化发育和迁徙,这可能是补肾填精法改善先天肾虚免疫紊乱状态的作用机制之一。
刘聪[3](2021)在《TCEP对大菱鲆生殖系统和抗氧化系统的影响》文中提出三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)是人工合成的磷酸衍生物,属于有机磷阻燃剂(OPEs),广泛应用于工业生产之中。由于第二类溴代阻燃剂(BFRs)的禁用,包括TCEP在内的OPEs使用量逐渐上升,在环境中的积累量也在逐年升高,且在环境中的分布也十分广泛。在各种水环境中都可以检测到TECP的存在,这对水生生物和海水养殖生物产生了威胁。TCEP作为一种新型内分泌干扰物EDCs,低剂量就会造成很强的生物毒性,影响生物体的生殖、神经、器官发育等。但关于TCEP对鱼类,特别是养殖硬骨鱼的毒理研究还是空白。大菱鲆(Scophthalmus maximus)因其较高经济价值和营养价值,成为我国北方海水养殖中重要的养殖品种。水环境中内分泌干扰物的积累,将会影响大菱鲆的健康,对经济收益带来了严重的威胁。大菱鲆的繁殖过程主要受HPG轴上激素的调节,其中促性腺激素释放激素GnRH、促黄体生成素LH、促卵泡激素FSH以及褪黑素基因KISS是重要的调节基因,促性腺激素鱼黄体生成素LH和鱼促卵泡素FSH以及类固醇类激素雌二醇E2和11-酮基睾酮11kt是重要的调节激素。大菱鲆的肝脏使其主要的抗氧化防御反应产生的器官,其中含有大量与抗氧化防御相关的酶类。超氧化物歧化酶SOD,过氧化氢酶CAT,和谷胱甘肽-S-转移酶GST都是在抗氧化防御中发挥重要作用的酶。本论文以大菱鲆为研究对象,以上述基因和激素作为分子标志物,旨在研究新型污染物TCEP对大菱鲆造成的生物学效应,探究TCEP对大菱鲆生殖系统和机体内抗氧化防御系统的影响。通过qRT-PCR技术测定了在急性胁迫条件下,大菱鲆幼鱼体内生殖相关基因表达的变化。TCEP胁迫有促进GnRH、LH、FSH和KISS类基因表达的作用,在12 h之内表达量会大幅上升,体现了 TCEP的内分泌干扰特性;但TCEP胁迫超过12h后,基因的表达量会有所下降,说明在处于过量TCEP胁迫的情况下,大菱鲆的生殖基因表达会受到限制。大菱鲆的正常生殖系统会被破坏,生殖基因的过量表达会使幼鱼性早熟,无法正常生长,造成工厂养殖大菱鲆的减产。在成年大菱鲆体内通过Elisa试剂盒测定发现,低剂量TCEP的持续胁迫,会使大菱鲆体内促性激素LH和FSH以及类固醇类性激素E2和11kt含量逐渐下降,说明TCEP会影响大菱鲆生殖系统中的激素调节,这将影响生殖细胞的正常成熟,造成工厂养殖大菱鲆无法顺利繁衍子二代。同时通过qRT-PCR技术对比大菱鲆幼鱼中肝脏和肌肉中SOD、CAT和GST酶基因的表达量变化表明,TCEP的急性胁迫会使大菱鲆肝脏中抗氧化相关酶在24h之内急剧上升,增加氧化应激反应,对大菱鲆的抗氧化系统造成干扰,造成抗氧化系统的紊乱,使工厂养殖大菱鲆更容易受到病害问题侵扰。本研究为全面评估TCEP造成的毒理效应提供依据,GnRH等基因和LH、FSH等激素可以分别在基因和蛋白层面,作为分子标志物评估TCEP对大菱鲆的影响。本研究也为合理控制有机磷阻燃剂OPEs类物质的使用量和排放量、以及养殖环境监测提供了参考。对揭示新型内分泌干扰物的危害和对促进大菱鲆海水健康养殖具有重要意义。
钱梦[4](2021)在《补中益气汤(方)与脾虚肌无力(证)方证关联的生物学基础》文中认为研究背景:中医证候具有跨系统的病理生理学内涵,中医复方成分复杂且具有多系统、多靶点的作用特点,这使得单一角度研究证候或方药具有很大的不确定性。而辨证论治中的“方-证相关”的经验及原理则要求在研究方药或证候时有必要将二个方面结合起来。目前,探查方证关联的现代生物学基础正在成为方证相关领域的重要研究热点。“脾主肌肉”是中医脾脏的重要生理属性之一,补中益气汤是健脾益气的代表方之一,临床和实验研究显示该方用于脾虚肌无力显示一定的健脾强肌效用,但目前有关脾主肌肉的现代病理生理学内涵和补中益气汤作用的分子机制尚不清楚。因此探查补中益气汤(方)与脾虚肌肉无力(证)关联的生物学基础对于揭示脾主肌肉的现代内涵和补中益气汤的分子机制具有重要的科学意义。肌肉减少症临床表现以肌肉无力或/和萎缩为特征,与中医脾虚肌肉无力证甚为接近。研究表明,蛋白质代谢失衡是肌肉减少症的重要的病理生理学基础,涉及系统-器官-细胞分子不同层面的调控失常。本学科前期的研究显示,饮食不节+游泳力竭法复制的脾虚证大鼠模型涉及多系统的异常变化并伴有骨骼肌肌力下降及病理损伤,涉及能量代谢障碍、神经-肌肉接头功能异常及炎性损伤等机制。健脾类方的比较研究显示,补中益气汤对该模型肌肉损伤有更好的改善作用,并涉及对其多个病理生理学环节的调节。基于上述背景,我们推测中医脾虚肌无力证是之前探查到的炎性激活、能量代谢异常、内分泌失调等多个环节共同参与导致肌肉蛋白质代谢失调为特点的一种病证,并有其独特分子调控机制。研究目的:应用“饮食失节+过度疲劳”法建立并评价脾虚肌无力证小鼠模型,在此基础上观察补中益气汤对该模型的健脾强肌效用,并以肌肉蛋白质代谢失衡为切入,在整体、器官及分子不同维度上,探查脾虚肌无力证模型的病理生理变化特点与补中益气汤的作用靶标及二者关联的生物学基础。研究一脾虚肌无力模型小鼠的建立与评价方法:昆明小鼠随机分为正常组与模型组(每组各30只),模型组采用“饮食不节+过度疲劳”法建立脾虚证肌无力小鼠模型,正常组正常饲养。各组小鼠:(1)每周观测并记录各组小鼠的外观行为评分、体重及饮食量;(2)实验第2、4周末进行负重游泳力竭实验,测定小鼠负重游泳力竭时间;(3)实验第1、2、3、4周末使用抓握力仪测定小鼠抓握力;(4)第15 d和29 d分两批次,酶联免疫(ELISA)法测定小鼠血清D-木糖、胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、血管活性肠肽(VIP)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α);称量法测定计算胸腺与脾脏指数、肌湿重与肌重/体重比;制作腓肠肌HE切片,观察病理改变,利用Image J软件计算肌纤维直径与横截面面积。结果:与正常组比较,模型组小鼠:(1)实验第2-4周活动状态、皮肤毛发、大便状态积分均明显增高(P<0.01);第1-4周体重明显降低(P<0.01);第1周饮食量明显增加(P<0.01),第3-4周饮食量明显降低(P<0.01);(2)第2-4周游泳力竭时间明显缩短(P<0.01或P<0.05);(3)第1-4周抓握力呈递进性明显降低(P<0.01);(4)第2-4周血清D-木糖、GAS、MTL含量明显降低,VIP明显增加(P<0.01或P<0.05);胸腺与脾脏指数明显降低,血清IL-1β、TNF-α含量明显降低(P<0.01 或P<0.05),IL-6 明显升高(P<0.01 或P<0.05);腓肠肌湿重和湿重/体重比明显降低(P<0.05),光镜下的腓肠肌纤维排列松散,边缘变钝,肌纤维间隙与肌束间隙明显变宽,肌纤维直径与横截面面积明显减少(P<0.01 或 P<0.05)。结论:“饮食失节+疲劳过度”法建立的模型小鼠在呈现中医脾虚证候相关的外观行为和实验室指标改变的同时,伴有骨骼肌肌力的下降与肌纤维的萎缩,表明“饮食失节+疲劳过度”法可成功建立小鼠脾虚肌无力证模型。研究二脾虚肌无力小鼠肌肉蛋白质失衡的分子机制及补中益气汤的干预作用方法:昆明小鼠随机分为正常组、模型组、补中益气汤高剂量组与低剂量组(每组各15只)。除正常组外,其余各组小鼠均采用“饮食不节+过度疲劳”法建立脾虚证肌无力模型,连续4周;其中中药高、低剂量组自第15d开始分别按3.8 g/kg·d和1.9g/kg-d灌服补中益气汤(颗粒溶液)。各组小鼠按研究一时间与方法观测:(1)观测不同时间点的外观行为积分、体重、饮食量、游泳力竭时间与抓握力;(2)实验第29 d的血清D-木糖、GAS、MTL、VIP、IL-1β、IL-6、TNF-α,促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)、生长激素(GH)、睾酮(T),下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)与促性腺激素释放激素(GnRH);胸腺与脾脏指数及肌湿重与肌重/体重比,腓肠肌的病理改变和肌纤维直径与横截面面积;ELISA法测定腓肠肌糖皮质激素受体α(GRα)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、胰岛素(INS)、胰岛素受体(INSR)、GH、T、IL-1β、IL-6、TNF-α、肌肉抑制素(myostatin)、激活素受体ⅡB(ACTR2B);Western Blot法检测腓肠肌磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)、磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶(p-akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化核糖体蛋白S6激酶(p-s6k1)、磷酸化真核翻译起始因子4B(p-eIF4B)、胰岛素受体低物1(IRS1)、磷酸化苏氨酸激酶3(p-Smad3)、磷酸化叉头蛋白O3A(p-Foxo3a)蛋白的相对表达量;免疫组化法检测肌萎缩蛋白1(Atrogin-1)和肌肉特异性环指蛋白1(MuRF-1)的阳性表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠:(1)实验第1-4周活动状态积分明显增高(P<0.05),第2-4周皮肤毛发和大便状态积分明显增高(P<0.01);第1周饮食量明显增加(P<0.01),第3-4周饮食量明显降低(P<0.01);第1-4周体重明显降低(P<0.01),游泳力竭时间明显缩短(P<0.05)。(2)血清D-木糖含量、GAS、MTL含量明显降低,VIP明显增加(P<0.01或P<0.05);胸腺与脾脏指数均明显降低(P<0.01);腓肠肌湿重和肌重/体重比均明显降低(P<0.01或P<0.05),镜下腓肠肌纤维排列松散,边缘变钝,肌纤维间隙与肌束间隙明显变宽;肌纤维直径与横截面面积均明显减少(P<0.01);第2和第4周抓握力明显下降(P<0.01);腓肠肌总蛋白明显降低(P<0.05),INS、INSR、IGF-1和IGF-1R 含量明显减少(P<0.01),pi3k、p-akt、mTOR、p-s6k1 以及 p-eIF4B 的表达量降低(P<0.05),Myostatin、ACTR2B 含量和 Atrogin-1、MuRF-1、p-Smad3、p-Foxo3a表达量均明显增加(P<0.01或P<0.05);下丘脑CRH/GnRH明显增加/降低(P<0.01 或P<0.05),血清 ACTH、CORT、IL-6 明显升高,GH、T、IL-1β、TNF-α 明显降低(P<0.01 或P<0.05),腓肠肌 GR-α、IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高(P<0.01或P<0.05),GH和T明显降低(P<0.01或P<0.05)。与模型组比较,中药高、低剂量组小鼠:(1)实验第3-4周活动状态、皮肤毛发、大便状态积分均明显降低(P<0.01或P<0.05),体重明显增加(P<0.01);第4周饮食量明显增加(P<0.01),游泳力竭时间明显延长(P<0.05)。(2)第4周,高剂量组D-木糖含量明显增加、VIP含量明显降低(P<0.01或P<0.05),高、低剂量组的血清GAS、MTL含量均明显增加(P<0.01或P<0.05);胸腺与脾脏指数均明显升高(P<0.01或P<0.05);二个剂量组的抓握力呈不同程度地增加(P<0.01);高剂量组肌纤维形态与正常组接近,肌纤维直径与横截面面积均明显增加(P<0.01或P<0.05);高、低剂量组腓肠肌总蛋白均明显增高(P<0.05),腓肠肌内 INS、INSR、IGF-1 和 IGF-1R含量明显增加(P<0.01 或P<0.05),pi3k、p-akt与mTOR蛋白表达量均明显升高(P<0.01或P<0.05),Myostatin和ACTR2B含量、Atrogin-1和MuRF-1表达量明显降低(P<0.01或P<0.05),高剂量组p-s6k1蛋白表达量明显升高(P<0.05);高、低剂量组下丘脑CRH与血清ACTH、CORT、IL-6和腓肠肌内GR-α、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明显降低(P<0.01或P<0.05),下丘脑GnRH、血清T、L-1β、TNF-α和腓肠肌GH、T均明显升高(P<0.01或P<0.05),高剂量组血清GH明显升高(P<0.05)。结论:脾虚肌无力小鼠的肌肉萎缩机制涉及整体、器官组织与分子不同层面。整体水平上,HPA轴功能的过度激活促进了蛋白质的降解,而内分泌系统相关激素的分泌减少又不利于蛋白质的合成;器官组织层面上,肌肉组织内炎性因子的高表达进一步促进了蛋白质降解;分子层面上,肌肉蛋白质代谢失衡则涉及mTOR/INS与UPS/myostatin信号通路之间的平衡失调。补中益气汤对脾虚肌无力模型小鼠具有明显的健脾强肌效用,其作用机制涉及对神经-内分泌-免疫多系统、肌肉蛋白质的合成与分解平衡及mTOR/INS与UPS/myostatin信号通路的调节。上述研究结果,为补中益气汤益气健脾强肌作用的临床运用提供了一定的药理学依据,对于揭示中医脾主肌肉的现代内涵、补益气汤健脾强肌作用的分子机制及补中益气汤-脾虚肌肉无力证关联的生物学基础具有重要意义。
陈思[5](2021)在《补肾活血汤改善早发性卵巢功能不全的临床研究和调节模型小鼠Keap1/Nrf2/ARE信号通路的机制研究》文中指出背景:近年来早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)发病率呈年轻化而且不断上升的趋势,严重影响女性生殖健康。POI发病原因复杂,病机不明,早期诊断不健全,治疗效果不确切,因此如何探明POI的病因和机制、寻找早期诊断标准和探索有效治疗方法仍然是当前医学领域面临的重难点问题。中医中药治疗具有多成分,多途径,多靶点的整体调节功能。针对肾虚血瘀型POI,补肾活血法是妇科治疗本病的常用方法。本课题以中西医相关理论、临床疗效观察和实验研究结果等为依据,阐释补肾活血汤防治POI的临床证治效果和分子学机制,为中医药有效治疗POI提供科学依据。目的:通过临床研究评价补肾活血汤对肾虚血瘀型POI的防治作用,并通过实验研究从Keap1/Nrf2/ARE信号通路角度探讨补肾活血汤治疗POI的机制。方法:1.临床研究:将60例POI患者随机分为补肾活血汤组20例(予补肾活血汤口服治疗)、芬吗通组20例(予芬吗通1/10 口服治疗)和补肾活血汤联合芬吗通治疗组20例(予补肾活血汤和芬吗通1/10联合口服治疗),所有患者分别给予相应药物治疗3个月经周期,比较三组POI患者治疗前后中医症候积分和Kupperman评分的改善情况,血清雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)水平变化,血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的改变,B超卵巢体积(OV)、窦卵泡数(AFC)、卵巢基质血流阻力指数(RI)的变化。2.实验研究:2.1采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析补肾活血汤水提物的化学成分。2.2筛选动情周期正常的C57BL/6J雌鼠20只,随机分为空白对照组5只、模型组5只、阳性药补佳乐对照组5只、补肾活血汤组5只。除空白对照组5只外,其余15只小鼠均予皮下注射ZP3多肽,1周后加强造模,建立自身免疫性POI动物模型。加强造模1周后,空白对照组和模型组每天灌胃生理盐水0.2mL,补佳乐组小鼠按0.13 mg/kg给予补佳乐溶液0.2 mL,补肾活血汤组小鼠按12.64 g/kg给补肾活血汤0.2 mL,持续28天。给药结束前10天取阴道脱落细胞巴氏染色观察小鼠动情周期变化。给药结束次日收集标本,计算脾脏、卵巢、子宫和胸腺的脏器指数,ELISA法检测血清抗ZP抗体(AzpAb)水平,性激素抗苗勒管激素(AMH)、E2、FSH和黄体生成素(LH)水平及SOD、MDA的变化;卵巢组织H&E染色、免疫组化染色和ZP抗体免疫荧光染色,光学显微镜观察卵巢组织形态变化、Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的表达及ZP蛋白表达情况,Q-PCR检测卵巢中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 mRNA 水平变化。结果:1.临床研究所有入组患者的平均年龄为34.65±3.78岁,36-40岁患者占50%。POI患者合并免疫性疾病4例、心理应激9例,环境应激4例、手术6例、感染2例、有家族史1例。经治疗3个周期后,补肾活血汤组在综合疗效(88%)、中医症候疗效(82%)、Kupperman评分(30.07±3.74)与芬吗通组(78%、72%、31.61±3.18)和补肾活血汤联合芬吗通组(94%、88%、28.94±3.83)相当。在改善临床症状上,中药治疗后潮热汗出、失眠、疲倦乏力的症状明显改善(P<0.05),芬吗通治疗后肌肉痛的症状有所改善(P<0.05),补肾活血汤联合芬吗通治疗后潮热汗出、失眠、头晕、疲倦乏力、关节痛的症状改善明显(P<0.05)。三组在下调FSH水平方面差异均有显着性(P<0.05),而三组治疗前后E2和OV和AFC均无明显变化(P>0.05)。补肾活血汤组治疗前后RI值下降明显(P<0.05),余两组RI均无明显差异。治疗后补肾活血汤组和芬吗通组SOD上升(均P<0.05)。补肾活血汤组MDA下降明显(P<0.05),而芬吗通组和补肾活血汤联合芬吗通组均无此变化。临床研究期间三组患者均无不良反应。2实验研究2.1 BSHXT水提物中鉴别并定量分析了 21种中药单体化合物。2.2与空白组相比,模型组小鼠体重明显下降(P<0.01);与模型组相比,补肾活血汤组小鼠体重显着上升(P<0.05)。空白组小鼠动情周期紊乱率0%,模型组小鼠动情周期紊乱率100%,补佳乐组小鼠动情周期紊乱率60%,补肾活血汤组小鼠动情周期紊乱率80%。给药28天后收取标本并进行相关指标测定。与空白组相比,模型组小鼠卵巢指数下降明显(P<0.05);与模型组比较,补佳乐组和补肾活血汤组卵巢指数均上升明显(P<0.01、P<0.05)。与空白对照组相比,模型组小鼠卵巢指数、子宫指数和胸腺指数下降(P<0.01),脾脏指数上升(P<0.01);与模型组相比,补佳乐组和补肾活血汤组卵巢指数上升(P<0.01、P<0.05),且补肾活血汤组脾脏指数下降(P<0.05)。卵巢组织H&E染色和ZP免疫荧光染色表明,补肾活血汤能够明显减少小鼠卵巢中炎症细胞浸润和透明带的形成,且增加始基卵泡和次级卵泡数目、减少闭锁卵泡数目,而补佳乐无此作用。ELISA法检测小鼠血清中性激素(E2、FSH、LH、AMH)、AzpAb和SOD、MDA含量发现,与空白组相比,模型组小鼠性激素呈低雌高促水平,且AMH水平下降明显,而补佳乐和补肾活血汤均能不同程度逆转异常性激素状态;模型组血清AzpAb水平明显升高,补肾活血汤组下调AzpAb水平(P<0.01)优于Positive组(P<0.05);模型组SOD明显下降、MDA水平明显上升,药物治疗后,补佳乐组和补肾活血汤组SOD、MDA水平均有改善。免疫组化和Q-PCR结果提示,与空白组相比,模型组Nrf2、Keap1、NQO1的表达及其mRNA水平明显下降,虽HO-1表达无明显变化,但其mRNA水平下降明显(P<0.05)。与模型组比较,补肾活血汤组Nrf2及其mRNA表达均增强,补佳乐组只能部分增强Keap1、NQO1 mRNA水平。结论:1.补肾活血汤可明显改善中医症候积分、临床症状积分、性激素水平,在改善卵巢RI和氧化应激状态方面优于芬吗通1/10和补肾活血汤联合芬吗通1/10治疗。2.补肾活血汤水提液中鉴别并定量分析了 21种中药单体化合物。3.ZP3成功诱导的POI免疫性模型小鼠卵巢发生炎症且功能下降,补肾活血汤不仅能减少小鼠卵巢中炎症细胞浸润和透明带的形成,逆转异常性激素状态,还能下调血清AzpAb,并激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路及下游抗氧化酶SOD、HO-1和NQO1活性。因此补肾活血汤可能通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路改善模型小鼠卵巢功能、减少氧化应激状态并调节机体免疫。
陈燕霞[6](2020)在《补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究》文中指出研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%~20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下(Diminished Ovarian Reserve,DOR)是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1~6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素(FSH、LH、E2)含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素(AMH、INHB、FSH、LH、E2)水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数(P<0.05),下调血清FSH、LH水平(P<0.01),并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01),减少闭锁卵泡计数(P<0.01)。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高(P<0.01),血清AMH和INHB水平上升(P<0.01),FSH、FSH/LH值下降(P<0.01,P<0.05);补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01,P<0.05,P<0.01),减少次级卵泡和闭锁卵泡数目(P<0.01),同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值(P<0.01)。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值(P<0.01),同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平(P<0.01),并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比(P<0.01)。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平(P<0.05),增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值(P<0.05,P<0.01),同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值(P<0.01)。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量(P<0.05,P<0.01),增加CAT、GSH-Px和SOD活力(P<0.01)。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平(P<0.05),同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率(P<0.01)。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高(P<0.01),但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。
李帅[7](2020)在《中医肾藏藏调节之精的生物学基础研究》文中研究表明研究背景:关于精,中医学有禀承父母的先天之精、出生后获得的后天之精、主持生育的生殖之精、脾胃化生的水谷之精、脏腑所藏的脏腑之精等多种类型,但肾所藏的精显然还对肾藏的生殖、生长发育、气化和主水等功能具有调节作用,关于精的来源、分布、性状、功能、与气血津液之间的关系等,古代文献和《中医基础理论》教材都做了详细描述,但就是没有给出精的物质实体,本文详细地分析了中医学的传统认识,并与西医学的研究成果进行对比,提出了调节之精概念,并给出了调节之精的生物学基础。研究目的:基于中医学关于肾藏和精的传统认识,提出调节之精的概念及功能,采用中西医学对照的方法,获得调节之精的生物学基础。研究方法:从《素问》、《灵枢》等中医经典着作中获得有关肾藏和精的描述。从新世纪(第二版)全国高等中医药院校规划教材《中医基础理论》中获得精的定义和特征属性、肾藏的生理功能。提出调节之精的概念,并就其功能从古籍文献描述和中医临床用药进行了论证。基于中、西医学研究对象(都是研究人体)和研究目的(为了维护人的健康和对人体功能的完备认识)的一致性,选取全国中医药行业高等教育十二五规划教材第九版《生理学》和十二五普通高等教育本科规划教材《生理学》第八版和十一五普通高等教育本科规划教材《医学免疫学》第二版作为主要研究资料,查阅与人体调节功能有关的西医学认识,发现调节之精与激素、细胞因子具有高度一致性,从而给出调节之精的生物学基础是激素和细胞因子。创新点:提出调节之精概念,调节之精的生物学基础是激素和细胞因子,调节之精具有调节生长发育、生殖、泌尿、气化、造血和免疫的功能。
王康[8](2020)在《小尾寒羊产后不同时期PRL分泌及其在不同组织中mRNA表达规律研究》文中进行了进一步梳理本论文研究了小尾寒羊产后催乳素(Prolactin,PRL)的分泌和在不同组织中的表达规律,并分析乳腺组织中PRL相关基因的表达,以期进一步揭示PRL的功能,为阐明PRL与母羊繁殖性能的关系奠定理论基础。试验选择38~42月龄、体重74.5±5.2 kg、体质健康、体况良好的经产产羔小尾寒羊30只,母羊产羔当天为试验开始第0d,在母羊产后7 d、30 d、55 d和70 d随机选取10只早上8:00空腹采血,采用ELISA方法测定血清中PRL的浓度。从被采血的10只母羊中随机选取5只进行屠宰,屠宰后迅速采集垂体、下丘脑、乳腺、卵巢、子宫、淋巴和肾组织,检测小尾寒羊产后不同时期各组织PRL mRNA表达量及乳腺中JAK2、STAT5A、CSN2 mRNA和p-STAT5A蛋白表达量。试验结果表明:①产后70d内,试验羊血清中PRL的浓度变化范围为(158.77±19.37)~(343.33±27.69)mIU/L,平均为(245.16±72.38)mIU/L。小尾寒羊产后第7 d-70 d PRL的分泌呈极显着下降(P<0.01),产后7 d浓度最高(343.33±27.69)mIU/L,产后第 70 d 达到最低值(158.77±19.37)mIU/L。②小尾寒羊产后7 d,PRL在不同组织的mRNA表达量由高到底为垂体>下丘脑>卵巢>乳腺>子宫>淋巴>肾;产后30d为垂体>下丘脑>乳腺>卵巢>子宫>淋巴>肾;产后55 d为垂体>下丘脑>乳腺>肾>子宫>淋巴>卵巢;产后70d为垂体>下丘脑>淋巴>肾>乳腺>卵巢>子宫。产后4个时期垂体和下丘脑中PRL表达水平均极显着高于肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺(P<0.01),垂体组织中PRL表达量均极显着高于下丘脑(P<0.01),而肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺组织中的PRL表达量差异均不显着(P>0.05)。③在垂体和下丘脑中PRL均在产后7 d表达水平最高,极显着高于产后30 d、55 d和70 d(P<0.01),之后呈下降趋势,产后70 d表达水平最低,极显着低于产后7 d、30 d和55 d(P<0.01)。在乳腺中PRL在产后30d表达水平最高,显着高于产后55 d和70 d(P<0.05),与产后7d差异不显着(F>0.05);产后70 d表达水平最低,显着低于产后7d和30 d(P<0.05),与产后55 d差异不显着(P>0.05)。在卵巢中PRL在产后7d表达水平最高,显着高于30d、55d和70 d(P<0.05),之后呈下降趋势;产后70d表达水平最低,显着低于产后7d和30d(P<0.05),与产后55 d差异不显着(P>0.05)。小尾寒羊产后各时期PRL在子宫、淋巴和肾中表达差异不显着(P>0.05)。④小尾寒羊产后7 d乳腺中JAK2表达量最高,但与30 d、55 d和70 d无差异(P>0.05)。产后7 d乳腺中STAT5A表达量最高,极显着高于30d、55 d和70 d(P<0.01),而30d、55d和70d差异不显着(P>0.05)。产后7d乳腺中CSN2表达量最高,显着高于30d和55(P<0.05),而30d和55d差异不显着(P>0.05),产后70 d乳腺中无CSN2表达。⑤小尾寒羊产后乳腺中p-STAT5A蛋白相对表达水平逐渐降低,产后7 d和产后30 d p-STAT5A蛋白表达水平显着高于产后70d(P<0.05),产后7d、30d和55 d差异不显着(P>0.05)。综上所述,小尾寒羊产后第7 d-70 d PRL分泌量逐渐下降;PRL mRNA在不同组织中表达量不同,不同组织中PRL mRNA表达量在泌乳前期较高,以后逐渐下降;乳腺中JAK2、STAT5A及CSN2在泌乳初期mRNA表达量最高,以后显着下降。
马丹凤[9](2020)在《促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究》文中研究表明目的促孕安怡方是黎烈荣教授在更年安怡方的基础上,针对高龄女性生育力下降化裁而成,在前期临床观察研究已取得较好的疗效的基础上,我们以自然衰老的雌性大鼠(10-12月龄)为初老模型,观察促孕安怡方对初老模型大鼠卵巢储备功能和子宫内膜容受性的影响,并对其机理作初步研究,为促孕安怡方在生育力下降的高龄女性中的临床应用提供实验数据及坚实的理论依据。方法选取自然衰老的10-12月龄的大鼠为研究对象进行造模。将造模成功的大鼠随机分为二组,分别为:初老模型组和初老药物组,另外一组为正常对照组(4-6月龄大鼠)。每组的给药方式如下所示:A组(正常对照组):灌服等体积纯化水12.73ml/kg,每日1次,连续15日;B组(初老模型组):灌服等体积纯化水10.82ml/kg,每日1次,连续15日;C组(初老药物组):灌服促孕安怡方,剂量10.82ml/kg,每日1次,连续共15日;实验包括四个部分。第一部分实验为:初老大鼠模型的建立与评价。通过15天对自然衰老雌性大鼠(10-12月龄)进行阴道脱落细胞涂片观察,选取阴道脱落细胞涂片表现为动情间期延长或动情周期紊乱者作为初老雌性大鼠模型。第二部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响。各组大鼠分别于给药15日后,麻醉,开腹,腹主动脉取血。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清抗苗勒氏管激素(AMH)、抑制素B(INH-B)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平。第三部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢干细胞因子(SCF)和生长分化因子9(GDF-9)表达的影响。将实验二取血后的大鼠,剖取卵巢组织,称重并计算脏器指数;苏木素-伊红(HE)病理切片,在显微镜下观察卵巢结构,各期卵泡及黄体数目;蛋白质印迹法(Western Blot)检测卵巢干细胞因子(SCF)和生长分化因子9(GDF-9)的蛋白定量表达水平。第四部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及对白血病抑制因子(LIF)、HOXA-10mRNA表达的影响。将实验二取血后的大鼠,剖取子宫组织,称重并计算脏器指数;苏木素-伊红(HE)病理切片,在显微镜下观察子宫内膜厚度,腺体数量和结构;制备透射电镜切片,观察胞饮突;免疫组化HRP法测定子宫内膜LIF的表达;实时荧光定量PCR法测HOXA-1OmRNA含量。酶联免疫吸附法(ELISA),它以免疫学反应为基础,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。然后洗涤除去多余的游离反应物,通过显色,用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值),绘制出标准曲线,同时计算出待测定物的浓度。ELISA分为多种方法,本文用双抗夹心法检测大鼠血清AMH、INH-B、FSH和LH,用竞争法检测E2。用苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和免疫组织化学染色法处理标本组织石蜡切片后,在显微镜下观察并记录图像。本文,此法主要用于观察卵巢和子宫内膜的细胞形态及卵巢LIF蛋白的表达。蛋白质印迹法(Western Blot)是把蛋白转移到膜上,再用抗体进行检测的方法。本文主要用此法检测卵巢干细胞因子(SCF)和生长分化因子9(GDF-9)的蛋白定量表达水平。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是指一种在DNA扩增反应中,于聚合酶链式反应(PCR)体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测PCR全程,然后用标准曲线对未知模板采取定量分析的方法。本文主要用此法检测子宫内膜HOXA-1OmRNA含量。所有实验的数据结果采用SPSS19.0软件包进行分析,数据资料以(?)形式表示,组间差异性分析采用单因素方差分析方法(One-Way ANOVA)并进行多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.初老雌性大鼠模型的建立与评价4-6月龄雌性大鼠的阴道脱落细胞涂片均观察到周期出现的规律动情周期。10-12月龄雌性大鼠做阴道脱落细胞涂片观察,可以观察到动情间期延长或动情周期紊乱,但极少数有个体差异性。2.促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠血清抗苗勒氏管激素(AMH)、抑制素B(INH-B)和雌二醇(E2)水平,降低促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢干细胞因子(SCF)和生长分化因子9(GDF-9)表达的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠的卵巢脏器指数和干细胞因子(SCF)及生长分化因子9(GDF-9)的表达,改善卵巢显微结构。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及白血病抑制因子(LIF)、HOXA-10mRNA表达的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠的子宫脏器指数和白血病抑制因子(LIF)及HOXA-10mRNA的表达,改善子宫内膜显微结构并增加胞饮突数量。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在本实验中,我们发现促孕安怡方能够调控初老模型大鼠血清抗苗勒氏管激素(AMH)、抑制素B(INH-B)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的水平;上调卵巢干细胞因子(SCF)和生长分化因子9(GDF-9)的表达;增强子宫内膜白血病抑制因子(LIF)和HOXA-10mRNA的表达;改善卵巢和子宫显微结构;从而改善初老模型大鼠的卵巢储备功能和子宫内膜容受性,增强初老雌性大鼠的生育力。
岳阿兰[10](2020)在《从调控HPO轴探讨“阴三针”治疗卵巢早衰小鼠的作用机制》文中研究表明目的:1.观察“阴三针”对雷公藤多苷片诱导的小鼠卵巢早衰模型的卵巢功能及下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)轴的调控作用;2.探讨HPO轴在卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)发病中的作用机制及“阴三针”对POF模型小鼠HPO轴的调控作用,并揭示β-EP及HPO轴在POF发病和治疗中的作用,为电针改善POF提供理论依据。方法:将8周龄C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、模型组(雷公藤多苷片造模组)、电针组(“阴三针”治疗组)、药物组(坤泰胶囊治疗组)、假电针组,共5组,每组10只。以小鼠一般生理情况、阴道脱落细胞、脏器指数、血清相关性激素水平、卵巢组织形态、卵巢中TNF-α、Caspase-3蛋白表达为观测指标,观察“阴三针”对卵巢早衰的治疗和改善作用。结果:1.生理病理特征:造模前各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05),造模后各组小鼠体重与空白对照组相比,差异皆有统计学意义(P<0.05)。与模型组小鼠对比,电针组治疗前后体重差值增长较明显(P<0.05)。2.动情周期:空白对照组动情周期为4~5天,模型组动情周期延长为7~9天,电针组动情周期为4~5天,药物组动情周期为4~6天,假电针组动情周期为6~8天。3.脏器指数:与空白对照组相比,模型组小鼠脏器指数(卵巢、子宫、脾脏)均下降(P<0.05)。与模型组相比,电针组和药物组的小鼠卵巢、子宫指数均增加(P<0.05)。4.各组小鼠血清中相关性激素和下丘脑中β-EP水平的比较:与空白对照组相比,模型组血清FSH、LH水平显着上升(P<0.05);电针组小鼠血清中LH水平较模型组下降(P<0.05)。造模后小鼠血清中E2水平和下丘脑β-EP水平较空白对照组明显下降(P<0.05),经不同干预措施后,电针组小鼠血清E2和下丘脑β-EP水平提高显着(P<0.05)。5.各组小鼠卵巢形态学改变及各级卵泡所占百分比:空白对照组小鼠卵巢各级卵泡发育正常。模型组小鼠卵巢明显萎缩,颗粒细胞排列紊乱。电针组小鼠卵泡较模型组相比,卵巢体积明显增大,空泡样卵泡减少或消失。与空白对照组相比,模型组、假电针组小鼠生长卵泡所占百分比小,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,电针组小鼠生长卵泡所占百分比明显增大(P<0.05)。模型组和假电针组的闭锁卵泡所占百分比较空白对照组大(P<0.05),电针组闭锁卵泡所占百分比明显减少(P<0.05)。模型组、药物组、假电针组黄体所占百分比与空白对照组相比明显较小(P<0.05),而电针组在治疗后黄体所占百分比增加(P<0.05)。6.Western blot法检测小鼠卵巢中TNF-α、Caspase-3蛋白的变化:模型组小鼠卵巢中TNF-α蛋白的表达显着高于空白对照组(P<0.05)。电针组、药物组和假电针组TNF-α蛋白的表达显着低于模型组(P<0.05)。各组小鼠卵巢中Caspase-3蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05),但模型组小鼠卵巢中Caspase-3蛋白的表达有明显高于空白对照组的趋势,电针组小鼠卵巢中Caspase-3蛋白的表达较模型组相比,有明显下降的趋势。结论:1.“阴三针”能够改善POF模型小鼠的一般生理病理情况,恢复动情周期,提高小鼠卵巢和子宫指数,调节性激素水平,改善卵巢组织形态、抑制TNF-α细胞因子,下调Caspase-3的表达。2.“阴三针”的治疗作用主要是通过HPO轴正负反馈调节起作用。3.本实验结果表明,“阴三针”通过调控HPO轴,延缓HPO轴功能衰老,促进体内环境相对平衡,从整体上改善卵巢早衰。
二、大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达(论文提纲范文)
(1)褪黑素介导生物钟基因调控鹅产蛋节律行为(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
符号说明 |
第1章 文献综述 |
1 褪黑素的生理功能 |
1.1 褪黑素的生物合成及分泌调控 |
1.2 褪黑素调节生物钟的功能 |
2 褪黑素的受体 |
3 生物钟的构成与运行 |
3.1 禽类节律钟核心生物钟与外周生物钟的分布 |
3.2 时钟基因是组成生物钟最基本的要素 |
3.3 时钟基因的表达模式与生物钟运行的标准 |
4 生物钟在雌禽排卵-产蛋过程中的调控作用 |
4.1 松果体通过褪黑素分泌调控雌禽排卵-产蛋 |
4.2 生物钟通过HPG轴影响排卵 |
5 卵巢颗粒细胞的增殖和生物钟节律 |
5.1 卵巢卵泡的发育会影响家禽的繁殖性能和产蛋行为 |
5.2 卵巢颗粒细胞的生物钟节律 |
6 研究目的与意义 |
第2章 褪黑素分泌及时钟基因表达与鹅产蛋行为的关系 |
1 材料与方法 |
1.1 试验动物 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要试剂 |
1.4 样品采集 |
1.4.1 血液采取 |
1.4.2 组织样品获取 |
1.5 试验方法 |
1.5.1 鹅的产蛋节律的观察 |
1.5.2 鹅的褪黑素分泌规律检测 |
1.5.3 褪黑素受体在松果体和松果体外组织中表达的检测 |
1.5.4 时钟基因在松果体及松果体外组织中表达的检测 |
1.6 数据分析 |
2 结果与分析 |
2.1 鹅的产蛋节律的观察 |
2.2 鹅的褪黑素分泌规律 |
2.3 褪黑素受体在松果体和松果体外组织中表达 |
2.3.1 褪黑素受体亚型在松果体和松果体外组织中表达 |
2.3.2 褪黑素受体蛋白在松果体和松果体外组织中表达 |
2.4 时钟基因在扬州鹅松果体组织中表达 |
2.5 时钟基因在扬州鹅松果体外组织中表达 |
2.5.1 时钟基因在下丘脑中表达的节律性 |
2.5.2 时钟基因在垂体中表达的节律性 |
2.5.3 时钟基因在卵巢中表达的节律性 |
3 讨论 |
4 小结 |
第3章 褪黑素调控鹅卵巢颗粒细胞增殖和生物钟节律机制 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要仪器 |
1.3 主要试剂 |
1.4 试验方法 |
1.4.1 卵巢颗粒细胞的分离 |
1.4.2 细胞传代的步骤 |
1.4.3 台盼蓝细胞计数法 |
1.4.4 褪黑素处理细胞卵巢颗粒细胞 |
1.4.5 CCK8测定细胞活力 |
1.4.6 RT-qPCR检测 |
1.4.7 转录组测序 |
1.4.8 颗粒细胞体外过表达CNGB1试验 |
2 结果与分析 |
2.1 褪黑素调控卵巢颗粒细胞增殖作用 |
2.2 褪黑素对卵巢颗粒细胞增殖基因的节律性调控 |
2.2.1 褪黑素对卵巢颗粒细胞时钟基因的节律性调控 |
2.2.2 褪黑素对卵巢颗粒细胞增殖基因的节律性调控 |
2.3 褪黑素通过CNGB1调控生物钟节律和颗粒细胞增殖机制 |
2.3.1 RNA质量检测 |
2.3.2 测序数据统计 |
2.3.3 RT-qPCR结果验证 |
2.3.4 KEGG pathway分析 |
2.3.5 褪黑素通过CNGB1调控生物钟节律和颗粒细胞增殖 |
3 讨论 |
4 小结 |
全文结论 |
参考文献 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
(2)基于Wnt/β-catenin通路探讨左归丸对先天肾虚仔鼠免疫功能的影响及其机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一部分 理论研究 |
1.先天肾虚的理论研究 |
1.1 先天肾虚的病因病机 |
1.2 先天肾虚的表现 |
2.先天肾虚与免疫的相关研究 |
2.1 免疫的中医相关研究 |
2.2 先天肾虚引起免疫紊乱的理论研究 |
2.3 先天肾虚引起免疫紊乱的现代医学研究 |
2.4 先天肾虚的治疗方法 |
3.总结 |
第二部分 动物实验研究 |
1.实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 药物 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 实验动物分组 |
2.2 动物模型制备 |
2.3 给药剂量和方法 |
2.4 标本采集 |
2.5 检测指标 |
3.实验结果 |
3.1 先天肾虚模型指标结果 |
3.2 仔鼠胸腺指数和脾脏指数 |
3.3 仔鼠TECs超微结构 |
3.4 仔鼠胸腺内TMSβ4和Tα1 含量 |
3.5 仔鼠胸腺和脾脏内T细胞的分型 |
3.6 仔鼠胸腺内Wnt4,β-catenin,Foxn1 蛋白的表达 |
3.7 仔鼠胸腺内Wnt4,β-catenin,Foxn1 基因的表达 |
4.讨论 |
4.1 孕鼠肾虚 |
4.2 仔鼠先天肾虚 |
4.3 先天肾虚对胸腺的影响 |
4.4 先天肾虚对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
4.5 先天肾虚对T细胞的影响 |
4.6 左归丸对先天肾虚的作用 |
第三部分 细胞实验研究 |
1.实验材料 |
1.1 实验动物及细胞来源 |
1.2 药物 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 原代TECs细胞培养 |
2.2 含药血清制备 |
2.3 分组及干预方法 |
2.4 检测指标 |
2.5 统计方法 |
3.结果 |
3.1 免疫荧光鉴定TECs |
3.2 左归丸含药血清CCK-8 检测 |
3.3 抑制剂ICG-001 CCK-8 检测 |
3.4 不同抑制剂浓度对Wnt4 表达量的影响 |
3.5 TECs内 TMSβ4和Tα1 的含量 |
3.6 TECs内 Wnt4,β-catenin,Foxn1 基因的表达量 |
3.7 TECs内 Wnt4,β-catenin,Foxn1 蛋白的表达量 |
4.讨论 |
4.1 含药血清和抑制剂浓度 |
4.2 先天肾虚对TECs的影响 |
4.3 TECs内 Wnt/β-catenin信号通路的表达 |
讨论 |
1.先天肾虚模型 |
2.先天肾虚与免疫紊乱 |
2.1 先天肾虚影响免疫器官 |
2.2 先天肾虚影响免疫细胞 |
3.先天肾虚影响Wnt/β-catenin信号通路的表达 |
4.先天肾虚与补肾填精法的应用 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
1.实验图片 |
2.综述 先天肾虚胎鼠胸腺免疫功能的研究进展 |
参考文献 |
3.发表论文 |
致谢 |
(3)TCEP对大菱鲆生殖系统和抗氧化系统的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 绪论 |
1.1 大菱鲆简介 |
1.1.1 大菱鲆的养殖情况概述 |
1.1.2 大菱鲆的生殖系统 |
1.1.3 大菱鲆的抗氧化防御系统 |
1.1.4 大菱鲆的抗氧化防御的重要器官 |
1.2 内分泌干扰物 |
1.2.1 内分泌干扰物的定义及分类 |
1.2.2 内分泌干扰物的鉴定方法 |
1.3 TCEP简介 |
1.3.1 TCEP的来源与应用 |
1.3.2 TCEP在环境中的积累 |
1.3.3 TCEP在水生生物中的积累 |
1.4 内分泌干扰物的生物毒性 |
第二章 TCEP对大菱鲆生殖相关基因的影响 |
2.1 前言 |
2.2 样品和试剂 |
2.3 大菱鲆生殖相关基因表达的测定 |
2.4 基因的相对表达量 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第三章 TCEP对大菱鲆生殖相关激素分泌的影响 |
3.1 前言 |
3.2 样品和试剂 |
3.3 大菱鲆生殖相关激素含量的测定 |
3.4 大菱鲆生殖相关激素含量变化 |
3.5 讨论 |
3.6 小结 |
第四章 TCEP对大菱醉抗氧化相关基因的影响 |
4.1 前言 |
4.2 样品和试剂 |
4.3 大菱鲆抗氧化相关基因表达的测定 |
4.4 基因的相对表达量 |
4.5 讨论 |
4.6 小结 |
第五章 结论与展望 |
第六章 已发表的论文 |
致谢 |
参考文献 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(4)补中益气汤(方)与脾虚肌无力(证)方证关联的生物学基础(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略词 |
第一部分 文献综述 |
综述一 中医脾虚证的研究现状 |
1. 脾虚证的现代内涵 |
2. 脾虚肌无力模型的研究 |
3. 小结 |
参考文献 |
综述二 “补中益气汤”防治肌肉疾病的研究概况 |
1. 临床研究 |
2. 实验研究 |
3. 小结 |
参考文献 |
综述三 肌肉减少症的分子机制 |
1. 蛋白质合成与分解失衡 |
2. 激素水平 |
3. 炎性因子 |
4. 神经-肌肉功能衰退 |
5. 氧化应激与线粒体损伤 |
6. 其他 |
参考文献 |
第二部分 实验研究 |
前言 |
参考文献 |
研究一 脾虚肌无力小鼠模型的建立与评价 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
研究二 脾虚肌无力小鼠肌肉蛋白质失衡的分子机制及补中益气汤的干预作用 |
材料 |
方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
结语 |
1. 立论背景与研究思路 |
2. 脾虚肌无力证模型小鼠的建立与评价 |
3. 脾主肌肉及脾虚肌无力的现代病生理学内涵 |
4. 补中益气汤健脾强肌功效的现代作用机制 |
5. 补中益气汤(方)-脾虚肌无力(证)关联的生物学基础 |
6. 本研究的创新点及局限性 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
(5)补肾活血汤改善早发性卵巢功能不全的临床研究和调节模型小鼠Keap1/Nrf2/ARE信号通路的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
绪论 |
第一部分 理论研究 |
1. 西医学对早发性卵巢功能不全的认识 |
1.1 早发性卵巢功能不全与卵巢储备功能下降、卵巢早衰 |
1.2 早发性卵巢功能不全的流行病学 |
1.3 早发性卵巢功能不全的病因 |
1.4 早发性卵巢功能不全的机制 |
1.5 早发性卵巢功能不全的诊断 |
1.6 早发性卵巢功能不全的治疗 |
2. 中医学对早发性卵巢功能不全的认识 |
2.1 早发性卵巢功能不全的中医古籍认识 |
2.2 早发性卵巢功能不全的中医病因研究 |
2.3 早发性卵巢功能不全的中医病机研究 |
2.4 早发性卵巢功能不全的中医治疗研究 |
2.5 中医药的作用机制研究 |
第二部分 临床研究 补肾活血汤对肾虚血瘀型早发性卵巢功能不全的临床研究 |
1. 资料与方法 |
1.1 病例来源 |
1.2 诊断标准 |
1.3 病例选择标准 |
1.4 治疗方案 |
1.5 合并用药的规定 |
1.6 观测内容及指标 |
1.7 疗效评定标准 |
1.8 安全性评价及可能出现的不良反应的处理方法 |
1.9 统计方法 |
2. 结果 |
2.1 入组时各指标可比性分析 |
2.2 入组时一般情况比较 |
2.3 治疗后临床疗效比较 |
2.4 检测指标疗效比较 |
2.5 安全性观察 |
3. 讨论 |
3.1 POI与应激、心肾子宫轴、神经内分泌网络之间的关系 |
3.2 补肾活血汤的理论分析 |
3.3 补肾活血汤治疗POI的现状 |
第三部分 实验研究 从Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路探讨补肾活血汤治疗免疫性POI的分子机制 |
1. 材料和试剂 |
1.1 实验动物 |
1.2 实验药物 |
1.3 实验试剂 |
1.4 实验仪器 |
2. 实验方法 |
2.1 补肾活血汤水提液的制备 |
2.2 补肾活血汤水提液的药物质量控制研究 |
2.3 筛选实验动物 |
2.4 建立免疫性POI小鼠模型 |
2.5 分组给药 |
2.6 观察动情周期 |
2.7 实验取材 |
2.8 脏器指数 |
2.9 卵巢H&E染色 |
2.10 免疫组化染色检测Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1的表达 |
2.11 卵巢免疫荧光染色 |
2.12 ELISA测定血清E_2、FSH、LH、AMH、抗ZP抗体的水平 |
2.13 Q-PCR检测Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信号通路中相关基因的表达 |
2.14 数据分析 |
3. 实验结果与分析 |
3.1 UPLC-QTOF-MS/MS分析补肾活血汤水提液的成分 |
3.2 小鼠一般情况变化 |
3.3 小鼠阴道脱落细胞变化 |
3.4 小鼠脏器指数变化 |
3.5 小鼠血清E_2、FSH、LH、AMH水平 |
3.6 小鼠血清抗透明带抗体(AzpAb)水平 |
3.7 小鼠血SOD、MDA水平 |
3.8 小鼠卵巢组织H&E染色 |
3.9 小鼠卵巢透明带抗体免疫荧光染色 |
3.10 小鼠卵巢组织免疫组化 |
3.11 小鼠卵巢组织Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 mRNA的变化 |
4. 讨论 |
4.1 早发性卵巢功能不全的动物模型 |
4.2 应激与自身免疫性早发性卵巢功能不全的关系 |
4.3 补肾活血汤通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路治疗早发性卵巢功能不全 |
参考文献 |
结语 |
附录一 缩略词表 |
附录二 中医症状评分标准表 |
附录三 Kupperman(KMI)评分表 |
攻读博士学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
作者简介 |
(6)补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略词 |
第一章 文献研究 |
综述一 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下的研究进展 |
1 原始生殖细胞形成、迁移和增殖 |
2 性腺发育与性别决定 |
3 原始卵泡形成 |
4 原始卵泡激活 |
5 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下 |
综述二 卵巢储备功能低下中医研究进展 |
1 病名的阐释 |
2 病因 |
3 病机 |
4 治疗 |
结语 |
参考文献 |
第二章 实验研究 |
前言 |
第一部分 补肾促卵方安全性评价的研究 |
实验一 补肾促卵方急毒实验 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
第二部分 补肾促卵方保护雷公藤多普诱导DOR小鼠卵巢储备功能的机制研究 |
实验二 补肾促卵方浓度筛选实验 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验三 补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR通路保护原始卵泡池的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验四 补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3通路保护生长卵泡的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
实验五 补肾促卵方调控Nrf2/ARE通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 小结 |
参考文献 |
结论 |
创新点与展望 |
致谢 |
个人简历 |
附件 |
(7)中医肾藏藏调节之精的生物学基础研究(论文提纲范文)
提要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 关于肾藏和精的认识 |
1. 关于肾藏的认识 |
1.1 肾藏生理功能的文献描述 |
1.2 肾藏生理功能的现代研究 |
2. 关于精的认识 |
2.1. 关于精的古代认识 |
2.2 关于精的现代认识 |
2.3 中医精的研究意义 |
第二部分 关于调节功能的研究 |
1. 中医对调节功能的认识 |
1.1 中医理论中的调节 |
1.2 治法中的调节 |
1.3 方剂中调节中的调节 |
1.4 中药的调节 |
2. 生物医学对调节功能的认识 |
2.1 调节功能概述 |
2.2 激素和细胞因子 |
第三部分 激素和细胞因子的中医功能分类 |
1. 调节生长发育的激素和细胞因子 |
1.1 筛选标准 |
1.2 调节生长发育的激素 |
1.3 调节生长发育的细胞因子 |
2. 调节生殖的激素 |
2.1 筛选标准 |
2.2 直接调节作用 |
2.3 间接调节作用 |
3. 调节泌尿的激素 |
3.1 筛选标准 |
3.2 直接调控 |
3.3 间接调控 |
4. 调节气化的激素 |
4.1 筛选标准 |
4.2 直接作用 |
4.3 间接作用 |
5. 调节造血的激素和细胞因子 |
5.1 筛选标准 |
5.2 调节造血的激素 |
5.3 调节造血的细胞因子 |
6. 调节免疫的激素和细胞因子 |
6.1 筛选标准 |
6.2 调节免疫的激素 |
6.3 调节免疫的细胞因子 |
第四部分 调节之精的生物学基础 |
1. 调节之精 |
1.1 调节之精的提出 |
1.2 调节之精的含义和功能 |
1.3 调节之精功能异常的症状表现 |
1.4 调节之精的补充说明 |
2. 调节之精功能的立论依据 |
2.1 理论依据 |
2.2 实践依据 |
3. 激素和细胞因子的作用特点 |
3.1 激素 |
3.2 细胞因子 |
4. 激素和细胞因子与调节之精的对比 |
第五部分 调节 之精的应用举例 |
1. 侏儒症 |
2. 卵巢早衰 |
3. 支气管哮喘 |
4. 前列腺增生 |
5. 肾性贫血 |
结语 |
参考文献 |
致谢 |
(8)小尾寒羊产后不同时期PRL分泌及其在不同组织中mRNA表达规律研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 催乳素的结构和内分泌功能 |
1.1.1 催乳素的结构 |
1.1.2 催乳素的内分泌功能 |
1.2 催乳素基因在不同组织中的表达 |
1.3 催乳素与繁殖调控 |
1.4 催乳素与泌乳 |
1.4.1 催乳素对乳腺发育的作用 |
1.4.2 催乳素启动、维持泌乳及对泌乳性状的影响 |
1.5 催乳素与免疫 |
1.6 催乳素与JAK-STAT5信号通路 |
1.6.1 STAT家族概述 |
1.6.2 STAT5A的结构及其作用 |
1.6.3 JAK2-STAT5信号通路 |
1.6.4 JAK2-STAT5的负向调控 |
1.7 目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 试验时间和地点 |
2.2 试验动物与试验设计 |
2.3 试验羊的饲养管理 |
2.4 主要试剂和仪器设备 |
2.5 样品采集 |
2.5.1 血液样品采集 |
2.5.2 组织样品采集 |
2.6 PRL浓度测定 |
2.7 PRL及其相关基因表达测定 |
2.7.1 总RNA的提取与质量检测 |
2.7.2 反转录合成cDNA |
2.7.3 引物设计 |
2.7.4 PCR扩增 |
2.7.5 PCR产物回收与纯化 |
2.7.6 标准品的稀释 |
2.7.7 实时荧光定量PCR反应体系和条件 |
2.8 乳腺中p-STAT5A蛋白表达测定 |
2.8.1 乳腺组织总蛋白的提取及定量 |
2.8.2 分离胶、浓缩胶的配比和制备 |
2.8.3 SDS-PAGE申电泳 |
2.8.4 转膜 |
2.8.5 免疫反应 |
2.8.6 化学发光 |
2.9 数据统计与分析 |
3 结果与分析 |
3.1 小尾寒羊产后PRL分泌规律 |
3.2 小尾寒羊产后PRL在不同组织中的表达规律 |
3.2.1 小尾寒羊各组织中总RNA提取结果 |
3.2.2 反转录产物质量分析 |
3.2.3 小尾寒羊母羊产后不同时期各组织中PRL mRNA表达差异分析 |
3.3 小尾寒羊产后乳腺中JAK2、STAT5A、CSN2基因表达 |
3.3.1 反转录产物质量分析 |
3.3.2 小尾寒羊产后不同时期乳腺中JAK2、STAT5A和CSN2基因表达差异分析 |
3.4 小尾寒羊产后不同时期乳腺中p-STAT5A蛋白表达差异分析 |
4 讨论 |
4.1 哺乳动物分娩后PRL分泌规律 |
4.2 PRL基因在动物不同组织中的表达 |
4.3 PRL对乳腺中JAK2-STAT5信号通路及CSN2合成的影响 |
5 结论 |
参考文献 |
在读期间发表的学术论文 |
作者简历 |
致谢 |
附件 |
(9)促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分 理论研究 |
一、中医学对于女性生育力的研究 |
1 中医对女性生育力发展过程的认识 |
2 中医对女性生育力下降乃至不孕的机理探究 |
3 中医药对改善高龄女性生育力下降的对策研究 |
二、西医学对女性生育力的研究 |
1 西医对女性基础生殖内分泌的研究 |
2 女性生育力及其影响因素 |
3 改善女性生育力的西医疗法 |
参考文献 |
第二部分 实验研究 |
实验一 初老雌性大鼠模型的建立与评价 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
实验二 促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 数据统计与处理 |
4 结果 |
5 讨论 |
参考文献 |
实验三 促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢 SCF、GDF-9 表达的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 数据统计与处理 |
4 结果 |
5 讨论 |
参考文献 |
实验四 促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及LIF、HOXA-10m RNA 表达的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 数据统计与处理 |
4 结果 |
5 讨论 |
参考文献 |
第三部分 讨论 |
一、促孕安怡方的组方依据及配伍特点 |
1 促孕安怡方的组方依据 |
2 促孕安怡方的配伍特点 |
二、促孕安怡方的治疗优势 |
参考文献 |
第四部分 结语 |
一、研究结论 |
二、创新点 |
三、不足与展望 |
附1 |
附2 |
文献综述 高龄女性生育力下降的研究进展 |
参考文献 |
个人简历 |
致谢 |
(10)从调控HPO轴探讨“阴三针”治疗卵巢早衰小鼠的作用机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 卵巢早衰(P0F)的概述 |
1.2 POF病因学研究进展 |
1.2.1 遗传因素 |
1.2.2 免疫因素 |
1.2.3 医源性因素 |
1.2.4 酶缺乏及代谢因素 |
1.2.5 环境及其他因素 |
1.3 POF的治疗研究概况 |
1.3.1 激素替代治疗 |
1.3.2 干细胞治疗 |
1.3.3 免疫治疗 |
1.3.4 基因治疗 |
1.3.5 卵巢冷冻及移植技术 |
1.3.6 西医其他疗法 |
1.3.7 中医药治疗 |
1.4 卵巢早衰的可能机制 |
1.5 针灸治疗卵巢早衰的理论依据 |
1.5.1 调控下丘脑—垂体—卵巢(HPO)轴 |
1.5.2 改善卵巢、子宫的组织学形态 |
第二章 实验研究 |
2.1 实验目的 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 动物 |
2.2.2 药物 |
2.2.3 仪器 |
2.2.4 实验试剂 |
2.3 试验方法 |
2.3.1 药物配制 |
2.3.2 造模及分组 |
2.3.3 治疗方法 |
2.3.4 样本的采集 |
2.3.5 观察及检测指标 |
2.3.6 检测方法 |
2.4 统计学方法 |
2.5 结果 |
2.5.1 生理病理特征 |
2.5.2 动情周期 |
2.5.3 脏器指数 |
2.5.4 各组小鼠血清中E2、FSH、LH和下丘脑中β-EP水平的比较 |
2.5.5 各组小鼠卵巢形态学改变及各级卵泡所占百分比 |
2.5.6 Western blot法检测小鼠卵巢中TNF-α、Caspase-3蛋白的变化 |
2.6 讨论 |
2.6.1 中医学对卵巢早衰的认识 |
2.6.2 选择雷公藤多苷片诱导卵巢早衰小鼠模型的依据 |
2.6.3 “阴三针”治疗的立法思路 |
2.6.4 对小鼠一般生理特征的影响 |
2.6.5 对小鼠动情周期的影响 |
2.6.6 对小鼠脏器指数的影响 |
2.6.7 对小鼠血清性激素水平变化的影响 |
2.6.8 对小鼠下丘脑中β-EP水平变化的影响 |
2.6.9 对卵巢早衰小鼠卵巢组织形态学的影响 |
2.6.10 对卵巢早衰小鼠卵巢中TNF-α及csapase-3蛋白表达的影响 |
2.7 结论 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
致谢 |
统计学审核证明 |
四、大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达(论文参考文献)
- [1]褪黑素介导生物钟基因调控鹅产蛋节律行为[D]. 刘迪. 扬州大学, 2021
- [2]基于Wnt/β-catenin通路探讨左归丸对先天肾虚仔鼠免疫功能的影响及其机制研究[D]. 任梅荣. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]TCEP对大菱鲆生殖系统和抗氧化系统的影响[D]. 刘聪. 山东大学, 2021(09)
- [4]补中益气汤(方)与脾虚肌无力(证)方证关联的生物学基础[D]. 钱梦. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]补肾活血汤改善早发性卵巢功能不全的临床研究和调节模型小鼠Keap1/Nrf2/ARE信号通路的机制研究[D]. 陈思. 南京中医药大学, 2021(01)
- [6]补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究[D]. 陈燕霞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]中医肾藏藏调节之精的生物学基础研究[D]. 李帅. 山东中医药大学, 2020(01)
- [8]小尾寒羊产后不同时期PRL分泌及其在不同组织中mRNA表达规律研究[D]. 王康. 河北农业大学, 2020(01)
- [9]促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究[D]. 马丹凤. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [10]从调控HPO轴探讨“阴三针”治疗卵巢早衰小鼠的作用机制[D]. 岳阿兰. 广州中医药大学, 2020(06)