一、THE CHARACTERIZATION OF MYOSIN LIGHT CHAIN PHOSPHORYLATION BY THE CONSTITUTIVELY ACTIVE FRAGMENT OF MLCK（论文文献综述）
曹立创[1]（2019）在《肌球蛋白调节轻链磷酸化影响肌动球蛋白解离机理》文中研究表明活体内研究发现肌球蛋白调节轻链（MRLC）磷酸化影响肌动球蛋白横桥结构,而肌动球蛋白解离影响宰后肉的嫩度和保水性,在宰后肌肉中MRLC磷酸化是否会影响肌动球蛋白解离值得探讨。以羊宰后背最长肌为实验材料,通过电泳、磷酸化蛋白和全蛋白荧光染色、蛋白质免疫印迹、磷酸化蛋白质组学、Discovery Studio软件模拟以及等温滴定量热分析验证等方法,研究MRLC磷酸化影响肌动球蛋白解离的机理。明确原位模型中MRLC磷酸化对肌球蛋白降解和肌动球蛋白解离的影响;通过添加肌球蛋白轻链激酶和肌球蛋白轻链激酶抑制剂调节肌肉匀浆液中MRLC的磷酸化水平,验证离体模型中MRLC磷酸化与肌动球蛋白解离的关系;鉴定与肌动球蛋白解离密切相关的MRLC磷酸化肽段及位点;离体模型中调控肌球蛋白纯品中MRLC的磷酸化水平,研究MRLC特征位点磷酸化对肌动球蛋白解离的影响。研究结果如下:（1）MRLC磷酸化负向影响肌动球蛋白解离和MRLC、MHC降解。MRLC磷酸化水平与肌动球蛋白解离程度（r=-0.794,P<0.05）,MRLC降解程度（r=-0.764,P<0.05）和MHC降解程度（r=-0.826,P<0.05）均呈显着负相关。（2）离体模型中MRLC磷酸化负向影响肌动球蛋白解离,与原位模型结果一致。MRLC磷酸化作用可能有助于肌球蛋白与肌动蛋白之间相互作用力形成,从而抑制肌动球蛋白解离。离体模型中MRLC磷酸化水平与肌动球蛋白解离程度呈显着负相关（r=-0.736,P<0.05）。（3）肌动球蛋白解离最密切相关的磷酸化位点为MRLC第15位丝氨酸。羊骨骼肌中MRLC第15位丝氨酸的磷酸化状态与肌动球蛋白解离呈显着负相关（r=-0.816,P<0.05）。一些肌肉收缩蛋白、调节蛋白和结构蛋白,特别是MRLC、MHC、肌联蛋白和伴肌动蛋白的磷酸化也影响肌动球蛋白解离。（4）MRLC第15（17）位丝氨酸磷酸化负向影响肌动球蛋白解离存在两条可能途径:一是MRLC第15位丝氨酸磷酸化通过增强肌球蛋白与肌动蛋白间的离子键、氢键、疏水相互作用形成而降低肌动球蛋白解离;二是MRLC第15位丝氨酸磷酸化引起肌动球蛋白动能和总能量降低,键能升高,从而降低肌动球蛋白解离。MRLC氨基酸序列匹配发现羊骨骼肌中第15位丝氨酸对应兔骨骼肌中第17位丝氨酸。
杨高山[2]（2019）在《丹参和丹参来源的Sal-miR-1和Sal-miR-3调节血管平滑肌细胞生物学行为的作用机制》文中研究表明血管重塑（vascular Remodeling）是血管为适应内外环境变化而发生的结构和功能的改变。血流动力学变化或代谢紊导致血管内皮损伤时,损伤部位产生的生长因子、血管活性物质,可诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）表型转化、增殖和迁移,同时伴随着细胞外基质的合成、降解和骨架的重新排布。血管在发育过程中,为应对不断变化的灌注压,其结构发生不断的变化,逐渐形成成熟的血管网络,如血管动脉的形成或是胚胎血管新生等过程均属于生理性血管重塑。而当血管壁无法承受外界应激时,其组织结构和功能就会发生病理性改变,产生病理性血管重塑,进而发生一系列的心血管疾病,如动脉粥状硬化、动脉瘤和血管内皮增生等。血管内皮细胞,平滑肌细胞和单核巨噬细胞均参与血管重塑过程,在血管重塑的过程中,常常伴随着VSMC增殖、迁移和异常的表型转化等,VSMC中这些细胞生物学行为的改变,对发生血管重塑起到至关重要的作用。从中医理论上讲,血行不畅,壅遏于经脉,或淤积于脏腑组织器官,均称为瘀血。由瘀血内阻而引起的病变,即为血瘀证,或称瘀血证。血瘀形成的病因病机主要包括:血流急速,壅遏凝聚以致瘀;血行迁缓,淤积凝结以致瘀;脉络损伤以致血溢瘀结三个方面。血瘀可分“有形之瘀”和“无形之瘀”。“有形之瘀”如血栓、血肿、结块、结缔组织异常增生等;“无形之瘀”如血液流变学改变、病灶组织液增多所致的炎症等。按血瘀的范围又可划分为广义的“瘀”和狭义的“瘀”,狭义的瘀血以“瘀为积血”为代表,反映血液运行不畅停滞、留滞、淤积于局部;广义的瘀血还涉及血管病变、以及各种病理生理学的综合病变。这与我们今天所说的血管重塑性疾病的临床表现十分相似。内膜增生的主要形成原因是血管内膜损伤后,气血阻滞,血脉不通,心脉痹阻。主要的病机是气滞血瘀。根据中医“气为血之帅”,“气行则血行”的理论和临床经验,在选择防治内膜增生的组方时宜活血化瘀兼补气益气并用,补气以扶正,气足则血行,瘀去则络通,做到标本同治。近年,虽然在血管重塑发病机制研究方面取得很大进展,但尚缺乏逆转或减轻血管重塑的理想药物。因此,从传统的活血化瘀中药中寻找抗血管重塑的有效成分成为当前的研究热点之一。丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）是唇形科植物,作为中国传统是常用中药材,具有通经止痛,活血化瘀,凉血消痈,清心除烦等功效,被广泛应用于心血管疾病的治疗,如舒张冠状动脉、降血压、防治动脉粥样硬化、抗心肌肥厚等。水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的酮类化合物是丹参中有效成分中重要的两大类。近年研究发现,水稻和一些中药材中的小分子RNA（mi RNA）可以被人体吸收。这些植物来源的mi RNAs因其特殊的结构,使其经口服进入消化道后,不仅不被降解而且还能被机体吸收进入血循环,从而在不同靶器官发挥作用。已经证明,这些跨物种的mi RNAs不仅可以调节人体的脂类代谢,还能起到抗病毒甚至抑制肿瘤的功效。然而,丹参来源的mi RNAs能否调节VSMC迁移和黏附等生物学行为尚有待研究。VSMC迁移和黏附等生物学行为受基因表达程序和细胞骨架组构的调节。锌指转录因子家族成员KLF4在VSMC迁移、黏附和增殖等细胞生物学行为中起到了至关重要的作用,不仅调控了VSMC迁移和黏附相关的标志基因,还影响着细胞周期相关因子的表达。细胞迁移依赖于细胞骨架（尤其是肌动蛋白组成的微丝）不断聚合、解聚及其重排所提供的动力。非肌肌球蛋白通过与肌动蛋白微丝相互作用,调节细胞骨架的组构,并进而影响细胞的迁移和黏附。然而,目前KLF4和NMHCⅡA（Non muscle myosin heavy chainⅡA,NMHCⅡA）在调节VSMC迁移和黏附中的相互关系尚不清楚。丹参和丹参来源的mi RNAs是否通过调节KLF4和NMHCⅡA表达和/或活性而保护心血管结构与功能?丹参及其来源的mi RNAs如何调节KLF4和NMHCⅡA表达和/或活性?以及NMHCⅡA如何调节VSMC骨架组构?这些问题都有待于研究。本研究利用体外培养的VSMC和颈动脉损伤诱导的小鼠血管内膜增生模型,探讨丹参和丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3通过KLF4和NMHCⅡA调节VSMC生物学行为的作用机制,为研发活血化瘀抗血管重塑的有效药物提供新思路,开辟新途径。第一部分丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3的鉴定、在小鼠体内的稳定性以及对VSMC的作用目的:从丹参中分离、鉴定mi RNAs,探讨丹参及丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3在VSMC中的稳定性及其对VSMC的作用。方法:1.经灌胃给予小鼠注射液后,q RT-PCR检测小鼠血液及组织中丹参来源的mi RNAs。2.用不同浓度凝血酶（0～2 U/m L）处理VSMC 24 h或凝血酶（1U/m L）处理VSMC不同时间（0～48 h）,q RT-PCR和Western blot检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达。3.用凝血酶（1 U/m L）处理VSMC后,鬼笔环肽染色观察细胞骨架及肌丝的变化,免疫荧光染色检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的定位和表达。4.分别用Sal-mi R-1、Sal-mi R-3以及Sal-mi R-1和Sal-mi R-3共转染VSMC,q RT-PCR和Western blot检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达。5.用mi R-Ctl和Sal-mi R-1+3分别转染VSMC 24 h后,再分别给予生理盐水和凝血酶（1 U/m L）处理,q RT-PCR和Western blot检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达,免疫荧光染色检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达,划痕实验和Transwell小室实验检测VSMC的迁移情况,免疫荧光检测VSMC对淋巴细胞和巨噬细胞的黏附情况。6结扎小鼠颈动脉的同时,分别原位转染mi R-Ctl和Sal-mi R-1+3,苏木精-伊红染色观察和评价内膜增生的形态学改变,免疫双荧光染色,q RT-PCR和Western blot检测VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达。结果:1.丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3的鉴定及其在小鼠体内的稳定性利用高通量二代测序手段,对丹参中存在的mi RNAs进行序列分析,共筛选出了187种mi RNAs,其中既有与其它植物同源的mi RNAs,如ath-mi R166a-3p、hbr-mi R156、gma-mi R172b-5p等,又存在41种特异在丹参中存在的mi RNAs,通过KEGG和GO分析,我们选定几个感兴趣的mi RNAs对其进行q RT-PCR检测,结果显示在丹参和丹参注射液中均存在这几种mi RNAs。给小鼠灌胃丹参,提取血液及各个组织器官中的RNA并给予高碘酸钠处理后,进行q RT-PCR检测。因丹参特有的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3在VSMC中含量较高,我们决定将这两种mi RNAs作为研究对象。分别用Sal-mi R-1和Sal-mi R-3转染VSMC,提取RNA并给予高碘酸钠处理后,进行q RT-PCR检测。结果表明,丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3不被高碘酸钠氧化降解,可以在小鼠VSMC中稳定存在。2.Sal-mi R-1和Sal-mi R-3通过抑制凝血酶诱导VCAM-1、ICAM-1和TXA2R表达而影响VSMC细胞骨架组构和迁移首先,我们用q RT-PCR和Western blot分析证实,不同浓度的凝血酶或1 U/m L凝血酶处理VSMC不同时间,可以浓度和时间依赖性的上调VCAM-1、ICAM-1及TXA2R表达。VCAM-1、ICAM-1和TXA2R m RNA水平至少比对照组升高2-4倍。免疫荧光染色结果显示,凝血酶能显着诱导VCAM-1、ICAM-1和TXA2R蛋白表达。鬼笔环肽染色显示,与对照组相比,凝血酶刺激后的VSMC肌丝排布紊乱,应力纤维减少变细。用化学合成的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3转染VSMC,q RT-PCR和Western blot结果显示,Sal-mi R-1、Sal-mi R-3以及Sal-mi R-1和Sal-mi R-3共转染均能够明显抑制黏附因子VCAM-1、ICAM-1及TXA2R的表达,其中Sal-mi R-1和Sal-mi R-3共转染效果最为明显。此后,我们进一步研究Sal-mi R-1+3共转染对凝血酶效应的影响。用Sal-mi R-1+3转染VSMC24 h后,再给予凝血酶（1 U/m L）处理。q RT-PCR和Western blot检测结果显示,Sal-mi R-1+3能够显着抑制由凝血酶诱导的VCAM-1、ICAM-1和TXA2R表达。免疫荧光染色得到一致的结果。细胞划痕实验和Transwell小室实验证明,Sal-mi R-1+3抑制凝血酶诱导的VSMC的迁移。荧光染色检测细胞黏附的结果显示,凝血酶促进VSMC对淋巴细胞和巨噬细胞的黏附,转染Sal-mi R-1+3显着抑制由凝血酶诱导的VSMC对淋巴细胞和巨噬细胞的黏附。综上结果提示,Sal-mi R-1+3能够抑制凝血酶诱导的VSMC的迁移以及对单核细胞的黏附。3.丹参注射液和Sal-mi R-1+3抑制颈动脉结扎诱导的血管内膜增生及黏附因子的表达在结扎C57BL/6小鼠左侧颈总动脉的同时原位转染Sal-mi R-1+3或给予丹参注射液治疗。q RT-PCR分析结果显示,在转染Sal-mi R-1+3的小鼠,在这两种mi RNAs在血管组织中增加了3倍,而转染mi R-Ctl的小鼠检测不到Sal-mi R-1+3的存在。HE染色结果显示,C57BL/6小鼠颈动脉结扎21天后内膜显着增生。原位转染Sal-mi R-1+3或给予丹参注射液处理后,小鼠新生内膜形成、内膜中膜比（I/M）值显着降低,并且Sal-mi R-1+3组的治疗效果优于丹参注射液组。经q RT-PCR和Western blot检测发现,与未结扎组相比,结扎组小鼠颈动脉中的VCAM-1的表达明显上调,Sal-mi R-1+3转染显着抑制由结扎引起的VCAM-1表达的上调。免疫荧光染色和组织化学染色得到相同的结果。这些结果充分表明,Sal-mi R-1和Sal-mi R-3显着抑制血管损伤诱导的血管内膜增生和黏附分子表达。小结:1.Sal-mi R-1和Sal-mi R-3特异性存在于丹参及丹参注射液中,进入小鼠体内后能够稳定存在;2.在VSMC中,凝血酶显着上调VCAM-1、ICAM-1等黏附分子的表达;3.转染Sal-mi R-1+3能显着抑制凝血酶诱导的黏附分子表达和VSMC的迁移;4.转染Sal-mi R-1+3能够抑制由颈动脉结扎诱导的血管内膜增生;5.Sal-mi R-1+3通过活血化瘀、通络祛瘀抑制VSMC迁移及其与单核/巨噬细胞之间的黏附。第二部分OTUD7B介导Sal-mi R-1和Sal-mi R-3对KLF4和NMHCⅡA表达的调节目的:揭示Sal-mi R-1和Sal-mi R-3通过靶向抑制OTUD7B表达进而调节KLF4和NMHCⅡA的作用机制。方法:1.生物信息学预测Sal-mi R-1和Sal-mi R-3的靶基因。q RT-PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因分析验证OTUD7B是Sal-mi R-1和Sal-mi R-3的靶基因。2.q RT-PCR和Western blot、免疫荧光技术检测凝血酶对OTUD7B表达的影响。3.Label-free定量组学筛选OTUD7B互作蛋白,q RT-PCR、Western blot、免疫共沉淀检测OTUD7B与NMHCⅡA和KLF4之间的相互作用。4.Ch IP-q PCR和双荧光素酶报告基因分析检测KLF4与NMHCⅡA启动子的结合及对NMHCⅡA表达的调节作用。5.q RT-PCR、Western blot、免疫共沉淀检测KLF4与NMHCⅡA之间的相互作用。结果:1.在VSMC中,Sal-mi R-1和Sal-mi R-3通过靶向抑制OTUD7B表达而阻抑凝血酶对其表达的上调因为去泛素化酶OTUD7B在细胞增殖和迁移中发挥重要作用,首先我们检查凝血酶对OTUD7B表达的影响。分别用1 U/m L的凝血酶刺激细胞不同时间（0、6、12、24 h）或用不同浓度的凝血酶（0、0.5、1、2 U/m L）刺激细胞24 h,提取总RNA和总蛋白进行q RT-PCR和Western blot分析。结果显示,随着凝血酶刺激时间的延长和剂量的升高,OTUD7B的表达逐渐升高。免疫荧光结果也显示,用1 U/m L凝血酶刺激细胞24 h后,OTUD7B的表达显着上调。然后,我们检查Sal-mi R-1和Sal-mi R-3对OTUD7B表达的影响。与转染mi R-Ctl组相比,在转染Sal-mi R-1、Sal-mi R-3以及Sal-mi R-1+3共转染的细胞中,OTUD7B蛋白的表达受到抑制,Sal-mi R-1+3共转染对OTUD7B表达的抑制作用最为显着。q RT-PCR分析得到同样的结果。免疫荧光染色结果也显示,转染Sal-mi R-1+3后,OTUD7B的荧光强度显着减弱。以上结果提示,OTUD7B可能是Sal-mi R-1和Sal-mi R-3的靶基因。荧光素酶报告基因检测结果显示,与转染mi R-Ctl组相比,转染Sal-mi R-1、Sal-mi R-3后,OTUD7B 3’UTR报告基因活性受到显着抑制,但Sal-mi R-1和Sal-mi R-3对其结合位点突变的OTUD7B 3’UTR报告基因活性几乎没影响。在颈动脉原位转染Sal-mi R-1+3后,q RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测结果显示,Sal-mi R-1+3能够下调血管组织中OTUD7B的表达。2.OTUD7B通过去泛素化增加KLF4蛋白的稳定性上述结果表明,OTUD7B是受Sal-mi R-1和Sal-mi R-3调节的蛋白质,为了明确OTUD7B在VSMC中的功能,我们对OTUD7B进行Label-free定量组学分析,结果鉴定出53个能与OTUD7B互作的蛋白质,经过对这些蛋白质的功能进行分类和富集聚类等生物信息学分析,从中选取VSMC功能相关的候选蛋白NMHCⅡA进行进一步研究,Western blot结果显示,在VSMC中过表达或敲低OTUD7B,可导致KLF4蛋白表达水平升高或降低。但q RT-PCR检测结果显示,过表达或敲低OTUD7B对KLF4m RNA水平无明显影响,提示OTUD7B可能通过增加KLF4蛋白的稳定性来提高KLF4蛋白表达水平。为了进一步证实OTUD7B可增加KLF4蛋白的稳定性,我们对KLF4半衰期进行分析。结果显示,细胞被放线菌酮处理后,KLF4的蛋白合成受到抑制,半衰期约为6 h左右。当用MG132阻断KLF4蛋白酶体降解途径后,KLF4的半衰期显着延长,提示KLF4受蛋白酶体的降解。在VSMC中敲低OTUD7B后,MG132处理可消除敲低OTUD7B对KLF4的去稳定作用。在用CHX处理VSMC的同时过表达OTUD7B,检测KLF4的稳定性。结果表明,在过表达OTUD7B的细胞中,KLF4的半衰期显着延长。提示OTUD7B通过去泛素化增加KLF4蛋白稳定性。免疫共沉淀实验结果显示,在VSMC中过表达OTUD7B显着降低了KLF4泛素化水平。相反,敲低OTUD7B显着增加KLF4的泛素化水平,在293A细胞中敲低OTUD7B同样能够增加KLF4的泛素化水平。3.NMHCⅡA受KLF4和OTUD7B的负调控实验室前期用KLF4抗体进行Ch IP-Seq分析时发现,NMHCⅡA启动子区可能存在KLF4结合位点。生物信息学软件预测也显示NMHCⅡA启动子区存在能与KLF4结合的序列。我们进一步用Ch IP-q PCR和双荧光素酶报告基因实验对这些预测结果进行验证,结果显示,KLF4可与NMHCⅡA转录起始点上游-619 bp～-388 bp结合并抑制NMHCⅡA启动子活性。q RT-PCR和Western blot结果显示,过表达或敲低KLF4,能够分别抑制和上调NMHCⅡA的表达。这些结果表明,KLF4通过直接与NMHCⅡA启动子结合而抑制其表达。此外,免疫共沉淀结果显示OTUD7B与NMHCⅡA存在相互作用。Western blot结果显示,与对照组相比,过表达OTUD7B明显抑制NMHCⅡA蛋白表达水平。相反,与对照组相比,VSMC中敲低OTUD7B,则明显上调NMHCⅡA蛋白水平。我们进一步证实,敲低OTUD7B表达显着降低NMHCⅡA的泛素化水平,反之,过表达OTUD7B能够显着增加NMHCⅡA的泛素化水平。小结:1.在VSMC中,Sal-mi R-1和Sal-mi R-3通过靶向抑制OTUD7B表达而阻抑凝血酶对其表达的上调;2.OTUD7B通过去泛素化增加KLF4蛋白的稳定性;3.KLF4通过直接与NMHCⅡA启动子结合抑制NMHCⅡA的表达。第三部分NMHCⅡA促进VSMC骨架的形成抑制VSMC的迁移和对单核细胞的募集目的:揭示NMHCⅡA调节VSMC迁移和黏附活性的作用机制方法:1.鬼笔环肽染色观察敲低NMHCⅡA对细胞骨架及肌丝的影响。2.q RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测敲低NMHCⅡA对VSMC骨架蛋白和黏附因子VCAM-1表达的影响。3.细胞划痕实验和Transwell小室检测敲低NMHCⅡA对VSMC迁移的影响。4.利用VSMC-RAW264.7细胞共培养系统检测VSMC敲低NMHCⅡA对VSMC与巨噬细胞相互作用的影响。5.利用抗体阻断实验,检测VSMC敲低NMHCⅡA对巨噬细胞活化和迁移的影响及其与VCAM-1表达活性之间的关系。结果:1.NMHCⅡA参与VSMC骨架的组构因为已知非肌肌球蛋白重链NMHCⅡA参与细胞迁移和极性形成,细胞迁移涉及细胞骨架的重新组构,我们用靶向NMHCⅡA的si RNA敲低NMHCⅡA表达后,观察细胞骨架的变化。鬼笔环肽染色显示,与对照组相比,沉默NMHCⅡA后肌丝排布紊乱,应力纤维减少。用凝血酶处理VSMC 24 h后细胞肌丝减少,细胞骨架组织紊乱;同时沉默NMHCⅡA后,应力纤维进一步减少。这些结果提示,NMHCⅡA参与细胞骨架的重构过程。为了进一步明确NMHCⅡA调节细胞骨架组构的机制,我们检测敲低NMHCⅡA对VSMC标记基因表达的影响,Western blot和q RT-PCR,结果显示,敲低NMHCⅡA可显着减少SMα-actin和SM22α的表达,由此提示,NMHCⅡA可能通过参与对VSMC标志基因表达的调节而影响细胞骨架的重构。2.敲低NMHCⅡA导致VCAM-1表达上调我们进一步研究NMHCⅡA是否参与凝血酶对VCAM-1表达的诱导。Western blot检测结果显示,敲低NMHCⅡA导致VCAM-1表达显着上调。在转染si-NMHCⅡA同时给予凝血酶刺激,我们发现,在凝血酶作用下,VCAM-1表达上调,沉默NMHCⅡA后VCAM-1的表达进一步增加。免疫荧光染色获得同样的结果。上述结果表明,NMHCⅡA阻抑凝血酶对VCAM-1表达的诱导。3.NMHCⅡA下调引起的VCAM-1表达增加促进VSMC的迁移和黏附细胞划痕实验和Transwell小室实验发现,与对照组相比,在VSMC中敲低NMHCⅡA进一步增加凝血酶对VSMC迁移的诱导效应。为了进一步探讨NMHCⅡA是否影响VSMC与巨噬细胞之间的黏附,我们用VSMC-RAW264.7细胞共培养系统检测VSMC中敲低NMHCⅡA后对巨噬细胞跨膜迁移和黏附的影响。跨膜迁移和黏附分析结果显示,凝血酶显着促进RAW264.7细胞的跨膜迁移及其与VSMC黏附。与对照组VSMC相比,敲低NMHCⅡA进一步增加RAW264.7细胞的跨膜迁移及其与VSMC之间的黏附。为了进一步明确VCAM-1在巨噬细胞与VSMC黏附中的作用,用抗VCAM-1抗体阻断VSMC表面的VCAM-1后,观察其与RAW264.7细胞的相互作用。黏附分析结果显示,用抗体阻断VCAM-1作用后,两种细胞之间的黏附明显减少。结果提示,NMHCⅡA下调引起的VCAM-1表达增加促进VSMC对巨噬细胞的募集和活化。小结:1.NMHCⅡA参与VSMC骨架的组构;2.敲低NMHCⅡA导致VCAM-1表达上调;3.NMHCⅡA下调引起的VCAM-1表达增加促进VSMC的迁移和黏附。结论:1.丹参和丹参来源的Sal-mi R-1和Sal-mi R-3显着抑制VSMC的迁移、黏附和血管内膜增生,发挥了活血化瘀的功效。2.OTUD7B介导Sal-mi R-1和Sal-mi R-3对KLF4和NMHCⅡA表达的调节。3.NMHCⅡA通过促进VSMC骨架组构抑制VSMC的迁移和黏附。
刘书婷[3]（2018）在《MiR-26b靶向ROCK1调控间充质干细胞迁移的机制研究》文中指出间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种多能干细胞,因其来源广泛,自我更新、增殖能力和多向分化潜能强,并且具备免疫调节、抗炎和神经保护作用,从而成为临床细胞治疗中理想的种子细胞。移植的MSCs需定向迁移到损伤部位才能更好地发挥疗效,但有研究表明只有极少部分移植的MSCs可以到达病变部位,修复和治疗效果非常有限。因此,研究MSCs的迁移机制、提高其迁移能力对于提高MSCs的有效利用率至关重要。本文在实验室前期工作基础上,研究miR-26b靶向Rho相关丝氨酸/苏氨酸激酶（Rho-associated kinase 1,ROCK1）促进MSCs迁移的机制。本研究发现,在MSCs中转染miR-26b mimic上调miR-26b的表达能够显着降低ROCK1 m RNA水平的表达,而转染miR-26b Inhibitor（miR-26b I）抑制miR-26b后能够显着上调ROCK1 m RNA水平的表达;Western blot检测发现,高表达miR-26b后显着降低ROCK1蛋白水平的表达,而抑制miR-26b则显着提高ROCK1蛋白水平的表达,表明miR-26b负调控ROCK1的表达。进一步,我们通过查阅NCBI数据库,找到ROCK1的3’UTR序列,利用PCR获得含有miR-26b的保守结合位点的ROCK1的3’UTR,采用PCR定点突变的技术将miR-26b与ROCK1的3’UTR结合序列点突变失活,构建了大鼠ROCK1 3’UTR野生型和突变型的双荧光素酶报告基因质粒。将上述报告基因质粒与miR-26b mimic同时转入MSCs,通过酶标仪检测发现miR-26b能够显着降低野生型报告基因的表达,而对突变型报告基因的表达无影响,表明miR-26b可结合野生型3’UTR从而抑制报告基因的表达。通过上述实验我们证实在大鼠MSCs中miR-26b可直接靶向ROCK1,抑制ROCK1的表达。随后,利用Boyden chamber装置我们研究了miR-26b是否通过ROCK1影响MSCs的迁移。结果显示,转染miR-26b I抑制内源miR-26b、上调ROCK1的表达显着抑制MSCs机动性迁移和HGF诱导的趋化性迁移,若同时以ROCK1的特异性抑制剂Y27632处理,则MSCs机动性迁移和趋化性迁移能力显着提高,表明以Y27632抑制ROCK1的活性能够回复miR-26b I对MSCs迁移的抑制作用。相反,转染miR-26b mimic上调miR-26b、降低ROCK1的表达显着促进MSCs机动性迁移和趋化性迁移,若同时感染Ad-ROCK1回复ROCK1的表达,则MSCs机动性迁移和趋化性迁移能力显着下降,表明回复ROCK1的表达减弱miR-26b对MSCs迁移的促进作用。上述实验结果表明,miR-26b通过下调ROCK1的表达、抑制其活性从而促进MSCs迁移。ROCK1是Rho下游主要效应分子,有研究报道它可以通过提高肌球蛋白轻链（Myosin light chain,MLC）Ser19位点的磷酸化从而激活肌球蛋白（Myosin）,导致稳定的肌动蛋白丝束的形成;ROCK1还能提高切丝蛋白（Cofilin）Ser3位点的磷酸化从而调控微丝骨架的动态性;此外,ROCK1能够激活PTEN磷酸酶活性,抑制Akt信号通路。为了研究miR-26b通过ROCK1下游哪些分子调控MSCs迁移,我们首先通过Western blot检测改变miR-26b后ROCK1下游Cofilin、MLC及Akt的磷酸化水平的变化。结果显示,上调miR-26b后Akt信号通路被激活,Cofilin和MLC的磷酸化水平都降低;而下调miR-26b后Akt信号通路则被抑制,Cofilin和MLC的磷酸化水平增加,表明高表达miR-26b能够激活Akt信号通路、降低Cofilin和MLC的磷酸化水平。进一步,我们研究miR-26b引起的上述变化是否通过ROCK1。结果显示,高表达ROCK1抑制miR-26b mimic对Akt信号通路的激活作用,回复miR-26b mimic对Cofilin和MLC磷酸化的抑制作用;使用Y27632抑制ROCK1的活性则回复miR-26b I对Akt信号通路的抑制作用,抑制miR-26b I对Cofilin和MLC磷酸化的促进作用。以上结果表明miR-26b通过ROCK1影响Cofilin和MLC磷酸化及Akt信号通路的活化。细胞极性的建立是细胞快速迁移的重要过程。有研究指出,ROCK1作为一种激酶能够改变细胞极性从而影响迁移。我们通过鬼笔环肽免疫荧光染色指示微丝,利用Image J软件统计细胞面积、周长以及长轴和短轴之比,分析细胞铺展情况和极性大小。结果发现,上调miR-26b后MSCs面积和周长都变小,并且细胞呈现出明显的极性形态。为了研究此现象是否和ROCK1有关,我们同时高表达miR-26b和ROCK1,发现同时高表达miR-26b和ROCK1后细胞面积和周长都变大,极性形态消失。上述结果表明miR-26b通过靶向ROCK1影响了MSCs的面积、周长,促进细胞极性形成。肌球蛋白是驱动细胞收缩力主要的马达分子,肌动蛋白丝（Actin filaments）和肌球蛋白相互作用形成具有收缩性的肌动球蛋白纤维（Actomyosin fibers）从而调节多种生物过程,包括胞质分裂、粘附及迁移。肌球蛋白的活化形式由轻链磷酸化产生,MLC磷酸化调控细胞在黏附、铺展及迁移过程中的形态变化。我们将高表达miR-26b的MSCs通过划痕诱导细胞向划痕区域进行定向迁移,免疫荧光染色检测MLC的磷酸化、分布及与微丝的共定位。结果发现,高表达miR-26b的MSCs中MLC的磷酸化水平降低,这与Western blot检测结果相符;p-MLC在细胞膜状突起的前缘聚集,而对照组p-MLC主要位于细胞应力纤维处,膜状突起及边缘没有分布。这些观察结果表明高表达miR-26b后会导致MSCs边缘处肌球蛋白富集。综上所述,本文的研究结果表明miR-26b通过靶向ROCK1,降低Cofilin和MLC的磷酸化、激活Akt信号通路,促进MSCs形成较小铺展面积和细胞极性的形成,促进p-MLC在迁移细胞膜状突起前缘的分布,从而促进MSCs迁移。本研究进一步阐明miR-26b调控MSCs迁移的分子机制,为MSCs的临床移植治疗提供理论基础和实验依据。
马荣钠[4]（2015）在《平滑肌肌球蛋白的磷酸化调节机理》文中研究指明平滑肌肌球蛋白（smooth muscle myosin, SmM）是一种重要的分子马达,是平滑肌粗丝的主要成分。通过与肌动蛋白细丝的相互作用,SmM可以将ATP水解产生的化学能转化成构象变化,使粗丝-细丝间发生相互滑动,引起平滑肌收缩。SmM由两条重链、两条必需轻链（Essential light chain, ELC）、以及两条调节轻链（Regulatory light chain, RLC）组成。SmM重链包括位于N端的马达头部（包含ATP水解酶活性中心和细丝结合位点）、轻链ELC和RLC结合位点、以及C端的卷曲螺旋（coiled-coil）。SmM的马达功能受磷酸化调节。在非磷酸化状态下,SmM的马达活性处于抑制状态,其ATP水解酶活力极低；当SmM的RLC轻链被磷酸化后,SmM的马达活性处于高活性状态,具有很高的ATP水解酶活力。大量的研究表明,非磷酸化状态下,SmM的双头之间以及头部与尾部之间存在相互作用,使SmM处于折叠抑制状态；RLC磷酸化后,上述相互作用消失,SmM处于伸展激活状态。由于磷酸化位点位于RLC轻链,与ATP水解酶活性中心相距甚远,一个重要问题是RLC磷酸化如何调节ATP水解酶活性。首先,本论文研究了双头结构在SmM磷酸化调节中的作用。由于早期的实验发现带有一个马达头部的SmM（如单头SmM、S1）的马达活性不受磷酸化调节,并且始终处于高活性状态,因此普遍认为SmM的默认状态是高活性状态；非磷酸化状态下,SmM的双头之间以及头部与尾部之间的相互作用使其处于抑制状态；一旦破坏了这些相互作用,SmM即处于高活性状态。但是上述观点却无法解释后期通过重组表达得到的SmM的结果,如重组表达的单头SmM的活性不受磷酸化调节,但其活力比磷酸化后的双头SmM活力要低很多。为了对确定双头结构在磷酸化调节中的作用,本研究构建了一系列不同尾部长度的SmM截短片段,并且检测了它们的结构和受调节程度。在确定了对于形成稳定双头结构起到关键作用的尾部序列基础上,本研究还发现,在非磷酸化的条件下,actin激活的ATP水解酶活力会随着尾部的截短而增加；在磷酸化条件下,actin激活的ATP酶活力会随着尾部的截短而降低。尤其重要的是,无论磷酸化与否,不带尾部的SmM片段（S1）的活力都远低于磷酸化的双头SmM,但高于非磷酸化的双头SmM。这些实验结果显示SmM双头结构不但是非磷酸化抑制状态所必需的,也是磷酸化激活状态所必需的。据此,本研究提出了SmM磷酸化调节的新模型：SmM的默认活性状态是低活性状态,非磷酸化SmM处于抑制状态,磷酸化SmM的双头间存在协同作用,处于高活性状态。本研究提出的SmM磷酸化调节模型可以解释几乎所有已发表的SmM实验结果。其次,本论文研究了SmM头尾相互作用在维持非磷酸化抑制状态中的作用。大量的研究表明,非磷酸化SmM的头部和尾部相互作用,但其分子机制却不清楚。首先,通过亮氨酸拉链替换的方式鉴定出了对于维持头尾作用的关键尾部区域；其次,通过点突变以及ATP酶活力测定的方式进一步明确是该尾部区域的酸性氨基酸参与了与头部的作用。本论文推测SmM尾部的这些关键酸性氨基酸与头部的碱性氨基酸结合,突变实验显示头部的保守碱性氨基酸R406对维持非磷酸化抑制状态起着关键作用。通过上述研究,本论文证明：双头之间的相互作用在SmM的调节中起着不可或缺的作用,并且提出了SmM磷酸化调节的新模型；确定了尾部的酸性氨基酸以及头部的碱性氨基酸在SmM非磷酸化抑制状态中的作用。这些研究成果不但有助于揭示SmM磷酸化调节的分子机制,对其他分子马达的调节也有一定的借鉴意义。
郝丽娟,康志琼,马上上,吕鹏,姚勤,陈克平[5]（2015）在《肌球蛋白磷酸化的研究进展》文中研究表明肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位,由多条重链与多条轻链组成,被视为一种分子马达。在肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等生理过程中起重要作用。目前肌球蛋白磷酸化是研究的一个热点,它对细胞的迁移、收缩、胞质分裂以及其他未知功能都有着至关重要的作用。肌球蛋白磷酸化分为重链的磷酸化与轻链的磷酸化。根据国内外的最新相关研究报道,分别从肌球蛋白的结构与功能、磷酸化的作用机制、磷酸化的生物学功能以及最新研究成果等方面,对肌球蛋白的磷酸化研究进展进行阐述。
殷璐[6]（2012）在《肌球蛋白轻链激酶cDNA克隆及其CaM结合位点突变体的构建》文中研究说明目的：肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kianse, MLCK）是平滑肌收缩过程中的关键酶。当平滑肌细胞受到刺激后，细胞内的Ca2+浓度升高，MLCK可以通过与Ca2+/CaM复合物相结合，磷酸化肌球蛋白20KD的调节轻链（regulatory lightchain, RLC）,从而激活肌球蛋白ATP酶的活性，调节肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，促进平滑肌的收缩，这是MLCK调节平滑肌收缩的经典激酶调节机制。MLCK除了具有激酶活性之外，还具有与肌球蛋白和肌动蛋白相结合的非激酶活性。此外，MLCK对细胞的迁移以及细胞骨架的重组也发挥着重要的作用。为了研究MLCK的非激酶活性对血管平滑肌细胞骨架的影响，本实验利用PCR和分子克隆技术构建了牛胃重组全长MLCK真核表达载体，并且以此为基础，对牛胃重组全长MLCK的1002-1022氨基酸（即CaM结合位点）进行定点突变，获得CaM结合位点突变原核和真核表达载体，为深入研究MLCK的非激酶活性对平滑肌细胞收缩迁移的影响奠定了实验基础。方法：（1）以构建的MLCK全长原核表达载体pCold-MLCK为模板，设计PCR引物，上游引物中加入NheⅠ酶切位点和Flag标签序列（DYKDDDDK），Flag标签位于MLCK的N端，该标签抗体可用于检测转染的成功与否以及转染效率。以pCold-MLCK质粒为模板进行PCR扩增，获得533bp目的片段。用NheⅠ/KpnⅠ分别双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，获得144bp目的片段和5.4kb的载体片段，将二者相连接得到pcDNA-F-MLCK144质粒。再用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-MLCK质粒和pcDNA-F-MLCK144质粒，分别获得3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得重组的pcDNA-F-MLCK质粒。（2）根据CaM的结合位点，设计PCR引物，在上游和下游引物中分别加入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点，以pcDNA-F-MLCK质粒为模板进行PCR。用NheⅠ和EcoRⅠ分别双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，获得700bp的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得亚克隆质粒pcDNA-MLCK700。针对CaM结合位点设计突变引物，使MLCKcDNA序列中的T3016、G3017突变为G3016、C3017。以亚克隆质粒为模板进行PCR突变，获得CaM结合位点的亚克隆突变体pcDNA-MLCK700-CaM。用NcoⅠ分别酶切pcDNA-MLCK700-CaM质粒和pCold-MLCK质粒，获得556bp目的片段和7.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的原核表达突变体pCold-M-CaM质粒。（3）用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-M-CaM质粒和pcDNA-F-MLCK质粒，分别得到3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM。结果：（1）以质粒pCold-MLCK为模板，经PCR扩增后得到一条533bp目的片段，该片段大小与预期一致。用NheⅠ和KpnⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，分别得到144bp的目的片段和5.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得pcDNA-F-MLCK144质粒，该质粒经测序结果与预期一致。再用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-MLCK质粒和pcDNA-F-MLCK144质粒，分别获得3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得重组的pcDNA-F-MLCK质粒，该质粒经测序结果与预期一致。（2）以质粒pCold-MLCK为模板，经PCR扩增后得到一条700bp目的片段，该片段包含CaM结合位点。用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，分别得到700bp的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得亚克隆质粒pcDNA-MLCK700，该质粒经测序结果与预期一致。针对CaM结合位点设计突变引物，以亚克隆质粒为模板进行PCR突变，获得CaM结合位点的亚克隆突变体pcDNA-MLCK700-CaM，该质粒经测序结果与预期一致。用NcoⅠ单酶切pcDNA-MLCK700-CaM质粒和pCold-MLCK质粒，分别获得556bp目的片段和7.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的原核表达突变体pCold-M-CaM质粒，该质粒经测序结果与预期一致。（3）用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-M-CaM质粒和pcDNA-F-MLCK质粒，分别得到3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM，该质粒经测序结果与预期一致。结论：（1）通过DNA序列测定及分析结果显示，本实验已经成功地构建了MLCK重组野生型真核表达载体pcDNA-F-MLCK。（2）通过定点突变的方法获得CaM结合位点突变的原核表达载体pCold-M-CaM，该质粒可用于原核表达，进行功能研究。（3）利用PCR及分子克隆技术获得CaM结合位点突变的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM，该质粒可转染至MLCK基因沉默的平滑肌细胞中，进行表达及功能研究。本实验为进一步研究平滑肌细胞收缩及迁移分子机制提供了一定的实验基础。
焦东东,蔡辉[7]（2009）在《肌球蛋白轻链在血管平滑肌舒缩中的机制研究进展》文中研究指明
赵莹,张月,吕广艳,王辉,崔颖,魏晓晴,陈海波,高颖[8]（2009）在《肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响》文中认为目的:探讨肌球蛋白轻链激酶（MLCK）钙调蛋白（CaM）结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响。方法:构建牛胃重组全长野生型MLCKCaM结合位点突变型蛋白（△CaM/MLCK）;孔雀绿方法检测△CaM/MLCK对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响。结果:在无Ca2+/CaM存在时,随着△△CaM/MLCK浓度的增加,非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显增加;而磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显降低。结论:△CaM/MLCK对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性。
崔颖,谢策,吕广艳,王辉,赵莹,魏晓晴,曲淑贤,曹晶萍,高颖[9]（2009）在《平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体对ATP酶活性的调节作用》文中研究指明目的:探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制。方法:利用编码MLCK全长的pColdI表达载体对其ATP结合位点进行定点突变,获得无激酶活性的MLCK突变体;应用Glycerol-PAGE鉴定肌球蛋白磷酸化水平;应用孔雀绿方法检测重组MLCK对肌球蛋白ATP酶活性的影响。结果:MLCK/△ATP（突变型）失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性;重组MLCK（野生型）和MLCK/△ATP（突变型）均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性,而且激活与抑制作用均随着MLCK浓度的增加而增大,但二者对肌球蛋白的ATP酶活性的作用没有显着差异（P>0.05）。结论:平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体具有激活非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的作用。
张月[10]（2008）在《肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建、表达及功能研究》文中研究说明目的:肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kianse, MLCK）是调节平滑肌收缩的关键酶。通常情况下,在Ca2+和钙调蛋白（calmodulin, CaM）存在时,MLCK磷酸化肌球蛋白20KD的调节轻链（MLC20）,进而增加肌球蛋白（myosin）Mg2+-ATP酶活性,使肌球蛋白与肌动蛋白（actin）之间发生相互作用,引起肌肉收缩,这是调节平滑肌收缩的经典途径。MLCK作为一种多功能的调节蛋白,除具有磷酸化MLC20的激酶活性外,还具有与肌球蛋白和肌动蛋白结合的非激酶活性。有研究表明,MLCK的非激酶活性在平滑肌的收缩中也起一定的作用。为了更好的研究MLCK的非激酶活性,本实验利用牛胃重组全长野生型MLCK,对其1002-1022氨基酸（即CaM结合位点）进行定点突变,使牛胃MLCK cDNA序列中的T3016、G3017、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056突变为G3016、C3017、G3052、C3053、G3054、G3055、C3056,在氨基酸水平上Trp1006、Arg1018、Leu1019将被突变为Ala。并利用大肠杆菌表达系统成功地进行了大量表达,经纯化获得了重组的MLCK突变体。检测了重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响、MLCK突变体与肌动蛋白的结合的活性以及对体外肌丝运动的影响,进一步证明了MLCK的非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用。方法:根据牛胃重组全长野生型MLCK的cDNA序列设计两条突变引物,通过PCR反应进行定点突变。在大肠杆菌中表达重组全长野生型MLCK（WT/MLCK）和CaM结合位点突变型MLCK（ΔCaM/MLCK）,通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化。SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白。Glycerol-PAGE检测重组MLCK对MLC20的磷酸化水平。孔雀绿方法检测重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响。蛋白结合实验检测Ca2+/CaM对重组MLCK与肌动蛋白结合活性的影响。体外肌丝运动实验（in vitro motility assay）检测重组MLCK对肌动蛋白肌丝运动速度的影响。结果:测序结果显示成功构建了牛胃重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体（ΔCaM/MLCK）。ΔCaM/MLCK可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达,经CaM-Sepharose 4B和Superose 6 HR纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一条带。Glycerol-PAGE显示重组全长野生型MLCK（WT/MLCK）具有磷酸化MLC20的激酶活性,并随着MLCK浓度的增加MLC20的磷酸化水平也逐渐增加,ΔCaM/MLCK则失去了磷酸化MLC20的激酶活性。孔雀绿方法测得的酶活性结果为:在无Ca2+/CaM存在时,随着ΔCaM/MLCK浓度的增加,非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显增加;而磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显降低。结合实验结果表明:WT/MLCK和ΔCaM/MLCK都具有与肌动蛋白结合的能力;Ca2+/CaM可以部分阻断WT/MLCK和肌动蛋白的结合（P<0.05）,而Ca2+/CaM对ΔCaM/MLCK和肌动蛋白结合的影响不大（P>0.05）。体外运动实验结果显示:无Ca2+/CaM存在时,WT/MLCK和ΔCaM/MLCK均抑制肌动蛋白肌丝的运动（P<0.01）;有Ca2+/CaM存在时,WT/MLCK对肌动蛋白肌丝的运动影响不大,而ΔCaM/MLCK对肌动蛋白肌丝的运动则有明显抑制作用（P<0.01）。结论:本实验得到如下结论:1.通过定点突变获得重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体（ΔCaM/MLCK）并可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;经亲和层析和凝胶过滤获得较纯的重组MLCK。2.ΔCaM/MLCK失去了磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链的激酶活性。3.通过重组突变型MLCK（ΔCaM/MLCK）对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性。在无Ca2+/CaM条件下,激活非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性;抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性。4.结合实验结果表明:Ca2+/CaM通过MLCK的1002-1022位氨基酸（CaM结合位点）影响了MLCK与肌动蛋白的结合。5.由体外运动实验结果推测Ca2+/CaM是通过MLCK的1002-1022位氨基酸（CaM结合位点）影响MLCK与肌动蛋白的结合,进而调节了肌动蛋白与肌球蛋白的相互运动。
二、THE CHARACTERIZATION OF MYOSIN LIGHT CHAIN PHOSPHORYLATION BY THE CONSTITUTIVELY ACTIVE FRAGMENT OF MLCK（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、THE CHARACTERIZATION OF MYOSIN LIGHT CHAIN PHOSPHORYLATION BY THE CONSTITUTIVELY ACTIVE FRAGMENT OF MLCK（论文提纲范文）
（1）肌球蛋白调节轻链磷酸化影响肌动球蛋白解离机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肌动球蛋白解离与肌肉品质 |
| 1.1.1 肌动球蛋白形成与解离的分子途径 |
| 1.1.2 肌动球蛋白解离对肉品质的作用 |
| 1.2 肌球蛋白调节轻链的结构与分子功能 |
| 1.2.1 肌球蛋白调节轻链的结构 |
| 1.2.2 肌球蛋白调节轻链的分子功能 |
| 1.3 MRLC磷酸化与肌动球蛋白功能的关系 |
| 1.3.1 活体内MRLC磷酸化修饰研究进展 |
| 1.3.2 宰后肌肉中MRLC磷酸化修饰研究进展 |
| 1.3.3 MRLC磷酸化与肌动球蛋白功能关系研究进展 |
| 1.4 研究背景及内容 |
| 1.4.1 研究背景和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 肌球蛋白调节轻链磷酸化影响肌动球蛋白解离及肌球蛋白降解 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验仪器 |
| 2.2.3 试验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 肌动球蛋白解离程度筛选 |
| 2.3.2 MRLC磷酸化与肌动球蛋白解离程度和肌球蛋白降解的关系 |
| 2.3.3 MRLC磷酸化调节肌动球蛋白解离 |
| 2.3.4 MRLC磷酸化调节肌球蛋白降解 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 离体模型验证肌球蛋白调节轻链磷酸化对肌动球蛋白解离的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验仪器 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 离体模型中不同处理组MRLC磷酸化水平分析 |
| 3.3.2 离体模型中MRLC磷酸化水平差异组肌动球蛋白解离程度分析 |
| 3.3.3 离体模型中MRLC磷酸化水平差异组ATPase活性分析 |
| 3.3.4 离体模型中MRLC磷酸化水平、肌动球蛋白解离及其ATPase活性相关性分析 |
| 3.3.5 离体模型中MRLC磷酸化调节肌动球蛋白解离 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 肌动球蛋白解离相关的肌球蛋白调节轻链磷酸化肽段及磷酸化位点分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验仪器 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 肌肉样品磷酸化组学分析 |
| 4.3.2 MRLC磷酸化与肌动球蛋白解离关系 |
| 4.3.3 MHC磷酸化与肌动球蛋白解离关系 |
| 4.3.4 其它蛋白质磷酸化与肌动球蛋白解离关系 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 肌球蛋白调节轻链特征位点磷酸化调节肌动球蛋白解离的途径研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验仪器 |
| 5.2.3 试验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MRLC磷酸化前后肌动球蛋白分子动力学分析 |
| 5.3.2 MRLC高、中、低磷酸化水平组样品制备分析 |
| 5.3.3 MRLC磷酸化水平差异组样品磷酸化位点鉴定 |
| 5.3.4 MRLC磷酸化水平差异组样品蛋白间相互作用力分析 |
| 5.3.5 等温滴定量热法测定MRLC磷酸化水平差异组肌球蛋白与肌动蛋白的作用力 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 研究总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 项目资助 |
（2）丹参和丹参来源的Sal-miR-1和Sal-miR-3调节血管平滑肌细胞生物学行为的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 丹参来源的Sal-miR-1和Sal-miR-3的鉴定、在小鼠体内的稳定性以及对VSMC的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 OTUD7B介导Sal-miR-1和Sal-miR-3对KLF4和NMHCⅡA表达的调节 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NMHCⅡA通过促进VSMC骨架形成抑制VSMC的迁移和黏附 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 NMHCⅡA与心血管疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）MiR-26b靶向ROCK1调控间充质干细胞迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器设备 |
| 3.主要试剂 |
| 4.试剂配制 |
| 二、实验方法 |
| 1.MSCs的分离培养 |
| 2.Trizol法提取总RNA、反转录成cDNA和实时定量PCR |
| 3.Boyden chamber实验 |
| 4.细胞转染 |
| 5.腺病毒的包装和扩增 |
| 6.免疫印迹(Western blot) |
| 7.细胞免疫荧光染色 |
| 8.大鼠ROCK1的3’UTR双荧光素酶报告基因系统荧光活性检测 |
| 9.真核表达质粒的构建 |
| 10.统计分析 |
| 实验结果 |
| 一、在MSCs中miR-26b可直接靶向ROCK1 |
| 1.miR-26b能够下调MSCs中ROCK1的表达 |
| 2.ROCK1 3’UTR区双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 3.ROCK1是miR-26b的直接靶基因 |
| 二、ROCK1参与miR-26b调控的MSCs迁移 |
| 1.抑制ROCK1的活性能够回复miR-26b Inhibitor对MSCs迁移的抑制作用 |
| 2.高表达ROCK1减弱miR-26b对MSCs迁移的促进作用 |
| 三、miR-26b靶向ROCK1影响Akt信号通路和ROCK1下游分子 |
| 1.miR-26b对Akt信号通路和ROCK1下游分子的影响 |
| 2.同时改变ROCK1和miR-26b对Akt信号通路和ROCK1下游分子的影响 |
| 四、miR-26b对MSCs铺展面积、极性以及MLC分布的影响 |
| 1.ROCK1参与调控miR-26b对MSCs面积、周长和极性的影响 |
| 2.高表达miR-26b后磷酸化肌球蛋白轻链在MSCs中分布的变化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间已发表及待发表的论文 |
| 本研究所获基金资助 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）平滑肌肌球蛋白的磷酸化调节机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 图序 |
| 表序 |
| 目录 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肌球蛋白超家族 |
| 1.3 第Ⅱ类肌球蛋白 |
| 1.4 平滑肌肌球蛋白(Smooth Muscle Myosin,SmM) |
| 1.4.1 平滑肌肌球蛋白的结构 |
| 1.4.2 平滑肌肌球蛋白的磷酸化调节机制 |
| 1.4.3 肌球蛋白轻链激酶(Myosin Light Chain Kinase,MLCK) |
| 1.4.4 肌球蛋白磷酸酶(MP) |
| 1.5 研究背景 |
| 1.6 研究意义 |
| 第二章 平滑肌肌球蛋白的双头结构在磷酸化调节中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 质粒与菌种 |
| 2.2.4 基因克隆 |
| 2.2.5 真核细胞蛋白表达与纯化 |
| 2.2.6 ATP水解酶活力测定 |
| 2.2.7 蛋白酶处理Sm849 |
| 2.2.8 凝胶过滤层析 |
| 2.2.9 蛋白梯度胶的配制 |
| 2.2.10 电镜实验 |
| 2.2.11 非变性胶电泳 |
| 2.2.12 平滑肌肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的制备 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 平滑肌肌球蛋白不同截短蛋白的获得 |
| 2.3.2 平滑肌肌球蛋白二聚化的鉴定 |
| 2.3.3 维持平滑肌肌球蛋白稳定二聚化所需要的关键尾部区域 |
| 2.3.4 双头结构对于平滑肌肌球蛋白的磷酸化依赖的激活是必须的 |
| 2.3.5 酶解增加了S1的ATP水解酶活力 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 平滑肌肌球蛋白头尾相互作用在磷酸化调节中的作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 平滑肌肌球蛋白943之前的尾部参与头尾相互作用 |
| 3.3.2 平滑肌肌球蛋白899之后的尾部参与头尾相互作用 |
| 3.3.3 尾部的酸性氨基酸参与了头尾相互作用 |
| 3.3.4 头部的碱性氨基酸参与了头尾相互作用 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（5）肌球蛋白磷酸化的研究进展（论文提纲范文）
| 1肌球蛋白的结构与功能 |
| 2肌球蛋白轻链的磷酸化 |
| 2.1肌球蛋白轻链磷酸化的作用机制 |
| 2.2肌球蛋白轻链磷酸化的主要生物学功能 |
| 2.2.1磷酸化对细胞迁移的调节 |
| 2.2.2磷酸化对细胞收缩行为的影响 |
| 2.2.3磷酸化对细胞形态与凋亡的影响 |
| 2.3肌球蛋白轻链磷酸化的最新研究成果 |
| 2.3.1 β-抑制蛋白调控的磷酸化 |
| 2.3.2ELC与RLC相互作用对磷酸化的影响 |
| 3肌球蛋白重链的磷酸化 |
| 3.1重链磷酸化的作用机制 |
| 3.2肌球蛋白重链磷酸化的生物学功能及最新研究成果 |
| 3.2.1重链磷酸化对癌细胞迁移的调控 |
| 3.2.2棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ重链磷酸化对MgATPase活性的调控 |
| 4小结与展望 |
（6）肌球蛋白轻链激酶cDNA克隆及其CaM结合位点突变体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）肌球蛋白轻链在血管平滑肌舒缩中的机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 肌球蛋白结构及功能 |
| 2 血管平滑肌舒缩机制 |
| 3 肌球蛋白轻链在血管平滑肌舒缩中的作用 |
| 3.1 经典途径调节 |
| 3.2 非钙依赖性途径 |
| 3.3 非激酶途径 |
| 4 小 结 |
（8）肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 1.2.1△Ca M/MLCK表达载体构建及蛋白纯化 |
| 1.2.2孔雀绿方法检测ATP酶活性 |
| 1.2.3统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1△Ca M/MLCK蛋白的纯化 |
| 2.2△Ca M/MLCK对非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的作用 |
| 2.3△Ca M/MLCK对磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的作用 |
| 3 讨论 |
（9）平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体对ATP酶活性的调节作用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MLCK的ATP结合位点定点突变表达载体的构建 |
| 1.2.2 牛胃平滑肌重组全长MLCK的表达及纯化 |
| 1.2.3 肌球蛋白的提取及鉴定 |
| 1.2.4 磷酸化肌球蛋白的制备 |
| 1.2.5 肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性检测 |
| 1.2.6 蛋白质定量 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组MLCK (野生型) 和MLCK/△ATP (突变型) 对肌球蛋白轻链磷酸化的影响 |
| 2.2 重组MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的作用 |
| 2.3 重组MLCK对磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的作用 |
| 3 讨论 |
（10）肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建、表达及功能研究（论文提纲范文）
| 一、正文 |
| （一） 中文摘要 |
| （二） 英文摘要 |
| （三） 前言 |
| （四） 材料和方法 |
| （五） 结果 |
| （六） 讨论 |
| （七） 结论 |
| （八） 参考文献 |
| 二、文献综述 |
| （一） 综述 |
| （二） 参考文献 |
| 三、致谢 |
四、THE CHARACTERIZATION OF MYOSIN LIGHT CHAIN PHOSPHORYLATION BY THE CONSTITUTIVELY ACTIVE FRAGMENT OF MLCK（论文参考文献）
- [1]肌球蛋白调节轻链磷酸化影响肌动球蛋白解离机理[D]. 曹立创. 中国农业科学院, 2019(09)
- [2]丹参和丹参来源的Sal-miR-1和Sal-miR-3调节血管平滑肌细胞生物学行为的作用机制[D]. 杨高山. 河北医科大学, 2019(01)
- [3]MiR-26b靶向ROCK1调控间充质干细胞迁移的机制研究[D]. 刘书婷. 苏州大学, 2018(01)
- [4]平滑肌肌球蛋白的磷酸化调节机理[D]. 马荣钠. 中国科学技术大学, 2015(09)
- [5]肌球蛋白磷酸化的研究进展[J]. 郝丽娟,康志琼,马上上,吕鹏,姚勤,陈克平. 生命科学研究, 2015(02)
- [6]肌球蛋白轻链激酶cDNA克隆及其CaM结合位点突变体的构建[D]. 殷璐. 大连医科大学, 2012(01)
- [7]肌球蛋白轻链在血管平滑肌舒缩中的机制研究进展[J]. 焦东东,蔡辉. 中西医结合心脑血管病杂志, 2009(12)
- [8]肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体对肌球蛋白ATP酶活性的影响[J]. 赵莹,张月,吕广艳,王辉,崔颖,魏晓晴,陈海波,高颖. 现代生物医学进展, 2009(18)
- [9]平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体对ATP酶活性的调节作用[J]. 崔颖,谢策,吕广艳,王辉,赵莹,魏晓晴,曲淑贤,曹晶萍,高颖. 现代生物医学进展, 2009(16)
- [10]肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建、表达及功能研究[D]. 张月. 大连医科大学, 2008(02)