一、狂犬病毒CTN株核蛋白基因的克隆与序列分析（论文文献综述）
任元雪[1]（2021）在《狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用》文中研究说明研究背景:狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起狂犬病在人和动物间发生,造成宿主100%的死亡,严重威胁公共卫生安全。狂犬病病毒颗粒内部核心组成为核蛋白与病毒RNA结合形成核衣壳复合物,其中核蛋白除作为狂犬病病毒颗粒的重要组成部分之外,还承担着调控病毒复制,激活宿主免疫的功能,也可用于体外检测、病毒分型等。获得高纯度的核蛋白是开展基础科研和应用研究的基础,目前已有学者使用真核系统对核蛋白进行重组表达,但成本较高,操作复杂,也难以获得大量的核蛋白,其他学者使用原核系统对核蛋白进行表达,多以包涵体的形式出现,有人尝试使用融合标签或对其中部分序列进行截短表达,但难以获得具有生物学活性的核蛋白。本实验在CTN-1株的基础上对核蛋白编码序列进行优化,采用不同的表达条件促进核蛋白的可溶性表达,以期获得高产量、高纯度的具有生物学活性的核蛋白,并对其进行初步应用。研究方法:1、提取狂犬病病毒CTN-1株病毒总RNA,RT-PCR扩增出狂犬病病毒CTN-1株全长N基因,并在基因两端添加NdeI和XhoI位点,构建重组质粒pET-43.1a-NP。在大肠杆菌BL21（DE3）株诱导表达,使用SDS-PAGE和Image Lab软件分析其表达结果。2、重组质粒pET-43.1a-NP在大肠杆菌中未有表达,对N基因序列进行优化,通过替换稀有密码子,调整GC含量,优化mRNA的二级结构,人工合成基因后构建pET-43.1a-CTN-NP（Opti）表达质粒。通过改变诱导条件,优化诱导时间,提高核蛋白的表达产量。按照最佳表达条件大量诱导大肠杆菌,裂解和超声破碎诱导后菌液,离心后分别收集上清和沉淀,对沉淀使用盐酸胍溶解,使用固定化Ni2+螯合层析纯化。通过改变缓冲液的配方,在低温下对重组核蛋白进行复性。3、为了获得狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,对其诱导温度、IPTG浓度和诱导时间进行摸索。对可溶性表达的重组狂犬病病毒CTN-1株核蛋白使用Ni2+螯合层析纯化,通过电泳分析其纯化效果并进行Western Blot验证其反应原性。将可溶性的核蛋白、复性的核蛋白、阴性对照、阳性对照免疫小鼠,采集小鼠血清,用狂犬病核蛋白抗体检测试剂盒检测重组核蛋白免疫原性。4、以本研究所表达的具有反应原性和免疫原性的核蛋白为基础,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白最适包被浓度、包被温度、包被时间、封闭液和封闭条件以及二抗浓度的优化,初步建立可检测狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法,并用已知样本初步验证该方法的实用性和重复性。研究结果:1、通过构建狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,SDS-PAGE电泳发现诱导后菌液与诱导前菌液表达无明显差别,需要进一步对基因序列进行优化以提高表达产量。2、对狂犬病病毒CTN-1株N基因进行优化,优化序列与原始序列相比GC含量提升至51.5%,61个稀有密码子全部进行了替换,N基因的密码子适应指数（CAI）值由0.19提升至0.95。经过软件分析,优化后序列的mRNA二级结构更稳定。3、优化后狂犬病病毒CTN-1株N基因在大肠杆菌中诱导表达,在50 kD左右出现明显蛋白条带,表达产量明显提升。为了进一步提高核蛋白表达产量,对诱导时间和大肠杆菌OD值进行优化,发现当OD600为0.5、诱导5 h时为最佳表达条件,产量可达到32.3%。大肠杆菌大量诱导表达后,核蛋白以包涵体表达,使用基于Ni2+的螯合层析进行纯化,纯化后蛋白纯度为95.8%。通过对诱导剂使用浓度、诱导温度和诱导时间的优化,可以实现在16℃条件下过夜诱导,得到可溶性表达的核蛋白,进行纯化后获得了高纯度的核蛋白。4、狂犬病病毒CTN-1株重组核蛋白经Western Blot检测,在50 kD左右出现明显条带,说明核蛋白能够被核蛋白的特异性抗体结合,具有良好的反应原性。将重组核蛋白免疫小鼠后采集血清,抗体效价可达到1:320,证明核蛋白具有良好的免疫原性。5、已知血清样本的验证结果提示,本研究所建立的间接ELISA定性检测结果的阴阳性符合率为100%,批内与批间OD450值的变异系数均低于10%。研究结论:本实验在狂犬病病毒CTN-1株核蛋白原始序列表达产量较低的情况下,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白进行密码子优化,构建了重组表达质粒pET-43.1a-CTN-NP（Opti）,并通过降低诱导温度和延长诱导时间等条件实现了核蛋白在大肠杆菌表达系统中大量的可溶性表达。Western Blot和动物试验结果显示,本实验所表达的核蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。在此基础上,本研究初步建立了可检测抗狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法。
刘洋[2]（2015）在《人源抗狂犬病毒磷蛋白基因工程抗体及细胞内抗体的研究》文中提出本研究采用Fab噬菌体载体pComb 3H系统,选择了5位体内含高滴度的抗狂犬病毒抗体的志愿者,采集他们的抗凝外周血并分离淋巴细胞,提取细胞内的总RNA,并逆转录为互补的cDNA,利用人Fab抗体引物扩增抗体轻链和重链Fd段因片段,分别通过轻链酶切位点Sac I/Xba I和重链链酶切位点Xho I/Spe I克隆入pComb 3H噬菌体抗体库载体,构建成人源抗狂犬病毒的噬菌体Fab抗体库。将Fab抗体库菌库包装成噬菌体库,使用纯化的狂犬病毒颗粒aG株和CTN株对噬菌体库进行富集筛选,在最后一轮筛选富集后,挑取每个库至少挑取200个克隆进行原核诱导表达,包被抗人Fab抗体检测Fab抗体表达上清进行抗体表达检测,包被病毒颗粒检测抗体结合的特异性,双阳性克隆序列测定获得序列,登录VBASE2网站,输入抗体序列,通过与数据库中序列比较,确定抗体的轻链亚类和重链类型,以及可变区的CDR区基因。我们获得2株重链相同轻链相似的Fab抗体,选择其中一株表达为IgG全抗体,通过ELISA.免疫印迹和间接免疫荧光实验证实抗体特异性结合磷蛋白。虽然中和试验表明磷蛋白抗体并没有中和病毒的作用,但磷蛋白可以结合核蛋白、聚合酶蛋白,在调节病毒转录和复制过程发挥作用。分析磷蛋白序列,利用截短突变的方法确定表位,以狂犬病病毒磷蛋白全长为模板,N端截短,C段不变,构建P1,P2,P3,P4,P5截短克隆；C端截短,N段不变,每隔20个氨基酸进行截短,构建△C20,△C40,△C60,△C80,△C100截短克隆,截短片段C端带有HIS标签,瞬时转染表达,WB分析表位。结果显示,磷蛋白截短克隆P1、P2、P3、P4、P5和P△C20、P△C40、P△C60、P△C80、P △C100与抗HIS抗体反应,说明磷蛋白截短蛋白均有表达；而只有P1,P2,P3, P4,P5和P△C20与RV1A2反应,P△C40,P△C60,P△C80,P△C100却没有反应,提示目的表位位于257～277位氨基酸之间。随后构建更短截短片段的截短突变,将表位定于262～266位氨基酸（VLGWV）之间。查询磷蛋白晶体结构（186～297）（PDB：1VYI）,分析磷蛋白3D结构和抗原抗体对接,推测RV1A2结合W265氨基酸。分析狂犬病毒属7种基因型的129条序列,发现该位点（VLGWV）高度保守。将RV1A2抗体改造为单链抗体（scFv）,克隆入真核细胞表达载体pEF/myc/cyto中,在细胞质内定位表达,保证80%以上的细胞均有阳性表达。用狂犬病病毒攻击毒株CVS-11进行染毒,染毒后一到四天每天鉴定细胞内病毒复制情况和上清中病毒分泌情况。研究显示,细胞内抗体具有明显的病毒复制抑制功能,抗磷蛋白细胞内抗体在病毒易感细胞MNA细胞的表达会降低上清中的病毒滴度。由于抗体表位位于C端,与P1, P2, P3, P4, P5均能结合,具有较好的的结合广谱,而且该位点高度保守,因此狂犬病病毒磷蛋白C端会是一个较好的作用靶点。然而细胞内抗体抑制病毒增殖只是初步试验,还需要更进一步证据。细胞内抗体作为一种药物靶点,如何穿过血脑屏障和精确的细胞内定位,还有很长的路要走。
尹景峰[3]（2014）在《牛狂犬病的病毒全基因组序列分析及病理学研究》文中认为狂犬病是由狂犬病病毒引起的侵害中枢神经系统的一种人畜共患传染病,致死率几乎为100%。2010年底至2013年初,在内蒙古自治区一些奶牛饲养场和放牧区出现了奶牛狂犬病样病例,本文结合本次牛病,对该地区牛狂犬病病毒的分子生物学特征和致病性做了较深入研究,以为狂犬病的防治提供依据。本研究对24个奶牛饲养场（户）和1个放牧区17个病例（12例病牛和5例病犬）进行发病情况、流行病学调查和临床症状观察,以及对病死牛的病理学检查、免疫荧光染色和病毒核酸检测。选取3例典型病例的脑组织通过乳鼠脑内接种,分离病毒。根据GenBank狂犬病病毒的基因序列,设计了PCR的16对引物和末端测序的3条引物,采取RACE和RT-PCR方法,对全基因组序列分段扩增,拼接出病毒的全基因组序列,并对其进行序列比对和遗传演化分析。应用分离的毒株分别经肌肉和脑内接种不同年龄段（1日、4日、10日、2周、3周和4周）的小鼠,研究不同病毒毒株的毒力及其在脑内的分布和定位特征。用分离的毒株脑内接种10日龄乳鼠,在发病濒死期扑杀乳鼠,取脑组织,应用病理组织学染色、透射电镜、免疫荧光、原位杂交等方法,研究脑组织的病理组织学变化、超微结构病变、细胞凋亡、炎性细胞特征、神经细胞突起（MAP-2）的病变,以及病毒抗原与神经细胞突起病变、IL-1β mRNA、 RANTES mRNA和TIMP-1mRNA表达阳性细胞的相关性。结果表明：（1）17例病例RABV核酸阳性率为100%；牛狂犬病病理组织学病变群主要为神经细胞内形成胞浆内嗜酸性包涵体、非化脓性脑炎、肉芽肿样病变和变质性变化。（2）通过乳鼠脑内接种,分离到3株狂犬病病毒,分别命名为CNM1101C、 CNM1103C和CNM1104D,其基因组全长分别为11924nt、11917nt和11924nt, GenBank登陆号分别为KC193267、KC252633和KC252634。3株病毒均具有狂犬病病毒基因组的典型结构特征,基因组（G+C）%含量平均为44.56%,均属于基因Ⅰ型。（3）本研究分离的3株病毒与GenBank已公布的60株狂犬病毒各编码蛋白和基因同源性分析表明,N、P、M、G和L基因与编码蛋白的同源性依次为88.7%～100%（97.2%～100%）、85.4%～100%（91.3%-100%）、88.3%～100%（93.4%～100%）、85.8%～100%（91.6%～100%）和87.3%～99.9%（95.2%～100%）,5个蛋白的保守性依次为P<G<M<L<N。（4）本研究分离的3株病毒各结构蛋白的主要功能位点保守,但部分位点亦有氨基酸的突变发生,这种突变对病毒的毒力和免疫原性可能会产生影响。此外,CNM1103C株病毒与蒙古狼源和俄罗斯红狐分离株拥有较近的亲缘关系,CNM1101C和CNM1104D株病毒与大陆流行株亲缘关系较近。（5）3株病毒两种感染途径致小鼠发病年龄及病死率结果显示,3株病毒株的毒力强弱次序依次为CNM11O1C>CNM11O3C>CTN。3株病毒株在濒死小鼠脑内绝大多数部位均有病毒的感染,其中以小脑和脑干的病毒量较多,但不同的病毒株在脑内的分布略有不同。（6） CNM1101C、CNM1103C和CTN3株狂犬病病毒感染乳鼠后,脑组织的病理学变化有一定程度不同。感染3株病毒乳鼠脑组织中,病毒抗原阳性细胞包括神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。（7）狂犬病毒强毒和弱毒的感染均可引起乳鼠脑组织细胞TIMP-1mRNA、 RANTES mRNA和IL-1βmRNA表达上调,但弱毒在脑内引起的TIMP-1mRNA和IL-1βmRNA2种炎症因子的表达高于强毒,弱毒在脑内引起的RANTES mRNA炎症因子的表达不及强毒；即使是强毒,在脑内引起3种炎症因子的表达与其集中发生的部位也因毒株的不同而有差异。研究表明：本研究所检的11例奶牛、1例黄牛和5例犬病例均为狂犬病。分离到的3株病毒均具有狂犬病病毒基因组的典型结构特征,均属于基因Ⅰ型；各结构蛋白的主要功能位点保守,但部分位点亦有氨基酸的突变发生；CNM1103C株病毒与蒙古狼源和俄罗斯红狐分离株亲缘关系较近,CNM1101C和CNM1104D株病毒与大陆流行株亲缘关系较近。不同毒力狂犬病毒株感染乳鼠后引起脑组织不同程度的病理变化。感染3株病毒乳鼠脑组织RABV抗原阳性细胞有神经细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞。
于礼[4]（2012）在《人源抗病毒基因工程抗体功能表位研究 ——鸡尾酒式抗狂犬病毒抗体—发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体》文中研究指明噬菌体抗体库技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并已成功研发大量人源性抗体用于科学研究、疾病诊断和临床治疗。噬菌体抗体库技术是在噬菌体表面表达Fab或scFv形式,将抗体蛋白融合表达在噬菌体外壳蛋白的N端,经过一个“吸附一洗脱一扩增”的富集过程,可以从抗体库中获得不同靶向性的特异性抗体,进而通过各种实验方法对抗体功能进行鉴定。本研究利用scFv噬菌体抗体库系统作为平台技术,分别对狂犬病毒和发热伴血小板减少综合征病毒进行人源基因工程抗体的筛选和功能鉴定,本研究主要分为两部分内容：一、鸡尾酒式人源抗狂犬病毒基因工程抗体的研究狂犬病是由狂犬病毒（Rabies Virus,RV）引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科狂犬病毒属,基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,主要具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号中和性抗原位点。根据世界卫生组织推荐,对狂犬病Ⅲ级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白的方法。由于目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白和马抗狂犬病毒免疫球蛋白存在缺陷,由于狂犬病毒糖蛋白的序列并不十分保守,使用针对单一中和抗原位点的单克隆抗体不能起到广谱安全的疗效,因此,研制具有广谱抗狂犬病毒中和活性的单克隆抗体,并将针对不同表位的中和抗体联合组成鸡尾酒式配伍制剂就显得尤为重要。本研究scFv噬菌体表面展示技术为平台,从狂犬疫苗免疫者中获得抗体基因,用特异性PCR引物扩增抗体重链和轻链可变区基因,构建人源抗狂犬病毒噬菌体抗体库,经过高效噬菌体包装,通过亲和筛选获得5株抗狂犬病毒scFv抗体（RV1C3、RV2G12、RV1C5、RV1A11、RV2F5）。scFv抗体通过VH/VK双质粒系统真核进行IgG抗体表达,纯化后利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot和亲和力测定等实验方法对获得的IgG抗体进行功能鉴定,结果表明5株人源IgG抗体均特异性结合狂犬病毒糖蛋白,亲和力达到10-9M以上。利用快速免疫荧光灶抑制中和试验对单抗的中和活性进行检测,结果表明5株单抗对狂犬病毒aG株具有中和活性,但对狂犬病毒CVS株缺乏中和活性。通过竞争ELISA结合糖蛋白中和表位的关键位点突变对抗体结合表位进行鉴定,结果表明我们获得的5株抗体识别的Ⅱ号抗原表位。为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的特异性抗体,我们采用scFv噬菌体展示平台,对一株糖蛋白Ⅲ号表位中和抗体CR4098采用链置换法进行改造,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,经真核表达IgG抗体,通过ELISA,IFA、亲和力测定及中和试验验定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,亲和力达到2.8×10-gM,对狂犬病毒aG株和CVS株均具有良好的中和活性。通过竞争ELISA结合糖蛋白中和表位的关键位点突变对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别的糖蛋白Ⅲ号抗原表位。我们分别选取分别针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号抗原表位的三株单克隆抗体对CR57、RV08和RV3A5进行狂犬病毒多种毒株的交叉中和试验,显示三种抗体鸡尾酒式配伍对不同毒株均具有较好的中和活性。对CR57、RV08和RV3A5进行狂犬病毒暴露后动物保护活性测定,用狂犬病毒CVS-11株对仓鼠攻毒,单独或三株抗体配伍进行免疫保护,结果发现三株人源单克隆抗体及鸡尾酒配伍均产生良好的动物保护活性。综上所述,本部分研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建人源抗狂犬病毒scFv噬菌体抗体库,通过高通量筛选获得具有高亲和力的特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源抗体,良好的中和活性及动物保护活性,为鸡尾酒式单克隆抗体配伍制剂取代RIG做为狂犬病暴露后预防的被动免疫制剂奠定了基础。二、人源抗发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体及表位研究发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Seve fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV）属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,作为一种新发病毒,人们对SFTSV感染过程及其在体内引发的体液免疫了解甚少,本研究采用噬菌体抗体库系统筛选人源抗SFTSV单克隆抗体,探讨机体对SFTSV感染引发体液免疫反应的机制。首先我们从山东省2位发热伴血小板综合征恢复期病人外周血中分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,逆转录cDNA,利用人特异性IgGl引物扩增抗体轻链和重链Fd段基因片段,分别克隆入pComb 3H载体,构建成人源抗SFTSV的Fab噬菌体抗体库。为筛选到目的蛋白的特异性抗体,我们分别采用纯化的SFTSVHB29株病毒颗粒及重组核衣壳蛋白NP对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过三轮“吸附-洗脱-富集”过程,随机挑选1200个Fab克隆进行原核表达,通过ELISA和IFA方法进行检测,结果共获得94株序列不同的特异性针对SFTSV核蛋白的人源Fab单克隆抗体,未获得针对病毒糖蛋白的特异性抗体。另外,通过传统杂交瘤技术制备针对SFTSV病毒颗粒的鼠源单克隆抗体,在随机挑选的1000个克隆中,462个克隆针对核蛋白,16株针对糖蛋白。在人源和鼠源单克隆抗体的基础上,通过竞争ELISA、分子模拟和定点突变对SFTSV核蛋白进行表位研究,竞争ELSIA结果表明SFTSV核蛋白至少存在4个不同的抗原表位,基于分子对接预测的定点突变实验表明核蛋白N端第10位谷氨酸突变为丙氨酸时,大部分人源单克隆抗体对核蛋白的结合活性明显降低甚至消失。综上所述,本部分研究成功从SFTS病人中分离到大量针对核蛋白的单克隆抗体,表明核蛋白具有强免疫原性,在SFTSV感染引发的机体体液免疫中发挥重要作用,并通过表位分析发现氨基端是核蛋白最主要的抗原表位,为SFTSV感染的诊断和研究提供了分子基础。
陈哲,孙丽娜,李川,吕新军,唐青,梁米芳,李德新[5]（2010）在《人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制》文中研究说明从具有高滴度狂犬病毒抗体的多位疫苗注射者采集外周血淋巴细胞,构建人源抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库。用纯化的狂犬aG和CTN株病毒颗粒富集筛选所得Fab噬菌体抗体文库,利用ELISA和间接免疫荧光法IFA鉴定所得人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性,并通过序列测定确定所得抗体的轻链和重链的型别,成功获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆Fab抗体。将其中5株人源单克隆Fab抗体的轻链和重链分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒系统实现全抗体的分泌型表达。5株全抗体在体外与狂犬病毒CVS-11株的中和反应中均显示具有狂犬病毒中和活性。人源中和性抗狂犬病毒基因工程全抗体的获得为我国自行生产抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒奠定了物质基础。
陈哲[6]（2010）在《人源抗狂犬病毒基因工程抗体研究》文中研究指明狂犬病是由狂犬病毒（Rabies Virus, RV）引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。狂犬病毒属弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）,基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,与病毒的毒力、致病性密切相关。根据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）推荐,对狂犬病III级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白（rabies immune globulin, RIG）的方法。目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白（human rabies immune globulin, HRIG）和马抗狂犬病毒免疫球蛋白（Equine rabies immune globulin, ERIG）。但ERIG副反应比较严重,而且对某些疫苗的抗体反应有抑制,HRIG价格昂贵,供应量有限并且有潜在的病原威胁。抗狂犬病毒单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）具有中和效果高,安全性好,成本低,可大量生产等优点,能够取代RIG用于狂犬病的暴露后预防。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,筛选人源抗狂犬病毒中和抗体,实验有以下三部分：一,人源抗狂犬病毒Fab噬菌体抗体库的构建与筛选我们首先采集具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗注射者外周血,分离淋巴细胞,然后提取总RNA并合成cDNA,接着用特异性的PCR引物扩增特异性轻链和重链Fd段基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链基因与噬菌粒pComb3构建了轻链库,随后将重链基因克隆入轻链库中构建Fab噬菌体抗体库。最后使用辅助噬菌体对Fab噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建的Fab噬菌体抗体库的容量为4.5×108,轻链插入率和重链插入率均为100%,完全满足我们筛库的需要。在成功构建Fab噬菌体抗体库的基础上,用纯化的狂犬病毒颗粒aG和CTN株对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,然后与Genebank报道的抗体序列进行比较,根据抗体基因序列推断出其氨基酸序列,与vbase database比较,确定其CDR区。结果我们获得11株Fab抗体,序列测定结果证明其序列均为新的抗体序列,间接免疫荧光试验证明均针对狂犬病毒糖蛋白。二,人源抗狂犬病毒全抗体表达及功能鉴定在原核表达Fab抗体的基础上,我们利用昆虫杆状病毒载体技术平台实现了全抗体的真核表达。我们将11株Fab抗体中5株Fab抗体（RVFab1、RVFab3、 RVFab5、RVFab8、RVFab9）的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAC-L-Fc,然后将构建好的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞,通过IFA检测转染效果,接着纯化和扩增重组病毒,对表达产物进行纯化。利用SDS-PAGE、 ELISA、IFA等方法纯化的抗狂犬病毒IgG全抗进行功能鉴定,结果表明5株人源单克隆抗体均特异性针对狂犬病毒糖蛋白。利用非竞争ELISA检测5株抗体的亲和力,均高达10-9M。利用快速免疫荧光灶抑制中和试验对单抗的中和活性进行检测,结果表明5株单抗均具有较好的中和活性。三,人源抗狂犬病毒中和抗体表位研究通过竞争ELISA对5株抗体与抗原结合表位的相互关系进行鉴定,结果表明,5株抗体所识别的抗原表位彼此间存在相互重叠的关系。进一步利用竞争ELISA对5株抗体与一株针对狂犬病毒糖蛋白I号中和表位的抗体RVIgG57进行鉴定,结果表明,5株抗体与RVIgG57所识别的抗原表位均不存在相互重叠的关系。通过生物信息学分析狂犬病毒糖蛋白关键抗原位点,并结合相关文献报道,设计针对狂犬病毒糖蛋白三个主要中和位点的点突变,通过IFA分析人源抗体与中和位点突变体的结合活性。结果表明：我们获得的5株抗体均针对狂犬病毒糖蛋白II号中和表位,而RVIgG57针对狂犬病毒糖蛋白I号中和表位,与文献描述一致。综上所述,本研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建了人源抗狂犬病毒Fab噬菌体抗体库,筛选获得了11株特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源Fab抗体。将其中5株构建为IgG全抗体,显示均具有高亲和力和高中和活性,并且针对狂犬病毒糖蛋白II号中和抗原表位。这一结果的获得为单克隆抗体取代RIG做为狂犬病暴露后预防的被动免疫制剂奠定了基础。
熊成龙,邵中军,郑刚,居丽雯,周联娣,姜庆五[7]（2010）在《河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析》文中指出目的分析河南省9株狂犬病毒的核蛋白基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性的可能变异。方法以RT-nested-PCR扩增9株2006年12月分离于河南省信阳市的狂犬病毒街株,经纯化、克隆、测序后获得9条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析。结果9株狂犬病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为97.5%～99.3%和98.4%～99.8%;病毒与CTN疫苗的核苷酸序列同源性最高,为88.9%～90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%～98.0%;与其他疫苗株相比,9株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%～87.9%和94.2%～97.3%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代。结论9株河南省狂犬病毒流行株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,这些变异可能影响疫苗对流行株所致狂犬病的保护效果。
刘富强,陈立章,高立冬,张红[8]（2010）在《湖南省20株狂犬病毒株与疫苗株N基因序列分析》文中认为目的分析湖南省狂犬病毒株与疫苗株的N基因序列及遗传进化关系,从基因角度解决疫苗的选择问题,为狂犬病的防治提供科学依据。方法采用RT-PCR法从市售家犬脑组织标本内获得N基因并进行测序,采用DNAStar软件包中的MegAlign软件,将所得结果与国内外发表的代表性疫苗株相应基因进行核苷酸、氨基酸序列同源性比对分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发生树。结果湖南省20株狂犬病毒与国内外13株疫苗代表的株核苷酸同源性在85.3%～94.2%（中位数88.6%）。相应地,N基因编码的氨基酸序列同源性为95.4%～99.6%（中位数99.2%）。其中,与中国疫苗株CTN、SRV-9,国外疫苗株CVS、RBE3-15、SADB19-1st及HEP-Flury株的氨基酸序列同源性范围在99.2%～99.6%,并以与CTN疫苗株同源性中位数最高（90%）。系统发生分为两大群。湖南省20株研究毒株与中国人用CTN株具有很高的亲缘性,构成第一群。其余的疫苗毒株构成第二基因群。结论湖南省狂犬病毒株与中国人用疫苗株CTN同源性最高、亲缘关系最近,因此在湖南省使用CTN疫苗株效果可能较好。
刘富强[9]（2009）在《湖南省1988～2007年狂犬病流行病学研究》文中研究说明目的分析湖南近20年狂犬病的流行特征,探讨狂犬病发病和潜伏期的影响因素,为制定狂犬病防制策略提供科学依据。方法收集湖南省1988-2007年狂犬病法定疫情报告数据,进行描述性流行病学研究,对湖南省2004-2007年1059份狂犬病个案资料采用Epidata3.1软件录入数据库,运用SPSS13.0统计软件包,采用非参数检验（Mann-whitney U检验和Kruskal-Wallis检验）分析潜伏期长短的影响因素,用非条件logistic回归分析暴露后接种人用狂犬疫苗的影响因素。结果1988-2007年20年间,湖南省共报告狂犬病例4401例,年均发病率为0.35/10万,疫情呈现先下降后上升的“V”形趋势。全省14个市（州）均有病例报告,病例数多集中在湘南与湘中地区,永州、郴州、邵阳、衡阳、怀化5个市共报告2378例（占全省54.03%）。发病数以7-10月较多,2-4月较少；发病率最高是5-9岁年龄组,其次是10-14岁、65-69岁年龄组。农民占的比例最大（61.21%）,其次是学生（18.95%）。1059例狂犬病例中,潜伏期范围为7天-2760天,潜伏期中位数是56天,病程范围为O-13天,病程中位数是3天。病例潜伏期长短与年龄、职业、暴露程度、暴露部位、伤口处理方法、伤口冲洗、伤口消毒、伤口缝合、暴露后接种人用狂犬疫苗、暴露前免疫、以及伤人动物种类、伤人动物来源、动物伤人原因、共13个因素有关（经Mann-whitney U检验或Kruskal-Wallis检验,P<0.05）。暴露程度为Ⅱ级（OR=0.450,95%CI0.247-0.820）、未处理（OR=0.365,95%CI0.173-0.768）、伤口处理方式为其它（OR=0.102,95%CI0.023-0.464）是暴露后人用狂犬疫苗接种的保护因素,医疗机构处理（OR=31.467,95%CI 13.839-71.550）,伤口处理方式为伤口冲洗（OR=2.300,95%CI 1.145-4.622）,伤口处理方式为伤口缝合（OR=2.556,95%CI 1.090-5.993）是暴露后人用狂犬疫苗接种的危险因素。结论湖南省狂犬发病经历了1988-1996年下降期后,近年来又呈现上升的趋势。家犬的免疫接种率低、疫苗质量不高、伤后处理不及时,不规范、各部门之间缺乏协作等是狂犬病发病的原因,加强农村地区重点人群预防狂犬病的健康教育、提高暴露后伤口处理率及免疫接种率,是狂犬病防制的主要措施。目的了解湖南省家犬狂犬病病毒的感染状况,建立狂犬病实验室诊断技术平台,为防制狂犬病提供科学依据。方法2005年11月-2006年1月在狂犬病高、中、低发病地区按照分层抽样原则分别选择冷水滩区、邵东县、桃源县、湘乡市、泸溪县5个县（市、区）,2007年4月-2008年3月选择在全省14个市州的14个县（市）,由当地疾病预防控制中心工作人员按随机抽样的方法收集市售家犬的脑组织标本,冷冻条件下送湖南省疾病预防控制中心,采用直接免疫荧光法（DFA）初筛检测狂犬病病毒抗原和巢式RT-PCR方法检测狂犬病病毒特异性核酸进行确证。结果2005-2008年共检测犬脑组织标本1613份,通过DFA检测阳性80份,而经巢式RT-PCR确证阳性标本为67份,犬只狂犬病病毒感染率为4.15%。2005-2006年检测冷水滩区、邵东县、桃源县、湘乡市、泸溪县家犬感染率分别为1.83%、7.24%、5.88%、2.63%、1.97%,不同的地区犬只的狂犬病病毒感染率差异有统计学意义（χ2=9.673,P<0.05）。2007-2008年检测邵阳县、湘乡市、茶陵县、蓝山县家犬狂犬病病毒感染率分别为26.87%、13.83%、10.42%、6.94%,其余10个县未检测出阳性标本,不同的地区家犬的狂犬病病毒感染率差异有统计学意义（χ2=33.846,P<0.01）,以邵阳市、永州市、湘潭市等地区的家犬感染率较高。雄性、雌性家犬狂犬病病毒感染率分别是4.68%和2.85%（χ2=2.556,P>0.05）；大型、中型家犬的狂犬病病毒感染率分别为4.57%和3.02%（χ2=1.542,P>0.05）；成年犬、幼年家犬的狂犬病病毒感染率分别为4.95%和1.57%（χ2=11.133,P<0.01）；注射、未注射过兽用狂犬疫苗的家犬狂犬病病毒感染率为1.29%、4.63%（χ2=4.762,P<0.05）；春、夏、秋、冬季家犬狂犬病病毒感染率分别为9.56%、7.53%、2.31%、3.23%（χ2=22.254,P<0.01）。2005-2006年各监测点狂犬病病毒感染率与2006年各监测点人间狂犬病发病率呈正相关（Pearsonr=0.796,单侧P=0.047）；2007-2008年各监测点狂犬病病毒感染率与2007年各监测点人间狂犬病发病率秩次也呈正相关（Spearmanr=0.900,单侧P=0.019）。结论湖南省家犬狂犬病毒感染率较高,而且与人间狂犬病发病率呈正相关关系,需加强犬只免疫,严格犬只管理,遏制人间狂犬病疫情的发生。DFA法和巢式RT-PCR在狂犬病病毒的病原学监测中有实际应用价值。目的了解湖南省狂犬病病毒的病毒类型及其地理分布、病毒的变异动态特征,为制定有效的防制措施提供依据。方法将在狂犬病高、中、低发病地区的5个代表性县（市、区）所获狂犬病毒株N基因进行测序,然后进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析和系统发生分析等分子流行病学研究。利用DNAstar等生物信息学软件将N基因片段核苷酸、氨基酸序列与湖南省内历年狂犬病毒株、国内外狂犬病毒疫苗株、国内代表性狂犬病毒株、国外代表性的狂犬病毒株的核苷酸、氨基酸进行同源性比对、系统发生分析。结果湖南省2006年分离的20株病毒均为基因1型,各株间N基因片段核苷酸同源性为88.8%-100%（中位数98.1%）,氨基酸同源性为99.2%-100%（中位数99.6%）,系统发生可以分为A、B、C三群；与湖南省内历年狂犬病病毒株比较,核苷酸同源性为88.5%-100%（中位数97.9%）,氨基酸同源性为98.3%-100%（中位数99.6%）,系统发生分为A、B、C三群,狂犬病病毒具有地域性的特征。与国内外狂犬病疫苗株比较,研究毒株与中国疫苗株CTN同源性89.9%-94.2%（中位数90%）,亲缘关系最近。与国内代表性狂犬病病毒株比较,湖南省狂犬病病毒株与贵州、湖北、广西等周边相邻省份毒株的亲缘关系较近,与江苏、河南等省份的毒株也有较近的亲缘关系,系统发生可以分成A、B二个大群,A组以中国东部为主,B组以中国西部为主。与国外代表性狂犬病病毒株比较,系统发生可分为二个大群,本研究分离的20株狂犬病病毒全被分在同一组群,与印度尼西亚狂犬病病毒株进化关系最近且分在属同一分支,但与亚洲其他国家、美洲、非洲、欧洲等的狂犬病病毒株进化关系较远。结论湖南省2006年分离的20株狂犬病病毒均为基因1型。湖南省内狂犬病毒株N基因核苷酸与氨基酸同源性均较高,湖南省狂犬病毒株与国内邻省或较远的多个省份毒株的亲缘关系较近,研究毒株与亚洲印度尼西亚株亲缘关系较近,而与其他洲的亲缘关系较远,狂犬病毒株具有地域性分布的特征,狂犬病毒株与中国疫苗株CTN同源性最高,亲缘关系最近,因此在湖南省使用CTN疫苗株效果可能较好。
黄莹[10]（2009）在《狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的建立》文中研究说明反向遗传学是对遗传信息为RNA的生命体而言,在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰再按基因组组成顺序构建含有生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体。本研究对建立中国疫苗株狂犬病病毒反向遗传系统的成功探索,为进一步研究狂犬病病毒基因组结构与功能的关系,开发新型疫苗提供技术平台。本研究建立了中国人用疫苗株（CTN）狂犬病病毒反向遗传系统,其中主要元件包括:两端分别带有锤头状核酶（HamRz）和丁型肝炎核酶（HdvRz）并在G、L基因之间插入绿色荧光蛋白（GFP）基因的全长基因组cDNA重组真核表达质粒,以及核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L） 3个参与病毒转录和复制的辅助质粒。方法是将上述4个质粒共转染BHK-21细胞,在细胞RNA聚合酶II的作用下启动真核表达载体pVAX1的CMV启动子起始转录各个目的基因,成功拯救出CTN株重组狂犬病病毒（CTN-GFP）,通过感染重组病毒的细胞传代实验证明此病毒能够稳定表达GFP。重组病毒CTN-GFP分别脑内接种1日龄乳鼠和成年小鼠,结果导致乳鼠全部发病死亡,并在发病死亡的乳鼠脑内检测到绿色荧光蛋白的表达,而对成年鼠不致病,提示此病毒具有与亲代CTN株病毒相似的致病特性。
二、狂犬病毒CTN株核蛋白基因的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、狂犬病毒CTN株核蛋白基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 一、引言 |
| 1.1 狂犬病病毒核蛋白的结构与功能 |
| 1.2 狂犬病病毒核蛋白的应用 |
| 1.3 狂犬病病毒核蛋白表达概述 |
| 1.4 实验目的与意义 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.2 核蛋白密码子优化 |
| 2.2.3 优化后核蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 2.2.4 通过优化表达条件促进核蛋白的可溶性表达和纯化 |
| 2.2.5 重组核蛋白的反应原性和免疫原性检测 |
| 2.2.6 间接ELISA检测方法的建立 |
| 三、结果 |
| 3.1 核蛋白在大肠杆菌系统中的表达 |
| 3.1.1 PCR扩增N基因 |
| 3.1.2 pET-43.1a-NP表达质粒构建 |
| 3.1.3 重组pET-43.1a-NP质粒鉴定 |
| 3.1.4 在大肠杆菌中表达重组pET-43.1a-NP质粒 |
| 3.2 核蛋白密码子优化 |
| 3.2.1 核蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 核蛋白密码子优化 |
| 3.3 优化后核蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.1 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒构建 |
| 3.3.2 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒的鉴定 |
| 3.3.3 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.4 重组核蛋白表达诱导条件的优化 |
| 3.4 优化诱导条件实现重组核蛋白可溶性表达 |
| 3.4.1 IPTG浓度对重组可溶性表达的影响 |
| 3.4.2 诱导温度对重组核蛋白可溶性表达的影响 |
| 3.4.3 诱导时间对重组核蛋白可溶性表达产量的影响 |
| 3.4.4 可溶性表达条件下重组核蛋白的表达和纯化 |
| 3.5 重组核蛋白的免疫学活性检测 |
| 3.5.1 重组核蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.5.2 重组核蛋白的免疫原性鉴定 |
| 3.6 间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.6.1 最适核蛋白包被浓度的确定 |
| 3.6.2 最适包被温度和包被时间的确定 |
| 3.6.3 封闭剂的选择和最佳封闭时间的确定 |
| 3.6.4 酶标二抗工作浓度的确定 |
| 3.6.5 阴阳性检测临界值的确定 |
| 3.6.6 间接ELISA检测方法的初步验证 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、创新性与不足 |
| 七、参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）人源抗狂犬病毒磷蛋白基因工程抗体及细胞内抗体的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分：人源抗狂犬病毒Fab噬菌体抗体库的构建与筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分：人源抗狂犬病毒IgG全抗体表达及功能鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分小结 |
| 第三部分：人源抗狂犬病毒磷蛋白抗体RV1A2表位研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分小结 |
| 第四部分：抗狂犬病磷蛋白细胞内抗体功能初步研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分小结 |
| 全文总结 |
| 引用文献 |
| 致谢 |
（3）牛狂犬病的病毒全基因组序列分析及病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 狂犬病毒的分类 |
| 1.1.2 狂犬病病毒的分子生物学特点 |
| 1.2 流行病学研究进展 |
| 1.2.1 传染源和宿主 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 影响发病的因素 |
| 1.2.4 狂犬病流行范围 |
| 1.3 病理学研究 |
| 1.3.1 病理学变化 |
| 1.3.2 发病机理研究进展 |
| 1.4 狂犬病的诊断与防制 |
| 1.4.1 狂犬病的诊断 |
| 1.4.2 狂犬病的防制 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 牛狂犬病自然病例的病理学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 动物自然病例发病情况与临床症状 |
| 2.2.2 自然病例病理学检查 |
| 2.2.3 自然病例核酸检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 3株狂犬病病毒的全基因组测序 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 狂犬病犬牛脑标本来源 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 狂犬病病毒全基因组测序所用标本 |
| 3.1.4 实验道德规范 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 接种用脑组织的处理 |
| 3.2.2 接种方法 |
| 3.2.3 小鼠接种后观察 |
| 3.2.4 接种后直接免疫荧光检测 |
| 3.2.5 用于狂犬病毒N基因序列的扩增引物 |
| 3.2.6 设计用于分段扩增狂犬病病毒全基因组序列的引物 |
| 3.2.7 设计用于病毒基因组末端的基因序列扩增引物 |
| 3.2.8 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.9 cDNA合成 |
| 3.2.10 PCR和序列测定 |
| 3.2.11 狂犬病病毒基因组末端的基因序列扩增 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 狂犬病毒分离扩增结果 |
| 3.3.2 直接免疫荧光检测结果 |
| 3.3.3 狂犬病毒N基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.4 全基因组序列PCR反应产物电泳结果 |
| 3.3.5 狂犬病毒的基因组全长与各基因及其编码区域 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 引物设计 |
| 3.4.2 确保序列测定的准确性 |
| 3.4.3 全基因组的长度 |
| 3.4.4 (G+C)%含量 |
| 3.5 小结 |
| 4 3株内蒙古狂犬病病毒的全基因组序列的分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 用于狂犬病毒全基因组序列分析的参考序列 |
| 4.1.2 用于狂犬病病毒N基因序列分析的参考序列 |
| 4.2 用于序列分析的生物信息学常用软件 |
| 4.2.1 用于序列拼接的ATGC软件 |
| 4.2.2 ClustalX(1.8)软件 |
| 4.2.3 BioEdit软件 |
| 4.2.4 GeneDoc软件 |
| 4.2.5 MEGA(5)软件 |
| 4.2.6 DNAStar(5.01)软件包中MegAlign软件 |
| 4.3 狂犬病病毒的全基因组序列分析结果 |
| 4.3.1 狂犬病毒全基因序列的同源性分析 |
| 4.3.2 各结构基因所编码蛋白情况分析 |
| 4.3.3 结构蛋白基因同源性比较 |
| 4.3.4 非编码区序列比较 |
| 4.3.5 各结构蛋白的功能位点比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 3株狂犬病毒街毒株N基因(核蛋白)分析 |
| 4.4.2 基因组分子特征 |
| 4.4.3 遗传系谱间差异比较 |
| 4.4.4 种系发生分析 |
| 4.4.5 街毒株与疫苗株的比较研究 |
| 4.4.6 同源性分析 |
| 4.4.7 3株病毒致病性差异分析 |
| 4.5 小结 |
| 5 牛狂犬病病毒毒株实验感染小鼠的病理学研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验道德规范 |
| 5.1.2 病毒株 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 病毒悬液的制备与病毒滴度的检测 |
| 5.1.5 狂犬病病毒的接种与接种后观察 |
| 5.1.6 小鼠脑组织的收集与组织切片的制备 |
| 5.1.7 狂犬病病毒特异性抗原定位 |
| 5.1.8 电镜检查 |
| 5.1.9 脑标本的病理组织学观察 |
| 5.1.10 脑组织切片CD3+T淋巴细胞的免疫荧光染色 |
| 5.1.11 CD11b小胶质细胞的免疫荧光染色 |
| 5.1.12 活化的半胱天冬酶-3(Caspase-3)的间接免疫荧光染色 |
| 5.1.13 微管相关蛋白(MAP-2)的免疫荧光染色 |
| 5.1.14 神经细胞MAP-2与狂犬病毒抗原共定位 |
| 5.1.15 IL-1βmRNA、RANTES mRNA及TIMP-1 mRNA原位杂交检测 |
| 5.1.16 脑组织免疫荧光染色与激光扫描共聚焦观察 |
| 5.1.17 数据处理与统计 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 乳鼠接种病毒后的脑内病毒滴度、体重变化及病死率 |
| 5.2.2 外周和颅内两种接种方式对不同年龄段小鼠的致病性和感染能力 |
| 5.2.3 狂犬病病毒特异性抗原检测结果 |
| 5.2.4 神经细胞与神经纤维的病理变化 |
| 5.2.5 电镜检查 |
| 5.2.6 3株狂犬病毒在发病后濒死前乳鼠脑内的抗原分布 |
| 5.2.7 3株狂犬病毒在乳鼠脑组织内不同部位的病毒抗原含量 |
| 5.2.8 乳鼠脑组织内CD3+T淋巴细胞的浸润 |
| 5.2.9 乳鼠脑组织内CD11b小胶质细胞的活化 |
| 5.2.10 3株狂犬病毒乳鼠脑组织内Caspase-3免疫荧光染色结果 |
| 5.2.11 乳鼠脑组织微管相关蛋白2的荧光免疫荧光染色结果 |
| 5.2.12 乳鼠脑组织病毒抗原与微管相关蛋白2病变的相关性 |
| 5.2.13 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞激光扫描共聚焦观察结果 |
| 5.2.14 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果 |
| 5.2.15 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果 |
| 5.2.16 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 乳鼠脑组织神经细胞的病理学变化 |
| 5.3.2 3株病毒脑组织内抗原分布差异分析 |
| 5.3.3 3株病毒致乳鼠脑组织细胞凋亡情况 |
| 5.3.4 乳鼠脑组织炎性细胞情况 |
| 5.3.5 乳鼠脑组织神经细胞树突的病变 |
| 5.3.6 乳鼠脑组织狂犬病病毒抗原阳性细胞免疫荧光方法特异性鉴定 |
| 5.3.7 乳鼠脑组织原位杂交IL-1β mRNA染色结果 |
| 5.3.8 乳鼠脑组织原位杂交RANTES mRNA染色结果 |
| 5.3.9 乳鼠脑组织原位杂交TIMP-1 mRNA染色结果 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 7 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）人源抗病毒基因工程抗体功能表位研究 ——鸡尾酒式抗狂犬病毒抗体—发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体（论文提纲范文）
| 缩略说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部 鸡尾酒式人源抗狂犬病毒基因工程抗体的研究 |
| 第一节 人源抗狂犬病毒scFv噬菌体抗体库的构建和筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 鸡尾酒式人源抗狂犬病毒抗体功能及表位研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 第二部 人源抗发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体及表位研究 |
| 第一节 人源抗SFTSV Fab噬菌体抗体库的构建与筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节：人源抗SFTSV核蛋白基因工程抗体功能及表位研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士研究生期间已发表及发表文章 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 病毒、细胞、载体 |
| 2 抗原制备 |
| 3 噬菌体抗体文库的构建 |
| 4 噬菌体抗体库的富集筛选及Fab抗体的诱导表达 |
| 5 人源抗狂犬病毒Fab抗体的ELISA检测 |
| 5.1 Fab表达的检测 |
| 5.2 间接酶联免疫测定法 (ELISA) 检测Fab对狂犬病毒的结合活性 |
| 6 间接免疫荧光 (IFA) 检测 |
| 7 人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析 |
| 8 全抗体重组表达质粒的构建 |
| 9 转染及重组病毒感染与增殖 |
| 10 全抗体IgG分泌表达和纯化 |
| 11 人源抗狂犬病毒抗体快速免疫荧光灶抑制实验 (RFFIT |
| 结 果 |
| 1 人源抗狂犬病毒抗体库的筛选 |
| 2 人源抗狂犬病毒Fab抗体的序列分析 |
| 3 人源抗狂犬病毒Fab抗体对狂犬病毒糖蛋白的特异性结合 |
| 4 5株Fab抗体的全抗体IgG表达和纯化 |
| 5 人源抗狂犬病毒抗体快速免疫荧光灶抑制实验 (RFFIT) |
| 讨 论 |
（6）人源抗狂犬病毒基因工程抗体研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人源抗狂犬病毒Fab噬菌体抗体库的构建与筛选 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人源抗狂犬病毒全抗体表达及功能鉴定 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 人源抗狂犬病毒基因工程抗体的抗原结合表位研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章和专利 |
| 致谢 |
（7）河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析（论文提纲范文）
| 材 料 和 方 法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
（8）湖南省20株狂犬病毒株与疫苗株N基因序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 狂犬病毒N基因片段扩增及测序 |
| 1.3 狂犬病毒N基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 20株狂犬病毒株背景资料情况 |
| 2.2 与疫苗株N基因片段核苷酸序列同源性分析 |
| 2.3 与疫苗株N基因片段氨基酸序列同源性分析 |
| 2.4 与疫苗株N基因的系统发生分析 |
| 3 讨论 |
（9）湖南省1988～2007年狂犬病流行病学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英语缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 湖南省1988-2007年狂犬病流行特征及防制现状 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 资料来源 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 研究时间范围 |
| 2.4 研究内容与分析方法 |
| 2.5 质量控制 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 全省流行状况 |
| 3.1.1 一般概况 |
| 3.1.2 1988年-2007年湖南省狂犬病疫情动态分析 |
| 3.2 1988年-2007年湖南省狂犬病疫情的三间分布 |
| 3.2.1 地区分布 |
| 3.2.2 月份分布 |
| 3.2.3 人群分布 |
| 3.3 2004年-2007年1059例狂犬病例流行病学调查分析 |
| 3.3.1 病例一般情况与潜伏期、病程 |
| 3.3.2 流行因素调查 |
| 3.3.3 暴露后是否接种人用狂犬疫苗的影响因素分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 研究结果的可靠性 |
| 4.2 湖南省1988年-2007年狂犬病流行基本特征 |
| 4.3 湖南省狂犬病例潜伏期长短影响因素特点 |
| 4.4 暴露后是否接种人用狂犬疫苗的影响因素分析 |
| 4.5 湖南省狂犬病疫情居高不下的原因分析 |
| 4.5.1 行政管理存在的问题 |
| 4.5.2 犬只管理的问题 |
| 4.5.3 狂犬病暴露后处置质量的主要影响因素 |
| 4.5.4 健康教育力度不足 |
| 4.6 湖南省新时期预防和控制狂犬病的对策 |
| 4.6.1 政府重视,多部门密切配合,齐抓共管 |
| 4.6.2 加强犬只管理与动物狂犬病疫情的监测 |
| 4.6.3 提高狂犬病暴露后处置质量 |
| 4.6.4 加大狂犬病健康教育力度 |
| 4.6.5 建立公共卫生应对系统,加强狂犬病疫情报告、疫情调查与监测 |
| 4.6.6 增加经费投入,加大科研力度,加强狂犬病生物学研究 |
| 第五章 结论 |
| 第二篇 湖南省家犬感染狂犬病病毒现况调查研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 监测点选择 |
| 2.2 标本采集数量、采集和保存及编号方法 |
| 2.2.1 标本采集数量 |
| 2.2.2 标本的采集和保存方法 |
| 2.2.3 标本编号方法 |
| 2.2.4 生物安全 |
| 2.3 检测方法 |
| 2.3.1 直接免疫荧光法(DFA)检测狂犬病病毒抗原 |
| 2.3.2 巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测狂犬病病毒特异性核酸 |
| 2.4 家犬狂犬病病毒感染结果判定 |
| 2.5 统计分析 |
| 2.6 质量控制 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 湖南省家犬感染狂犬病病毒状况调查结果 |
| 3.1.1 一般情况 |
| 3.1.2 不同地区家犬的狂犬病病毒感染情况 |
| 3.1.3 不同性别家犬的狂犬病病毒感染情况 |
| 3.1.4 不同体型家犬的狂犬病病毒感染情况 |
| 3.1.5 不同年龄家犬的狂犬病病毒感染情况 |
| 3.1.6 家犬兽用狂犬病疫苗免疫对狂犬病病毒感染状况的影响 |
| 3.1.7 不同季节家犬的狂犬病病毒感染情况 |
| 3.2 湖南省家犬狂犬病病毒感染情况与人间狂犬病发病率间的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 外表行为正常家犬狂犬病病毒感染概况 |
| 4.2 湖南省家犬狂犬病病毒感染情况调查分析 |
| 4.3 湖南省家犬狂犬病病毒感染情况影响因素分析 |
| 4.3.1 地域影响 |
| 4.3.2 家犬性别、体型、年龄的影响 |
| 4.3.3 家犬兽用狂犬病免疫状况的影响 |
| 4.3.4 季节的影响 |
| 4.4 湖南省家犬狂犬病病毒感染情况与人间狂犬病发病间的关系 |
| 4.5 狂犬病病毒检测方法比较 |
| 第五章 结论 |
| 第三篇 湖南省狂犬病病毒分子流行病学研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 标本收集 |
| 2.2 狂犬病病毒N基因片段扩增及测序 |
| 2.3 狂犬病病毒N基因序列分子流行病学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 狂犬病病毒N基因核苷酸测序情况 |
| 3.2 狂犬病病毒基因型的确定 |
| 3.3 湖南省20株狂犬病病毒N基因序列的同源性及系统发生分析 |
| 3.3.1 N基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 3.3.2 N基因的氨基酸序列同源性分析 |
| 3.3.3 湖南省20株狂犬病病毒N基因片段核苷酸序列系统发生分析 |
| 3.4 与湖南省历年狂犬病病毒株的同源性与系统发生分析 |
| 3.4.1 湖南省历年狂犬病病毒株基因背景信息 |
| 3.4.2 与湖南省历年狂犬病病毒株N基因核苷酸同源性分析 |
| 3.4.3 湖南省历年狂犬病病毒株N基因片段氨基酸序列同源性分析 |
| 3.4.4 与湖南省历年狂犬病病毒株系统发生分析 |
| 3.5 与国内外狂犬病疫苗株的同源性及系统发生分析 |
| 3.5.1 疫苗株背景信息 |
| 3.5.2 与疫苗株N基因片段核苷酸序列同源性分析 |
| 3.5.3 与疫苗株N基因片段氨基酸序列同源性分析 |
| 3.5.4 与疫苗株N基因的系统发生分析 |
| 3.6 与国内狂犬病代表性毒株N基因核苷酸序列同源性和系统发生分析 |
| 3.6.1 国内狂犬病代表性毒株背景信息 |
| 3.6.2 与国内狂犬病代表性毒株N基因的核苷酸同源性分析 |
| 3.6.3 与国内狂犬病代表性毒株N基因核苷酸系统发生分析 |
| 3.7 与国外狂犬病病毒代表株N基因核苷酸同源性与系统发生分析 |
| 3.7.1 国外狂犬病病毒代表株背景信息 |
| 3.7.2 与国外代表性毒株N基因核苷酸同源性分析 |
| 3.7.3 与国外狂犬病病毒代表株N基因核苷酸系统发生分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 湖南省20株狂犬病病毒株N基因间的同源性与系统发生分析 |
| 4.2 湖南省内狂犬病病毒株N基因内部同源性与系统发生分析 |
| 4.3 研究毒株与狂犬病疫苗株的同源性与系统发生分析 |
| 4.4 研究毒株与国内周边省份狂犬病病毒代表性株的系统发生分析 |
| 4.5 研究毒株与国外狂犬病病毒代表性株的系统发生分析 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1 |
| 附表2 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的建立（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病及狂犬病病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1 狂犬病概况 |
| 1.2 狂犬病病毒分子生物学研究进展 |
| 第2章 动物RNA 病毒反向遗传技术研究进展 |
| 2.1 动物RNA 病毒反向遗传系统 |
| 2.2 不同类型的RNA 病毒反向遗传操作策略 |
| 2.3 狂犬病病毒反向遗传操作研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 CTN 株狂犬病病毒基因组分段克隆及全长CDNA 重组质粒的设计与构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 CTN 株狂犬病病毒反向遗传系统中N、P、L 蛋白辅助质粒的构建及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 CTN 株重组狂犬病病毒的拯救及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
| 英文摘要 |
四、狂犬病毒CTN株核蛋白基因的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用[D]. 任元雪. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]人源抗狂犬病毒磷蛋白基因工程抗体及细胞内抗体的研究[D]. 刘洋. 中国疾病预防控制中心, 2015(05)
- [3]牛狂犬病的病毒全基因组序列分析及病理学研究[D]. 尹景峰. 内蒙古农业大学, 2014(01)
- [4]人源抗病毒基因工程抗体功能表位研究 ——鸡尾酒式抗狂犬病毒抗体—发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白抗体[D]. 于礼. 中国疾病预防控制中心, 2012(12)
- [5]人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制[J]. 陈哲,孙丽娜,李川,吕新军,唐青,梁米芳,李德新. 病毒学报, 2010(04)
- [6]人源抗狂犬病毒基因工程抗体研究[D]. 陈哲. 中国疾病预防控制中心, 2010(12)
- [7]河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析[J]. 熊成龙,邵中军,郑刚,居丽雯,周联娣,姜庆五. 复旦学报(医学版), 2010(03)
- [8]湖南省20株狂犬病毒株与疫苗株N基因序列分析[J]. 刘富强,陈立章,高立冬,张红. 中国现代医学杂志, 2010(02)
- [9]湖南省1988～2007年狂犬病流行病学研究[D]. 刘富强. 中南大学, 2009(04)
- [10]狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的建立[D]. 黄莹. 吉林大学, 2009(08)